KR20040016449A

KR20040016449A - 치아 재생용 물질

Info

Publication number: KR20040016449A
Application number: KR10-2003-7015250A
Authority: KR
Inventors: 마틴존 티아스; 에릭찰스 레이놀즈
Original assignee: 더 유니버시티 오브 멜버른
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2004-02-21
Also published as: US7491694B2; NO20035152D0; CA2447751C; IL158963A0; IL158963A; AU2002308416B2; JP4299004B2; DE60230139D1; KR100860889B1; AU2002308416B8; HK1064303A1; DK1397106T3; NZ529566A; PT1397106E; WO2002094204A1; EP1397106A1; US20050063922A1; JP2004531553A; EP1397106B1; AU2002308416A1

Abstract

본 발명은 포스포펩타이드(phosphopeptides)에 의해 안정화된 무정형(amorphous) 칼슘 포스페이트(calcium phosphate) 및/또는 무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트(calcium fluoride phosphate)를 포함하는 치아 재생용 물질에 관한 것이다. 상기 치아 재생용 물질은 치아 재생부위 주변에 형성될 수 있는 치아우식증(dental caries)의 초기 단계를 재무기질화(수선)함으로써, 치아 구조를 보호하는 우수한 항-치아우식증 유발(anticariogenic)의 특성을 갖는다. 본 발명은 치아 재생용 물질의 제조방법 및 치아우식증의 치료 또는 예방방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 포스포펩타이드에 의해 안정화된 무정형 칼슘 포스페이트 및/또는 무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트를 포함하는 키트의 일부분을 제공한다.

Description

치아 재생용 물질{Dental restorative materials}

치아우식증(dental caries)은 치아 플라그 치질환유발 박테리아(dental plaque odontopathogenic bacteria)에 의한 식이용 당의 발효로부터 생성된 유기산에 의한 치아 견조직의 무기질 감소로 개시된다.

치아우식증은 여전히 주된 일반 대중의 건강문제에 해당하며, 재생된 치아 표면은 치아 재생부위의 주변에서 보다 치아우식증의 감염에 민감할 수 있다.

용액상의 카세인 포스포펩타이드-무정형 칼슘 포스페이트 복합체(casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate complex ; CPP-ACP) 및 CPP-안정화된 무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트 복합체(CPP-stabilised amorphous calcium fluoride phosphate complex ; CPP-ACFP)는 에나멜 무기질 감소를 방지하고, 동물및 정위치(in situ) 우식증 모델에서 에나멜 부표면(subsurface) 부위의 무기질재보급(remineralisation)을 촉진시키는 것이 보고되었다(Reynolds, 1997 특허출원번호 제 PCT/AU98/00160호).

활성 CPP는 미국 특허등록번호 제 5,015,628호로 등록되어 있으며, 하기에 기재된 Bos α_s1-카제인 X-5P(f59-79)[1], Bos β-카제인 X-4P(f1-25)[2], Bos α_s2-카세인 X-4P(f46-70)[3] 및 Bos α_s2-카세인 X-4P(f1-21)[4] 펩타이드들을 포함한다.

[1] Gln⁵⁹-Met-Glu-Ala-Glu-Ser(P)-Ile-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ile-

Val-Pro-Asn-Ser(P)-Val-Glu-Gln-Lys⁷⁹, α_s1(59-79)

[2] Arg¹-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser(P)-Leu

-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg²⁵, β(1-25)

[3] Asn⁴⁶-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-

Glu-Ser(P)-Ala-Glu-Val-Ala-Thr-Glu-Glu-Val-Lys⁷⁰, α_s2(46-70)

[4] Lys¹-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-Ser-Ile-

Ile-Ser(P)-Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys²¹, α_s2(1-21)

상기 펩타이드들은 신규한 형태의 용해성 무정형 칼슘 포스페이트 및 무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트를 안정화시킨다(Reynolds, 1997 특허출원번호 제 PCT/AU98/00160호).

글래스 이오노머 시멘트(glass ionomer cements ; GICs)는 기본재료(base) 및 치아재생과 같은 치과의술산업에 사용되는 물을 이용한(water-based) 치아 착색 및 화학적 접착제이다. 재생부위 주변에 GIC의 미세한 누출(microleakage)은 중대한 문제를 남기는 바, 하부 치아조직의 우식증을 야기할 수 있다(Bergenholtz et al., 1982; Davis et al., 1993; Pachuta and Melers, 1995). 그러나, GIC는 이온-방출 물질이고, 상기 시멘트로부터 플로라이드 이온의 느린 방출 및 치아조직에의 삽입은 커다란 항-치아우식증 유발 특성을 제공한다(Forss, 1993; Williams et al., 1999).

