PT1381627E - Polipéptidos derivados do péptido precursor de amilóide (app) e suas utilizações - Google Patents

Description

ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Polipéptidos derivados do péptido precursor de amilóide (APP) e suas utilizações" A presente invenção refere-se a compostos polipeptídicos, a compostos seus derivados e à utilização destes compostos em medicina. Pensa-se que os compostos de acordo com a invenção são potencialmente úteis como agentes para melhoria cognitiva e no tratamento de doenças neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de Alzheimer é uma doença do cérebro degenerativa que se caracteriza pela perda progressiva de memória e subsequentemente da maioria das outras funções cognitivas num declínio irreversível, ao longo de um período de anos. Representa um problema de saúde considerável, em particular na população em envelhecimento. A proteína precursora de amilóide ("APP") é uma proteína transmembranar multifunctional e é conhecida por ter funções importantes no tecido cerebral normal. É conhecido que a forma humana da APP consiste de 695 resíduos de aminoácido (SEQ ID No: 1) numa sequência que também é conhecida (ver Kang et al., Nature 325,733-736 (1987). É conhecido que a forma de pintainho da APP consiste de 534 resíduos de aminoácido (SEQ ID No: 2) e é bastante semelhante à forma humana, sendo aproximadamente 95% homóloga a esta (ver o artigo de Kang et al. acima referido e Barnes et al., J Neurosci, 18 (15) 5869-5880 (1998). As sequências de aminoácido das formas humana e de pintainho de APP estão reproduzidas na figura 1 das figuras deste pedido.

Dois efeitos que se verificou ocorrerem no cérebro de uma pessoa que sofre de Alzheimer são a formação de massas emaranhadas de proteína fora das células nervosas e a formação de uma proteína diferente dentro das células do cérebro. As proteínas extracelulares são conhecidas por serem agregados de polipéptidos com sequências de aminoácido que correspondem a porções da parte extracelular da APP. As massas emaranhadas 2 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ destas proteínas são conhecidas como placas amilóides. As proteínas intracelulares são conhecidas como proteínas tau. Não é conhecido, no entanto, se qualquer uma, ou ambas, a acumulação extracelular de placas amilóides e a acumulação intracelular de proteínas tau são as causas ou os sintomas de Alzheimer e doenças neurodegenerativas relacionadas, do tipo Alzheimer. A sequência de aminoácidos do fragmento de polipéptido β-amilóide (1-42) é idêntica nas formas humana e de pintainho de APP e consiste dos resíduos de aminoácido 597 a 638 na forma humana e resíduos 436 a 4 77 na forma de pintainho, (ver os artigos de Kang et al. e Barnes et al. acima referidos).

DEFINIÇÕES

As expressões seguintes são utilizadas neste pedido e têm os significados seguintes, excepto quando indicado em contrário pelo contexto: APP APP humana APP de pintainho RERMS APP 328-332 SMRER APP 332-328 Domínio Αβ β-amilóide 12-28 significa "proteína precursora de amilóide"; significa a forma humana de APP; significa a forma de pintainho de APP; significa o pentapéptido Arg-Glu-Arg-Met-Ser (SEQ ID No: 3); também significa o pentapéptido Arg-Glu-Arg-Met-Ser (SEQ ID No: 3) que corresponde aos resíduos de aminoácido 328 a 332 da APP humana; significa o pentapéptido Ser-Met-Arg-Glu-Arg (SEQ ID No: 4); significa o mesmo que SMRER; significa o domínio de APP que forma placas β-amilóides; significa a sequência de resíduos de aminoácido que é parte do domínio Αβ da APP humana, sendo a sequência 3 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys (SEQ ID No:8) que corresponde aos resíduos de aminoácido 608 a 624 de APP humana e aminoácidos 447 a 463 de APP de APP de pintainho; RSAER ΑΡΡ 319-335

RER ΑΡΡ 328-330 AC-RER RERM ΑΡΡ 328-331 MRER ΑΡΡ 331-328 Aminoácido, significa o pentapéptido Arg-Ser-Ala-Glu-Arg (SEQ ID No: 5); significa o polipéptido Ala-Lys-Glu-Arg-Leu-Glu-Ala-Lys-His-Arg-Glu-Arg-Met-Ser-Gln-Val-Met (AKERLEAKHRERMSQVM) (SEQ ID No:6); significa o tripéptido Arg-Glu-Arg (SEQ ID No : 9); significa o mesmo que RER; significa RER em que um dos átomos de hidrogénio do grupo -NH2 no terminal-N foi substituído por um grupo acetilo; a fórmula estrutural de Ac-RER é dada a seguir; significa o tetrapéptido Arg-Glu-Arg-Met (SEQ ID No: 10); significa o mesmo que RERM; significa o tetrapéptido Met-Arg-Glu-Arg (SEQ ID No: 11); significa o mesmo que MRER; tal como aqui utilizado, pretende incluir quer aminoácidos naturais, quer sintéticos, e quer aminoácidos D, quer L;

Aminoácido convencional significa qualquer dos vinte L- aminoácidos convencionais, normalmente encontrados em péptidos que ocorrem naturalmente;

Aminoácido não significa qualquer aminoácido convencional diferente dos aminoácidos convencionais, independentemente de ser preparado de forma sintética ou 4 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ derivado de uma fonte natural; tal como aqui utilizado, "aminoácido sintético" também inclui aminoácidos modificados quimicamente, incluindo, mas não se limitando a sais, derivados de aminoácido (tais como amidas), e substituições. Os aminoácidos contidos nos péptidos da presente invenção, e em particular no terminal-carboxilo ou amino, podem ser modificados por metilação, amidação, acetilação ou substituição com outros grupos químicos que podem alterar a semi-vida circulante do péptido sem afectar de forma adversa a sua actividade; adicionalmente, uma ligação dissulfureto pode estar presente ou ausente nos péptidos da invenção;

Derivado inclui qualquer péptido produzido com um fim, que na sua totalidade, ou em parte, tem uma sequência de aminoácidos substancialmente semelhante aos presentes compostos; os derivados dos presentes compostos podem caracterizar-se por substituições, eliminações, adições ou substituições de aminoácido, únicas ou múltiplas; estes derivados podem incluir (a) derivados em que um ou mais resíduos de aminoácido dos presentes compostos são substituídos com aminoácidos conservativos ou não conservativos; (b) derivados em que um ou mais aminoácidos são adicionados aos presentes compostos; (c) derivados em que um ou mais dos aminoácidos dos presentes compostos incluem um grupo substituinte; (d) derivados em que os presentes compostos ou uma sua porção são fundidos com outro EP 1 381 627/PT 5 APP 296-335, APP 317- péptido (e. g., albumina de soro ou domínio de transdução de proteína); (e) derivados em que um ou mais resíduos de aminoácido não convencionais (i. e., os diferentes dos 20 L-aminoácidos convencionais encontrados em proteínas que ocorrem naturalmente) são incorporados ou substituídos na sequência dos presentes compostos; e (f) derivados em que um ou mais grupos de ligação não-aminoácido são incorporados em, ou substituem uma porção dos presentes compostos; têm o significado indicado nas 332, ΑΡΡ 321-335, ΑΡΡ tabelas 1 e 2 a seguir 319-332, APP 321-332, APP 321-331, APP 325335, APP 321-330, APP 327-332 e APP 316-337

Ao longo deste pedido e suas reivindicações as sequências de aminoácido são escritas utilizando as abreviaturas convencionais de uma letra ou três letras. Todas as sequências são escritas da esquerda para a direita na direcção do terminal-N para o terminal-C. 0 seguinte termo é definido como se segue:

