PT1397106E

PT1397106E - Materiais de restauração dentária

Info

Publication number: PT1397106E
Application number: PT02771603T
Authority: PT
Inventors: Eric Charles Reynolds; Martin John Tias
Original assignee: Univ Melbourne
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2009-03-10
Also published as: US7491694B2; NO20035152D0; CA2447751C; IL158963A0; IL158963A; AU2002308416B2; JP4299004B2; DE60230139D1; KR100860889B1; AU2002308416B8; HK1064303A1; DK1397106T3; NZ529566A; WO2002094204A1; EP1397106A1; KR20040016449A; US20050063922A1; JP2004531553A; EP1397106B1; AU2002308416A1

Description

ΕΡ 1 397 106/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Materiais de restauração dentária" A presente invenção refere-se a materiais de restauração dentária incluindo um cimento de ionómero de vidro e fosfatos de cálcio amorfos e/ou fluorofosfatos de cálcio amorfos estabilizados por fosfopéptidos. Estes materiais de restauração dentária têm superiores propriedades anticariogénicas protegendo as estruturas dos dentes enquanto remineralizam (reparam) os estádios iniciais de cáries dentárias que se possam ter desenvolvido em torno da restauração. São igualmente proporcionados métodos de preparação dos materiais de restauração dentária da invenção e a utilização de materiais para o tratamento ou prevenção de cáries dentárias. A invenção proporciona também um kit de partes incluindo um cimento de ionómero de vidro e fosfatos de cálcio amorfos e/ou fluorofosfatos de cálcio amorfos estabilizados por fosfopéptidos.

ANTERIORIDADE

As cáries dentárias iniciam-se pela desmineralização de tecido duro dos dentes por ácidos orgânicos produzidos a partir da fermentação de açúcar da dieta por bactérias odontopatogénicas da placa dentária.

As cáries dentárias constituem ainda um importante problema de saúde pública e as superfícies dos dentes restaurados podem ser susceptíveis a mais cáries dentárias em torno das margens da restauração.

Foi demonstrado que os complexos fosfopéptido de caseína-fosfato de cálcio amorfo (CPP-ACP) e os complexos de fluorofosfato de cálcio amorfo estabilizados por CCP (CPP-ACFP) em solução previnem a desmineralização do esmalte e promovem a remineralização de lesões subsuperficiais do esmalte em modelos animais e humanos de cáries in situ [WO 9840406A]. 0 CPP activo foi especificado na Patente US 5015628 e inclui os péptidos Bos asi-caseína X-5P (f59-79) [1], Bos 2 ΕΡ 1 397 106/ΡΤ β-caseína Χ-4Ρ (f 1-25) [2], Bos as2-caseína X-4P (f46-70) [3] e Bos as2-caseína X-4P (fl-21) [4] seguintes: [1] Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-Ile-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln-Lys79. asi (59-79) [2 ] Arg^Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-

Ser(P)-Leu-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg25 . β(1—25) [3] Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys70. as2 (46-70) [4] Lys^Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser(P)-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys21. oís2 (1-21)

Estes péptidos estabilizam novas formas de fosfato de cálcio amorfo e fluorofosfato de cálcio amorfo muito solúveis [WO 98 40406 A] .

Os cimento de ionómero de vidro (GIC) são materiais à base de água, da cor dos dentes e quimicamente adesivos, utilizados em medicina dentária como bases e restaurações. As microfugas em torno das restaurações permanecem um problema significativo, que pode conduzir a cáries dos tecidos dos dentes subjacentes (Bergenholtz et al., 1982; Davis et ai., 1993; Pachuta e Meiers, 1995). Contudo, os GIC são materiais que libertam iões e a incorporação e libertação lenta de iões fluoreto a partir do cimento proporcionam uma propriedade anticariogénica significativa (Forss, 1993; Williams et ai., 1999) WO 97/36943A revela cimentos de ionómero de vidro compreendendo um fosfopéptido de caseína para o tratamento de cáries dentárias.