GIC 내로 CPP-ACP를 삽입시키는 경우 GIC 매트릭스(matrix) 내로 칼슘이온을 주입시키게 되어 GIC를 이용하지 못하게 될 것으로 예상하였으나, 놀랍게도 본 발명자들은 표준 물질인 상업적으로 판매되는 GIC 내로 CPP-ACP를 삽입시키는 경우 미세장력(microtensile) 결합 강도, 포괄적(comprehensive) 장력 및 이온-방출에 있어서 예상치 못한 우수한 성질의 GIC가 생성됨을 확인하였다. 사실, CPP-ACP를 함유하는 GIC는 하부 상아질(dentine) 부위를 상당히 재무기질화 시킬 수 있는데 반해, 표준 GIC는 거의 재무기질화시키지 못했다. 상기 결과로부터, 우수한 물리화학적 및 항-치아우식성 특성을 지진 CPP-ACP 또는 CPP-ACFP를 함유한 신규한 치아 재생용 물질은 본 발명의 토대를 제공할 수 있다.

본 발명은 치아 재생용 물질 및 유효용량의 카제인 포스포펩타이드(CPP)-무정형 칼슘 포스페이트(ACP) 복합체 또는 카제인 포스포펩타이드(CPP)-무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트(ACFP) 복합체를 포함하는 치아 재생용 조성물에 관한 것이다.

도 1은 GIC 처리로 재생된 치아 뿌리의 종단(longitudinal) 단편에 산성 버퍼 용액을 처리하여 편광 현미경(polarized-light microscopy)으로 관찰한 사진이다.

도 2는 CPP-ACFP를 포함하는 GIC 처리로 재생된 치아 뿌리의 종단 단편에 산성 버퍼 용액을 처리하여 편광 현미경으로 관찰한 사진이다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 아미노산 서열 -세린(P)-세린(P)-세린(P)-을 포함하는 포스포펩타이드에 의해 안정화된 무정형 칼슘 포스페이트(amorphous calcium phosphate ; ACP) 또는 무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트(amorphous calcium fluoride phosphate ; ACFP)가 첨가된 치아 재생용 물질을 포함하는 치아 재생용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 ACP 및 ACFP는 염기성 조건하에서 형성된다. 무정형 칼슘 포스페이트는 Ca₃(PO₄)₂·xH₂O로 기재되는 화학식과 유사(approximate)한 것이 바람직하며, 이때 x ≥1, 즉 Ca₃(PO₄)₂당 하나 또는 그 이상의 H₂O를 가진다. 칼슘 포스페이트 유도체는 Ca₂F(PO₄)·xH₂O로 기재되는 화학식과 유사한 칼슘 플로라이드 포스페이트이며, 이때 x ≥1인 무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트(ACFP)를 제공한다. 보다 바람직하게는, 칼슘 포스페이트 유도체는 ACP 및 ACFP가 n:1의 비율로 혼합되며, 이때 n ≥1인 정수, 예를 들면 1:1의 Ca₅F(PO₄)₃또는 2:1의 Ca₈F(PO₄)₅이다.

상기 무정형 칼슘 포스페이트의 정확한 비율 및 구성성분의 비율은 예를 들어, 구성성분 간의 상호작용에 따라 최종 조성물이 달라질 수 있다.

포스포펩타이드는 다양한 재료로부터 얻을 수 있다. 즉, 카제인의 트립신에 의한 분해 또는 기타 포스포-산이 풍부한 단백질에 의해 수득되거나 화학적 또는 재조합 합성에 의해 수득되며, 중심 서열 -세린(P)-세린(P)-세린(P)-을 포함하는 것으로 제공된다. 상기 중심 서열 주변(flanking)의 서열은 어떤 서열이어도 무방하다. 그러나, 상기 주변(flanking) 서열은 α_s1(59-79)[1], β(1-25)[2], α_s2(46-70)[3] 및 α_s2(1-21)[4]인 것이 바람직하다. 상기 주변 서열은 하나 또는 그 이상의 잔기가 결실, 추가 또는 보존적 치환됨으로써 선택적으로 변형될 수 있다. 펩타이드의 구조(conformation)가 유지된다면 상기 주변 영역의 아미노산 조성 및 서열은 중요하지 않으며, 칼슘 이온과 상호작용하는 모든 포스포릴(phosphoryl) 및 카르복실(carboxyl) 그룹은 모티프의 구조적 작용에 기여하는 것으로 보이는 주변영역에 위치하는 것이 바람직하다.

