PT1362869E

PT1362869E - Amido resistente preparado por desramificações pela isoamilase de amido de amilose de baixo peso molecular

Info

Publication number: PT1362869E
Application number: PT03009859T
Authority: PT
Inventors: Yong-Cheng Shi; Xiaoyuan Cui; Anne M Birkett; Michael G Thatcher
Original assignee: Nat Starch And Che Inv Holding
Priority date: 2002-05-14
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2007-01-31
Also published as: ES2276995T3; EP1362869B8; AU2003204157B2; DK1362869T3; AU2003204157A1; BR0306889A; JP2004131683A; DE60310161T2; EP1362869A1; ATE347566T1; NZ525811A; CN1461754A; KR20030088365A; MXPA03004175A; EP1362869B1; DE60310161D1; US7081261B2; US20030215561A1; CN1310950C; CA2428514A1

Description

ΡΕ1362869 1

DESCRIÇÃO "AMIDO RESISTENTE PREPARADO POR DESRAMIFICAÇÃO PELA ISOAMILASE DE AMIDO DE AMILOSE DE BAIXO PESO MOLECULAR"

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a amido resistente preparado por desramificação pela isoamilase de amidos de amilose de baixo peso molecular para formar uma cadeia curta completamente linear de composição α-glucana e sua utilização. 0 amido, um carbohidrato complexo, é composto por dois tipos de moléculas de polisacáridos, amilose, um polímero maioritariamente linear e flexível de unidades de D-glucose anidra que estão ligadas por ligações alfa-l,4-D-glucosídicas e amilopectina, um polímero ramificado de cadeias lineares que estão ligadas por ligações alfa-l,6-D-glucosídicas. 0 amido é digerido predominantemente no intestino delgado pelo enzima alfa-amilase. É conhecido que certas operações de processamento de amido resultam na transformação de amido em amido que é resistente à hidrólise enzimática dentro do intestino delgado, conhecido simplesmente por amido resistente. Amido resistente resiste à digestão e absorção no intestino 2 ΡΕ1362869 delgado e passa para o intestino grosso onde é fermentado por microflora colónica para ácidos gordos de cadeia curta, particularmente butirato e gases.

Literatura de investigação indica que esta fermentação de amido resistente por bactérias colónicas tem numerosos efeitos benéficos e portanto seria útil tanto para aplicações em comida como em fármacos. 0 amido resistente pode ser utilizado em comidas, incluindo comidas medicinais e suplementos dietéticos, para manter o cólon saudável e integridade mucosal. 0 amido resistente é conhecido como um prebiótico. Além disso, como não é utilizado até alcançar o intestino grosso onde é fermentado para ácidos gordos de cadeia curta, o amido resistente tem um reduzido valor calórico. A redução em carbohidratos disponíveis ou glicémicos no intestino delgado tem sido associado a controlo melhorado tanto da glucose no sangue como da insulina, com benefícios associados para gestão de peso. A investigação também indica que amidos resistentes podem contribuir para manter um sistema imune saudável em humanos. 0 amido resistente pode ser também utilizado como um fármaco. Tem sido associado a um decréscimo no risco de variadas doenças colónicas, incluindo um decréscimo na incidência de cancro. Adicionalmente, o amido resistente pode reduzir o risco de "cluster" de doenças metabólicas associadas com o Síndroma X incluindo resistência a 3 ΡΕ1362869 insulina, hiperglicémia, dislipidemia, disfibrinolise, diabetes, hipertensão e doença cardiovascular. Pode também ser útil para tratamento de obesidade. 0 amido resistente (RS) tem sido classificado na literatura em quatro categorias dependendo das causas de resistência. RS1 é um amido fisicamente inacessível devido a armadilhamento de grânulos dentro da matriz da proteína ou dentro da parede da célula da planta. RS2 é um amido que resiste à digestão pela alfa-amilase pancreática. RS3 é um amido retrógrado, não granular ou amido de comida. RS4 é um amido resistente que tem ligações diferentes das ligações alfa-1,4- e alfa-1,6-D-glucosídicas. Vários métodos têm sido referidos para produção do vários tipos de amido resistente. Estes incluem US 5.593.503 o qual descreve um método para preparar um amido resistente granular; e as Patente US Ns 5.281.276 e 5.409.542 as quais descrevem métodos de preparação de amidos resistentes do tipo RS3, todos a partir de amidos de amilose de alto peso molecular. US 5.855.946 descreve um método de preparação de um amido resistente do tipo RS4 por ligação cruzada e fosforilação de amido. US 6.043.229 publica um amido resistente parcialmente degradado e retrocedido. EP 1 088 832 e US 2003/054501 publicam mais processos para preparar amido resistente.