Embora fosse de esperar que a inclusão de CPP-ACP num GIC resultasse na incorporação dos iões de cálcio na matriz do GIC tornando-os indisponíveis, surpreendentemente, verificámos que a incorporação de CPP-ACP num GIC padrão, comercialmente disponível, resultou num GIC com inesperadas propriedades superiores em termos de resistência de ligações microtênseis, resistência à compressão e libertação de iões. Se facto, surpreendentemente o GIC contendo CPP-ACP foi capaz de 3

ΕΡ 1 397 106/PT remineralizar significativamente a dentina subjacente enquanto o GIC padrão não. Estes resultados formam a base da presente invenção que consiste em novos materiais de restauração dentária contendo CPP-ACP ou CPP-ACFP com superiores propriedades físico-químicas e anticariogénicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma composição para restauração dentária incluindo um cimento de ionómero de vidro e uma quantidade eficaz de um complexo fosfopéptido de caseína(CPP)-fosfato de cálcio amorfo (ACP) ou um complexo fosfopéptido de caseína(CPP)-fluorofosfato de cálcio amorfo (ACFP).

De acordo com um aspecto da invenção, é proporcionada uma composição para restauração dentária, incluindo um cimento de ionómero de vidro ao qual foi adicionado fosfato de cálcio amorfo (ACP) ou fluorofosfato de cálcio amorfo (ACFP) estabilizados por fosfopéptidos contendo a sequência de aminoácidos - Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-. Preferivelmente, o ACP e o ACFP são formados sob condições alcalinas. 0 fosfato de cálcio amorfo tem preferivelmente a fórmula aproximada Ca3 (P04) 2 · xH20 onde x > 1, ie existe uma ou mais H20 por

Ca3(P04)2· O derivado de fosfato de cálcio pode ser um fluorofosfato de cálcio com a fórmula aproximada Ca2F(P04) .xH20 onde x > 1 proporcionado fluorofosfato de cálcio amorfo (ACFP). Mais preferivelmente o derivado de fosfato de cálcio pode ser uma mistura de ACP e ACFP na razão de n:l, onde n é um número inteiro ^ 1, eg 1:1 originando CasF(P04)3 ou 2:1 originando Ca8F(P04)5. É de esperar que as razões exactas acima descritas, e as proporções de componentes no fosfato de cálcio amorfo, sejam diferentes na composição final devido, por exemplo, a interacções entre componentes. 0 fosfopéptido pode ser de qualquer fonte; pode ser obtido por digestão tríptica de caseína ou outras fosfoproteínas ricas em ácido ou por síntese química ou recombinante, desde que compreenda a sequência nuclear -Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-. A sequência flanqueadora desta sequência nuclear pode ser qualquer sequência. Contudo, as 4

ΕΡ 1 397 106/PT sequências flanqueadoras em asi(59-79) [1], β(1-25) [2], oís2 ( 46-70 ) [3] e as2(l-21) [4] são preferidas. As sequências flanqueadoras podem opcionalmente ser modificadas por deleção, adição ou substituição conservativa de um ou mais resíduos. A composição e sequência de aminoácidos da região flanqueadora não são críticas desde que a conformação do péptido seja mantida e que todos os grupos fosforilo e carboxilo que interactuam com iões de cálcio sejam mantidos pois as regiões flanqueadoras preferidas parecem contribuir para a acção estrutural do motivo. A base do material de restauração dentária é um cimento de ionómero de vidro. Prefere-se que a quantidade de complexo CPP-ACP ou complexo CPP-ACFP incluídos no material de restauração dentária seja de 0,01-80% em peso, preferivelmente 0,5-10% e mais preferivelmente 1-5% em peso. O material de restauração dentária da presente invenção, que contém os agentes acima mencionados, pode ser preparado e utilizado em várias formas aplicáveis à prática dentária. O material de restauração dentária de acordo com a presente invenção pode ainda incluir outros iões, eg. os iões antibacterianos Zn2+, Ag+, etc. ou outros ingredientes adicionais, dependendo do tipo e formato de um material de restauração dentária particular. É preferível que o pH do complexo CPP-ACP ou complexo CPP-ACFP esteja entre 2-10, mais preferivelmente 5-9 e ainda mais preferivelmente 7-9. É preferível que o pH do material de restauração dentária contendo o complexo CPP-ACP ou o complexo de ACFP esteja entre 2-10, mais preferivelmente 5-9 e ainda mais preferivelmente 7-9. A invenção refere-se também a um método de fabrico de uma composição de restauração. Preferivelmente, o método inclui a adição de ACP e/ou ACFP, estabilizados por fosfopéptidos como atrás referido, a um cimento de ionómero de vidro. A invenção refere-se também à utilização de uma composição de restauração como referido acima para o tratamento e/ou prevenção de cáries dentárias. A invenção refere-se também a um kit de partes incluindo (a) um cimento de ionómero de vidro e (b) complexo CPP-ACP ou complexo CPP-ACFP juntamente com instruções para a sua 5

