PT1556414E - Misturas de oligossacáridos derivados de heparina, sua preparação e composições farmacêuticas que as contêm - Google Patents

Misturas de oligossacáridos derivados de heparina, sua preparação e composições farmacêuticas que as contêm Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO "MISTURAS DE OLIGOSSACÁRIDOS DERIVADOS DE HEPARINA, SUA PREPARAÇÃO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTEM" A presente invenção refere-se a misturas de oligossacáridos derivados da heparina, ao seu processo de preparação e às composições farmacêuticas as contêm. A heparina é uma mistura de mucopolissacáridos sulfatados de origem animal, utilizada nomeadamente pelas suas propriedades anticoagulantes e antitrombóticas.
No entanto, a heparina apresenta desvantagens que limitam as condições da sua utilização. Em particular, a sua actividade anticoagulante significativa (anti lia) pode causar hemorragias.
Foram propostas heparinas de baixo peso molecular obtidas por despolimerização básica de ésteres de heparina (documento EP40144); no entanto estes produtos apresentam ainda uma actividade anti-IIa significativa.
Foram igualmente descritas heparinas de peso molecular muito baixo no documento US6384021. No entanto os valores da actividade anti-Xa obtida nos exemplos descritos não excedem as 120 UI e a proporção anti-Xa/anti-IIa obtida está compreendida entre 15 e 50. 1
No documento WO-0208295, são preparadas heparinas de peso molecular muito baixo por um processo diferente do documento US6384021 e apresentam uma actividade compreendida entre 100 e 150 UI com proporções anti-Xa/anti-IIa igualmente muito elevadas para alguns exemplos de aplicação. O pedido de Patente Europeia EP-A-027089 divulga fracções de oligossacáridos possuindo uma actividade anti-Xa superior à da heparina não fraccionada.
No entanto, existe uma necessidade constante nesta classe de medicamentos para melhorar as actividades anti-Xa, nomeadamente obtendo actividades superiores a 150 Ul/mg, assim como a proporção anti-Xa/anti-IIa, e consequentemente desenvolver novas gerações de derivados de Heparinas.
Um dos objectivos da invenção consiste consequentemente em melhorar a actividade anti-Xa e a proporção anti-Xa/anti-IIa modificando os processos descritos na técnica anterior, nomeadamente controlando a percentagem de água durante a etapa de despolimerização. A heparinas assim obtidas apresentam assim uma excelente actividade antitrombótica e possuem uma actividade anti-IIa próxima da heparina reduzindo os riscos de hemorragia com uma actividade anti-IIa muito baixa. Do mesmo modo, os produtos da invenção apresentam durações de semi-vida muito mais elevadas do que a heparina. A invenção tem consequentemente como objectivo novas misturas de oligossacáridos derivados da heparina possuindo uma actividade mais selectiva em relação ao factor X activado (factor Xa) e ao factor II activado (factor lia) que a heparina. 2 É entendido que as misturas de polissacáridos tendo um peso molecular médio de 1500 a 3000 Da podem ser qualificadas como oligossacáridos. A presente invenção tem consequentemente como objectivo as misturas de oligossacáridos sulfatadas possuindo a estrutura geral dos polissacáridos constitutivos da heparina e apresentando as caracteristicas seguintes: têm um peso molecular médio de 2000 a 3000 daltons, uma actividade anti-Xa > 150 Ul/mg e < 200 Ul/mg, uma actividade anti-IIa inferior a 10 Ul/mg e uma proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa superior a 30, os oligossacáridos constitutivos das misturas contêm 2 a 26 motivos sacaridicos, têm um motivo ácido urónico-4,5 insaturado 2-O-sulfato numa das suas extremidades, contendo uma fracção hexassacarídica representando 15 a 25% das misturas de oligossacáridos e contendo 8 a 15% do hexassacárido AIIa-IIs-Is na fracção hexassacarídica:
Alia ||s Is O hexassacárido AIIa-IIs-Is contido na mistura de oligossacáridos descrita na presente invenção é uma sequência 3 significativamente semelhante à ATUI e caracterizada por uma actividade anti-IIa superior a 740 U/mg. A mistura de oligossacáridos descrita na presente invenção está sob a forma de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso.
Como sal de metal alcalino ou alcalino-terroso, são preferidos os sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio. O peso molecular médio é determinado por cromatografia liquida de alta pressão utilizando duas colunas em série, por exemplo, as comercializadas sob a designação TSK G3000 XL e TSK G2000 XL. A detecção é realizada por refractometria. O eluente utilizado é nitrato de litio e o caudal é de 0,6 mL/min. O sistema é calibrado com padrões preparados por fraccionamento de Enoxaparina (AVENTIS) por cromatografia em gel de agarose-poliacrilamida (IBF). Esta preparação é realizada de acordo com a técnica descrita por Barrowcliffe et al., Thromb. Res., 12, 27-36 (1977-78) ou D. A. Lane et al., Thromb. Res., 12, 257-271 (1977-78). Os resultados são calculados utilizando o programa informático GPC6 (Perkin Elmer). A actividade anti-Xa é medida pelo método amidolitico num substrato cromogénico descrito por Teien et al., Thromb. Res., 10, 399-410 (1977), tendo como padrao o primeiro padrão internacional de heparinas de baixo peso molecular. A actividade anti-IIa é medida pela técnica descrita por Anderson L. O. et al., Thromb. Res., 15, 531-541 (1979), tendo como padrão o primeiro padrão internacional de heparinas de baixo peso molecular. 4 A fracção hexassacarídica representa 15 a 25% da mistura de oligossacáridos.
As misturas de acordo com a invenção contêm 8 a 15% do hexassacárido AIIa-IIs_-Is na fracção hexassacarídica da mistura de oligossacáridos. A percentagem da fracção hexassacarídica pode ser determinada de um modo analítico por cromatografia líquida de alta pressão em colunas TSK G3000 XL e TSK G2000 XL ou ainda por separação preparativa da fracção hexassacarídica. A mistura está, neste caso, submetida a cromatografia em colunas preenchidas com gel do tipo poliacrilamida agarose, tal como o comercializado sob a marca Ultrogel ACA202R (Biosepra). A mistura é eluída com uma solução de hidrogenocarbonato de sódio. De um modo preferido, a solução de hidrogenocarbonato de sódio é uma solução de 0,1 mol/L a 1 mol/L. De um modo ainda mais preferido, a separação é realizada a uma concentração de 1 mol/L. A detecção é realizada por espectrometria UV (254 nm). Após fraccionamento, a fracção hexassacarídica em solução em hidrogenocarbonato de sódio é neutralizada com ácido acético glacial. A solução é, em seguida, concentrada sob pressão reduzida para se obter uma concentração de acetato de sódio superior a 30% em peso. A fracção hexassacarídica é precipitada por adição de 3 a 5 volumes de metanol. A fracção hexassacarídica é recuperada por filtração por vidro sinterizado n° 3. A mistura hexassacarídicas obtida pode ser analisada por HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho) para daí determinar o conteúdo em hexassacárido AIIa-IIs_-Is. O hexassacárido AIIa-IIs_-Is pode ser isolado por cromatograf ia HPLC preparativa ou cromatografias de afinidade em coluna de antitrombina III sepharose de acordo com as técnicas utilizadas 5 pelo especialista na técnica M. Hook, I. Bjork, J. Hopwood e U. Lindahl, F.E B.S letters, vol 656(1) (1976)).