치아 재생용 물질은 기본적으로 글래스 이오노머(ionomer) 시멘트, 복합 물질 또는 호환성 있는 기타 재생용 물질이 될 수 있다. 치아 재생용 물질에 포함되는 CPP-ACP 복합체 또는 CPP-ACFP 복합체의 유효용량은 0.01 내지 80 중량%로 포함되는 것이 바람직하며, 0.5 내지 10 중량%로 포함되는 것이 보다 바람직하며, 1 내지 5 중량%로 포함되는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 치아 재생용 물질은 상기 물질을 포함하여 제조될 수 있으며, 다양한 형태로 치과 진료에 적용되어 이용될 수 있다. 나아가, 본 발명에 의한 치아 재생용 물질은 항박테리아 이온인 Zn²⁺, Ag⁺등과 같은 다른 이온 또는 특정한 치아 재생용 물질의 형태 및 타입에 따라 추가적 성분을 포함할 수 있다. CPP-ACP 복합체 또는 CPP-ACFP 복합체의 pH는 2 내지 10인 것이 바람직하며, 5 내지 9인 것이 보다 바람직하고, 7 내지 9인 것이 가장 바람직하다. 상기 CPP-ACP 복합체 또는 CPP-ACFP 복합체를 포함하는 치아 재생 물질의 pH는 2 내지 10인 것이 바람직하며, 5 내지 9인 것이 보다 바람직하고, 7 내지 9인 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명은 치아 재생용 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 상기에서 설명한 포스포펩타이드에 의해 안정화된 ACP 및/또는 ACFP를 기본재료 치아 재생용 물질에 첨가하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 치아우식증(dental caries)의 치료 및/또는 예방을 위해 상기에서 설명한 치아 재생용 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물 또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물을 제공하고, 이를 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 동물의 치아에 도포하는 것을 포함하는 동물의 치아우식증을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 치아 재생용 조성물을 제조하기 위해 사용되는 기기와 함께 사용하는 (a) 치아 재생용 물질 및 (b) CPP-ACP 복합체 또는 CPP-ACFP 복합체를 포함하는 키트의 일부분에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 치아 재생용 조성물을 제조하기 위해 사용되는 기기와 함께사용하는 (a) 치아 재생용 물질 및 (b) 카제인 포스포펩타이드 (c) 칼슘 이온 및 (d) 포스페이트 이온 및 선택적으로는 플로라이드 이온을 포함하는 키트의 일부분에 관한 것이다.

비록, 본 발명의 명세서에서 특히 인간에게 적용하는 것으로 기재되어 있으나, 본 발명은 또한 동물에도 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 소, 양, 말 및 닭과 같은 가축 뿐만 아니라, 고양이 및 개와 같은 애완동물 및 동물원의 동물들에도 적용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 글래스 이오노머 시멘트에 CPP-ACP의 삽입

압축 강도(Compressive Strength)와 수분 조정 시간 분석(Wet Setting Time assay)을 위한 CPP-ACP를 포함하는 GIC의 제조

압축 강도 테스트를 위해 글래스 이오노머 시멘트(glass ionomer cement ; GIC)로 24개의 실린더(4 ㎜ 지름 x 6 ㎜ 길이)를 제조하였고, 네트(net) 조정 시간 테스트를 위해 12개의 디스크(10 ㎜ 지름 x 5 ㎜ 두께)를 제조하였다. 4개의 그룹(A, B, C, D)을 검체(specimen)로 하였다(표 1). 압축 강도 테스트를 위해 그룹마다 6개의 검체를 제조하였으며, 네트 조정 시간 테스트를 위해 그룹마다 3개의 검체를 제조하였다.

그룹 A(대조군)는 자가-치료용(self-curing) 글래스 이오노머 시멘트를 사용하여 제조하였다(Fuji Ⅸ GP, liquid batch No. 080561 and powder batch No. 061051, GC international, Tokyo, Japan). 그룹 B, C 및 D는 상기 GIC 파우더에 각각 0.78, 1.56 및 3.91%(w/w)의 CPP-ACP를 각각 파우더:액체의 비율이 3.6:1이 되도록 첨가하여 제조하였다. CPP-ACP(Recaldent^TM)는 본락(Bonlac) 식품회사(Melbourne, Australia)로부터 제공받았다. 실험 그룹에서, CPP-ACP 및 GIC 파우더를 플라스틱 용기에서 수작업으로(manually) 혼합 교반한 후, 검체를 제조할 때까지 4℃에서 보관하였다. 모든 검체에 사용되는 GIC 액체 및 파우더 : 액체의 비율은 상업적으로 판매되는 GIC의 지침에 따랐다. 생성물은 혼합하기 전까지 상온에 도달할때까지 놓아두었다. 모든 그룹에서, 파우더와 액체는 20초간 수작업으로 혼합하였으며, 그후 상기 혼합물을 각각에 상응하는 테스트용 몰드(mold)에 넣었다. 압축강도 및 네트 조정 시간 테스트는 ISO 방법에 따라 수행하였다(ISO, 1991).