Sequência de ordem inversa, tal como aqui utilizado, a sequência de ordem inversa de uma sequência particular é uma sequência em que a ordem dos resíduos de aminoácido é inversa, em comparação com a sequência particular, quando se faz a leitura na direcção do terminal-N para o terminal-C e vice-versa; assim, por exemplo, SMRER é a sequência de ordem inversa de RERMS, sendo cada uma lida como referido acima da esquerda para a direita, na direcção do terminal-N para o 6 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ terminal-C; adicionalmente, MVQSMRERHKAELREKA (SEQ ID No: 7) (também designado aqui como APP 335-319) é a sequência de ordem inversa de APP 319-335 definida acima. O documento WO-A-94/09808 (The Regents of The University of Califórnia, inventor T Saito) e T Saito e vários co-autores em j. Neuroscience 14 5461-5470 (1994), J. Neurobiol. 25_, 585-594 (1994) e J. Cell Biol. 121, 879-886 (1993) descrevem alguns polipéptidos que correspondem a partes da APP humana. Estes polipéptidos consistem do seguinte:

Tabela 1 N° de residuos de aminoácido Parte da APP humana correspondente Sequência SEQ ID NO. 40 APP 296-335 TPDAVDKYLETPGDENEHAHF QKAKERLEAKHRERMSQVM [Thr-Pro-Asp-Ala-Val- Asp-Lys-Tyr-Leu-Glu- Thr-Pro-Gly-Asp-Glu- Asn-Glu-His-Ala-His- Phe-Gln-Lys-Ala-Lys- Glu-Arg-Leu-Glu-Ala- Lys-His-Arg-Glu-Arg- Met-Ser-Gln-Val-Met] 22 17 APP 319-335 AKERLEAKHRERMSQVM [Ala-Lys-Glu-Arg-Leu- Glu-Ala-Lys-His-Arg- Glu-Arg-Met-Ser-Gln- Val-Met] 6 16 APP 317-332 QKAKERLEAKHRERMS [Gln-Lys-Ala-Lys-Glu-Arg - Leu - Glu - Ala - Ly s-His-Arg-Glu-Arg-Met-Ser] 12 7 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ Ν° de resíduos de aminoácido Parte da APP humana correspondente Sequência SEQ ID NO. 15 APP 321-335 ERLEAKHRERMSQVM [Glu-Arg-Leu-Glu- Ala-Lys-His-Arg-Glu-Arg-Met-Ser-Gln-Val-Met] 13 14 APP 319-332 AKERLEAKHRERMS [Ala-Lys-Glu-Arg-Leu-Glu-Ala-Lys-His-Arg-Glu-Arq-Met-Ser] 14 12 APP 321-332 ERLEAKHRERMS (Glu-Arg-Leu-Glu-Ala- Lys-His-Arg-Glu-Arg- Met-Ser] 15 11 APP 321-331 ERLEAKHRERM [Glu-Arg-Leu-Glu-Ala- Lys-His-Arg-Glu-Arg- Met] 16 11 APP 325-335 AKHRERMSQVM [Ala-Lys-His-Arg-Glu- Arg-Met-Ser-Gln-Val- Met] 17 10 APP 321-330 ERLEAKHRER [Glu-Arg-Leu-Glu-Ala-Lya-His-Arg-Glu-Arg] 18 6 APP 327-332 HRERMS [His-Arg-Glu-Arg-Met- Ser] 19 5 APP 328-332 RERMS, [Arg-Glu-Arg-Met-Ser] 3 4 APP 328-331 RERM [Arg-Glu-Arg-Met] 10 3 APP 328-330 RER [Arg-Glu-Arg] 9 8 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

As mesmas publicações também se referem ao polipéptido 17-mero que é a sequência de ordem inversa de APP 319335 (como definido acima). A sequência de ordem inversa também é aqui identificada como APP 335-319. G Multhorp et al. em J. Mol Recognition 8, 247-257 (1995) descrevem o seguinte polipéptido que também corresponde a parte da APP humana:

Tabela 2 N° de resíduos de aminoácido Parte da APP humana correspondente Sequência SEQ ID NO. 22 APP 316-337 FQKAKERLEAKHRERMSQVMRE (Phe-Gln-Lys-Ala-Lys- Glu-Arg-Leu-Glu-Ala- Lys-His-Arg-Glu-Arg- Met-Ser-Gln-Val**Met- Arg-Glu] 20

Mileusnic R et al. European Journal of Neuroscience, vol. 12 no. Suplemento 11, página 314 (24 Junho 2000) descrevem que a injecção de RERMS ou SMRER 30 min antes do treino de memória (um tarefa de esquiva passiva de teste: pintainhos com um dia de pré-treino de idade) reverteu a amnésia induzida por APP antisentido nos referidos pintainhos (resumo). O documento WO-A-97/00063 descreve um polipéptido que compreende a sequência RER no seu terminal-C (página 61, exemplo XXI), sendo referido (página 61, linhas 7-9) que este é um agente bloqueador potencialmente superior para aumentar a quantidade disponível de CFR e/ou Ucn, sendo mais à frente referido (página 61, linhas 24-27) que este tem aplicação na modificação da disposição, aprendizagem, memória e comportamento de indivíduos normais e com distúrbios mentais (doença de Alzheimer: página 64, linhas 22-24),(página 61, linhas 24-27, reivindicação 36). Pode-se incorporar uma amida ΕΡ 1 381 627/ΡΤ substituída (metilamida, etilamida) no terminal-C (página 67, linhas 7-10).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo: (a) um composto com a fórmula: 0 0 0 II H CH—C-N— I II H II —CH—C-N-CH—C- 1 1 1 ch2 I 1 ch2 1 çh2 1 CH2 1 çh2 1 ch2 I ch2 I 1 c=o I 1 ch2 I 1 NH I 1 OH 1 NH 1 I C=NH I X z II —o— 1 nh2 nh2 em que Xi é um grupo acilo representado pela fórmula: o

II -c- X2 é H ou um grupo acilo representado pela fórmula: e R representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo substituído com alquilo ou não substituído, um grupo aralquilo de cadeia linear ou ramificada, ou um grupo arilo substituído com alquilo ou não substituído, sendo os grupos R iguais ou diferentes quando estão presentes dois, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável. A invenção também proporciona um método não terapêutico, não cirúrgico para produzir um efeito de melhoria cognitiva num animal, compreendendo proporcionar um animal no qual se pretende produzir o efeito; e 10 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ administrar ao animal uma quantidade de um composto eficaz para produzir a melhoria cognitiva, em que o composto tem a fórmula: 0 II 0 || 0 || II H CH—C-N- II -CH—c— H —N-CH- | II -C-OH ch2 | CHa | 1 ÇH2 1 CH, | 1 CHj, 1 1 CH, | 1 ch2 1 c=o | 1 ch2 NH | 1 OH NH | 1 C=NH | 1 c= | =NH 1 NHZ 1 nh2 em que Xi é um grupo acilo representado pela fórmula: R-C- X2 é H ou um grupo acilo representado pela fórmula: R-C- e R representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo substituído com alquilo ou não substituído, um grupo aralquilo de cadeia linear ou ramificada, ou um grupo arilo substituído com alquilo ou não substituído, sendo os grupos R iguais ou diferentes, quando estão presentes dois.

De preferência X2 é H.

Com vantagem, R representa um grupo alquilo de Ci a Ce de cadeia linear ou ramificada.

Mais preferencialmente, R é um grupo metilo.

Exemplos de grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada são grupos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, t-butilo, pentilo e hexilo. Exemplos de 11 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ grupos cicloalquilo substituídos ou não substituídos são grupos metilciclohexilo e ciclohexilo. Exemplos de grupos aralquilo de cadeia linear ou ramificada, substituídos ou não substituídos, são um grupo benzilo. Exemplos de grupos arilo substituídos ou não substituídos são grupos fenilo e tolilo.