De um modo preferido, as misturas de acordo com a invenção têm uma actividade anti-IIa inferior a 5 Ul/mg e, mais particularmente, de 0,5 a 3,5 Ul/mg. Os exemplos de aplicações descritos abaixo mostram valores compreendidos entre 1,1 e 1,6 Ul/mg quando se utilizam as características preferidas do processo.
De um modo preferido, as misturas apresentam uma proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa superior a 50 e, mais particularmente, superior a 100.
De um modo preferido, as misturas de acordo com a invenção têm um peso molecular médio compreendido entre 2400 e 2650 Da. A invenção tem consequentemente, mais particularmente, como objectivo as misturas, tal como definidas anteriormente apresentando uma actividade anti-Xa > 150 Ul/mg e < 200 Ul/mg, uma actividade anti-IIa compreendida entre 0,5 e 3,5 Ul/mg e um peso molecular médio compreendido entre 2400 e 2650 Da.
As misturas de oligossacáridos de acordo com a invenção podem ser preparadas por despolimerização de um sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina em meio orgânico, utilizando uma base orgânica forte com pKa superior a 20 (de um modo preferido, propriedades próximas das da família dos fosfazenos definidos, por exemplo, de acordo com R. Schwesinger et ai., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 26, 1167-1169 (1987), R.
Schwesinger et ai., Angew. Chem. 105, 1420 (1993)), transformação do sal de amónio quaternário do éster benzilico da 6 heparina despolimerizada em sal de sódio, saponificação dos ésteres residuais e eventualmente purificação. 0 processo de acordo com a invenção retoma as grandes etapas do processo, tal como descritas no documento WO 0208295 adicionando uma caracteristica essencial que permite obter as misturas de oligossacáridos de acordo com a invenção com as caracteristicas fisico-quimicas e as actividades descritas acima.
De facto, para obter as misturas de oligossacáridos específicos de acordo com a invenção, é necessário controlar a selectividade da base para um controlo muito preciso do teor de água da mistura durante a etapa de despolimerização. O processo de acordo com a presente invenção é, desta forma, caracterizado por um controlo da forte selectividade da base durante a despolimerização. Este permite despolimerizar a heparina conservando ao máximo as sequências próximas da ATUI, tal como o hexassacárido AlIa-IIs^-Is descrito na presente invenção. Esta etapa crítica do processo permite obter as misturas de oligossacáridos de acordo com a invenção.
Esta caracteristica do processo traduz-se em actividades anti-IIa inesperadas, no que respeita aos pesos moleculares médios das misturas de oligossacáridos (150 Ul/mg < anti-IIa <200 Ul/mg para um peso molecular médio compreendido entre 2000 Da e 3000 Da) . Esta selectividade deve-se às características fisico-quimicas muito particulares das bases fosfazeno que apresentam um pKa superior a 20, um impedimento estérico muito significativo e uma nucleofilicidade baixa.
Este efeito expressa-se totalmente quando o meio reaccional é anidro. De outro lado, quando o teor de água do meio 7 reaccional aumenta, observa-se uma redução drástica da selectividade da despolimerização. A preservação de sequências próximas de ATUI diminui e a consequência é uma diminuição significativa da actividade anti-IIa. Em presença de uma pequena quantidade de água, a base fosfazeno protona-se e a espécie reactiva torna-se um hidróxido de amónio quaternário. Neste caso, as propriedades de impedimento estérico muito forte e de baixa nucleofilicidade são perdidas e influenciam significativamente a qualidade do produto obtido. Quando se realizam testes de despolimerização com um teor de água medido e controlado, pode-se observar este efeito a expresar-se plenamente. A tabela seguinte resume o impacto do teor de água na selectividade da despolimerização (apenas este parâmetro é variável nos ensaios: as estequiometrias dos reagentes, as diluições, as temperaturas permanecem constantes de acordo com os critérios do especialista na técnica. A base utilizada é a base fosfazeno: 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina).
Teor de água% 0,05% 0, 1% 0,2% 0,3% 0, 4% 0,57% 1,8% 2,5% anti-IIa Ul/mg 192 177 161 132 122 120 105 99 anti-IIa Ul/mg 1,3 1,5 1,4 1,4 1,3 1,4 3,1 13,4 anti-IIa/anti-IIa 148 118 115 94 94 85, 7 34 7,4
Para uma selectividade óptima e uma preservação máxima das sequências próximas de ATUI, é preferido utilizar conteúdos de água inferiores a 0,3% quando se trabalha com 1 equivalente molar de base fosfazeno, em comparação com o éster benzilico da heparina, sal de benzetónio. 8 A invenção tem consequentemente, mais particularmente, como objectivo a etapa de despolimerização do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina obtido de acordo com os métodos conhecidos do especialista na técnica, caracterizada por se utilizar uma base da família dos fosfazenos, nomeadamente em solução em diclorometano, contendo uma percentagem de água inferior a 0,3% e, mais particularmente, inferior a 0,2%.
Vantajosamente, a proporção em mol de base forte/éster está compreendida entre 0,2 e 5, de um modo preferido entre 0,6 e 2 e particularmente entre 0,8 e 1,2. A utilização da proporção equimolecular constitui consequentemente parte das formas de realização preferidas da invenção.
Podem ser utilizados outros solventes apróticos conhecidos do especialista na técnica, tais como THF ou DMF. O sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina é, de um modo preferido, um sal de benzetónio, cetilpiridínio ou cetiltrimetilamónio.
As bases da família dos fosfazenos são, de um modo preferido, as de fórmula: R3 R2—N F4 \ / R1—N=P—N—R5 N—R6 / R7 em que os radicais RI em R7 sao idênticos ou diferentes e representam radicais alquilo. 9
Em particular, a invenção tem como objectivo o processo tal como definido acima, caracterizado por a base utilizada na etapa d) de despolimerização) ser 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina (l,3,2-diazafosforin-2-amina, 2-[(1,1-dimetiletil)imino]-N,N-dietil-1,2,2,2,3,5,6-octa-hidro-1,3-dimetil):
ou terc-butilimino-tri(pirrolidino)-fosforano.