상아질(dentin)에 대한 미세장력 결합 강도

티몰(thymol)을 함유한 식염수에 보관한 비-치아우식증 인간 구치(molar)를 발치(extraction)한 후, 2달 이내에 사용하였다. 상기 기재된 대로 1.56%(w/w) CPP-ACP를 함유하는 GIC(Fuji Ⅸ GP, batch No. 9909021, GC International, Japan)를 이용하여 절반은 GIC, 절반은 상아질로 17개의 막대 모양의 검체를 제조하였다. 통상의 GIC를 사용하여 대조군(n=17)을 제조하였다. 모든 검체에서 액체 및 파우더 : 액체의 비율은 상업적으로 판매되는 산물과 동일하게 하였다. 미세장력 결합 강도 테스트는 상기 기술된 방법(Phrukkanon et al., 1998; Tanumiharja et al., 2000)에 따라 수행하였으며, 결함(failure)이 생길 때까지 1 ㎜/분의 크로스-헤드(cross-head) 속도로 검체에 장력(tension)을 가하였다. 평균 결합 강도 수치를 표준식으로 계산하였으며(ISO, 1991), 결함 형태(mode)를 평가하기 위해 주사전자현미경(scanning electron microscope)(SEM 515; Philips, Eindhoven, The Netherlands)으로 파쇄된 검체를 관찰하였다.

이온 측정 및 CPP 검출

1.56%(w/w) CPP-ACP를 함유한 실험용 GIC 화합물로 12개의 디스크(6 ㎜ 지름 x 2 ㎜ 두께)를 제조하였고, 변형시키지 않은 GIC로 12개의 대조군을 제조하였다. GIC를 혼합한 후, 상기에 기술된 바와 동일하게 몰드에 주입하고 압축한 다음, 37℃ 및 100% RH로 세팅된 조건 하에서 1시간동안 놓아두었다. 세팅하는 동안, 채워진 몰드의 바닥과 윗부분을 손으로 눌러(hand pressure) 마일라 스트립(mylar strip)과 현미경 슬라이드로 덮었다. 몰드에서 디스크를 제거한 후, 각각의 밀봉된 플라스틱 튜브에 넣었다. 6개의 실험용 디스크를 pH 6.9의 탈이온화된 물 2㎖에서 37℃로 반응시키고(Milli-Q Reagent water System, Millipore Corporation), 나머지 6개의 실험용 디스크는 pH 5.0에서 50 mM 소듐 락테이트(Ajax Chemicals, Auburn, NSW) 버퍼에서 반응시켰다. 대조군도 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 용액을 3일 동안 24시간 마다 교환하였으며, 용액마다 방출되는 칼슘, 무기염 포스페이트 및 플로라이드 이온을 측정하였다. 원자흡광 분광광도법(atomic absorption spectrophotometry)(Adamson and Reynolds, 1995)을 이용하여 칼슘 농도를 측정하였고, 비색성(colorimetrically)을 이용하여 무기염 포스페이트 농도를 측정하였고, 이온 선택 전극(Ion 85 Radiometer, Copenhagen, Denmark)을 이용하여 플로라이드 이온을 측정하였다. 이온의 방출은 노출된 GIC의 μ㏖/㎟ 표면적으로 나타내었다.

용액내 CPP의 존재는 66% 물, 33% CH₃CN 및 1% 포름산이 함유된 2,5-디하이드록시 벤조익산(2,5-dehydroxy benzoic acid)의 MALDI-MS(Matrix Assisted LaserDesorption/Ionisation-Mass Spectrometry)(Voyager-DE, Perseptive Biosystems; Farmingham, MA, USA)를 이용하여 측정하였다.

통계 분석

압축 강도 및 네트 조정 시간 테스트의 데이터를 다양한 범위의 단일방향 오차분석(one-way analysis of variance ; ANOVA)으로 측정하였으며, 압축 강도는 최소-유효차(least-significant difference ; LSD)를 이용하였고, 네트 조정 시간은 본페로니(Bonferroni) 테스트를 이용하였다. 미세장력 결합 강도의 데이터를 스튜던트 티 테스트(Student's t test)로 비교하였다(p<0.05). 파쇄된 검체의 결함 형태를 검색하기 위해 카이 스퀘어드 분포(Chi squared distribution)(p<0.05)를 이용하였다. 이온 분비 분석 데이터를 스튜던트 티 테스트로 비교하였다(p<0.05).

결과

압축 강도 및 네트 조정 시간

GIC에 대한 압축 강도 및 네트 조정 시간에 대한 평균값은표 1에 나타내었다. 모든 검체에 대한 평균 압축 강도는 118.3 MPa 내지 169.6 MPa이었으며, 1.56% CPP-APP를 포함하는 GIC에 대해서는 가장 높은 수치를 나타내었다. 평균 적정 조정 시간은 523초 내지 186초 범위였으나, 3.91% CPP-APP(그룹 D)를 포함하는 검체만은 다른 그룹과 유의성 있게 차이나는 수치를 나타내었다.