ΕΡ 1 397 106/PT utilização para a preparação de uma composição para restauração dentária.

Será claramente entendido que, embora a presente descrição se refira especificamente a aplicações em seres humanos, a invenção é também útil para fins veterinários. Assim, em todos os aspectos, a invenção é útil para animais domésticos tais como gado vacum, ovelhas, cavalos e galináceos; para animais de companhia tais como gatos e cães; e para animais de jardim zoológico.

FIGURAS

Figura 1 : Corte longitudinal da raiz de um dente restaurado com GIC tratado com solução tampão ácida e visualizado utilizando microscopia de luz polarizada.

Figura 2 : Corte longitudinal da raiz de um dente restaurado com GIC contendo CPP-ACFP, tratado com solução tampão ácida e visualizado utilizando microscopia de luz polarizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção será agora descrita com detalhes a titulo de referência apenas aos Exemplos não limitantes que se seguem.

Exemplo 1 Incorporação de CPP-ACP num Cimento de Ionómero de Vidro

Preparação de GIC contendo CPP-ACP para Ensaios de Resistência à compressão e Tempo Global de Endurecimento

Prepararam-se vinte e quarto cilindros, de 4 mm de diâmetro x 6 mm de comprimento, a partir de cimentos de ionómero de vidro (GIC) para o teste de resistência à compressão e doze discos, de 10 mm de diâmetro x 5 mm de espessura, para o teste de tempo global de endurecimento. Formaram-se quatro grupos (A, B, C, D) com os espécimes (Tabela 1). Prepararam-se seis espécimes por grupo para o teste de resistência à compressão e três espécimes por grupo para o teste de tempo global de endurecimento. 6

ΕΡ 1 397 106/PT Ο Grupo A (controlo) foi preparado utilizando um cimento de ionómero de vidro auto-curável (Fuji IX GP, lote liquido N.° 080561 e lote em pó N.° 061051, GC International, Tokyo, Japão). Os Grupos B, C e D foram preparados a partir do mesmo

GIC, contendo 0,78, 1,56 e 3,91% p/p de CPP-ACP respectivamente incorporados numa razão pó ilíquido de 3,6:1. O CPP-ACP (Recaldent™) foi obtido de Bonlac foods Ltd (Melbourne, Austrália). Para os grupos experimentais, o CPP-ACP e os pós de GIC foram misturados manualmente e agitados num recipiente de plástico, e mantidos a 4°C até à preparação dos espécimes. O líquido de GIC e a razão pó ilíquido utilizados para todos os espécimes foram os indicados pelo fabricante comercial do GIC. Deixou-se o produto atingir a temperatura ambiente antes da mistura. Para todos os grupos, o pó e o líquido foram misturados manualmente durante 20 s e a mistura foi então colocada em moldes para cada teste correspondente. Os testes de resistência à compressão e tempo global de endurecimento foram realizados seguindo métodos ISO (ISO, 1991) .

Resistência da Ligação Microtênsil à Dentina

Molares humanos sem cárie armazenados em solução salina contendo timol foram utilizados nos dois meses seguintes à extracção. Prepararam-se dezassete espécimes em forma de barra, metade GIC e metade dentina, utilizando GIC (Fuji IX GP, lote N.° 9909021, GC International, Japão) contendo 1,56% p/p de CPP-ACP como descrito acima. Os espécimes de controlo (n=17) foram preparados utilizando o GIC normal. O líquido e a razão pó ilíquido para todos os espécimes permaneceu a mesma que para o produto comercial. Realizaram-se testes de resistência da ligação microtênsil seguindo um método previamente descrito (Phrukkanon et al., 1998; Tanumiharja et al., 2000), testando os espécimes em tensão a uma velocidade de cabeça transversal de 1 mm/min até à ruptura. Os valores de resistência média da ligação foram calculados utilizando a fórmula padrão (ISO, 1991), e os espécimes fracturados foram observados num microscópio electrónico de varrimento (SEM 515; Phillips, Eindhoven, Holanda) para avaliar o modo de ruptura. 7

