JP5021898B2 - ヘパリン誘導多糖類混合物、その製造およびそれを含有する医薬組成物 - Google Patents
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Description
− 平均分子量1500〜3000ダルトン、抗Xa活性120〜200IU/mg、
抗IIa活性10IU/mg未満、および、抗Xa活性/抗IIa活性の比30超を有し、
− 混合物の構成成分であるオリゴ糖が、糖単位2〜26個を含み、その末端の一方において4,5−不飽和ウロン酸2−O−硫酸単位を有し、下記式:
を有する硫酸化オリゴ糖の混合物である。
G3000 XLおよびTSK G2000 XLの商品名の元に販売されているものを使用して測定する。検出は屈折率測定法により行う。使用する溶離剤は硝酸リチウムであり、流量は0.6ml/分である。系はアガロースポリアクリルアミドゲル(IBF)上のクロマトグラフィーによりエノキサパリン(ABENTIS)の分画により製造した標準物質を用いて補正する。この製造はBarrowcliffe et al.,Thromb.Res.,12,27−36(1977−78)またはD.A.Lane et al.,Thromb.Res.,12,257−271(1977−78)に記載の手法に従って行う。結果はGPC6ソフトウエア(Perkin Elmer)を用いて計算する。
上記した式において、アルキル基は直鎖または分枝鎖の形態の炭素原子1〜6個を含む。
a)塩化ベンゼトニウムの作用によるヘパリンナトリウムの塩転移反応(transalification)、
b)塩化ベンジルの作用によるベンゼトニウムヘパリネートのエステル化、
c)得られたベンジルエステルの第4級アンモニウム塩への塩転移反応、
d)上記した方法によるヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩の脱重合、
e)ナトリウム塩への第4級アンモニウム塩の変換、
f)場合により水酸化ナトリウムのような塩基の作用によるヘパリンのケン化、
g)場合により特に過酸化水素のような酸化剤の作用による精製、
を包含する上記方法である。
法(例えばEP0037319B1)により精製してよい(工程g)。好ましくは、精製は10〜50℃の温度で水性媒体中過酸化水素を用いて行う。好ましくは、この操作は20〜40℃で行う。
a)ベンゼトニウムヘパリネートを得るための塩化ベンゼトニウムを用いたナトリウム塩の形態へのヘパリンの変換(塩転移)、
b)ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩を得るための、上記の通り得られたベンゼトニウム塩の塩化ベンジルを用いたエステル化および酢酸ナトリウムのアルコール溶液による処理、
c)第4級アンモニウム塩、好ましくはベンゼトニウム、セチルピリジニウムまたはセチルトリメチルアンモニウム塩へのヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩の塩転移、に従って製造してよい。
ベンゼトニウムヘパリネート
水125ml中の塩化ベンゼトニウム25gの溶液を、水100ml中のナトリウム塩の形態のヘパリン10gの溶液に添加した。生成物を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。
塩化ベンジル16mlを塩化メチレン80ml中のベンゼトニウムヘパリネート20gの溶液に添加した。溶液を12時間30℃に加熱した。次にメタノール中酢酸ナトリウムの10%溶液108mlを添加し、混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥した。このようにしてヘパリンのベンジルエステル7.6gが、エステル化度77%のナトリウム塩の形態で得られる。
ヘパリンのベンジルエステル(ナトリウム塩)36g(0.0549モル)および蒸留水540mlを、2Lの三角フラスコAに導入した。約20℃の温度でホモゲナイズした後、淡黄色の溶液が得られた。塩化ベンゼトニウム64.45g(0.1438モル)および水450mlの溶液を1Lの三角フラスコB中に磁気攪拌しながら製造した。三角フラスコB中の溶液を攪拌しながら三角フラスコA中の溶液内に約35分かけて注ぎ込んだ。大量の白色沈殿の形成が観察された。三角フラスコBを蒸留水200mlで洗浄し、洗浄水を三角フラスコA内に導入した。次に攪拌を停止し、懸濁液を12時間沈殿させる。この時間が経過した後、上澄みの透明の部分を除去し、廃棄した。水560mlを沈降した沈殿に添加し(スラリーの発生)、そして混合物を20分間攪拌した。沈殿を約30分再沈殿させる。上澄みを除去し廃棄する(560ml)。蒸留水約560mlを用いて洗浄するこの操作を、沈降させた沈殿に対して2回反復した。最後の洗浄操作において、沈殿が懸濁液中に残存し、これをNo.3焼結ガラスで濾過した。次にケーキを蒸留水200mlで4回洗浄した。湿潤した白色固体を、排水してから60℃程度の温度で減圧下(2.7kPa)に乾燥した。12時間乾燥後、ベンジルヘパリネート、ベンゼトニウム塩87.5gを得た。収率94.9%が得られた。
4−デオキシ−α−L−スレオ−ヘキセンピラノシル−ウロン酸−(1→4)−2−デオキシ−2−アセトアミド−6−O−スルホ−α−D−グルコピラノシル−(1→4)−β−D−グルコピラノシルウロン酸−(1→4)−2−デオキシ−2−スルファミド−3,6−ジ−O−スルホ−α−D−グルコピラノシル)−(1→4)−2−O−スルホ−α−L−ヨードピラノシルウロン酸−(1→4)−2−デオキシ−2−スルファミド−6−O−スルホ−α−D−グルコピラノース。
− 実施例1〜7および12は重合反応の選択性に対する水分含有量の影響および得られた生成物のaXaおよびaIIa活性を示す。
− 実施例8〜10は得られた生成物のaXaおよびaIIa活性に対する塩基当量数の影響を示す(水分含有量0.1%)。
− 実施例11は2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン以外のホスファゼン塩基の使用:t−ブチルイミノトリ(ピロリジノ)ホスホランの使用を説明する。
ジクロロメタン70mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)10g(0.006モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を0.1%に調節した。溶液を窒素下40℃に加熱した。完全に溶解した後、溶液を20℃程度の温度に冷却し、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン1.75ml(0.006モル)を添加した。得られた混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール300ml中の無水酢酸ナトリウム30gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト5gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら5℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を1時間30分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(220ml)。メタノール220mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約1時間20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(250ml)。メタノール250mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール100mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を、排液してから次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(5g)中の脱重合ヘパリンのナトリウム塩2.51gを得た。得られた収率は64%であった。
上記の通り得られたセライト(5g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩2.5g(0.0038モル)および水17mlを50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水5mlで2回洗浄した。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ0.4ml(0.004モル)を5℃程度の温度で磁気攪拌しながら導入した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム3gを添加した。溶解後、メタノール21mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール44mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を5℃程度の温度で45分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(90ml)。メタノール90mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を、廃液してから次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.31gを得た。得られた収率は66%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン1.3gおよび蒸留水13mlを50mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.07mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム2gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次にメタノール14mlを注ぎ込んだ。次に溶液を10℃に冷却し、そして約15分間攪拌した。次にメタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を約15分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。メタノール50mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約25分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を、排液してから次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.13gを得た。得られた収率は87%であった。