상아질에 대한 최소장력 결합 강도

표 2는 1.56% w/w CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군에 대한 평균 최소장력 결합 강도 수치를 나타내며, 파쇄된 검체에 대한 결함 형태(mode of failure)을 나타낸다. CPP-ACP를 포함하는 GIC(10.59 ±4.00 MPa)는 대조군(7.97 ±2.61 MPa)에 비해 상당히 높은 결합 장력 수치를 나타내었다. 결함 형태의 분포는 SEM을 사용하여 분석하였으며, 이것 또한 유의성있는 차이가 있음을 확인하였다(p<0.05). 제 2형 파쇄는 CPP-ACP 포함하는 GIC에서 보다 빈번하게 나타났으며, 반면 제 4형 파쇄는 대조군에서 더 빈번하게 나타났다(표 2). 360 ×배율로 SEM을 이용하여 측정한 두 개 시멘트의 미세구조는 거의 비슷하였지만, 대조군의 경우는 CPP-ACP를 포함하는 시멘트에 비교하였을 때 훨씬 더 거친 파쇄 표면과 훨씬 많은 구멍을 형성하였다.

이온 및 CPP 방출

1.56% w/w CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군 GIC로부터 증류수(pH 6.9) 및 소듐 락테이트 버퍼(pH 5.0)로의 플로라이드, 칼슘 및 포스페이트 방출의 평균값은표 3,표 4및표 5에 나타내었다. 증류수로의 플로라이드의 방출 형태는 샘플과 대조군 사이에서 비슷하게 나타났으며, 이때 처음 24시간 동안은 최고조로 방출되고 다음 두 번의 24시간 동안에는 천천히, 그러나 지속적으로 방출되었다(표 3). 플로라이드의 방출은 두 개의 물질, 즉 CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군 GIC에 대해 pH 6.9의 증류수보다는 pH 5.0의 소듐 락테이트 버퍼에서 상당히 높은 양이었다. 또한, 상기 두 개의 pH 범위에서 대조군에 비해 CPP-ACP를 포함하는 GIC가 상당히 높은 양의 플로라이드를 방출하였다(표 3).

GIC로 부터의 칼슘 방출 수치는표 4에 나타내었다. 중성 pH의 증류수에는 CPP-ACP를 포함하는 GIC 또는 대조군 중 어느것에서도 칼슘이 방출되지 않았다. 그러나, pH 5.0의 소듐 락테이트 버퍼에서는 오직 CPP-ACP를 포함하는 GIC에서 칼슘이 방출되었다. 상기 방출량은 플로라이드에 비해서는 낮았지만 3회의 24시간 동안은 지속적으로 분비되었다(표 4).

증류슈(pH 6.9) 및 소듐 락테이트 버퍼(pH 5.0)에서 GIC로부터 방출되는 무기염 포스페이트는표 5에 나타내었다. 처음 24시간 동안, 포스페이트의 방출은 상기 두 개의 pH 수치에서 CPP-ACP를 포함하는 GIC에서 대조군에 비해 훨씬 더 많았다. 무기염 포스페이트의 방출은 상기 두가지 물질에 대해 pH 6.9의 증류수 보다는 pH 5.0의 소듐 락테이트 버퍼에서 훨씬 더 많았다.

1.56% CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군 GIC를 이용하여 24시간 동안 반응시킨 뒤 소듐 락테이트 버퍼(pH 5.0) 및 증류수(pH 6.9)를 MALDI-MS 분석한 결과, 단지 CPP-ACP를 포함하는 GIC를 반응시킨 후의 pH 5.0 버퍼에서 CPP가 검출되었다.

결론

CPP-ACP의 안정화된 복합체를 GIC의 글래스 파우더 내로 삽입시켰으며, 예상과는 반대로 칼슘 이온, 포스페이트 이온 및 CPP의 적어도 일부는 GIC 매트릭스와 결합하지 못하고 방출됨에 따라, 물리화학적 및 항-치아우식성 특징을 가진 시멘트를 제조하였다.

다양한 임상 적응용으로 GIC를 사용하는 가장 중요한 이유는 에나멜, 상아질 및 레진 조성물과 같은 다른 표면에 화학적으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있기 때문이다(Akinmade and Nicholson, 1993). GIC는 레진 조성물과의 결합(Li et al., 1996; Pereira et al., 1998), 비외상성 재생 치료(ART)(Frencken et al., 1996), 터널 재생(Svanberg, 1992) 및 일차(primary) 치아의 재생(Frankenbergeret al., 1997)에 일반적으로 사용된다. 따라서, 결합 강도는 GIC의 중요한 특성이다. CPP-ACP를 포함하는 GIC의 미세장력 결합 세기의 평균값은 대조군 GIC의 값보다 훨씬 더 높게 나타났다. 사용된 테스트 방법은 다른 두께의 상아질을 가진 검체, 치아의 세관 방향성 및 질병에 의해 감염된 상아질 검체에 성공적으로 사용되었다(Phrukkanon et al., 1998). 따라서, 상아질 기질의 질, 깊이 및 습도와 같은 인자(Barrow et al., 1994; Tagami et al., 1993)는 본 발명의 결과에 영향을 주지 않았다.