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Medições de Iões e Detecção de CPP

Prepararam-se doze discos, de 6 mm de diâmetro x 2 mm de espessura, utilizando a fórmula de GIC experimental contendo 1,56 % p/p de CPP-ACP e prepararam-se doze controlos a partir do GIC não modificado. 0 GIC foi misturado, como descrito acima, injectado em moldes, condensado e deixado endurecer a 37°C e 100% de HR durante 1 h. Durante o endurecimento, o fundo e o topo dos moldes cheios foram cobertos por tiras de mylar e lâminas de microscópio por pressão manual. Removeram-se os discos dos moldes e colocaram-se em tubos de plástico individuais selados. Seis dos discos experimentais foram incubados a 37°C em 2 mL de água desionizada pH 6,9 (Milli-Q Reagent Water System, Millipore Corporation), e os outros seis em tampão de lactato de sódio 50 mM (Ajax Chemicals, Auburn, NSW) a pH 5,0. Seguiu-se o mesmo procedimento com os controlos. As soluções foram mudadas a cada 24 h durante 3 dias e a libertação de cálcio, fosfato inorgânico e iões fluoreto foi medida em cada solução.

Determinaram-se as concentrações de cálcio utilizando espectrofotometria de absorção atómica (Adamson e Reynolds 1995), as de fosfato inorgânico por colorimetria (Itaya e Ui, 1966) e as de ião fluoreto utilizando um eléctrodo selectivo para o ião (Ion 85 Radiometer, Copenhagen, Dinamarca). A libertação dos iões foi expressa em ymol/mm2 de área superficial do GIC exposto. A presença de CPP nas soluções foi determinada utilizando Espectroscopia de Massa - Dessorção/Ionização a Laser Assistida por Matriz (MALDI-MS) (Voyager-DE, Perseptive Biosystems; Farmingham, MA, EUA) com uma matriz de ácido 2,5-desidroxibenzóico em 66% de água, 33% de CH3CN e 1% de ácido fórmico.

Análise Estatística

Os resultados dos testes de resistência à compressão e tempo global de endurecimento foram sujeitos a análise de variância (ANOVA) de uma via, utilizando as diferenças mínimas significativas (LSD) para o teste de resistência à compressão e Bonferroni para o tempo global de endurecimento. Os resultados da resistência da ligação microtênsil foram 8 ΕΡ 1 397 106/ΡΤ comparados utilizando ο teste t de Student (p<0,05). Utilizou-se a distribuição do Qui quadrado (p<0,05) para detectar o modo de ruptura de espécimes fracturados. Os resultados das análises de libertação de iões foram comparados utilizando o teste t de Student (p<0,05).

RESULTADOS

Resistência à Compressão e Tempo Global de Endurecimento

Os valores médios para a resistência à compressão e tempos globais de endurecimento para os GIC estão apresentados na Tabela 1. As resistências médias à compressão para todos os espécimes variaram de 118,3 MPa a 169,6 MPa, com o valor mais elevado obtido para o GIC contendo 1,56% de CPP-ACP. Os tempos globais de endurecimento médios variaram de 523s a 186 s, mas apenas espécimes contendo 3,91% de CPP-ACP (Grupo D) foram significativamente diferentes dos outros.

Resistência da Ligação Microtênsil à Dentina A Tabela 2 mostra os valores médios de resistência da ligação microtênsil para os GIC contendo 1,56% p/p de CPP-ACP e de controlo e o modo de ruptura para os espécimes fracturados. Encontrou-se um valor de resistência da ligação no GIC contendo CPP-ACP (10,59 ± 4,00 MPa) significativamente superior ao do controlo (7,97 ± 2,61 MPa). Verificou-se que a distribuição no modo de ruptura como analisada utilizando SEM era também significativamente diferente (p<0,05). A fractura Tipo 2 foi mais frequente com o GIC contendo CPP-ACP, enquanto a Tipo 4 foi mais frequente com o controlo (Tabela 2) . A microestrutura dos dois cimentos examinados por SEM a uma ampliação de 360x parecia genericamente similar, embora parecesse haver uma superfície de fractura mais porosa e rugosa com os controlos relativamente aos cimentos contendo CPP-ACP.