Nas fórmulas anteriores, os radicais alquilo contêm 1 a 6 átomos de carbono em cadeia linear ou ramificada. A invenção tem consequentemente como objectivo um processo de preparação de misturas de oligossacáridos de acordo com a invenção compreendendo as etapas seguintes: a) Transalificação da heparina de sódio por acção de cloreto de benzetónio, b) Esterificação do heparinato de benzetónio por acção de cloreto de benzilo, c) Transalificação do éster benzílico obtido em sal de amónio quaternário, 10 d) Despolimerizaçao do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina pelo método tal como definido acima, e) Transformação do sal de amónio quaternário em sal de sódio, f) Eventualmente saponificação da heparina por acção de uma base, tal como hidróxido de sódio g) Eventualmente purificação nomeadamente por acção de um agente de oxidação, tal como água oxigenada. 0 esquema de reacção seguinte ilustra a presente invenção: 11
Ρ^Ο-^ 820 TA
°^.°Na 0(S0,Na)X
Etapa a
Λ*· O-WH^O—©H V-Ο-λλΛ 0(SOjNa)Y NH(SO,Na)Z
Cloreto de benzetónio (Hirci·) ~ Heparinato de sódio ' m =-25 p= X+Y+Z (proporção de sulfatação global do dissacárido médio) X= Proporção de sulfatação do local, o complemento é representado pelo radical H Y= Proporção de sulfatação do local, o complemento é representado pelo radical H Z= Proporção de sulfatação do local, o complemento é representado pelo radical COCH3 1/ J, CHjCIj 21 MeOH, AcONa Etapa b Ο^,ΟίΒηρ
0(S0jNa)x O. W* O—)—O—(ÇH )—Ο-ύΛ _ Ó(SO,Na)Y NH(S0jNa)Z b = proporção de esterificação Éster benzílico bruto 0(SO,Na)x Purificação 0sa^0(Bn)b
__ ÓfSOjNaJY MH(SOsNa)Z_ b = proporção de esterificação Éster benzílico puro, sal de sódio
Ester benzílico puro, sal de sódio +
v Cloreto de benzetónio (HyCt) 0_,0(Bn)b -0(SOjHy)x
Transalificação Etapa c 0(SOjHy)Y NH(SOjHy)Z m = -25 Éster benzílico puro, sal de benzetónio 0
Ck O
Despolimerização 21 MeOH/ AcONa Etapa d e e
o(So,Na)x 0 ONa
_Im ULMWH bruto (ésteres residuais)
Saponificação NaOH 4"C
0(S03Na)Y NH(S03HaJ: 0(S03Na)Y NH(S03Na)Z
Etapa f m = ~ 3
ULMWH bruto
Purification H202 -&- Etapa g
A transformação do sal de amónio quaternário do éster benzílico da heparina despolimerizada em sal de sódio (etapa E) é realizada, geralmente, por tratamento do meio reaccional com uma solução alcoólica de acetato de sódio e, de um modo preferido, com uma solução de acetato de sódio a 10% em metanol 12 (peso/volume), a uma temperatura compreendida entre 15 e 25 °C. 0 equivalente em peso de acetato adicionado é, de um modo preferido, 3 vezes superior à massa de sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina utilizado na reacção de despolimerização. A saponificação (etapa f) é realizada geralmente utilizando um hidróxido de metal alcalino, tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de litio, em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 0 e 20 °C e, de um modo preferido, 0 e 10 °C. Utilizar-se-ão de um modo geral 1 a 5 equivalentes molares do hidróxido de metal alcalino. De um modo preferido, a saponificação será realizada na presença de 1 a 2 equivalentes molares do hidróxido de metal alcalino. 0 produto final pode ser eventualmente purificado (etapa g) por qualquer método conhecido de purificação de heparinas despolimerizadas (por exemplo, documento EP 0037319B1). De um modo preferido, purifica-se utilizando peróxido de hidrogénio, em meio aquoso, a uma temperatura de 10 a 50 °C. De um modo preferido, esta operação será realizada entre 20 e 40 °C. 0 sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina pode ser preparado de acordo com o esquema de reacção seguinte: a) transformação da heparina de sódio utilizando cloreto de benzetónio para obter heparinato de benzetónio (Transalificação), b) esterificação do sal de benzetónio obtido anteriormente utilizando cloreto de benzilo, depois tratamento com uma 13 solução alcoólica de acetato de sódio para obter o sal de sódio do éster benzilico da heparina, c) transalificação do sal de sódio do éster benzilico heparina em sal amónio quaternário e, de um modo preferido em de sal de benzetónio, cetilpirinio ou cetiltrimetilamónio. A reacção da etapa a) é realizada por acção de cloreto de benzetónio em excesso, em heparina sódica, a uma temperatura próxima de 15 a 25 °C. De um modo vantajoso, a proporção molar sal/heparina sódica está compreendida entre 3 e 4. A heparina de partida utilizada é, de um modo preferido, uma heparina de porco. Esta pode ser purificada previamente para diminuir a sua proporção de sulfato de dermatano de acordo com o processo descrito na patente FR2663639. A esterificação da etapa b) realiza-se de um modo preferido num solvente orgânico clorado (por exemplo, clorofórmio, cloreto de metileno), a uma temperatura compreendida entre 25 e 45 °C e, de um modo preferido entre 30 e 40 °C. 0 éster sob a forma de sal de benzetónio é, em seguida, recuperado sob a forma de sal de sódio por precipitação utilizando acetato de sódio a 10% em peso num álcool tal como metanol. Utilizam-se geralmente 1 a 1,2 volumes de álcool por volume de meio reaccional. A quantidade de cloreto de benzilo e o tempo de reacção são adaptados para se obter uma proporção de esterificação compreendida entre 50 e 100% e, de um modo preferido, entre 70 e 90%. De um modo preferido, utilizam-se 0,5 a 1,5 partes em peso de cloreto de benzilo para 1 parte em peso de sal de benzetónio 14 de heparina. Do mesmo modo, de um modo preferido, o tempo de reacção estará compreendido entre 10 e 35 h. A transalificação da etapa c) é realizada utilizando um cloreto de amónio quaternário e, de um modo preferido, utilizando cloreto de benzetónio, cloreto de cetilpiridinio ou cloreto de cetiltrimetil amónio, em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 10 e 25 °C. De um modo vantajoso, a proporção molar de cloreto de amónio quaternário/sal de sódio do éster benzilico da heparina está compreendida entre 2 e 3.
As misturas de acordo com a invenção sob a forma de sal de sódio, podem ser transformadas num outro sal de um metal alcalino ou alcalino-terroso. Passa-se eventualmente de um sal a outro utilizando o método descrito na patente FR 7313580.
As misturas de acordo com a invenção não são tóxicas e podem assim ser utilizadas como medicamentos.
As misturas de oligossacáridos desta invenção podem ser utilizadas como agentes antitrombóticos. Em particular, estas são úteis para o tratamento ou a prevenção de tromboses venosas e arteriais, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, angina instável, enfarte do miocárdio, isquemia cardíaca, doenças oclusivas das artérias periféricas e fibrilhação auricular. Estas são igualmente úteis na prevenção e no tratamento da proliferação das células musculares lisas, aterosclerose e arteriosclerose, no tratamento e na prevenção do cancro pela modulação da angiogénese e dos factores de crescimento e no tratamento e na prevenção dos distúrbios diabéticos, tais como as retinopatias e as nefropatias diabéticas. 15 A presente invenção refere-se igualmente às composições farmacêuticas contendo como principio activo uma mistura de fórmula (I) eventualmente em associação com um ou mais excipientes inertes.
As composições farmacêuticas são, por exemplo, soluções injectáveis por via subcutânea ou intravenosa. Estas são igualmente úteis para uma administração por via pulmonar (inalação) ou via oral. A posologia pode variar em função da idade, peso e saúde do doente. Para um adulto, em geral esta está compreendida entre 20 e 100 mg por dia por via intramuscular ou subcutânea.
Os exemplos seguintes ilustram a invenção sem no entanto a limitar.
Exemplo A: PREPARAÇAO DE SAL DE BENZETONIO DE HEPARINATO DE BENZILO
Heparinato de benzetónio
Adiciona-se uma solução de 25 g cloreto de benzetónio em 125 mL de água a uma solução de 10 g de heparina de sódio em 100 mL de água. O produto é filtrado, lavado com a água e seco. Éster benzílico de heparina (sal de sódio)
Adicionam-se 16 mL de cloreto de benzilo a uma solução de 20 g de heparinato de benzetónio em 80 mL de cloreto de 16 metileno, . A solução é aquecida a uma temperatura de 30 °C durante 12 horas. Adicionam-se então 108 mL de uma solução de acetato de sódio a 10% em metanol, filtra-se, lava-se com metanol e seca-se. Obtêm-se assim 7,6 g de éster benzilico de heparina sob a forma de sal de sódio cuja proporção de esterificação é de 77%.