미세장력 결합 강도 테스트 동안에 GIC 및 상아질 사이에서의 부착에 결함을 가져오는 가장 일반적인 형태는 제 4형으로, 이는 GIC 내에서의 응집력 결함을 나타내는 것이다(Tanumiharja et al., 2000). 대조군 GIC의 현저한 결함 형태는 본 발명에서 발견되었다. CPP-ACP를 포함하는 GIC에 대한 현저한 결함 형태는 제 2형으로, 이는 GIC에 있어서의 부분적인 응집 결함 및 GIC 및 상아질 사이에서의 부분적인 응집 결함이다.

CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군으로부터의 이온의 방출에 있어서, pH 5.0의 소듐 락테이트 버퍼에서 플로라이드의 방출은 증류수(pH 6.9)에서 방출되는 것 보다 훨씬 더 많은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 정상 GIC에 대한 이전의 보고에서도 나타나 있다(Forss, 1933; Kuhn and Wilson, 1985). 그러나, 본 발명에서는 두가지 모두의 pH 수치에서 GIC 대조군 보다는 CPP-ACP를 포함하는 GIC로부터 플로라이드가 훨씬 더 많이 방출되었으며, 이는 예상하지 못한 결과였다. 특정한 이론과 결부되는 것은 아니지만, CPP-ACP는 GIC로부터 플로라이드 이온의 방출을 촉진시키며, 이는 카제인 포스포펩타이드-무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트(CPP-ACP) 복합체를 형성함으로써 시멘트 매트릭스로부터 방출되는 것으로 예상되었다.

두 개의 pH 수치(5.0 및 6.9)에서 대조군 GIC 보다는 CPP-ACP GIC로부터 방출되는 무기염 포스페이트의 양이 훨씬 더 많았다.

본 발명의 실시예에서, pH 5.0에서 72시간 이후에 CPP-ACP를 포함하는 GIC로부터 방출되는 전체 비율은 플로라이드가 72.25 ±9.99 μmol/mm², 무기염 포스페이트가 1.85 ±0.1 μmol/mm²이었고, 칼슘 이온은 0.15 μmol/mm²이었다. CPP-ACP를 포함하는 GIC가 높은 미세장력 결합 강도를 가지고, CPP-ACFP 복합체를 방출하는 시멘트의 특성때문에, 1.56% CPP-ACP를 포함하는 GIC가 향상된 항우식성 잠재력을 가진 우월한 재생성/기본재료임을 알 수 있다.

<실시예 2> CPP-ACFP를 포함하는 GIC로부터의 CPP-ACFP 방출에 의한 상아질의 재무기질화

깨끗하게 발치하고, 균열 및 감염이 없는 우식증이 없는 3살짜리 어린이의 구치를 일반적인 생리식염수 용액에 보관해 두었으며, 상기 구치를 7 mm 길이 ×3 mm 넓이 ×1.5 mm 깊이를 가지는 두 개의 박스-형태의 구멍을 제조하는데 사용하였고, 이때 상기 구멍은 실린더형의 다이아몬드 절삭기, 고속 터민 및 공기-물 냉각제를 사용하여 근심 및 원심 표면 모두에 시멘트-에나멜 결합을 둘러서 제조하였다. 구멍의 여백은 저속 실린더 다이아몬드 절삭기를 사용해 마무리하여 카보(cavo) 표면 각이 가능한 한 90°에 가깝도록 하였다. 치아는 두 개의 그룹(A,B)으로 분리하였다. 그룹 A로부터의 치아는 자가-경화(self-curing) GIC(Fuji Ⅸ GP capsulated, batch No. 140493, GC International, Tokyo, Japan)를 사용하여 재생시켰고, 실험군인 그룹 B로부터의 치아는 상기와 동일한 GIC에 실시예 1에서 제조한 1.56% w/w CPP-ACP를 결합시킨 것을 사용하여 재생시켰다. 모든 검체에 사용되는 GIC 액체 및 분말:액체 비는 상업적 판매자의 지침에 따랐다. 상기 물질은 실온에서 혼합하였고, 플라스틱 주걱을 사용하여 상기 물질을 구멍으로 삽입하였으며, 37℃ 및 100% RH로 조정한 조건에 1시간 동안 놓아두었다. 재생이 완성되면 모든 틈이 노출되도록 유수에서 미세한 연마 디스크(Soflex, 3M)를 사용하여 연마하였으며, 각각의 카보-표면 틈의 강도는 20 × 배율의 광학현미경 하에서 확인하였다.