Libertação de Iões e CPP

Os valores médios para a libertação de fluoreto, cálcio e fosfato em água (pH 6,9) e tampão de lactato de sódio (pH 5,0) pelo GIC contendo 1,56% p/p de CPP-ACP e pelo GIC de controlo estão apresentados nas Tabelas 3, 4 e 5. O padrão de 9 ΕΡ 1 397 106/ΡΤ libertação de fluoreto em água foi similar entre amostras e controlos, ocorrendo a maior libertação durante as primeiras 24 h e uma libertação mais lenta mas continuada durante os dois períodos seguintes de 24 h (Tabela 3) . A libertação de fluoreto foi significativamente maior no tampão de lactato de sódio de pH 5,0 do que na água de pH 6,9 para ambos os materiais, para o GIC contendo CPP-ACP e o GIC de controlo. Verificou-se uma libertação de fluoreto significativamente maior com o GIC contendo CPP-ACP do que com o controlo para ambos os valores de pH (Tabela 3).

Os valores de libertação de cálcio pelos GIC estão apresentados na Tabela 4. Não foi libertado cálcio a pH neutro em água nem pelo GIC contendo CPP-ACP nem pelo controlo. Verificou-se libertação de cálcio apenas no GIC contendo CPP-ACP no tampão de lactato de sódio de pH 5,0. A libertação foi baixa relativamente ao fluoreto mas contínua durante os três períodos de 24 h (Tabela 4). A libertação de fosfato inorgânico pelos GIC em água (pH 6,9) e tampão de lactato de sódio (pH 5,0) está apresentada na Tabela 5. Para ambos os valores de pH a libertação de fosfato foi significativamente maior pelo GIC contendo CPP-ACP do que pelos controlos durante o primeiro período de 24 h. A libertação de fosfato inorgânico foi significativamente maior em tampão de lactato de sódio a pH 5,0 do que em água a pH 6,9 para ambos os materiais. A análise MALDI-MS do tampão de lactato de sódio (pH 5,0) e da água (pH 6,9) após 24 h de incubação com o GIC contendo 1,56% p/p de CPP-ACP e o GIC de controlo revelou que o CPP podia ser detectado no tampão de pH 5,0 apenas após incubação com o GIC contendo CPP-ACP. O espectro de massa obtido foi o mesmo que se observou com CPP-ACP padrão.

Conclusão

Os complexos estabilizados de CPP-ACP foram incorporados no pó de vidro de um GIC e, em contraste com o que seria de esperar, pelo menos alguns dos iões de cálcio, iões fosfato e CPP não ficaram ligados na matriz do GIC mas foram libertados para produzir um cimento com superiores propriedades físico-químicas e anticariogénicas. 10

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Uma razão importante para a utilização de GIC numa variedade de aplicações clinicas é a sua capacidade para se ligar quimicamente a diferentes superfícies como esmalte, dentina e resina compósita (Akinmade e Nicholson, 1993). Os GIC são utilizados de forma rotineira em conjunto com resinas compósitas (Li et al., 1996; Pereira et al., 1998), em tratamento de restauração não traumático (ART, Atraumatic Restorative Treatment) (Frencken et al., 1996), em restaurações em túnel (Svanberg, 1992) e na restauração de dentes de leite (Frankenberger et al., 1997). A resistência à ligação, portanto, é uma propriedade importante do GIC. O valor médio da resistência da ligação microtênsil do GIC contendo CPP-ACP foi superior ao do GIC de controlo. 0 método de teste utilizado tem sido utilizado com sucesso em espécimes com diferente espessura de dentina, orientação de túbulos dentinais e com espécimes de dentina afectada por doenças (Phrukkanon et al., 1998). Portanto, factores tais como a qualidade, a profundidade e a humidade do substrato de dentina (Burrow et al., 1994; Tagami et al., 1993) não afectaram os resultados deste estudo. 0 mais comum modo de ruptura na adesão entre um GIC e a dentina durante os testes de resistência da ligação microtênsil é de Tipo 4, i.e., ruptura coesiva no interior do GIC (Tanumiharja et al., 2000). Este foi o modo predominante de ruptura do GIC de controlo encontrado neste estudo. 0 modo predominante de fractura para os GIC contendo CPP-ACP, foi de Tipo 2, i.e. ruptura coesiva parcial no GIC e ruptura adesiva parcial entre o GIC e a dentina.