Ester benzilico da heparina (sal de benzetónio)
Introduzem-se 36 g (0,0549 mol) de éster benzilico de heparina (sal de sódio) e 540 mL de água destilada num erlenmeyer A de 2 litros. Após homogeneização a uma temperatura de cerca de 20 °C, obtém-se uma solução amarela pálida. Prepara-se uma solução de 64,45 g (0,1438 mol) de benzetónio e 450 mL cloreto de água num erlenmeyer B de 1 litro, sob agitação magnética. A solução do erlenmeyer B é vertida durante cerca de 35 minutos na solução de erlenmeyer A sob agitação. Observa-se a formação de um precipitado branco abundante. O erlenmeyer B é lavado com 200 mL de água destilada e a água da lavagem é introduzida no erlenmeyer A. A agitação é então terminada e deixa-se a suspensão sedimentar durante 12 horas. Passado esse tempo, recolhe-se e reserva-se a parte limpida do sobrenadante. Adicionam-se 560 mL de água ao precipitado sedimentado formado (aspecto de pasta), e agita-se durante 20 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (560 mL) . Renova-se duas vezes esta operação de lavagem do precipitado sedimentado, com cerca de 560 mL de água destilada. Na última operação de lavagem, deixa-se o precipitado em suspensão e filtra-se em Vidro sinterizado 3. O bolo é, em seguida, lavado 4 vezes com 200 mL de água destilada. O sólido branco húmido é enxugado, 17 depois seco sob pressão reduzida (2,7 kPa), a uma temperatura próxima de 60 °C. Após 12 horas de secagem, obtêm-se 87,5 g de heparinato de benzilo, sal de benzetónio. O rendimento obtido é de 94,9%.
Exemplo B: DESCRIÇÃO DO HEXASACÁRIDO ATUI (AIIa-IIs-Is)
Alia ||s Is
Espectro de protão em D2O, 500 MHz, T = 298 K, δ em ppm: 1,97 (3H, S) , 3,18 (1H, dd, 10 e 3 Hz), 3,30 (1H , t, 8 Hz) , 3, 37 (1H, dd, 10 e 3 Hz ) , 3, 60 (2H , m; ) , entre 3, , 65 e 3,85 (6H , m) , 3,87 (2H, m) , 3,95 (1H, d, 8 Hz) , 4,03 (1H, d, 8 Hz) , entre 4, 05 e 4,13 (4H, m) , entre 4, ,16 e 4,45 (8H, m) , 4, 52 (1H, d, 8 Hz) , 4,67 (1H, m) , 5, 06 (1H, d, r 6 Hz), 5, 10 (1H , d, 3 Hz) , 5, 33 (1H, d, 4 Hz) , 5, 36 > (1H , d, 3 Hz) , 5,46 (1H , d, 3 Hz) , 5, 72 (1H , d, 4 Hz) .
Sal decassódico do ácido 4-desoxi-a-L-treo-hexenopiranosilurónico-(1-,4)-2-desoxi-2-acetamido-6-0-sulfo-a-D-glucopiranosil- (1^4) -ácido P-D-glucopiranosilurónico- (1-^4) -2-desoxi-2-sulf amido-3,6-di-O-sulf o-a-D-glucopiranosil) — (1—*-4) — 18 ácido 2-0-sulfo-a-Z-idopiranosilurónico-(l->4)-2-desoxi-2-sulfamido-6-O-sulfo-a-D-glucopiranose. • Os exemplos 1 a 7 e 12 ilustram a influência do teor de água sobre a selectividade da reacção de polimerização e na actividade anti-IIa e anti-IIa dos produtos obtidos. • Os exemplos 8 a 10 ilustram a influência do número de equivalentes de base sobre a actividade anti-IIa e anti-IIa do produto obtido (com um teor de água de 0,1%) • O exemplo 11 ilustra a utilização de uma outra base fosfazeno para além da 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l, 3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina:
Utilização de terc-butilimino tri(pirrolidino) fosforano EXEMPLO 1
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 0,1%) :
Introduzem-se 70 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 10 g (0,006 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. O teor de água do meio reaccional é ajustado para 0,1%. A solução é aquecida a 40 °C sob azoto. Após a dissolução completa, retorna-se a uma temperatura próxima de 20 °C, depois, adicionam-se 1,75 mL (0,006 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper- 19 hidro-1,2,3-diaza-fosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 30 g de acetato de sódio anidro em 300 mL de metanol. Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 5 g de celite Hyflo supercel. Sob agitação magnética, a mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio a uma temperatura próxima de 5 °C. Após 5 minutos de agitação deixa-se decantar a suspensão durante uma hora e 30 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (220 mL). Adicionam-se 220 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 1 hora e 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (250 mL). Adicionam-se 250 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de Vidro sinterizado 3. 0 bolo obtido é, em seguida, lavado com 100 mL de metanol. 0 sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 2,51 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em celite (5 g) . O rendimento obtido é de 64%.
Saponificação:
Introduzem-se 2,5 g (0,0038 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (5 g) obtido anteriormente e 17 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 5 mL de água. 0 filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 0,4 mL (0, 004 mol) de 20 hidróxido de sódio a 30% sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 3 g de cloreto de sódio. Após a dissolução adicionam-se ao meio reaccional 21 mL de metanol. Após 15 minutos de agitação adicionam-se 44 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 45 minutos a uma temperatura próxima de 5 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (90 mL). Adicionam-se 90 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (80 mL). Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 1,31 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 66%.
Purificação:
Introduzem-se 1,3 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 13 mL de água destilada num erlenmeyer de 50 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 + 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,07 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 21 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 2 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 14 mL de metanol. A solução é, em seguida, arrefecida a 10 °C e agitada durante cerca de 15 minutos. Adicionam-se então 36 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante cerca de 15 minutos. 0 sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (50 mL) . Adicionam-se 50 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 25 minutos. 0 sobrenadante é recolhido e reservado (50 mL). O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 1,13 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 87%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2600 Daltons
Actividade anti-Xa: 177 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,5 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 118 22 EXEMPLO 2
Despolimerização e transformação em sal de sódio (0,2%)
Introduzem-se 70 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente 10 g (0,006 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A sob agitação e pressão de azoto. O teor de águado meio reaccional é ajustado para 0,2%. Após a dissolução completa, adicionam-se 1,75 mL (0,006 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-l,2,3-diaza-fosforina. Agita-se durante 24 horas a uma temperatura próxima de 20 °C. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 30 g de acetato de sódio anidro em 300 mL de metanol. Após a dissolução completa adicionam-se 5 g de celite Hyflo supercel à solução. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após 5 minutos de agitação deixa-se decantar a suspensão durante 2 horas. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (220 mL) . Adicionam-se 220 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 2 horas. O sobrenadante é recolhido e reservado (230 mL). Adicionam-se 230 mL de metanol ao precipitado sedimentado. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 150 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 2,63 g de heparina em bruto despolimerizada em celite (5 g). O rendimento obtido é de 67%. 23
Saponificação:
Introduzem-se 2,5 g (0,0038 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em celite (5 g) obtido anteriormente e 18 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 5 mL de água. O filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 0,4 mL (0, 004 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 2 g de cloreto de sódio. Vertem-se 14 mL de metanol na mistura de reacção. Após 15 minutos de agitação adicionam-se 36 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 45 minutos a uma temperatura próxima de 5 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (80 mL) . Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 48 horas de secagem, obtêm-se 2,3 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio) . O rendimento obtido é de 65%.