GIC 재생을 포함하는 치아의 뿌리는 다량의 물을 스프레이로 공급하는 조건 하에서 저속 다이아몬드 톱을 사용하여 절단하였다. 네일(nail) 광택제의 두 개의 외막은 전체 치아 표면에 도포하였으며, 구멍의 틈 주위에 단지 1 mm의 창을 남겨두었다. 각각의 치아는 2.2 mM 칼슘 클로라이드, 2.2 mM 소듐 디하이드로젠 오쏘포스페이트 및 50 mM 아세틱산, pH 5.0으로 구성되는 25 ㎖ 완충액을 포함하는 각각의 플라스틱 바이알에 보관하였다. 치아는 상기 용액에서 4일 동안 보관하였으며, 상기 용액은 매 24시간 마다 교체하였다. 검체를 미네랄 제거 용액으로부터 분리한 뒤, 수돗물에서 철저하게 세척하고, 수냉의 다이아몬드 톱 마이크로톰을 사용하여 재생부위를 따라 절단하여 100 ㎛ 두께로 갈아 종단절편을 제조하였다. 제조된 슬라이드는 임히비션(imhibition) 매개체로 퀴놀린을 사용한 편광 현미경을 사용하여 손상부위 형성을 측정하였다(도 1및도 2).

도 1은 플로라이드를 방출하는 GIC에 의해 거의 보호되지 못한 GIC 재생부위에 인접한 상아질에 있는 많은 부표면 손상을 나타낸다. 한편,도 2는 GIC로부터 방출되는 CPP-ACFP에 의해 아주 잘 보호된(재무기질화) 거의 부표면 손상이 없는 것을 나타낸다. 이러한 결과를 통해, 플로라이드를 방출하는 GIC 내로 CPP-ACP를 삽입시키는 것은 GIC 재생부위 주변의 치아우식증의 초기 단계를 재무기질화하는(수선하는) 현저한 능력을 발생시킨다.

상기에 기재된 기본적인 발명에 대한 다른 이점과 변형은 당업자에게 명백하며, 모든 변형과 적용은 본 발명의 범위에 포함된다.

CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군의 압축 강도(MPa) 및 네트 조정 시간(s).

그룹	CPP-ACP(%, w/w)	압축 강도	네트 조정 시간
A	0.00	137.8 ±40.7^a	186 ±5^b
B	0.78	153.7 ±24.7	210 ±17
C	1.56	169.6 ±28.6	226 ±35
D	3.91	118.6 ±12.5	523 ±35^c

a : 평균 ±표준편차, n=6, 각 그룹 간에 압축 강도의 유의성 있는 차이를 보이지 않음(A, B, C, D).

b : 평균 ±표준편차; n=3.

c : 다른 조정 시간으로부터 유의성 있는 차이를 나타냄(p<0.05).

1.56% w/w CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군의 미세장력 결합강도(MPa) 및 결함형태.

그룹	결합강도	결함 빈도의 형태
그룹	결합강도	제1형^b	제2형	제3형	제4형	계
1.56 %(w/w)CPP-ACP/GIC	10.59 ±4.00^a	2^c	11^d	0	4	17
대조군 GIC	7.97 ±2.61	2	5	0	10	17

a : 평균 및 표준편차; 대조군 그룹과 유의성 있는 차이를 나타냄(p<0.05).

b : 결함형태:

제1형은 재생부위와 상아질 사이의 접촉성 결함;

제2형은 GIC와 상아질 사이의 부분적 접촉성 결함 및 GIC 내의 부분적 접촉성 결함;

제3형은 상아질 내의 응집성 결함;

제4형은 GIC 내의 응집성 결함.

c : 평균 빈도 수치.

d : 대조군 그룹과 유의성 있는 차이를 나타냄(p<0.05).

중성 및 산성 pH에서 CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군으로부터 플로라이드 방출.

기간	플로라이드 방출(μ㏖/㎟)
	증류수(pH 6.9)	소듐 락테이트(pH 5.0)
	CPP-ACPGIC	대조군GIC	CPP-ACPGIC	대조군GIC
1^st24 h	16.70 ±2.43	10.07 ±1.20	34.52 ±8.16	24.80 ±0.47
2^nd24 h	5.19 ±0.79	3.17 ±0.30	19.12 ±4.26	14.50 ±1.41
3^rd24 h	3.35 ±0.07	2.42 ±0.14	18.61 ±3.29	15.33 ±0.89
계	24.67 ±3.99	15.66 ±1.58	72.25 ±9.99	54.64 ±1.38

a : 평균 ±표준편차, n=6.

b : 동일한 pH에서 대조군 수치와 유의성 있는 차이(p<0.05)를 나타냄.

c : 상이한 pH에서 CPP-ACP GIC 수치와 유의성 있는 차이(p<0.05)를 나타냄.

d : 상이한 pH에서 대조군 수치와 유의성 있는 차이(p<0.05)를 나타냄.

중성 및 산성 pH에서 CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군으로부터 칼슘 방출.

기간	칼슘 방출(μ㏖/㎟)
	증류수(pH 6.9)	소듐 락테이트(pH 5.0)
	CPP-ACPGIC	대조군GIC	CPP-ACPGIC	대조군GIC
1^st24 h	-^a	-	0.35 ±0.07^b,c,d	-
2^nd24 h	-	-	0.31 ±0.07^c,d	-
3^rd24 h	-	-	0.26 ±0.05^c,d	-
계	-	-	0.92 ±0.15^c,d	-

a : 칼슘이온의 방출이 검출되지 않음.

b : 평균 ±표준편차, n=6.

c : 동일한 pH에서 대조군 수치와 유의성 있는 차이(p<0.05)를 나타냄.

d : 상이한 pH에서 샘플 수치와 유의성 있는 차이(p<0.05)를 나타냄.