Em relação à libertação de iões pelo GIC contendo CPP-ACP e pelos controlos, mostrou-se que a libertação de fluoreto em tampão de lactato de sódio de pH 5,0 foi significativamente maior do que em água (pH 6,9). Esta verificação foi previamente relatada para GIC normais (Forss, 1993; Kuhn e Wilson, 1985). Contudo, neste estudo a libertação de fluoreto foi significativamente maior pelo GIC contendo CPP-ACP do que pelos GIC de controlo para ambos os valores de pH, o que foi um resultado inesperado. Sem ligação a qualquer teoria, parece que o CPP-ACP promove a libertação de iões fluoreto pelo GIC, provavelmente por formação de complexos fosfopéptido de 11 ΕΡ 1 397 106/ΡΤ caseína-fluorofosfato de cálcio amorfo (CPP-ACFP), que são libertados pela matriz do cimento.

Foi libertado significativamente mais fosfato inorgânico pelo GIC com CPP-ACP para ambos os valores de pH (5,0 e 6,9) do que foi libertado pelo GIC de controlo.

Neste exemplo, as taxas totais de libertação pelo GIC contendo CPP-ACP após 72 h a pH 5,0 foram de 72,25 ± 9,99 pmol/mm2 para o fluoreto, 1,85 ± 0,1 pmol/mm2 para o fosfato inorgânico e 0,92 ± 0,15 pmol/mm2 para os iões de cálcio. A superior resistência da ligação microtênsil do GIC contendo CPP-ACP e a capacidade do cimento para libertar complexos CPP-ACFP indicam que o GIC contendo 1,56% de CPP-ACP foi uma base de restauração superior com um potencial anticariogénico melhorado.

Exemplo 2 Remineralização da dentina por libertação de CPP-ACFP por um GIC contendo CPP-ACFP

Utilizaram-se terceiros molares humanos sem cáries recentemente extraídos, sem fendas nem defeitos, armazenados em solução salina normal, para preparar duas cavidades com formato de caixa, de 7 mm de comprimento x 3 mm de largura x 1,5 mm de profundidade, ao longo da junção cimento-esmalte de ambas as superfícies mesial e distai, utilizando uma broca cilíndrica de diamante, turbina de alta velocidade e arrefecimento com ar-água. Efectuou-se o acabamento das margens da cavidade com uma broca cilíndrica de diamante de baixa velocidade para se conseguir um ângulo cavo superficial tão próximo quanto possível dos 90°. Dividiram-se os dentes em dois grupos (A, B). Os dentes do grupo A foram restaurados com um GIC auto-curável (Fuji IX GP capsulado, lote N.° 140493, GC International, Tokyo, Japão), e os dentes do grupo B, o grupo experimental, foram restaurados utilizando o mesmo GIC adicionado de 1,56% p/p de CPP-ACP preparado como no Exemplo 1. O líquido de GIC e a razão pó ilíquido para todos os espécimes permaneceu como para o produto comercial. Os materiais foram misturados à temperatura ambiente, colocados nas cavidades utilizando uma espátula de plástico e deixaram-se endurecer a 37° C e 100% de HR durante 1 h. Remataram-se e poliram-se as restaurações com discos de polimento fino (Soflex, 3M) sob água corrente para assegurar que todas as 12 ΕΡ 1 397 106/ΡΤ margens estão expostas, e a integridade de cada margem cavo-superficial foi confirmada por microscópio óptico a uma ampliação de 20x.