Purificação:
Introduzem-se 1,4 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 15 mL de água destilada num erlenmeyer de 50 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. 24
Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 ym e adicionam-se 0,07 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 40 °C a mistura é arrefecida a uma temperatura próxima de 20 °C depois neutralizada por adição de HC1 1 N. Adicionam-se a 2 g de cloreto de sódio ao meio reaccional. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 ym, depois vertem-se 14 mL de metanol. A solução é, em seguida, arrefecida a 10 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 36 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 15 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (40 mL) . Adicionam-se 40 mL de metanol ao precipitado sedimentado (aspecto de pasta) e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (50 mL) . O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa) , a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 1,2 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 86%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2650 Daltons
Actividade anti-Xa: 161 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,4 Ul/mg 25
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 115 EXEMPLO de referência 3
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 0,3%)
Introduzem-se 70 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se 10 g (0,006 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A sob agitação e pressão de azoto. O teor de águado meio reaccional é ajustado para 0,3%. Após a dissolução completa, adicionam-se 1,75 mL (0,006 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-l,2,3-diaza-fosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 30 g de acetato de sódio anidro em 300 mL de metanol. Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 5 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após 5 minutos de agitação, deixa-se decantar a suspensão durante 1 hora 10 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (220 mL). Adicionam-se 220 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 100 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 2,57 g de sal de sódio 26 de heparina despolimerizada em bruto em celite (5 g). 0 rendimento obtido é de 66%.
Saponificação:
Introduzem-se 2,5 g (0,0038 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (5 g) obtido anteriormente e 18 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 5 mL de água. O filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 0,4 mL (0,004 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 3 g de cloreto de sódio. Vertem-se 15 mL de metanol na mistura de reacção. Após 15 minutos de agitação, adicionam-se 36 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 1 hora. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (70 mL) . Adicionam-se 70 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa) , a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 48 horas de secagem, obtêm-se 1,42 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 62%. 27
Purificação:
Introduzem-se 1,4 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 14 mL de água destilada num erlenmeyer de 50 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,07 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 2 g de cloreto de sódio. Após a dissolução a
solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 14 mL de metanol. O filtrado é, em seguida, arrefecido a 10 °C e agitado durante 15 minutos. Adicionam-se então 36 mL de metanol, depois agita-se durante cerca de uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 40 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (50 mL). Adicionam-se 50 mL de metanol ao precipitado sedimentado (aspecto de pasta) e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 25 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 1,24 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 89%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2400 Daltons 28
Actividade anti-Xa: 132 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,4 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 94 EXEMPLO de referência 4
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 0,4%):
Introduzem-se 70 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 10 g (0,006 mol) de éster benzilico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. O teor de água do meio reaccional é ajustado para 0,4%. A solução é aguecida a 30 °C sob azoto. Após a dissolução completa, retorna-se a uma temperatura próxima de 20 °C depois adicionam-se 1, 75 mL (0,006 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 30 g de acetato de sódio anidro em 300 mL de metanol. Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 5 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante cerca de 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após 5 minutos de agitação, deixa-se decantar a suspensão durante 2 horas. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (80 mL) . Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 29 1 hora. 0 sobrenadante é recolhido e reservado (80 mL) .
Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 150 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa) , a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 3,25 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (5 g) . O rendimento obtido é de 83%.
Saponificação:
Introduzem-se 3,1 g (0,0018 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g) obtido anteriormente e 21 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 6 mL de água. O filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 0,7 mL (0, 007 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 4 g de cloreto de sódio. Vertem-se 28 mL de metanol na mistura de reacção. Após 15 minutos de agitação, adicionam-se 72 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 1 hora. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (90 mL) . Adicionam-se 90 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (90 mL) . Adicionam-se 90 mL de metanol ao 30 precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. 0 bolo obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 48 horas de secagem, obtêm-se 1,9 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 67%.
Purificação:
Introduzem-se 1,9 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 19 mL de água destilada num erlenmeyer de 50 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,1 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 2 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 14 mL de metanol e agita-se durante 15 minutos. Adicionam-se então 36 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 15 minutos. 0 sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (40 mL). Adicionam-se 40 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (50 mL). Adicionam-se 500 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. A 31 suspensão é, em seguida, filtrada através de vidro sinterizado 3. 0 bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 72 horas de secagem, obtêm-se 1,56 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 82%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2350 Daltons
Actividade anti-Xa: 122 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,3 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 94 EXEMPLO de referência 5
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 0,57%) :
Introduzem-se 140 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 20 g (0,019 mol) de éster benzilico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. O teor de água do meio reaccional é ajustado para 0,57%. Após a dissolução completa, adicionam-se 3,5 mL (0,012 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetil-per-hidro-l,2,3-diaza-fosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. 32
Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g de acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 10 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 5 minutos de agitação deixa-se decantar a suspensão durante 30 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL). Adicionam-se 400 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 1 hora. 0 sobrenadante é recolhido e reservado (420 mL). Adicionam-se 420 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. A suspensão é, em seguida, filtrada através de vidro sinterizado 3. 0 bolo obtido é, em seguida, lavado com 200 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 6,66 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g). O rendimento obtido é de 85%.
Saponificação:
Introduzem-se 6,66 g (0,0101 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g) obtido anteriormente e 47 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 15 mL de água. O filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 1,1 mL (0,011 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 5 °C. Após a adição, a mistura é agitada 33 durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 9,5 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 66 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação, adicionam-se 171 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 3/4 de hora a uma temperatura próxima de 5 °C. 0 sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (160 mL) . Adicionam-se 160 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (180 mL) . Adicionam-se 180 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. A suspensão é, em seguida, filtrada através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado 2 vezes com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 4,53 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 74%.
Purificação:
Introduzem-se 4,53 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 45 mL de água destilada num erlenmeyer de 100 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,25 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 5,5 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 38 mL de metanol 34 a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 100 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 20 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (90 mL) . Adicionam-se 90 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 25 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (100 mL). O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 3,7 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). 0 rendimento obtido é de 82%. as caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2200 Daltons
Actividade anti-Xa: 120 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,4 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 86 35 EXEMPLO de referência 6
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 1/8%) :
Introduzem-se 140 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 20 g (0,019 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. O teor de água do meio reaccional é ajustado para 1,8%. Após a dissolução completa, adicionam-se 3,5 mL (0,012 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-l,2,3-diaza-fosforina.
Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 10 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 5 minutos de agitação, deixa-se decantar a suspensão durante 30 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL). Adicionam-se 400 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 1 hora. O sobrenadante é recolhido e reservado (420 mL) . Adicionam-se 420 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 200 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa) , a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 36 7,54 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g). O rendimento obtido é de 96%.
Saponificação:
Introduzem-se 7,54 g (0,0101 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g) obtido anteriormente e 53 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A solução é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada com 2 vezes 15 mL de água. 0 filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 1,25 mL (0,012 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 10,5 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 70 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação, adicionam-se 190 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 3/4 de hora a uma temperatura próxima de 4 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (180 mL). Adicionam-se 180 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (180 mL) . Adicionam-se 180 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 2 vezes 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 5,53 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 80%. 37
Purificação:
Introduzem-se 5,53 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 55 mL de água destilada num erlenmeyer de 100 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,31 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 7 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 49 mL de metanol a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 126 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 20 minutos. 0 sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (105 mL) . Adicionam-se 105 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 25 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (110 mL) . O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. 0 bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 5 0 mL de metanol. 0 sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 55 °C. Após 18 horas de secagem , obtêm- -se 4,53 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 82%.
As características da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2600 Daltons 38
Actividade anti-Xa: 105 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 3,1 UI/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 34 EXEMPLO de referência 7
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 2,5%):
Introduzem-se 140 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 20 g (0,019 mol) de éster benzilico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. O teor de água do meio reaccional é ajustado para 2,5%. Após a dissolução completa, adicionam-se 3,5 mL (0,012 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-l,2,3-diaza-fosforina.
Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g de acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 10 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 5 minutos de agitação, deixa-se decantar a suspensão durante 1 hora. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL) . Adicionam-se 400 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL) . O precipitado em 39 suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. 0 bolo obtido é, em seguida, lavado com 200 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 7,78 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g). O rendimento obtido é de 99,6%.
Saponificação:
Introduzem-se 7,78 g (0,0119 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g) obtido anteriormente e 79 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 15 mL de água. 0 filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 1,3 mL (0,012 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitaçao magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 10 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 60 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação, adicionam-se 190 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 3/4 de hora a uma temperatura próxima de 4 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (180 mL) . Adicionam-se 180 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (180 mL) . Adicionam-se 180 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de 40 vidro sinterizado 3. 0 bolo obtido é, em seguida, lavado com 2 vezes 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 5,87 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 82%.
Purificação:
Introduzem-se 5,87 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 59 mL de água destilada num erlenmeyer de 100 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 ym e adicionam-se 0,34 mL de uma solução aguosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 7 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 ym, depois vertem-se 49 mL de metanol a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 126 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora, a agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 20 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (105 mL) . Adicionam-se 105 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 25 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (110 mL) . 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão 41 reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 55 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 5,21 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). 0 rendimento obtido é de 89%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 3550 Daltons
Actividade anti-Xa: 99 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 13,4 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 7.4 EXEMPLO de referência 8
Despolimerização e transformação em sal de sódio (0,5 equivalentes de base):
Introduzem-se 140 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 20 g (0,019 mol) de éster benzilico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. Após a dissolução completa a uma temperatura próxima de 30 °C e regresso a uma temperatura de cerca de 20 °C, adicionam-se 1,75 mL (0,006 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-1,2,3- diazafosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g de acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida numa 42 solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 1 hora de agitação deixa-se decantar a suspensão durante 2 horas. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (420 mL). Adicionam-se 420 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 18 horas. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL) . Adicionam-se 400 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (400 mL) . O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado 2 vezes com 100 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 60 °C. Após secagem, obtêm-se 5,7 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto. O rendimento obtido é de 73%.
Saponificação:
Introduzem-se 5,7 g (0,0086 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 53 mL de água num erlenmeyer de 100 mL. Introduzem-se 0,93 mL (0,009 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 6 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 42 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação adicionam-se 108 mL de metanol, depois agita-se durante 30 minutos. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 30 minutos a uma temperatura próxima de 4 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado 43 (180 mL) . Adicionam-se 180 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (170 mL) . Adicionam-se 170 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 2 vezes 30 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida, a uma temperatura próxima de 60 °C. Após secagem, obtêm-se 3,5 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). 0 rendimento obtido é de 67,4%.
Purificação:
Introduzem-se 3,5 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 35 mL de água destilada num erlenmeyer de 100 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,6 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,18 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 3,6 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 27 mL de metanol a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 65 mL de metanol, depois agita-se durante 30 minutos. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 30 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (80 mL) . Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. Deixa-se 44 ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (70 mL). Adicionam-se 70 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 2 vezes 30 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida, a uma temperatura próxima de 60 °C. Após secagem, obtêm-se 2,8 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio) . O rendimento obtido é de 80%.
As características da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2900 Daltons
Actividade anti-Xa: 146,1 Ul/mg Actividade anti-IIa: 5,1 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 28,6 EXEMPLO 9
Despolimerização e transformação em sal de sódio (0,6 equivalentes de base):
Introduzem-se 280 mL de diclorometano num balão A de três entradas. Aplicam-se lentamente sob agitação 40 g (0,024 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. Após a 45 dissolução completa a uma temperatura próxima de 30 °C e regresso a uma temperatura próxima de 20 °C, adicionam-se 4,2 mL (0,014 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g de acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. Metade da mistura de reacção do balão A de três entradas é vertida uma solução metanólica de acetato de sódio a uma temperatura próxima de 4 °C, sob agitação magnética. Após 1 hora de agitação deixa-se decantar a suspensão. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (310 mL). Adicionam-se 310 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 1 hora. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 18 horas. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL) . Adicionam-se 400 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 1 hora. O sobrenadante é recolhido e reservado (300 mL) . O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 2 vezes 100 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida, a uma temperatura próxima de 60 °C. Após secagem, obtêm-se 6 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto. O rendimento obtido é de 77%.
Saponificação:
Introduzem-se 6 g (0,0091 mol) de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio) anteriormente obtido e 56 mL de água num erlenmeyer de 250 mL. Introduz-se 1 mL (0,010 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 46 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 6,4 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 45 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação adicionam-se 115 mL de metanol, depois agita-se durante 30 minutos. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 30 minutos a uma temperatura próxima de 4 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (170 mL) . Adicionam-se 170 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (140 mL). Adicionam-se 140 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado 2 vezes com 30 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida, a uma temperatura próxima de 60 °C. Após secagem, obtêm-se 3,6 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 65,3%.
Purificação:
Introduzem-se 3,5 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 35 mL de água destilada num erlenmeyer de 100 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,6 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 ym e adicionam-se 0,18 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C, a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 3,5 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 ym, depois vertem-se 25 mL de metanol 47 a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 63 mL de metanol, depois agita-se durante 30 minutos. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 30 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (70 mL). Adicionam-se 70 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante alguns minutos. A suspensão é, em seguida, filtrada através de vidro sinterizado 3. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado 2 vezes com 30 mL de metanol. 0 sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida, a uma temperatura próxima de 60 °C. Após secagem, obtêm-se 2,5 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 71,4%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2600 Daltons
Actividade anti-Xa: 150,5 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 3,2 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 47 48 EXEMPLO 10
Despolimerização e transformação em sal de sódio (0,8 equivalentes de base):
Introduzem-se 70 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 10 g (0,006 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. Após a dissolução completa a uma temperatura próxima de 30 °C e regresso a uma temperatura próxima de 20 °C, adicionam-se 1,38 mL (0,004 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l,3-dimetilper-hidro-l,2,3- diazafosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 30 g de acetato de sódio anidro em 300 mL de metanol. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min 15 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 5 minutos de agitação, deixa-se decantar a suspensão durante 1 hora. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (190 mL). ao precipitado sedimentado Adicionam-se 190 mL de metanol e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (190 mL). Adicionam-se 190 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. 0 sobrenadante é recolhido e reservado (190 mL) . O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 150 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 3,05 g de 49 heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). 0 rendimento obtido é de 80%.
Saponificação:
Introduzem-se 3,05 g (0,0048 mol) de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio) anteriormente obtido e 21 mL de água num erlenmeyer de 100 mL. A solução é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 6 mL de água. O filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 0,6 mL (0, 006 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 4 g de cloreto de sódio. Adiciona-se 28 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação adicionam-se 72 mL de metanol, depois agita-se durante 1 hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 30 minutos a uma temperatura próxima de 4 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (80 mL). Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (80 mL). Adicionam-se 80 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 30 minutos. 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após secagem, obtêm-se 1,6 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 57%. 50
Purificação:
Introduzem-se 1,6 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 16 mL de água destilada num erlenmeyer de 50 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,6 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. 0 meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,08 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 2 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 14 mL de metanol a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 36 mL de metanol, depois agita-se durante 1 hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 30 minutos. 0 sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (50 mL) . Adicionam-se 50 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (50 mL) . O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após secagem, obtêm-se 1,25 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 78%.