중성 및 산성 pH에서 CPP-ACP를 포함하는 GIC 및 대조군으로부터 포스페이트 방출.

기간	무기염 포스페이트 방출(μ㏖/㎟)
	증류수(pH 6.9)	소듐 락테이트(pH 5.0)
	CPP-ACPGIC	대조군GIC	CPP-ACPGIC	대조군GIC
1^st24 h	0.36 ±0.07^a,b,c	0.02 ±0.00^d	0.88 ±0.15^b,c	0.53 ±0.05^d
2^nd24 h	0.09 ±0.13^c	0.01 ±0.01^d	0.48 ±0.03^c	0.53 ±0.03^d
3^rd24 h	0.02 ±0.01^c	0.01 ±0.01^d	0.48 ±0.05^c	0.49 ±0.03^d
계	0.49 ±0.10^b,c	0.15 ±0.10^d	1.85 ±0.13^b,c	1.55 ±0.06^d

a : 평균 ±표준편차, n=6.

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상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 치아 재생용 조성물은 우수한 물리화학적 및 항-치아우식성 특성을 가져 치과학적 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

치아 재생용 물질 및 유효용량의 카제인 포스포펩타이드(CPP)-무정형 칼슘 포스페이트(ACP) 복합체 또는 카제인 포스포펩타이드(CPP)-무정형 칼슘 플로라이드 포스페이트(ACFP) 복합체를 포함하는 치아 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 CPP는 아미노산 서열 Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 ACP는 염기성 조건하에서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ACP는 Ca₃(PO₄)₂·xH₂O의 화학식을 가지며, 상기에서 x ≥1인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 ACFP는 염기성 조건하에서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 또는 제 5항에 있어서, 상기 ACFP는 Ca₂F(PO₄)·xH₂O의 화학식을 가지며, 상기에서 x ≥1인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 ACFP는 또한 ACP를 포함하며, 여기서 ACP 및 ACFP는 n:1의 비율이며, 상기 n ≥1인 정수인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치아 재생용 물질은 치아용 시멘트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 치아용 시멘트는 글래스 이오노머(ionomer) 시멘트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CPP-ACP 복합체 또는 CPP-ACFP 복합체의 유효용량은 0.01 내지 80 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10항에 있어서, 상기 유효용량은 0.5 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 유효용량은 1 내지 5 중량%인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 pH 2 내지 10 범위를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13항에 있어서, 상기 pH는 5 내지 9인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 14항에 있어서, 상기 pH는 7 내지 9인 것을 특징으로 하는 조성물.
ACP 또는 ACFP 및 CPP를 치아 재생용 물질에 첨가하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 조성물 제조방법.
CPP-ACP 복합체 또는 CPP-ACFP를 치아 재생용 물질에 첨가하는 것을 포함하는, 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 조성물 제조방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제 16항 또는 제 17항의 방법에 의해 제조된 조성물의, 동물의 치아우식증을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제 제조용 용도.
제 18항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제 16항 또는 제 17항 중어느 한 항의 방법에 의해 제조되는 조성물을 제공하고, 이를 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 동물의 치아에 도포하는 것을 포함하는, 동물의 치아우식증을 치료 및/또는 예방하는 방법.
제 20항에 있어서, 상기 동물은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 치아 재생용 물질 및 (b) CPP-ACP 복합체 및/또는 CPP-ACFP 복합체를 포함하고, 이것이 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하기 위해 사용되는 기기와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 킷트의 일부분.
(a) 치아 재생용 물질, (b) 카제인 포스포펩타이드, (c) 칼슘 이온 및 (d) 포스페이트 이온을 포함하고, 이것이 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하기 위해 사용되는 기기와 함께 사용되는 것을 특징으로 하는 킷트의 일부분.
제 23항에 있어서, 킷트의 일부분은 추가로 플로라이드 이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 킷트의 일부분.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 실질적으로 본 발명에서 기재된 어느 하나의 실시예에 따르는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 16항에 있어서, 상기 제조방법은 실질적으로 본 발명에서 기재된 어느 하나의 실시예에 따르는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 18항에 있어서, 상기 용도는 실질적으로 본 발명에서 기재된 어느 하나의 실시예에 따르는 것을 특징으로 하는 용도.
제 20항에 있어서, 상기 치아우식증을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법은 실질적으로 본 발명에서 기재된 어느 하나의 실시예에 따르는 것을 특징으로 하는 방법.
제 22항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 킷트의 일부분은 실질적으로 본 발명에서 기재된 어느 하나의 실시예에 따르는 것을 특징으로 하는 킷트의 일부분.