平均分子量:2600ダルトン
抗Xa活性:177IU/mg
抗IIa活性:1.5IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:118
ジクロロメタン70mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)10g(0.006モル)を窒素気圧下に攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を0.2%に調節した。完全に溶解した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン1.75ml(0.006モル)を添加した。得られた混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール300ml中の無水酢酸ナトリウム30gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト5gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を磁気攪拌しながら5℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を2時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(220ml)。メタノール220mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を2時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(230ml)。メタノール230mlを沈降した沈殿に添加し。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール150mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(5g)中の粗製の脱重合ヘパリンの2.63gを得た。得られた収率は67%であった。
上記の通り得られたセライト(5g)中の脱重合ヘパリンのナトリウム塩2.5g(0.0038モル)および水18mlを50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水5mlで2回洗浄した。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ0.4ml(0.004モル)を5℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム2gを添加した。メタノール14mlを反応混合物に注ぎ込んだ。15分間攪拌の後、メタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を5℃程度の温度で45分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。48時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.3gを得た。得られた収率は65%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン1.4gおよび蒸留水15mlを50mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.07mlを添加した。40℃程度の温度で約2時間攪拌した後、混合物を20℃程度の温度に冷却し、次に1NHClを添加することにより混合物を中和した。塩化ナトリウム2gを反応混合物に添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次にメタノール14mlを注ぎ込んだ。次に溶液を10℃に冷却し、そして15分間攪拌した。次にメタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を約15分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(40ml)。メタノール40mlを沈降した沈殿に添加し(スラリー発生)、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.2gを得た。得られた収率は86%であった。
平均分子量:2650ダルトン
抗Xa活性:161IU/mg
抗IIa活性:1.4IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:115
ジクロロメタン70mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)10g(0.006モル)を窒素気圧下に攪拌しながら添加した。反応媒体の水分含有量を0.3%に調節した。完全に溶解した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン1.75ml(0.006モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール300ml中の無水酢酸ナトリウム30gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト5gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を磁気攪拌しながら5℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を1時間10分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(220ml)。メタノール220mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール100mlで洗浄した。湿潤固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(5g)中のナトリウム塩として粗製の脱重合ヘパリン2.57gを得た。得られた収率は66%であった。
上記の通り得られたセライト(5g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩2.5g(0.0038モル)および水18mlを50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水5mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ0.4ml(0.004モル)を5℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム3gを添加した。メタノール15mlを反応混合物に注ぎ込んだ。15分間攪拌の後、メタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を1時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(70ml)。メタノール70mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。48時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.42gを得た。得られた収率は62%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン1.4gおよび蒸留水14mlを50mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.07mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム2gを添加した。溶解後、次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次にメタノール14mlを注ぎ込んだ。次に濾液を10℃に冷却し、そして15分間攪拌した。次にメタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を40分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。メタノール50mlを沈降した沈殿に添加し(スラリー発生)、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約25分間放置して再沈降させた。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.24gを得た。得られた収率は89%であった。
平均分子量:2400ダルトン
抗Xa活性:132IU/mg
抗IIa活性:1.4IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:94
ジクロロメタン70mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)10g(0.006モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を0.4%に調節した。溶液を窒素下30℃に加熱した。完全に溶解した後、混合物を20℃程度の温度に冷却し、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン1.75ml(0.006モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール300ml中の無水酢酸ナトリウム30gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト5gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら5℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を2時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約1時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール150mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(5g)中のナトリウム塩として粗製の脱重合ヘパリン3.25gを得た。得られた収率は83%であった。