Os grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada são particularmente preferidos para R. 0 composto da invenção pode ser fisicamente ligado a outra molécula ou veículo para a entrega farmacêutica do composto. A invenção compreende também um composto como definido acima, para utilização em medicina e a utilização deste composto na preparação de medicamentos para o tratamento de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer, e como agente de melhoria cognitiva. A utilização medicinal é preferencialmente o tratamento de uma doença neurodegenerativa, mais preferencialmente o tratamento da doença de Alzheimer.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As figuras deste pedido consistem do seguinte: A Figura 1 que mostra a sequência de aminoácidos de app humana e APP de pintainho, como mencionado acima; A Figura 2 mostra o efeito do polipéptido β-amilóide 12-28 na formação de memória; A Figura 3 mostra o efeito de RERMS na amnésia induzida por β-amilóide 12-28; A Figura 4 mostra o efeito de RERMS na amnésia induzida por anti-APP; A Figura 5 mostra o efeito de RERMS, SMRER e RSAER na amnésia induzida por APP-antisentido; 12 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ A Figura 6 mostra ο efeito de ΑΡΡ 319-335 na amnésia induzida por APP-antisentido; A Figura 7 mostra o efeito de RERMS num treino fraco; A Figura 8 mostra o efeito de APP 319-335 num treino fraco; A Figura 9 mostra o efeito de RER num treino fraco; A Figura 10 mostra o efeito de RER e Ac-RER na amnésia induzida por β-amilóide 12-28; A Figura 11 mostra o efeito de Ac-RER num treino fraco; A Figura 12 mostra o efeito de doses diferentes de RER e

Ac-RER; e A Figura 13 mostra o efeito de Ac-RER na amnésia induzida por β-amilóide 1228.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção será em seguida descrita a título de exemplo com referência aos seguintes procedimentos e resultados experimentais. Os péptidos RER, RERMS, SMRER, RSAER e APP 319-335 referidos estão fora do âmbito da invenção.

Materiais e métodos

Animais e treino

Incubaram-se e chocaram-se ovos de Ross Chunky obtidos comercialmente, em incubadoras e mantiveram-se até 16+6 horas de idade. Os pintainhos foram colocados aos pares em pequenas bandejas de aluminio.

Após um período de equilíbrio de uma hora, os pintainhos foram pré-treinados e treinados essencialmente como descrito por Lossner e Rose (J. Neurochem. 41,1357-1363 (1983). O pré-treino envolveu três apresentações de 10 s de uma pérola branca pequena (2 mm de diâmetro), a intervalos de aproximadamente 5 minutos. Os pintainhos que não conseguiram 13 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ dar bicadas na pérola pelo menos duas vezes em três apresentações (menos de 5%), não foram utilizados subsequentemente, mas permaneceram nas suas bandejas durante a experiência. Utilizaram-se duas técnicas de treino: treino "forte" e "fraco". Em ambos, 5 a 10 minutos após o último ensaio de pré-treino, os pintainhos foram treinados por uma apresentação de 10 s de uma pérola cromada com 4 mm de diâmetro que tinha sido mergulhada em metilantranilato de sabor amargo.

Os pintainhos de controlo deram bicadas numa pérola humedecida ou seca. Na versão "forte" da tarefa, utilizou-se metilantranilato a 100%. Na versão "fraca", utilizou-se metilantranilato a 10%. Os pintainhos deram espontaneamente bicadas nas pérolas de treino ou controlo no espaço de 20 s. Os pintainhos que deram bicadas na pérola amarga evidenciaram uma reacção de desagrado e normalmente não tornaram a dar bicadas numa pérola semelhante, mas seca, durante algumas horas subsequentes. A vários tempos após o treino, os pintainhos foram testados, sendo-lhes oferecida uma pérola cromada de 4 mm de diâmetro, seca, seguido 10 minutos mais tarde de uma pérola branca pequena (2 mm de diâmetro), cada uma durante 20 a 30 s. Os animais foram testados por um experimentador cego em relação ao tratamento que cada pintainho tinha recebido. Considera-se que os pintainhos se lembram da tarefa se evitam a pérola cromada durante o teste, mas dão bicadas na pérola branca (discriminam), e que se esqueceram se dão bicadas em ambas as pérolas. A reevocação é calculada como uma pontuação da percentagem de esquiva (percentagem de pintainhos que evitam a pérola cromada) e como uma pontuação de discriminação (percentagem de pintainhos que evitam a pérola cromada, mas dão bicadas na pérola branca). A utilização da pontuação de discriminação assegura que os pintainhos podem de facto ver e dar bicadas precisas na pérola; e deste modo a esquiva da pérola cromada não é devido a factores não específicos, como a falta de coordenação visual-motora, motivação, atenção, excitação, etc. mas é um acto positivo, demonstrando memória em relação ao estímulo desagradável. Cada pintainho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre grupos foram testadas quanto ao significado estatístico pelo teste-g descrito por Sokal e Rohlf (Biometry: the Principies and Practice of Statistics in 14 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

Biological Research (2a edição), w H Freeman, Nova Iorque (1981) . A validade desta tarefa de treino particular utilizada para determinar a formação de memória é amplamente discutida por Andrew (Neural and Behavioural Plasticity: the Use of the Domestic Chick as a Model, Oxford University Press, Oxford, RU (1991) .

Verificou-se que os pintainhos treinados na versão forte da tarefa reevocam a esquiva durante pelo menos 48 horas, e verificou-se que mais de 80% evitam e discriminam normalmente num teste às 24 horas. Deste modo, quando se administram agentes que são amnésicos - isto é, fazem com que o pintainho não se lembre - os pintainhos irão demonstrar o esquecimento ao dar bicadas, em vez de evitar, as pérolas cromadas durante o teste. Pelo contrário, verificou-se que os pintainhos normalmente se lembram da versão "fraca" da tarefa durante apenas algumas horas - cerca de 6 a 8 horas no total; sendo a retenção a 24 horas normalmente reduzida para cerca de 20 a 30%. Deste modo, a experiência de aprendizagem não está associada à memória a longo prazo. Podem-se assim testar agentes que melhoram a memória. Um agente que melhora a memória, administrado a um pintainho treinado na tarefa de aprendizagem fraca, produz um aumento na retenção a 24 horas-maior percentagem de esquiva da pérola cromada. Isto é, estes agentes de melhoria de memória ajudam a converter uma aprendizagem fraca em forte, permitindo a transição de memória de curto, para longo prazo.

Injecções de péptido

Injecções intracranianas bilaterais (2 pg/hemisfério) quer de solução salina, quer de soluções em solução salina de diferentes péptidos (0,5 a 5 pg/hemisfério) homólogos a diferentes regiões do dominio externo da APP humana foram injectadas intracerebralmente numa região especifica do cérebro, que se sabe ser necessária para a formação de memória (o estriado ventral intermédio) a diferentes pontos de tempo, pré- ou pós-treino, utilizando uma seringa Hamilton de 5 pg adaptada com uma manga de plástico para permitir uma penetração de 3 mm. No final da injecção, a agulha foi mantida no lugar durante 5 seg. A colocação correcta foi assegurada utilizando um suporte de cabeça concebido especialmente, 15 ΕΡ 1 381 627/PT descrito por Davis et al. (Physiol. Behav. 22,177-184 (1979), e foi monitorizada visualmente post-mortem, de forma rotineira. Os péptidos ou outras substâncias foram administrados a vários tempos antes ou após o protocolo de treino. Os pintainhos foram testados a diferentes pontos de tempo após o treino, como descrito acima. 0 comportamento geral dos pintainhos após as injecções foi observado, para se detectarem quaisquer potenciais reacções não especificas ou adversas às injecções.