As raízes dos dentes contendo a restauração de GIC foram cortadas utilizando uma serra de diamante de baixa velocidade sob pulverização copiosa com água. Aplicaram-se dois revestimentos de verniz das unhas a todas a superfície do dente, deixando apenas uma janela de 1 mm em torno das margens da cavidade. Cada dente foi armazenado num frasco de plástico individual contendo 25 mL de solução tampão ácida consistindo em cloreto de cálcio 2,2 mM, di-hidrogeno-ortofosfato de sódio 2,2 mM e ácido acético 50 mM a pH 5,0. Os dentes foram armazenados na solução durante quatro dias, e a solução foi renovada a cada 24 h. Os espécimes foram removidos da solução de desmineralização, bem enxaguados com água da torneira e cortados através das restaurações com um microtomo de serra de diamante arrefecido com água, para produzir cortes longitudinais que foram escavados até 100 pm de espessura. As laminas resultantes foram avaliadas quanto à formação de lesões utilizando microscopia de luz polarizada com quinolina como meio de inibição (Fig. 1 e Fig. 2). A Figura 1 mostra uma lesão subsuperficial substancial na dentina adjacente à restauração de GIC com muito pouca protecção proporcionada pela libertação de fluoreto pelo GIC. A Fig. 2 por outro lado mostra uma lesão subsuperficial fracamente formada com protecção drástica (remineralização) proporcionada pela libertação de CPP-ACFP pelo GIC. Estes resultados mostram que a inclusão de CPP-ACP num GIC que liberta fluoreto produz uma capacidade notável de remineralizar (reparar) estádios iniciais de decaimento em torno das restaurações de GIC. 13

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TABELAS

Tabela 1. Resistência à compressão (MPa) e tempo global de endurecimento (s) para GIC contendo CPP-ACP e controlos

Grupo CPP-ACP (% p/p) Resistência à compressão Tempo global de endurecimento A 0,00 137,8 ± 40,7a 186 ± 5b B 0, 78 153,7 ± 2 4,7 210 ± 17 C 1,56 169,6 ± 28,6 226 ± 35 D 3,91 118,6 ± 12,5 523 ± 35° a Média ± desvio padrão, n = 6. Sem diferenças significativas na resistência à compressão entre grupos (A, B, C, D). b Média ± desvio padrão; n = 3. c Significativamente diferente dos outros tempos de endurecimento (p<0,05).

Tabela 2. Resistência da ligação microtênsil (MPa) e modo de ruptura com GIC contendo 1,56% p/p de CPP-ACP e de controlo

Grupo Resistência da ligação Frequência do Modo de Ruptura Tipo lb Tipo 2 Tipo 3 Tipo 4 Total GIC com 1,56% p/p 10,59 ± 4,00a 2C lld 0 4 17 de CPP-ACP GIC Controlo 7,97 ± 2,61 2 5 0 10 17 a Média e desvio padrão; significativamente diferente do grupo de controlo (p<0,05). b Modo de ruptura:

Tipo 1 ruptura adesiva entre a restauração e a dentina;

Tipo 2 ruptura adesiva parcial entre o GIC e a dentina e ruptura coesiva parcial no GIC;

Tipo 3 ruptura coesiva na dentina;

Tipo 4 ruptura coesiva no GIC.

Valor médio da frequência. d Significativamente diferente do grupo de controlo (p<0,05). 14

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Tabela 3. Libertação de fluoreto pelo GIC contendo CPP-ACP e de controlo a pH neutro e ácido

Período Libertação de Fluoreto (pmol/mm2) Água (pH 6,9) Lactato de Sódio (pH 5.0) GIC com CPP-ACP GIC de GIC com CPP-ACP GIC de

Controlo Controlo las 2 4 h 16, 70 ± 2,43a'b'c 10, 07 ± 1,20d 00 52 ± 8, 16c 24, 80 ± o, 47 2as 2 4 h 5,19 ± 0,79b'c 3, 17 ± T5 O 00 o 19, 12 ± 4, 26c 14, 50 ± 1, 41 3as 2 4 h 3,35 ± O o tr o 2, 42 ± 0,14d 18, 61 ± 3, 29c 15, 33 ± 0, 89 Total 24,67 ± 3, 99b'c 15, 66 ± 1,58d 72, 25 ± 9, 99c 54, 64 ± 1/ 38 a Média ± desvio padrão, n = 6. b Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do controlo ao mesmo pH. c Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do GIC com CPP-ACP a pH diferente.

d Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do controlo a pH diferente.