上記の通り得られたセライト(10g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩3.1g(0.0018モル)および水21mlを、50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水6mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ0.7ml(0.007モル)を5℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム4gを添加した。メタノール28mlを反応混合物に注ぎ込んだ。15分間攪拌の後、メタノール72mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を1時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(90ml)。メタノール90mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(90ml)。メタノール90mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。48時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.9gを得た。得られた収率は67%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン1.9gおよび蒸留水19mlを50mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウ
ムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.1mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム2gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次にメタノール14mlを注ぎ込み、そして混合物を15分間攪拌した。次にメタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を約15分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(40ml)。メタノール40mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。メタノール500mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。次に懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。72時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.56gを得た。得られた収率は82%であった。
平均分子量:2350ダルトン
抗Xa活性:122IU/mg
抗IIa活性:1.3IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:94
ジクロロメタン140mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)20g(0.019モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を0.57%に調節した。完全に溶解した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン3.5ml(0.012モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト10gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を30分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。メタノール400mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約1時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(420ml)。メタノール420mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール200mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(10g)中のナトリウム塩として、粗製の脱重合ヘパリン6.66gを得た。得られた収率は85%であった。
上記の通り得られたセライト(10g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩6.66g(0.0101モル)および水47mlを50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水15mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ1.1ml(0.011モル)を5℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム9.5gを添加した。メタノール66mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール171mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を5℃程度の温度で3/4時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(160ml)。メタノール160mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(180ml)。メタノール180mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを2回メタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)4.53gを得た。得られた収率は74%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン4.53gおよび蒸留水45mlを100mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.25mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム5.5gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール38mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール100mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を20分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(90ml)。メタノール90mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約25分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(100ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)3.7gを得た。得られた収率は82%であった。
平均分子量:2200ダルトン
抗Xa活性:120IU/mg
抗IIa活性:1.4IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:86
ジクロロメタン140mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)20g(0.019モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を1.8%に調節した。完全に溶解した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン3.5ml(0.012モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト10gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を30分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。メタノール400mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約1時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(420ml)。メタノール420mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール200mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(10g)中ナトリウム塩として、粗製の脱重合ヘパリン7.54gを得た。得られた収率は96%であった。