Materiais de péptidos

Os polipéptidos administrados foram sintetizados utilizando um sintetizador de péptidos convencional, de um modo que é bem conhecido dos peritos na arte. Os polipéptidos sintetizados foram purificados utilizando RP-hplc e a pureza foi também verificada por espectrometria de massa (MALDI-TOF), sendo ambas as técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. Os polipéptidos após sintese foram mantidos num estado liofilizado sob atmosfera de árgon, em que o árgon preveniu a oxidação de cisteina, metionina, e triptofano, em particular. A sintese de polipéptidos como referido, é realizada pela MWG-Biotech UK Limited of Milton Keynes, RU. 0 RERMS também está disponível da Bachem Limited of St. Helens, Merseyside, RU. 0 Ac-RER pode ser sintetizado por técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. Foi obtido da Cambridge

Research Biochemicals Limited of Billingham, Cleveland, RU.

Para mais detalhes em relação aos métodos de síntese para a preparação de péptidos e derivados de péptidos, faz-se referência aos "Principies of Peptide Synthesis" de M. Bodanszky, 2a Edição (Springer Laboratory, 1993).

Resultados experimentais É bem conhecido em muitos sistemas de modelos animais para o estudo de memória que a injecção de β-amilóide e péptidos β-amilóides, tais como β-amilóide 12-28, tem como resultado que os animais não retêm memórias adquiridas recentemente. A Figura 2 mostra este resultado para um 16 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ pintainho; a injecção de β-amilóide 12-28 no cérebro 30 minutos antes de treinar os pintainhos na tarefa de esquiva passiva resulta em amnésia em animais testados 30 minutos depois. A Figura 2 mostra na metade do lado esquerdo a percentagem de esquiva medida em termos de esquiva total e discriminação para um controlo de solução salina e na metade do lado direito a percentagem de esquiva medida quando se injecta β-amilóide 12-28 como descrito acima, 30 minutos pré-treino e a memória é testada 30 minutos pós-treino.

No entanto, se a amnésia é induzida por injecção de β-amilóide 12-28 30 minutos pré-treino e o RERMS é injectado 20 minutos pré-treino, a retenção de memória é recuperada. A Figura 3 mostra que neste caso a memória é normal às 24 horas pós-treino. A Figura 3 mostra à esquerda a percentagem esquiva medida em termos de esquiva total e discriminação para um controlo de solução salina, no centro os resultados correspondentes quando o β-amilóide 12-28 é injectado 30 minutos pré-treino e a memória é testada 24 horas após o treino e à direita os resultados quando a injecção pré-treino de β-amilóide 12-28 é seguida 10 minutos mais tarde de RERMS e a memória é mais uma vez testada 24 horas após o treino.

Demonstra-se assim que o RERMS pode prevenir a perda de memória produzida pelo β-amilóide 12-28, um componente das placas amilóides caracteristicas da doença de Alzheimer. É conhecido que inibir a função normal da APP bloqueando o seu domínio externo com um anticorpo monoclonal específico (mb22Cll) pela altura do treino, apesar de não ter efeito na capacidade dos pintainhos aprenderem a resposta de esquiva passiva, impede a transição para a memória de longo prazo. O anticorpo monoclonal mb22Cll, disponível da Boehringer-Mannheim, reconhece especificamente um epítopo que consiste em parte do domínio externo de APP. A Figura 4 mostra à esquerda a percentagem de esquiva medida para pintainhos injectados com um controlo de solução salina, no centro a percentagem de esquiva medida quando o 17 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ mb22Cll é injectado (1-5 pg em 2 μΐ) intracerebralmente, como descrito anteriormente para injecções de péptido 30 minutos pré-treino e à direita, a percentagem de esquiva medida quando o RERMS também é injectado 25 minutos após o mb22Cll (5 minutos pré-teino). Em todos os casos, a memória foi testada 24 horas pós-treino.

Os resultados apresentados na Figura 4 demonstram que o RERMS injectado 5 minutos antes do treino impede a perda de memória induzida pelo anticorpo e que o péptido RERMS pode impedir a perda de memória induzida por anti-APP. Deste modo, o RERMS pode impedir a perda de memória resultante de inibir a função normal de APP.

As Figuras 5 e 6 mostram o efeito de induzir perda de memória por injecção de um oligodesoxinucleótido fosfodiéster 16-mero protegido na extremidade concebido para corresponder aos sítios de início da transcrição 146 e AUG1786 do ARNm de APP, imediatamente a montante de um sítio de ligação a ribozima. 0 oligodesoxinucleótido 5'-CCC GAG GAC TGA GCC A-3' (SEQ ID No: 21) foi também modificado no 2o e 13° nucleótidos para impedir a formação de laçadas internas e está disponível do King's College Molecular Medicine Unit, Londres, RU. O oligodesoxinucleótido foi utilizado em formas emaranhadas (SC) e de anti-sentido (AS) e administrado como descrito anteriormente para a administração de péptidos numa quantidade de 0,6 a 1,0 pg em 2 μΐ.

Numa primeira experiência, os pintainhos foram injectados com solução salina, RERMS, SMRER e RSAER em várias combinações, nas quantidades acima referidas.

Os resultados são apresentados na Figura 5 que mostra a percentagem de esquiva medida na tarefa de aprendizagem "forte" descrita anteriormente. A Figura 5a mostra o efeito comparado com um controlo de solução salina administrado separadamente do oligodesoxinucleótido SC, 12 horas pré-treino e oligodexosinucleótido AS 12 horas pré-treino, juntamente com o efeito de administrar RERMS após o oligodesoxinucleótido AS, 30 minutos pré-treino. A Figura 5a mostra que o oligodesoxinucleótido SC não teve efeito na memória, mas o composto AS tinha um efeito 18 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ significativo de perda de memória que foi evitado numa extensão substancial quando se administrou RERMS. A Figura 5b mostra que se obtiveram resultados semelhantes com o pentapéptido SMRER de ordem inversa. A Figura 5c mostra que o efeito obtido com RERMS e SMRER está ausente com o pentapéptido RSAER.

Numa segunda experiência, os oligodesoxcinucleótidos SC e AS foram administrados 12 horas pré-treino. Um polipéptidos (APP 319-335) que corresponde aos resíduos de aminoácido 319 a 335 da APP humana foi injectado 30 minutos pré-treino. Os pintainhos foram testados quanto à memória de acordo com a versão "forte" do teste descrito anteriormente, 30 minutos após o treino. A Figura 6 mostra sucessivamente a partir da esquerda: a percentagem de esquiva medida para um controlo de solução salina; a percentagem de esquiva medida quando o oligodesoxinucleótido SC foi administrado; A percentagem de esquiva medida quando o oligodesoxinucleótido AS foi administrado; e a percentagem de esquiva medida quando a APP 319-335 foi administrada 30 minutos pré-treino, após administração do oligodesoxinucleótido AS, 12 horas pré-treino. Cada resultado é apresentado quer em termos de esquiva total (coluna do lado esquerdo), quer de discriminação (coluna do lado direito).

Os resultados apresentados na Figura 6 demonstram que o APP 319335 pode impedir a perda de memória induzida pelo anti-sentido.

As Figuras 7 e 8 mostram os efeitos de RERMS e APP 319335 na memória em pintainhos treinados com o teste de memória "fraco", descrito anteriormente.