Tabela 4. Libertação de cálcio pelo GIC contendo CPP-ACP e de controlo a pH neutro e ácido

Período Libertação de cálcio (pmol/mm2) Água (pH 6,9) Lactato de Sódio (pH 5,0) GIC com CPP-ACP GIC de GIC com CPP-ACP GIC de Controlo Controlo las 24 h a - 0,35 ± 0, 07b,c,d - 2as 24 h - - 0,31 ± 0,07c,d - 3as 24 h - - 0,26 ± 0,05c,d - Total - - 0,92 ± 0,15c,d - a Sem libertação de iões cálcio detectada. b Média ± desvio padrão, n = 6

c Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do controlo ao mesmo pH. d Significativamente diferente (p < 0,05) do valor da amostra a pH diferente. 15

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Tabela 5. Libertação de fosfato pelo GIC contendo CPP-ACP e de controlo a pH neutro e ácido

Período Libertação de Fosfato inorgânico (pmol/inm2) Água (pH 6,9) Lactato de Sódio (pH 5,0) GIC com CPP-ACP GIC de Controlo GIC com CPP-ACP GIC de Controlo 1as 2 4 h 0,36 ± 0, o7a,b'c o, 02 ± 0, 00d 0, 88 ± 0,15b'c 0,53 ± 0, 05 2as 2 4 h 0,09 ± 0,13c 0, 01 ± 0, 01d 0,48 ± 0, 03c 0,53 ± 0, 03 3as 2 4 h 0,02 ± 0,01d o, 01 ± 0, 01d 0,48 ± 0, 05c 0,49 ± 0, 03 Total 0,49 ± 0,10b'c o, 15 ± 0, 10d 1, 85 ± 0,13b'c 1,55 ± 0, 06 a Média ± desvio padrão, n = 6. b Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do controlo ao mesmo pH. c Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do GIC com CPP-ACP a pH diferente.

d Significativamente diferente (p < 0,05) do valor do controlo a pH diferente.

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Lisboa, 2009-03-02

Claims

ΕΡ 1 397 106/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição para restauração dentária incluindo um cimento de ionómero de vidro e uma quantidade eficaz de um complexo fosfopéptido de caseína(CPP)-fosfato de cálcio amorfo (ACP) ou de um complexo fosfopéptido de caseína (CPP)-fluorofosfato de cálcio amorfo (ACFP).
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o CPP inclui a sequência de aminoácidos -Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o ACP é formado sob condições alcalinas.
4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o ACP tem a fórmula Ca3 (P04) 2 · XH2O, onde x > 1.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o ACFP é formado sob condições alcalinas.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 5, em que o ACFP tem a fórmula Ca2F(PC>4) .XH2O onde x á l.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, em que o ACFP contém também ACP, em que o ACP e o ACFP estão na razão de η: 1, onde n é um número inteiro b l.
8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a quantidade eficaz do complexo CPP-ACP ou do complexo CPP-ACFP é de 0,01 a 80% em peso.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8 em que a quantidade eficaz é de 0,5 a 10% em peso.
10. Composição de acordo com a reivindicação 9 em que a quantidade eficaz é de 1 a 5% em peso.
11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, possuindo um pH de 2 a 10.
12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que o pH é de 5 a 9.
13. Composição de acordo com a reivindicação 12, em que o pH é de 7 a 9. ΕΡ 1 397 106/PT 2/2
14. Método de fabrico da uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que o método inclui a adição de complexo CPP-ACP ou complexo CPP-ACFP ao cimento de ionómero de vidro.
15. Utilização de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou fabricada pelo método de acordo com a reivindicação 14, para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento e/ou prevenção de cáries dentárias em animais.
16. Utilização de acordo com a reivindicação 15 em que o animal é o ser humano.
17. Kit de partes incluindo (a) cimento de ionómero de vidro e (b) complexo CPP-ACP e/ou complexo CPP-ACFP, juntamente com instruções para a sua utilização para a preparação de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13. Lisboa, 2009-03-02