上記の通り得られたセライト(10g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩7.54g(0.0101モル)および水53mlを、50mlの三角フラスコに入れた。この溶液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水15mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ1.25ml(0.012モル)を4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム10.5gを添加した。メタノール70mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール190mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で3/4時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(180ml)。メタノール180mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(180ml)。メタノール180mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを2回メタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)5.53gを得た。得られた収率は80%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン5.53gおよび蒸留水55mlを100mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.31mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム7gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール49mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール126mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を20分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(105ml)。メタノール105mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約25分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(110ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に55℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)4.53gを得た。得られた収率は82%であった。
平均分子量:2600ダルトン
抗Xa活性:105IU/mg
抗IIa活性:3.1IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:34
ジクロロメタン140mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)20g(0.019モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を2.5%に調節した。完全に溶解した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン3.5ml(0.012モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト10gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を1時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。メタノール400mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール200mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、セライト(10g)中のナトリウム塩として、粗製の脱重合ヘパリン7.7gを得た。得られた収率は99.6%であった。
上記の通り得られたセライト(10g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩7.78g(0.0119モル)および水79mlを50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水15mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ1.3ml(0.012モル)を4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム10gを添加した。メタノール60mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール190mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で3/4時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(180ml)。メタノール180mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(180ml)。メタノール180mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを2回メタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)5.87gを得た。得られた収率は82%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン5.87gおよび蒸留水59mlを100mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.34mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム7gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール49mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール126mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を20分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(105ml)。メタノール105mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約25分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(110ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に55℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)5.21gを得た。得られた収率は89%であった。
平均分子量:3550ダルトン
抗Xa活性:99IU/mg
抗IIa活性:13.4IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:7.4
ジクロロメタン140mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)20g(0.019モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。30℃程度の温度で完全に溶解させ、そして20℃程度の温度に冷却した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン1.75ml(0.006モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に注ぎ込んだ。1時間攪拌した後、懸濁液を2時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(420ml)。メタノール420mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。沈殿を約18時間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。メタノール400mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。上澄みを分離し、廃棄した(400ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール100mlで2回洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に60℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン5.7gをナトリウム塩として得た。得られた収率は73%であった。
上記の通り得られた粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩5.7g(0.0086モル)および水53mlを100mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ0.93ml(0.009モル)を4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム6gを添加した。メタノール42mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール108mlを添加し、その後30分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で30分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(180ml)。メタノール180mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(170ml)。メタノール170mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを2回メタノール30mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に60℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)3.5gを得た。得られた収率は67.4%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン3.5gおよび蒸留水35mlを100mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.6±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.18mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム3.6gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール27mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール65mlを添加し、その後30分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を30分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(70ml)。メタノール70mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール30mlで2回洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に60℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.8gを得た。得られた収率は80%であった。