As características da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2400 Daltons 51
Actividade anti-Xa: 154,3 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,6 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 96,4 EXEMPLO 11
Despolimerização e transformação em sal de sódio:
Introduzem-se 140 mL de diclorometano num erlenmeyer A. Aplicam-se lentamente sob agitação 20 g (0,019 mol) de éster benzílico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. Após a dissolução completa a uma temperatura próxima de 40 °C e regresso a uma temperatura próxima de 20 °C, adicionam-se 3,5 mL (0,011 mol) de terc-butilimino-tri(pirrolidino)fosforano. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g de acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. Após a dissolução completa adiciona-se à solução 10 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante 1 min e 30 segundos numa solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 5 minutos de agitação deixa-se decantar a suspensão durante 30 minutos. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (400 mL) . Adicionam-se 400 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 1 hora 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (250 mL) . Adicionam-se 250 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 52 5 minutos. 0 precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. 0 bolo obtido é, em seguida, lavado com 200 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após secagem, obtêm-se 5,39 g de heparina despolimerizada (éster benzilico, sal de sódio). O rendimento obtido é de 69%.
Saponificação:
Introduzem-se 5 g (0,0076 mol) de heparina despolimerizada (éster benzilico, sal de sódio) anteriormente obtido e 35 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A solução é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 2 vezes com 10 mL de água. O filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 250 mL. Introduz-se 1 mL (0,01 mol) de hidróxido de sódio a 30%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 2 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 6 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 42 mL de metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação adicionam-se 104 mL de metanol, depois agita-se durante 15 minutos. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 1 hora a uma temperatura próxima de 4 °C. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (140 mL) . Adicionam-se 140 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 45 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (160 mL) . Adicionam-se 160 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, 53 lavado com 100 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 48 horas de secagem, obtêm-se 2,7 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 59%.
Purificação:
Introduzem-se 2,6 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 25 mL de água destilada num erlenmeyer de 50 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 pm e adicionam-se 0,15 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 3 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 pm, depois vertem-se 21 mL de metanol a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 54 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 20 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (50 mL) . Adicionam-se 50 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 20 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (50 mL). O precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 3. 0 bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, 54 obtêm-se 2,35 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). 0 rendimento obtido é de 90%.
As caracteristicas da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2400 Daltons Actividade anti-Xa: 167,5 Ul/mg Actividade anti-IIa: 1,1 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 152 EXEMPLO 12
Despolimerização e transformação em sal de sódio (água a 0,05%):
Introduzem-se 140 mL de diclorometano num erlenmeyer. Aplicam-se lentamente sob agitação 20 g (0,019 mol) de éster benzilico de heparina (proporção de esterificação: 75%, sal de benzetónio) obtido como descrito no exemplo A. Adicionam-se 20 g de crivo molecular 4 A ao meio reaccional e o teor de água é levado a 0,05% agitando lentamente durante 48 h. 0 sobrenadante é transferido sob atmosfera inerte para um erlenmeyer A. Após a dissolução completa, adicionam-se 3,5 mL (0,012 mol) de 2-terc-butilimino-2-dietilamino-1,3-dimetilper-hidro-1,2,3-diaza-fosforina. Agita-se a uma temperatura próxima de 20 °C, durante 24 horas. Durante esse tempo, prepara-se num erlenmeyer B, uma solução de 60 g de acetato de sódio anidro em 600 mL de metanol. 55
Após a dissolução completa, adicionam-se à solução 10 g de celite Hyflo supercel. A mistura de reacção do erlenmeyer A é vertida durante cerca de 2 minutos numa solução metanólica de acetato de sódio, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após 15 minutos de agitação deixa-se decantar a suspensão durante 1 hora. A parte límpida do sobrenadante é recolhida e reservada (420 mL) . Adicionam-se 420 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 15 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 1 hora. O sobrenadante é recolhido e reservado (450 mL). Adicionam-se 450 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 15 minutos. A suspensão é, em seguida, filtrada através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 200 mL de metanol. O sólido húmido amarelo claro é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 16 horas de secagem, obtêm-se 5,36 g de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g) . O rendimento obtido é de 68,6%.
Saponificação:
Introduzem-se 5,36 g (0,00817 mol) de sal de sódio de heparina despolimerizada em bruto em celite (10 g) obtido anteriormente e 50 mL de água num erlenmeyer de 50 mL. A suspensão é filtrada através de vidro sinterizado 3 e lavada 4 vezes com 15 mL de água. 0 filtrado obtido é aplicado num erlenmeyer de 150 mL. Introduzem-se 1,01 mL (0,0122 mol) de hidróxido de sódio a 35%, sob agitação magnética, a uma temperatura próxima de 4 °C. Após a adição, a mistura é agitada durante 3 horas. Neutraliza-se a solução por adição de HC1 1 N e adicionam-se 11 g de cloreto de sódio. Adicionam-se 77 mL de 56 metanol ao meio reaccional. Após 15 minutos de agitação, adicionam-se 200 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 1 hora a uma temperatura próxima de 4 °C. 0 sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (240 mL) . Adicionam-se 240 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 10 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. 0 sobrenadante é recolhido e reservado (225 mL). Adicionam-se 225 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 10 minutos. A suspensão é, em seguida, filtrada através de vidro sinterizado 3. O bolo obtido é, em seguida, lavado com 2 vezes 50 mL de metanol. O sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 40 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 2,65 g de heparina despolimerizada em bruto (sal de sódio). O rendimento obtido é de 53,7%.
Purificação:
Introduzem-se 2,65 g de heparina despolimerizada em bruto obtida anteriormente e 26,5 mL de água destilada num erlenmeyer de 100 mL. A mistura é levada a 40 °C sob agitação magnética. Leva-se o pH a 9,7 ± 0,1 por adição de hidróxido de sódio 1 N. O meio reaccional é filtrado por membrana 0,45 ym e adicionam-se 0,25 mL de uma solução aquosa de peróxido de hidrogénio a 30%. Após cerca de 2 horas de agitação, a uma temperatura próxima de 20 °C a mistura é neutralizada por adição de HC1 1 N, depois adicionam-se 3 g de cloreto de sódio. A solução é, em seguida, filtrada por membrana 0,45 ym, depois vertem-se 21 mL de metanol a uma temperatura próxima de 10 °C. A solução é, em seguida, 57 levada a 20 °C e agitada durante 15 minutos. Adicionam-se então 54 mL de metanol, depois agita-se durante uma hora. A agitação é então terminada e deixa-se sedimentar a suspensão durante 45 minutos. O sobrenadante é, em seguida, recolhido e depois reservado (46 mL) . Adicionam-se 46 mL de metanol ao precipitado sedimentado e agita-se durante 5 minutos. Deixa-se ressedimentar o precipitado durante cerca de 30 minutos. O sobrenadante é recolhido e reservado (50 mL) . São adicionados 50 mL de metanol e o precipitado em suspensão é, em seguida, filtrado através de vidro sinterizado 4. O bolo branco obtido é, em seguida, lavado com 2 porções de 10 mL de metanol. 0 sólido húmido é enxugado, depois seco sob pressão reduzida (6 kPa), a uma temperatura próxima de 50 °C. Após 18 horas de secagem, obtêm-se 2,363 g de heparina despolimerizada pura (sal de sódio). O rendimento obtido é de 89,1%.