Como referido anteriormente, os pintainhos treinados com a versão fraca (treinados com metilantranilato a 10%) retêm memória de esquiva apenas durante cerca de 6 horas e em seguida esquecem-se. A Figura 7 mostra, à esquerda, os resultados da percentagem de esquiva (em termos de esquiva total e discriminação) para pintainhos treinados na versão "forte" do treino, no centro os resultados correspondentes 19 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ para treino "fraco" e à direita o efeito da administração de RERMS após treino "fraco". Os pintainhos foram testados quanto a memória 24 horas após o treino; o RERMS foi administrado de acordo com o procedimento descrito anteriormente, 30 minutos pré-treino. A Figura 8 mostra os resultados correspondentes obtidos quando o polipéptido APP 319-335 foi utilizado em vez de RERMS.

As Figuras 7 e 8 mostram que o RERMS e APP 319-335 se injectados antes de treinar os pintainhos na tarefa fraca, melhoram a memória às 24 horas. Deste modo, eles funcionam como agentes de melhoria cognitiva (agentes nootrópicos). Deste modo, o RERMS e APP 319-335 melhoram ambos a memória normal em animais treinados com a versão fraca. A Figura 9 mostra o efeito de RER na memória de pintainhos treinados com o teste de memória "fraco", descrito anteriormente.

Como referido anteriormente, os pintainhos treinados com a versão fraca (treinados com metilantranilato a 10%) retêm a memória de esquiva durante apenas cerca de 6 horas e depois esquecem-se. A Figura 9 mostra, nas três colunas à esquerda, à esquerda os resultados da percentagem de esquiva (em termos de esquiva total) para pintainhos treinados na versão "forte" treino, no centro os resultados correspondentes para treino "fraco" e, à direita, o efeito de administrar RER após um treino "fraco". Os pintainhos foram testados quanto à memória 24 horas após o treino; o RER foi administrado de acordo com o procedimento descrito anteriormente, 30 minutos pré-treino. A Figure 9 mostra à direita os dados correspondentes em termos de discriminação. A Figura 9 mostra que o RER, se injectado antes de treinar os pintainhos com a tarefa fraca aumenta a memória às 24 horas. Deste modo, funciona como agente de melhoria cognitiva (agente nootrópico). Deste modo, o RER aumenta a memória normal em animais treinados com a versão fraca. 20 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ A Figura 10 mostra ο efeito de RER e Ac-RER na amnésia induzida por β-amilóide 12-28 em pintainhos treinados com o teste de memória "forte" descrito anteriormente. A Figura 10 mostra da esquerda para a direita a percentagem de esquiva medida em termos de esquiva total e discriminação para - pintainhos treinados com a versão "forte" do treino; o efeito amnésico de β-amilóide 12-28 administrado a 2 pg/hemisfério, 30 mins antes do treino; - o efeito de RER administrado a 2 pg/hemisfério, 20 mins antes do treino após administração de β-amilóide 12-28, 30 mins antes do treino; e - o efeito de Ac-RER administrado a 2 pg/hemisfério, 20 mins antes do treino, após administração de β-amilóide 12-28, 30 mins antes do treino.

Os resultados na figura 10 mostram que ambos, RER e Ac-RER têm o efeito de recuperar a memória, medido 20 mins após administração de RER ou Ac-RER, após amnésia induzida por administração de β-amilóide 12-28.

Os resultados também mostram que o efeito de recuperação de memória de Ac-RER é menor que o de RER, mas indicam que o Ac-RER é mais estável após administração e deste modo mais adequado para administração periférica. A Figura 11 mostra o efeito de Ac-RER na memória em pintainhos treinados com o teste de memória "fraco", descrito anteriormente. A Figura 11 mostra da esquerda para a direita a percentagem de esquiva medida em termos de esquiva total e discriminação para - pintainhos treinados com a versão "forte" do treino: - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino; - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino após ter sido administrado Ac-RER a 2 pg/hemisfério, com 30 mins de antecedência; e 21 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino após o Ac-RER ter sido administrado a 2 pg/hemisfério, com 60 mins de antecedência.

Os resultados na figura 11 mostram que o Ac-RER tem o efeito de melhorar a memória de pintainhos treinados com a versão fraca, quando administrado com 30 ou 60 minutos de antecedência. Os resultados também mostram que o efeito 60 minutos após a administração ainda é significativo, embora menor do que 30 minutos após a administração.

Os resultados mostram portanto que o Ac-RER tem o efeito de um agente de melhoria cognitiva e que o efeito é aparente durante um período de tempo significativo. A Figura 12 mostra o efeito de diferentes doses de RER e Ac-RER na memória de pintainhos treinados com o teste de memória "fraco", descrito anteriormente. A Figure 12 mostra da esquerda para a direita a percentagem esquiva medida em termos de esquiva total e discriminação para - pintainhos treinados com a versão "forte" do treino; - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino; - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino após se ter administrado RER com 30 min de antecedência a 0,2 pg/hemisfério; - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino após se ter administrado RER com 30 mins de antecedência, a 1,0 pg/hemisfério; - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino, após se ter administrado RER com 30 mins de antecedência, a 2,0 pg/hemisfério; - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino, após se ter administrado Ac-RER com 30 mins de antecedência, a 4.0 pg/hemisfério; e - pintainhos treinados com a versão "fraca" do treino, após se ter administrado Ac-RER com 30 mins de antecedência, a 6.0 pg/hemisfério. 22 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

Os resultados na Figura 12 mostram que ambos, RER e AC-RER têm o efeito de melhorar a memória de pintainhos treinados com a versão fraca quando administrados com 30 minutos de antecedência e que são necessárias doses mais elevadas de Ac-RER em relação a RER para se obter um efeito comparável.

Os resultados mostram assim que é necessário utilizar quantidades maiores de Ac-RER, em comparação com RER, como agente de melhoria cognitiva. Isto indica, mais uma vez, que o Ac-RER é mais estável após administração do que o RER e, deste modo, mais adequado para administração periférica. A Figura 13 mostra o efeito de Ac-RER administrado a diferentes tempos na amnésia induzida por β-amilóide 12-28 em pintainhos treinados com o teste de memória "forte" descrito anteriormente. A Figura 13 mostra da esquerda para a direita a percentagem de esquiva, medida em termos de esquiva total e discriminação para - pintainhos treinados com a versão "forte" do treino; o efeito amnésico de β-amilóide 12-28 administrado a 2 pg/hemisfério 30 mins antes do treino ; - o efeito de recuperação de memória de Ac-RER administrado a 4 pg/hemisfério, 60 mins antes do treino e 30 mins antes da administração de β-amilóide 12-28 a 2 pg/hemisfério; - o efeito de recuperação de memória de Ac-RER administrado a 4 pg/hemisfério 20 mins antes do treino e 10 mins após a administração de β-amilóide 12-28 a 2 pg/hemisfério; e - o efeito de recuperação de memória de Ac-RER administrado a 4 pg/hemisfério, juntamente com β-amilóide 12-28 a 2 pg/hemisfério, 30 mins antes do treino.

Os resultados da figura 13 mostram que o Ac-RER tem o efeito de recuperar a memória quando a amnésia foi induzida por β-amilóide 12-28. O efeito manifesta-se independentemente de o Ac-RER ser administrado antes, após ou em simultâneo com o β-amilóide 12-28 indutor de amnésia. O papel de APP na formação de memória foi atribuído ao seu envolvimento nos processos de adesão das células ao 23 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ substrato. Os dados referidos sugerem que o envolvimento da APP na formação de memória envolve muito provavelmente alteração em fenómenos de transdução de sinal. 0 tempo após o treino durante o qual o anticorpo e anti-sentido induziram a amnésia e durante o qual o RER, Ac-RER, RERMS e SMRER previnem a amnésia, corresponde ao tempo durante o qual a formação de memória é vulnerável à inibição das funções de transdução de sinal putativas da APP. 0 sistema dos pintainhos é bom para explorar estas questões pois a tarefa de aprendizagem é precisa e ocorre num tempo bem definido e permite também assegurar que qualquer efeito observado de uma substância injectada é especifico da retenção e não da aquisição ou de processos concomitantes, tais como acuidade visual, excitação ou actividade motora. Adicionalmente, o papel de outras moléculas de adesão celular na cascata que leva à modulação sináptica foi bem mapeado, pelo que os efeitos quer de bloquear, quer de tentar recuperar a actividade de APP funcional podem ser estabelecidos num contexto definido: ver Rose, Learn. Memory 1_, 1-17 (2000) .