平均分子量:2900ダルトン
抗Xa活性:146.1IU/mg
抗IIa活性:5.1IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:28.6
ジクロロメタン280mlを三つ口フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)40g(0.024モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。30℃程度の温度で完全に溶解させ、そして20℃程度の温度に冷却した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン4.2ml(0.014モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。三つ口フラスコA中の反応混合物の半量を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に注ぎ込んだ。1時間攪拌した後、懸濁液を2時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(310ml)。メタノール310mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を1時間攪拌した。沈殿を約18時間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。メタノール400mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を1時間間攪拌した。上澄みを分離し、廃棄した(300ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール100mlで2回洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に60℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン6gをナトリウム塩として得た。得られた収率は77%であった。
上記の通り得られた粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩6g(0.0091モル)および水56mlを250mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ1ml(0.010モル)を4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム6.4gを添加した。メタノール45mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール115mlを添加し、その後30分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で30分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(170ml)。メタノール170mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(140ml)。メタノール140mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを2回メタノール30mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に60℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)3.6gを得た。得られた収率は65.3%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン3.5gおよび蒸留水35mlを100mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.6±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.18mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム3.5gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程
度の温度でメタノール25mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール63mlを添加し、その後30分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を30分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(70ml)。メタノール70mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。沈殿を数分間放置して再沈降させた。次に懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール30mlで2回洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に60℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.5gを得た。得られた収率は71.4%であった。
平均分子量:2600ダルトン
抗Xa活性:150.5IU/mg
抗IIa活性:3.2IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:47
ジクロロメタン70mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通り得られたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)10g(0.006モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。30℃程度の温度で完全に溶解させ、そして20℃程度の温度に冷却した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン1.38ml(0.004モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール300ml中の無水酢酸ナトリウム30gの溶液を三角フラスコB中に製造した。三角フラスコA中の反応混合物を磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分15秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を1時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(190ml)。メタノール190mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(190ml)。メタノール190mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。上澄みを分離し、廃棄した(190ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール150mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン3.05gをナトリウム塩として得た。得られた収率は80%であった。
上記の通り得られた粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩3.05g(0.0048モル)および水21mlを100mlの三角フラスコに入れた。溶液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水6mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ0.6ml(0.006モル)を4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム4gを添加した。メタノール28mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール72mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で30分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(80ml)。メタノール80mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を30分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6pKa)に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.6gを得た。得られた収率は57%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン1.6gおよび蒸留水16mlを50mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.6±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.08mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム2gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール14mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール36mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を30分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。メタノール50mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6pKa)に乾燥した。乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)1.25gを得た。得られた収率は78%であった。