As características da heparina despolimerizada assim obtida são as seguintes:
Peso molecular médio: 2500 Daltons
Actividade anti-Xa: 192 Ul/mg
Actividade anti-IIa: 1,3 Ul/mg
Proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa: 148 Lisboa, 8 de Maio de 2012 58

Claims (31)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Misturas de oligossacáridos sulfatados possuindo a estrutura geral de polissacáridos constitutivos da heparina e apresentando as caracteristicas seguintes: - têm um peso molecular médio de 2000 a 3000 daltons, - têm uma actividade anti-Xa > 150 Ul/mg e < 200 Ul/mg, - têm uma actividade anti-IIa inferior a 10 Ul/mg, têm uma proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa superior a 30, - os oligossacáridos constitutivos das misturas: - contêm 2 a 26 motivos sacaridicos, - uma motivo ácido urónico-4,5 insaturado 2-O-sulfato numa das suas extremidades, - contêm uma fracção hexassacarídica representando 15 a 25% das misturas de oligossacáridos, - contêm de 8 a 15% do hexassacárido AlIa-IIs^-Is na fracção hexassacarídica 1 Na O
    OH Alia lis Is e estão sob a forma de um sal de metal alcalino ou alcalino-terroso.
  2. 2. Mistura de oligossacáridos de acordo com a reivindicação 1 caracterizada por o sal de metal alcalino ou alcalino-terroso ser seleccionado de sais de sódio, potássio, cálcio e magnésio.
  3. 3. Mistura de oligossacáridos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada por esta ter actividade anti-IIa inferior a 5 Ul/mg.
  4. 4. Misturas de oligossacáridos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas por estas apresentarem uma proporção actividade anti-Xa/actividade anti-IIa superior a 50.
  5. 5. Misturas de oligossacáridos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadas por estas terem um peso molecular médio compreendido entre 2400 e 2650 Da. 2
  6. 6. Mistura de oligossacáridos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por esta apresentar uma actividade anti-Xa > 150 Ul/mg e < 200 Ul/mg, uma actividade anti-IIa compreendida entre 0,5 e 3,5 Ul/mg e um peso molecular médio compreendido entre 2400 e 2650 Da.
  7. 7. Processo de preparação de misturas de oligossacáridos, tais como definidas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, durante o qual se despolimeriza o sal de amónio quaternário do éster benzílico da heparina em meio orgânico na presença de uma base orgânica forte com pKa superior a 20, caracterizado por a base orgânica utilizada consistir na família dos fosfazenos contendo uma percentagem de água inferior a 0,3%.
  8. 8. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 7 de misturas de oligossacáridos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o teor de água ser inferior a 0,2%.
  9. 9. Processo de preparação de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado por o sal de amónio quaternário do éster benzílico da heparina ser sal de benzetónio, cetilpiridínio ou cetiltrimetilamónio.
  10. 10. Processo de preparação de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado por as bases da família de fosfazenos serem as de fórmula: 3 R1 R2
    N—R6 R7 / em que os radicais Ri a R7 são idênticos ou diferentes e representam radicais alquilo lineares ou ramificados contendo de 1 a 6 átomos de carbono.
  11. 11. Processo de preparação de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por a base da família dos fosfazenos utilizada durante a etapa de despolimerização ser 2-terc-butilimino-2-dietilamino-l, 3-dimetilper-hidro-l, 2,3-diazafosforina ou terc-butilimino-tri(pirrolidino)- fosforano.
  12. 12. Processo de preparação de acordo com as reivindicações 7 ou 8 caracterizado por a proporção em mole de base forte/éster estar compreendida entre 0,2 e 5.
  13. 13. Processo de preparação de acordo com as reivindicações 7 ou 8, no qual se realizam as operações seguintes: a) Transalificaçao da heparina de sódio por acção de cloreto de benzetónio, b) Esterificação do heparinato de benzetónio obtido por acção de cloreto de benzilo, c) Transalificação do éster benzílico obtido e obtenção do sal de amónio quaternário, 4 d) Despolimerização do sal de amónio quaternário do éster benzílico da heparina pelo método, tal como definido na reivindicação 7 ou 8, e) Transformação do sal de amónio quaternário em sal de sódio, f) Eventualmente saponificação da heparina por acção de uma base, g) Eventualmente purificação.
  14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a reacção da etapa a) ser realizada por acção de cloreto de benzetónio em excesso, em heparina sódica, a uma temperatura próxima de 15 a 25 °C com uma proporção molar sal/heparina sódica compreendida entre 3 e 4.
  15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a esterificação da etapa b) ser realizada no seio de um solvente orgânico clorado a uma temperatura compreendida entre 25 e 45 °C e o éster sob a forma de sal de sódio ser, em seguida, recuperado por precipitação utilizando acetato de sódio a 10% em peso num álcool numa proporção de 1 a 1,2 volumes de álcool por volume de meio reaccional.
  16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 13 ou 15, caracterizado por a proporção de esterificação do sal de amónio quaternário do éster benzílico da heparina estar compreendida entre 50 e 100%. 5
  17. 17. Processo de acordo com as reivindicações 13, 15 ou 16, caracterizado por serem utilizadas 0,5 a 1,5 partes em peso de cloreto de benzilo por 1 parte em peso de sal de benzetónio de heparina com um tempo de reacção que irá estar compreendido entre 10 e 35 h.
  18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a transalificação da etapa c) ser realizada utilizando um cloreto de amónio quaternário em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 10 e 25 °C.
  19. 19. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a proporção molar de cloreto de amónio quaternário/sal de sódio do éster benzilico da heparina estar compreendida entre 2 e 3.
  20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a transformação em sal de sódio do sal de amónio quaternário do éster benzilico da heparina despolimerizada (etapa E) ser realizada por tratamento do meio reaccional com uma solução alcoólica de acetato de sódio, a uma temperatura compreendida entre 15 e 25 °C.
  21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por a saponificação (etapa f) ser realizada utilizando um hidróxido de metal alcalino em meio aquoso, a uma temperatura compreendida entre 0 e 20 °C.
  22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por serem utilizados 1 a 5 equivalentes molares de hidróxido de metal alcalino. 6
  23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por se purificar (etapa g) utilizando peróxido de hidrogénio, em meio aquoso, a uma temperatura de 10 a 50 °C.
  24. 24. Medicamento contendo as misturas de oligossacáridos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
  25. 25. Medicamento de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por este apresentar uma actividade antitrombótica.
  26. 26. Medicamentos de acordo com as reivindicações 24 ou 25 para a prevenção ou tratamento de tromboses venosas e arteriais, trombose venosa profunda, embolia pulmonar, angina instável, enfarte do miocárdio, isquemia cardíaca, doenças oclusivas das artérias periféricas, fibrilhação auricular, proliferação das células musculares lisas, aterosclerose e a arteriosclerose, cancro por modulação da angiogénese e dos factores de crescimento e distúrbios diabéticos.
  27. 27. Composições farmacêuticas contendo, pelo menos, um medicamento tal como definido na reivindicação 24, e um ou mais excipientes ou veículos ou aditivos farmaceuticamente inertes.
  28. 28. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 27, caracterizadas por estas consistirem em soluções injectáveis por via subcutânea ou intravenosa.
  29. 29. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 27, caracterizadas por estas consistirem numa formulação para inalação destinada à via pulmonar. 7
  30. 30. Composições farmacêuticas de acordo com a reivindicação 27, caracterizadas por estas consistem numa formulação para uma administração destinada à via oral.
  31. 31. Misturas de oligossacáridos sulfatados de acordo com a reivindicação 1, susceptiveis de serem obtidas pelo processo tal como definido na reivindicação 13. Lisboa, 8 de Maio de 2012 8
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