Assim, os resultados experimentais descritos acima indicam que os compostos da presente invenção são eficazes para o tratamento e/ou prevenção de doenças e distúrbios neurológicos e como potenciadores cognitivos (agentes nootrópicos) em outros animais, incluindo mamíferos humanos e não humanos. Os compostos são portanto eficazes no tratamento e/ou prevenção da doença de Alzheimer em humanos e outras doenças ou distúrbios neurodegenerativos em animais em geral, incluindo humanos. Estes animais incluem animais transgénicos e outros modelos animais para a doença de Alzheimer.

Tal como aqui utilizado, excepto quando indicado em contrário pelo contexto, os termos "tratamento", "tratar" e expressões análogas utilizadas em relação a doenças neurodegenerativas incluem no seu âmbito não só o tratamento quando os sintomas são aparentes, mas também a prevenção parcial ou total destas doenças e o atraso do seu inicio em pacientes ou animais que são submetidos a tratamento antes do inicio da doença, ou antes de os seus sintomas serem evidentes. 24 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

Os compostos da presente invenção podem ser administrados intracerebralmente como descrito acima, ou podem ser administrados perifericamente, por exemplo intramuscular, intravenosa, transdérmica ou oralmente, de preferência após complexação como descrito acima. Em vez de, ou adicionalmente, os compostos podem ser protegidos contra alteração entre administração e eficácia, por exemplo por adição de grupos protectores.

Os resultados experimentais das Figuras 10 a 13 mostram que os derivados de polipéptido da presente invenção, em particular Ac-RER, são eficazes durante períodos de tempo maiores após a administração do que os seus análogos que não possuem grupos protectores e são portanto particularmente adequados para administração periférica.

Os compostos da presente invenção também podem ser formulados como composições farmacêuticas, como referido anteriormente, em particular composições como as que são capazes de atravessar a barreira hemato-encefálica e são, deste modo, adequadas para administração periférica.

Em todos os casos, uma dose adequada de compostos peptídicos de acordo com a invenção é de 10 a 100 pg/kg de peso corporal do animal a ser tratado.

Tal como aqui utilizado, o termo "eficaz para tratar" no contexto de uma doença neurodegenerativa significa a quantidade do(s) composto (s) utilizado(s) no tratamento que provoca a redução ou estabilização ou, consoante o caso, previne ou atrasa o aparecimento destes sintomas, tal como medido por critérios médicos ou psicológicos convencionais, por exemplo como descrito em Handbook of Memory Disorders (eds: A D Baddeley, B A Wilson e F N Watts), Wiley (1995).

Tal como aqui utilizado, o termo "eficaz para tratar" em relação a uma melhoria cognitiva significa uma quantidade do (s) composto(s) utilizado(s) no tratamento que provoca uma melhoria no poder cognitivo, tal como medido por critérios psicológicos, por exemplo como descrito no Handbook of Memory Disorders (eds: A D Baddeley, B A Wilson and F N Watts), Wiley (1995) . 25 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

TEXTO LIVRE DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO. Texto livre <223> 3 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 5-mero 4 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 5-mero 5 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 5-mero 6 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 17-mero 7 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 17-mero 8 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 17-mero 9 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 3-mero 10 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 4-mero 11 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 4-mero 12 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 16-mero 13 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 15-mero 14 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 14-mero 15 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 12-mero 16 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 11-mero 17 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 11-mero 18 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 10-mero 19 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 6-mero 20 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 22-mero 21 Descrição de Sequência Artificial: oligonucleótido 16-mero de extremidades protegidas modificado nas posições 2 & 13 para prevenir a formação de laçadas internas 22 Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 40-mero 26 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> The Open university <110> Steven Peter Russell Rose, <110> Radmila Mileusnic, < 120> Polipéptidos, seus derivados e suas utilizações

<130> RA/P301588WO <140> PCT/GB02/xxxxx <141> 2002-04-17 <150> GB 0109558.7 <151> 2001-04-18 <150> GB 0120084.9 <151> 2001-08-17 <150> US 09/998491 <151> 2001-11-30 <150> GB 0207387.2 <151> 2002-03-28 <160> 22 <170> Patentín ver. 2.1 < 210 > 1

<211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 15 10 15

Ala Leu Glu vai Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30

Gin lie Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn vai Gin 35 40 45

Asn Gly Lys Trp Asp ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys lie Asp 50 55 60

Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gin Tyr cys Gin Glu Vai Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80

Gin He Thr Asn Vai vai Glu Ala Asn Gin Pro vai Thr He Gin Asn 85 90 95

Trp Cys Lys Ara Gly Arg Lys Gin Cys Lys Thr His Pro His Phe Vai 100 105 lio ile Pro Tyr Ara Cys Leu vai Gly Glu Phe vai Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 val Pro asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gin Glu Arg Met Asp Vai cys 130 135 140

Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr cys ser Glu 145 150 155 160

Lys ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly ile 27 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 165 170 175

Asp Lys Phe Arg Gly Vai Glu Phe Vai Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190

Ser Asp Asn vai Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp ser Asp Vai 195 200 205

Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 val vai Glu vai Ala Glu Glu Glu Glu Vai Ala Glu vai Glu Glu Glu 225 230 235 240

Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu val Glu Glu 245 250 255

Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser ile 260 265 270

Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu ser val Glu Glu val val Arg 275 280 285

Val Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu 290 295 300

Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys 305 310 315 320

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met ser Gin val Met Arg 325 330 335

Glu Trp Glu Glu Ala Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp 340 345 350

Lys Lys Ala val lie Gin His Phe Gin Glu Lys Val Glu ser Leu Glu 355 360 365

Gin Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gin Gin Leu val Glu Thr His Met Ala 370 375 380

Arg val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn 385 390 395 400

Tyr Ile Thr Ala Leu Gin Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe 405 410 415

Asn Met Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His 420 425 430

Thr Leu Lys His Phe Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala 435 440 445

Ala Gin ile Arg ser Gin val Met Thr His Leu Arg val ile Tyr Glu 450 455 460

Arg Met Asn Gin Ser Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala val Ala 465 470 475 480

Glu Glu Ile Gin Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn 485 490 495

Tyr ser Asp Asp val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser 500 505 510

Tyr Gly Asn Asp Ala Leu Met pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr 515 520 525

Val Glu Leu Leu Pro Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gin 28 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 530 535 540 pro Trp His ser Phe Gly Ala Asp Ser val pro Ala Asn Thr Glu Asn 545 550 555 560 Glu vai Glu pro Vai Asp Ala Arg pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr 565 570 575 Thr Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser 580 585 590 Glu vai Lys Met Asp Ala Glu phe Arg His Asp ser Gly Tyr Glu Val 595 600 605 His His Gin Lys Leu Val Phe phe Ala Glu A5P val Gly Ser Asn Lys 610 615 620 Gly Ala lie He Gly Leu Met val Gly Gly val val Ile Ala Thr val 62S 630 635 640 lie vai lie Thr Leu 645 val Met Leu Lys Lys 650 Lys Gin Tyr Thr Ser 655 ile His His Gly Vai vai Glu val Asp Ala Ala val Thr Pro Glu Glu Arg 660 665 670 His Leu ser Lys Met Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn pro Thr Tyr Lys 675 680 685 Phe Phe Glu Gin Met Gin Asn 690 695 < 210 > 2 <211> 534