平均分子量:2400ダルトン
抗Xa活性:154.3IU/mg
抗IIa活性:1.6IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:96.4
ジクロロメタン140mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)20g(0.019モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。40℃程度の温度で完全に溶解させ、そして20℃程度の温度に冷却した後、t−ブチルイミノトリ(ピロリジノ)ホスホラン3.5ml(0.011モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト10gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に1分30秒かけて注ぎ込んだ。5分間攪拌の後、懸濁液を30分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(400ml)。メタノール400mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約1時間20分放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(250ml)。メタノール250mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール200mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。乾燥後、脱重合ヘパリン(ベンジルエステル、ナトリウム塩)5.39gを得た。得られた収率は69%であった。
上記の通り得られた脱重合ヘパリン(ベンジルエステル、ナトリウム塩)5g(0.0076モル)および水35mlを50mlの三角フラスコに入れた。溶液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水10mlで2回リンスした。得られた濾液を250mlの三角フラスコに入れた。30%苛性ソーダ1ml(0.01モル)を4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を2時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム6gを添加した。メタノール42mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール104mlを添加し、その後15分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で1時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(140ml)。メタノール140mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約45分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(160ml)。メタノール160mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール100mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。48時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.7gを得た。得られた収率は59%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン2.6gおよび蒸留水25mlを50mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.15mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム3gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール21mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール54mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を20分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。メタノール50mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約20分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。次に懸濁液中の沈殿をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.35gを得た。得られた収率は90%であった。
平均分子量:2400ダルトン
抗Xa活性:167.5IU/mg
抗IIa活性:1.1IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:152
ジクロロメタン140mlを三角フラスコA中に入れた。実施例Aに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル(エステル化度:75%、ベンゼトニウム塩)20g(0.019モル)を攪拌しながらゆっくり添加した。4Aのモレキュラーシーブ20gを反応媒体に添加し、48時間ゆっくり攪拌しながら水分含有量を0.05%とした。上澄みを不活性雰囲気下、三角フラスコAに移した。完全に溶解した後、2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスホリン3.5ml(0.012モル)を添加した。混合物を24時間20℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール600ml中の無水酢酸ナトリウム60gの溶液を三角フラスコB中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト10gを溶液に添加した。三角フラスコA中の反応混合物を、磁気攪拌しながら4℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に約2分間かけて注ぎ込んだ。15分間攪拌の後、懸濁液を1時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した(420ml)。メタノール420mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を15分間攪拌した。沈殿を約1時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(450ml)。メタノール450mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を15分間攪拌した。次に懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール200mlで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。16時間乾燥後、セライト(10g)中のナトリウム塩として粗製の脱重合ヘパリン5.36gを得た。得られた収率は68.6%であった。
上記の通り得られたセライト(10g)中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩5.36g(0.00817モル)および水50mlを50mlの三角フラスコに入れた。懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過し、水15mlで2回リンスした。得られた濾液を150mlの三角フラスコに入れた。35%苛性ソーダ1.01ml(0.0122モル)を、4℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を3時間攪拌した。1NHClを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム11gを添加した。メタノール77mlを反応媒体に添加した。15分間攪拌の後、メタノール200mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を4℃程度の温度で1時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(240ml)。メタノール240mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を10分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(225ml)。メタノール225mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を10分間攪拌した。次に懸濁液をNo.3焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを2回メタノール50mlで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に40℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.65gを得た。得られた収率は53.7%であった。
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン2.65gおよび蒸留水26.5mlを100mlの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら40℃とした。1N水酸化ナトリウムを添加することによりpHを9.7±0.1とした。反応媒体を0.45μmメンブレンで濾過し、30%過酸化水素水溶液0.25mlを添加した。20℃程度の温度で約2時間攪拌した後、1NHClを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム3gを添加した。次に溶液を0.45μmメンブレンで濾過し、次に10℃程度の温度でメタノール21mlを注ぎ込んだ。次に溶液を20℃とし、そして15分間攪拌した。次にメタノール54mlを添加し、その後1時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を45分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した(46ml)。メタノール46mlを沈降した沈殿に添加し、混合物を5分間攪拌した。沈殿を約30分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した(50ml)。メタノール50mlを添加し、次に懸濁液中の沈殿をNo.4焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール各10mlで2回洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に50℃程度の温度で減圧下(6kPa)に乾燥した。18時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン(ナトリウム塩)2.363gを得た。得られた収率は89.1%であった。
平均分子量:2500ダルトン
抗Xa活性:192IU/mg
抗IIa活性:1.3IU/mg
抗Xa活性/抗IIa活性の比:148
Claims (40)
- ヘパリンの構成成分である多糖類の一般的構造を有する、ヘパリンより誘導された硫酸化オリゴ糖の混合物であって、
− 平均分子量1500〜3000ダルトン、抗Xa活性154.3〜200IU/mg、抗IIa活性10IU/mg未満、および抗Xa活性/抗IIa活性の比30超を有し、
− 混合物の構成成分であるオリゴ糖が、
− 糖単位2〜26個を含み、
− 該オリゴ糖の末端の一方において4,5−不飽和ウロン酸またはその2−O−硫酸単位を有し、
− 硫酸オリゴ糖の混合物が:
− 6糖類画分を含み、ここで、前記6糖類画分の8〜15%が式
アルカリまたはアルカリ土類金属塩の形態である、
特徴を有する硫酸化オリゴ糖の混合物。 - アルカリまたはアルカリ土類金属の塩がナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩から選択されることを特徴とする請求項1記載のオリゴ糖の混合物。
- オリゴ糖の混合物15〜25%に相当する6糖類画分を含むことを特徴とする請求項1または2に記載のオリゴ糖の混合物。
- 抗IIa活性5IU/mg未満を有することを特徴とする請求項1〜3の何れか1項に記載のオリゴ糖の混合物。
- 抗IIa活性が0.5〜3.5IU/mgであることを特徴とする請求項4記載のオリゴ糖の混合物。
- 抗Xa活性/抗IIa活性の比50超を示すことを特徴とする請求項1〜5の何れか1項に記載のオリゴ糖の混合物。
- 抗Xa活性/抗IIa活性の比が100超を示すことを特徴とする請求項6記載のオリゴ糖の混合物。
- 平均分子量2000〜3000ダルトンを有することを特徴とする請求項1〜7の何れか1項に記載のオリゴ糖の混合物。
- 平均分子量が2400〜2650ダルトンであることを特徴とする請求項8記載のオリゴ糖の混合物。
- 抗Xa活性154.3〜200IU/mg、抗IIa活性0.5〜3.5IU/mgおよび平均分子量2400〜2650ダルトンを示すことを特徴とする請求項1〜9の何れか1項に記載のオリゴ糖の混合物。
- 使用される有機溶媒がジクロロメタンであることを特徴とする請求項11記載の方法。
- 脱重合工程の間の水含有量が0.2%未満となるように制御されることを特徴とする請求項1記載のオリゴ糖の混合物の製造のための請求項11または12に記載の方法。
- ヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩がベンゼトニウム、セチルピリジニウムまたはセチルトリメチルアンモニウム塩であることを特徴とする請求項11〜13の何れか1項に記載の製造方法。
- 脱重合工程の間に使用するホスファゼンのファミリーの塩基が2−t−ブチルイミノ−2−ジエチルアミノ−1,3−ジメチルパーヒドロ−1,2,3−ジアザホスフォリンまたはt−ブチルイミノトリ(ピロリジノ)−ホスホランであることを特徴とする請求項11〜13の何れか1項に記載の製造方法。
- ヘパリンから請求項1〜10の何れか1項に記載のオリゴ糖の混合物を製造する方法であって、以下の操作:
a)塩化ベンゼトニウムの作用によるヘパリンナトリウムの塩転移反応、
b)塩化ベンジルの作用により得られたベンゼトニウムヘパリネートのエステル化、
c)得られたベンジルエステルの塩転移反応および第4級アンモニウム塩の取得、
d)請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法によるヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩の脱重合、
e)ナトリウム塩への第4級アンモニウム塩の変換、
f)場合により塩基の作用によるヘパリンのケン化、
g)場合により酸化剤の作用による精製、
を実施する、上記方法。 - f)工程で使用される塩基が水酸化ナトリウムであることを特徴とする請求項16記載の方法。
- g)工程で使用される酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする請求項16または17に記載の方法。
- 工程a)の反応をヘパリンナトリウム上、過剰量の塩化ベンゼトニウムの作用により、塩/ヘパリンナトリウムのモル比3〜4で15〜25℃の温度において行うことを特徴とする請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- 工程b)のエステル化を、25〜45℃の温度で、塩素化有機溶媒中で行い、そして次にナトリウム塩の形態のエステルを、反応媒体の容量当りアルコール1〜1.2容量の比率でアルコール中10質量%の酢酸ナトリウムを用いた沈殿により回収することを特徴とする請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- エステル化を30〜40℃の温度で行うことを特徴とする請求項20記載の方法。
- 塩素化有機溶媒がクロロホルムまたは塩化メチレンであることを特徴とする請求項20または21に記載の方法。
- アルコールがメタノールであることを特徴とする請求項20〜22の何れか1項に記載の方法。
- ヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩のエステル化の程度が50〜100%であることを特徴とする請求項16〜18、20の何れか1項に記載の方法。
- ヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩のエステル化の程度が70〜90%であることを特徴とする請求項24記載の方法。
- ヘパリンのベンゼトニウム塩1質量部当り塩化ベンジル0.5〜1.5質量部を、10〜35時間の反応時間で使用することを特徴とする請求項16〜18、20〜25の何れか1項に記載の方法。
- 工程c)の塩転移を、10〜25℃の温度で水性媒体中、塩化第4級アンモニウムを用いることにより行うことを特徴とする請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- 塩化第4級アンモニウムが塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムまたは塩化セチルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする請求項27記載の方法。
- 塩化第4級アンモニウム/ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩のモル比が2〜3であることを特徴とする請求項27または28に記載の方法。
- 脱重合されたヘパリンのベンジルエステルの第4級アンモニウム塩のナトリウム塩への変換(工程e)を、15〜25℃の温度で、酢酸ナトリウムのアルコール溶液で反応媒体を処理することにより行うことを特徴とする請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- 酢酸ナトリウムのアルコール溶液がメタノール中の酢酸ナトリウムの10%溶液(質量/体積)であることを特徴とする請求項30記載の方法。
- ケン化(工程f)を、0〜20℃の温度で、水性媒体中、アルカリ金属水酸化物を用いて行うことを特徴とする請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- ケン化(工程f)を、0〜10℃の温度で行うことを特徴とする請求項32記載の方法。
- アルカリ金属水酸化物が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムであることを特徴とする請求項32または33に記載の方法。
- アルカリ金属水酸化物1〜5モル当量を用いることを特徴とする請求項32〜34の何れか1項に記載の方法。
- 水酸化ナトリウム1〜2モル当量を用いることを特徴とする請求項35記載の方法。
- 精製(工程g)を、10〜50℃の温度で、水性媒体中、過酸化水素を用いて行うことを特徴とする請求項16〜18の何れか1項に記載の方法。
- 精製(工程g)を、20〜40℃の温度で行うことを特徴とする請求項37記載の方法。
- 請求項16〜18の何れか1項に記載の方法により得ることができる請求項1〜10の何れか1項に記載の多糖類の混合物。
- 請求項11または12に記載の方法により得られる請求項1〜10の何れか1項に記載の多糖類の混合物。
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