< 212 > PRT <213> Gallus gallus < 4 0 0 > 2

Gly Met Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile Asp 15 10 15

Lys Phe Arg Gly vai Glu Phe Vai Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu Ser 20 25 30

Asp Asn Leu Asp Ser Ala Asp Ala Glu Asp Asp Asp ser Asp vai Trp 35 40 45

Trp Gly Gly Ala Asp Ala Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Asp Asp Lys Vai 50 55

Vai Glu Glu Gin pro Glu Glu Asp Glu Glu Leu Thr Vai Vai Glu Asp 65 70 75 80

Glu Asp Ala Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Gly Asp Glu rle Glu Glu 85 90 95

Thr Glu Glu Glu Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr sar lie Ala 100 105 HO

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser vai Glu Glu vai vai Arg vai 115 120 125

Pro Thr Thr Ala Ala Ser Thr Pro Asp Ala vai Asp Lys Tyr Leu Glu 130 135 140

Thr Pro Gly Asp Glu Asn Glu His Ala His Phe Gin Lys Ala Lys Glu 145 150 155 160 29 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ

Arg Leu slu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Vai Met Arg Glu 165 170 175 trp Glu Glu Ala Glu Arg Gin Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys 180 185 190

Lys Ala vai lie Gin His Phe Gin Glu Lys vai Glu Ser Leu Glu Gin 195 200 205

Glu Ala Ala Asn Glu Arg Gin Gin Leu vai Glu Thr His Met Ala Arg 210 215 220 val Glu Ala Met Leu Asn Asp Arg Arg Arg lie Ala Leu Glu Asn Tyr 225 230 235 240 lie Thr Ala Leu Gin Thr Val Pro Pro Arg Pro Arg His val Phe Asn 245 250 255

Met Leu Lys Lys Tyr val Arg Ala Glu Gin Lys Asp Arg Gin His Thr 260 265 270

Leu Lys His Phe Glu His val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala 275 280 285

Gin Ile Arg Ser Gin val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg 290 295 300

Met Asn Gin Ser Leu Ser Phe Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu 305 310 315 320

Glu Ile Gin Asp Glu Val Asp Glu Leu Leu Gin Lys Glu Gin Asn Tyr 325 330 335 ser Asp Asp val Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu pro Arg Ile Ser Tyr 340 345 350

Gly Asn Asp Ala Leu Met Pro ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr val 355 360 365

Glu Leu Leu Pro val Asp Gly Glu Phe ser Leu Asp Asp Leu Gin Pro 370 375 380

Trp His Pro Phe Gly val Asp ser val pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu 385 390 395 400

Val Glu Pro Val Asp Ala Arg pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr 405 410 415

Arg Pro Gly Ser Gly Leu Thr Asn Val Lys Thr Glu Glu Val Ser Glu 420 425 430

Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His 435 440 445

His Gin Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp val Gly ser Asn Lys Gly 450 455 460

Ala ile ile Gly Leu Met val Gly Gly val Val ile Ala Thr val ile 465 470 475 480 val ile Thr Leu val Met Leu Lys Lys Lys Gin Tyr Thr Ser ile His 485 490 495

His Gly val val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His 500 505 510

Leu ser Lys Met Gin Gin Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe SIS 520 525

Phe Glu Gin Met Gin Asn 530 < 210 > 3 <211> 5

< 212 > PRT <213> Sequência artificial 30 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 5-mero < 4 0 0 > 3

Ar^ Glu Arg Met Ser

<210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 5-mero < 4 0 0 > 4

Ser Met Arg Glu Arg

<210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 5-mero < 4 0 0 > 5

Ar^ ser Ala Glu Arg

<210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 17-mero < 4 0 0 > 6

Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin Vai 15 10 15

Met

<210> 7 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 17-mero < 4 0 0 > 7

Met Val Gin Ser Met Arg Glu Arg His Lys Ala Glu Leu Arg Glu Lys 15 10 IS

Ala 31 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ <210> 8 <211> 17

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 17-mero < 4 0 0 > 8 vai His His Gin Lys Leu vai Phe Phe Ala Glu Asp vai Gly Ser Asn 15 10 15

Lys

<210> 9 <211> 3 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 3-mero < 4 0 0 > 9

Arg Glu Arg

<210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 4-mero < 4 0 0 > 10 Arg Glu Arg Met

<210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 4-mero < 4 0 0 > 11 Met Arg Glu Arg

<210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 16-mero < 4 0 0 > 12

Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser 15 10 15 32 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ < 210 > 13 <211> 15

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 15-mero < 4 0 0 > 13

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gin vai Met 15 10 15 <210> 14 <211> 14

< 212 > PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 14-mero < 4 0 0 > 14

Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met Ser 1 5 10 < 210 > 15 <211> 12

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 12-mero < 4 0 0 > 15

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met ser 1 5 10

<210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 11-mero <400> 16

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met 15 10

<210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 11-mero < 4 0 0 > 16

Ala Lys His Arg Glu Arg Met ser Gin vai Met 1 5 10 33 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ <210> 18 <211> 10

< 212 > PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 10-mero < 4 0 0 > 18

Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg 1 5 10

<210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 6-mero < 4 0 0 > 19

His Arg Glu Arg Met ser

<210> 20 <211> 22 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 22-mero <400> 20

Phe Gin Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His Arg Glu Arg Met 15 10 15

Ser Gin vai Met Arg Glu 20

<210> 21 <211> 16 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: oligodesoxinucleótido 16-mero de extremidades protegidas modificado nas posições 2 & 13 para prevenir a formação de laçadas internas < 4 0 0 > 21 cccgaggact gagcca 16

<210> 22 <211> 40 <212> PRT <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Descrição de Sequência Artificial: polipéptido 40-mero 34

ΕΡ 1 381 627/PT < 4 Ο Ο> 22

Thr ργο Asp Ala Vai Asp Lys Tyr 1 5

Glu His Ala His Rhe Gin Lys Ala 20

Arg Glu Arg Met Ser Gin vai Met 35 40

Leu Glu Thr Pro Gly Asp Glu Asn 10 15

Lys Glu Arg Leu Glu Ala Lys His 25 30

Lisboa, 2011-02-08

Claims (23)

1. ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo: (a) um composto com a fórmula: 0 II 0 || n II H CH—C-N- -CH— | II H -C-N— —CH—C-OH | ch2 | 1 ch2 1 1 ch2 | 1 CH2 1 ch2 | 1 CH2 çh2 1 c= I :θ 1 ch2 I 1 NH 1 OH 1 NH 1 X z II —o— X z II —o— 1 nh2 nh2 em que Xi é um grupo acilo representado pela fórmula: 0 R-C- X2 é H ou um grupo acilo representado pela fórmula: o II R-C- e R representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo substituído com alquilo ou não substituído, um grupo aralquilo de cadeia linear ou ramificada, ou um grupo arilo substituído com alquilo ou não substituído, sendo os grupos R iguais ou diferentes quando estão presentes dois, e (b) um transportador farmaceuticamente aceitável.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que X2 é H.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, em que R representa um grupo alquilo o Ί o de cadeia linear ou ramificada.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, em que R é um grupo metilo. ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 2/5
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o composto está fisicamente ligado a uma outra molécula ou veiculo para a entrega farmacêutica do composto.
6. 6. Composto com a fórmula: 0 II O II O 1! h II H II CH—C-N·— —CH—C-N-CH—C-OH ch2 ch2 ch2 I I I ch2 ch2 ch2 i i i CH2 —o II o çh2 NH OH 1 NH I —o— II 2 X 1 C=NH I nh2 1 nh2 em que Xi é um grupo acilo representado pela fórmula: O R-C- X2 é H ou um grupo acilo representado pela fórmula: 0 R-C- e R representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo substituído com alquilo ou não substituído, um grupo aralquilo de cadeia linear ou ramificada, ou um grupo arilo substituído com alquilo ou não substituído, sendo os grupos R iguais ou diferentes quando estão presentes dois, para utilização em medicina.
7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que x2 é H.
8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 7, em que R representa um grupo alquilo Ci-C6 de cadeia linear ou ramificada.
9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 8, em que R é um grupo metilo. ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 3/5
10. 10. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9, que está fisicamente ligado a uma outra molécula ou veiculo para a entrega farmacêutica do composto.
11. 11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, para utilização no tratamento de uma doença neurodegenerativa.
12. 12. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, para utilização no tratamento da doença de Alzheimer.
13. 13. Utilização de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, na preparação de um medicamento para utilização no tratamento de uma doença neurodegenerativa.
14. 14. Utilização de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, na preparação de um medicamento para utilização no tratamento da doença de Alzheimer.
15. 15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, para utilização como potenciador cognitivo.
16. 16. Utilização de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, na preparação de um medicamento para utilização como potenciador cognitivo.
17. 17. Método não terapêutico, não cirúrgico, para produzir um efeito de melhoria cognitiva num animal, compreendendo proporcionar um animal no qual se pretende produzir o efeito; e administrar ao animal uma quantidade de um composto eficaz para produzir a melhoria cognitiva, em que o composto tem a fórmula: ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 4/5 ο Ο Ο CH—C-N-CH—C-N- -CH—1 I 1 CH, I CHj I 1 CH, I 1 CH, | 1 CH2 I 1 CHZ 1 1 ch2 I 1 c=o —o— 1 ΝΗ OH NH X z II —o— C=l I 1 nh2 1 nh2 em que Χχ é um grupo acilo representado pela fórmula: o II R-C- X2 é H ou um grupo acilo representado pela fórmula: o II R-C- e R representa um grupo alquilo de cadeia linear ou ramificada, um grupo cicloalquilo substituído com alquilo ou não substituído, um grupo aralquilo de cadeia linear ou ramificada, ou um grupo arilo substituído com alquilo ou não substituído, sendo os grupos R iguais ou diferentes quando estão presentes dois.
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que X2 é H.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que R representa um grupo alquilo Ci-C6 de cadeia linear ou ramificada.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que R é um grupo metilo.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em que o referido composto é administrado na forma de uma composição farmacêutica que compreende o referido composto e um transportador farmaceuticamente aceitável. ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 5/5
22. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em que o referido composto está fisicamente ligado a uma outra molécula ou veiculo, para a entrega farmacêutica do composto.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, em que o animal é um ser humano. Lisboa, 2011-02-08 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 1/7 humana MLPGLALLLIAAWTARALEVPTDGNAGLIiAEPQIAMFCGRLNMHMHVQNGKWDSDPSGTKTCIDTK 66 humana EGILQYCQEVYPELQITNWEANQPVTIQMWCKRGRKQCKTHPHFVIPYRCLVGEFVSDALLVPDK 132 pintainho.............................GMNLHDYGMLLPCGIDKFRGVEFVCCPIiAEESDMLDS 37 MllllllIIIIIIIIIIIIIIIIMIltllt.il humana CKFLHQERMDVCETHLHWHTVAKETCSERSTHLHDYGMIiLPCGIDKFRGVEFVCCPLAEESDNVDS 198 pintainho ADAEDDDSDVWWGGADADYADGSDDKWEEQPEEDEELTWEDEDADDDDDDDGDEI -EETEEEYE 103 lllhlllllllllll 111111:1111 I 11:1 I hl Ihlhlllh II II II humana ADAEEDDSDVWWGGADTDYADGSEDKW.EVAEEEEVAEVEEEEADDDEDDBDGDEVEEEAEEPYE 263 pintainho EATERTTSIATTTTTTTESVEEWRVPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRE 168 IM111111111II1111MI1111III1111111111111III111111111111111III1111 -·· humana EATERTTSIATTTTTTTESVEEWRVPTTAASTPDAVDKYLETPGDENEHAHFQKAKERLEAKHRE. 329 pintainho RMSQVHREWEEAERQAKiniPKADlCKAVTQHFQEKVESLEQEAAHERQQLVETHMARVEAMLNDKRR 234 llllllllllllllllllllllilllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll humana RMSQVMREWEEAERQAKKLPKADKKAVIQHFQEKVESXjEQEAANERQQLVETEMARVEAMLNDRRR 395 pintainho IALEHYTTALQTVPPRPRHVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKBFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHLRV 300 :1111111111 lllllllllllllllltlllllllllllllllllllllllllllllllllllll humana LALENYITALQAVPPRPRflVFNMLKKYVRAEQKDRQHTLKHFEHVRMVDPKKAAQIRSQVMTHIjRV 461 pintainho IYERMNQSLSFLYNVPAVAEEIQDEVDEIXQKEONYSDDVIANMISEPRISYGNDAIMPSLTETKT 365 llllllllll lllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllllll humana IYERMNQSLSLLYHVPAVAEEIQDEVDEIJíQKEQNYSDDVLAHMISEPRISYGNDALMPSLTETKT 527 pintainho TVELLPVDGEFSLDDLOPWHPFGVDSVPAHTENEVEPVDARPAADRGLTTRPGSGLTNVKTEEVSE 432 1111I11.11111II11111 II 11111II1111III11111IIII11111111111:| 111:11 humana TVELLPVNGEFSLDDLQPWBSFGADSVPANTENEVEPVDARPAADRGIiTTRPGSGLTMIKTEEISE 593 iãtviVitIiVMlKKKQYTSIHHG 498 iiiiiiiiimuimiiiii

    humana pintainho WEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYEEPTYKFFEQMQÍI* 534 llllllllllllllllllllllllllllllllllll humana WEVDAAVTPEERaLSKMQQMGYENPTYKFFEQMQB* 695 659 FIG. 1 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 2/7

    SALINA FIG. 2 ιοο 80 ϋTOTAL □ DISCRIM É Η ã Μ ω ω ο 60- 40 20- solução Α-ΒΕΤΑ(12-28) RERMS SALINA

    Η μ 3 S 1 627/E>T FIG. cn o % DE ESQUIVA

    % DE ESQUIVA

    % DE ESQUIVA

    w \ -J ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 4/7 Η δ Μ ω ο dP 100 -| 80- :¾¾¾¾¾¾ 60 - 40 20-

    |í 0- SvÃ-yss&í v v <J SOLOÇAO SALINA SC AS FIG.6 H TOTAL □ DISCRIM * .1¾ Ê® )¾¾¾¾ ::¾¾¾ APP(319-335) TOTAL

    FIG. 7 10% MeA + RERMS ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 5/7 ιοο ι, 80 · § 60-1 Μ Μ 40 Q dí> 20 · Ο Ι 00% MeA 10% MeAFIG. 8 θTOTAL □ DISCRIM titi 10% MeA + APP(319-335) EFEITO DE RER NO TREINO FRACO

    FIG. 9 ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 6/7 Ο EFEITO DE RER ΝΑ AMNÉSIA INDUZIDA POR A-BETA

    FIG. 10 EFEITO DE Ac-RER NO TREINO FRACO

    ΕΡ 1 381 627/ΡΤ 7/7 CURVA DE DOSE-RESPOSTA PARA RER E Ac-RER total

    FIG. 12 O EFEITO DE Ac-RER NA AMNÉSIA INDUZIDA POR A-BETA

    < < < FIG. 13