Surpreendentemente, descobriu-se agora que alfa-1,4-glucanas completamente lineares de cadeia curta, as 4 ΡΕ1362869 quais sao altamente cristalizadas resultam num amido o qual é resistente à digestão pela amilase.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta patente refere-se a um amido resistente preparado pela desramificação total de um amido de amilopectina de baixo peso molecular utilizando isoamilase. Tal amido resistente é útil em produtos comestíveis, incluindo suplementos nutricionais. A equivalente dextrose, como aqui é utilizada, pretende significar o poder redutor do hidrolisado. Cada molécula de amido tem um fim redutor; portanto DE está inversamente relacionado com o peso molecular. 0 DE da D-glucose anidra está definida como 100 e a DE de amido não hidrolisado é virtualmente zero.

Amido totalmente ou completamente desramifiçado, como utilizado aqui neste documento, pretende significar que o qual inclui teoricamente 100%, por peso, de amilose de cadeia curta e, na prática, que o qual está tão altamente desramifiçado que mais actividade enzimática não produz mudança mensurável na percentagem de amilose de cadeia curta.

Como utilizado aqui neste documento, um prebiótico, pretende significar um amido resistente que afecta beneficamente o hospedeiro por estimulação selectiva 5 ΡΕ1362869 do crescimento e/ou actividade de uma ou um número limitado de bactérias no cólon e, melhora portanto a saúde do hospedeiro.

Como utilizado aqui neste documento, o termo amido resistente, pretende significar a soma de amido e produtos da degradação de amido não absorvido no intestino delgado de indivíduos saudáveis.

Como utilizado aqui neste documento, o termo amilose de baixo peso molecular, refere-se a polímeros lineares contendo desde cerca de 5 até 65 unidades de glucose anidra ligadas por ligações alfa-1,4-D-glucosídeas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta patente refere-se a um amido resistente preparado por desramificação total de amido de amilopectina de baixo peso molecular utilizando isoamilase. Tal amido resistente é útil em produtos comestíveis, incluindo suplementos nutricionais.

Amido, como aqui neste documento é utilizado, pretende incluir todos os amidos derivados de qualquer fonte nativa, qualquer uma das quais pode ser adequada para utilização aqui neste documento. Um amido nativo, como aqui neste documento é utilizado, é um como é encontrado na natureza. Também adequados são amidos derivados de uma planta obtida por técnicas de cultura normalizadas 6 ΡΕ1362869 incluindo cruzamento, translocação, inversão, transformação ou qualquer outro método de engenharia genética ou de cromossomas para incluir suas variações. Adicionalmente, são também adequados aqui neste documento, os amidos derivados de uma planta crescida a partir de mutações artificiais e variações da anterior composição genérica, os quais podem ser produzidos por conhecidos métodos normalizados de cultura de mutações.

Fontes típicas de amidos são cereais, tubérculos, raízes, legumes e frutas. A fonte nativa pode ser a variedade ceróide de grão de cereal (milho), ervilha, batata, batata doce, banana, cevada, trigo, arroz, aveia, sagu, amaranto, tapioca, araruta, cana e sorgo, particularmente milho, batata, mandioca e arroz, mais particularmente milho ou batata, mandioca e arroz. Como utilizado aqui neste documento, o termo "ceróide" ou "amilose de baixo peso molecular" pretende incluir um amido não contendo mais do que cerca de 10% por peso de amilose. Particularmente adequado na invenção são aqueles amidos os quais não contêm mais do que cerca de 5% de amilose por peso. O amido é completamente hidrolisado pela iso-amilase. A hidrólise enzimática da base amido é realizada utilizando técnicas conhecidas na especialidade. A quantidade de enzima utilizada é dependente da fonte e actividade das enzimas e base de material utilizado. Tipicamente, a enzima é utilizada numa quantidade de desde cerca de 0,05 até cerca de 2%, particularmente desde cerca de 0,1 até cerca de 0,4% por peso de amido. 7 ΡΕ1362869

Os parâmetros óptimos para a actividade da enzima irão variar dependendo da enzima utilizada. A velocidade da degradação da enzima depende em factores conhecidos na técnica, incluindo a concentração da enzima, concentração do substrato, pH, temperatura, presença ou ausência de inibidores e o grau e tipo de modificação, caso exista. Estes parâmetros podem ser ajustados para optimizar a velocidade de digestão da base amido. 0 amido é gelatinizado utilizando técnicas conhecidas na especialidade antes da hidrólise da isoamilase. Técnicas conhecidas na especialidade incluem sem limitação aquelas apresentadas por exemplo em Patente U.S. Ns 4.465.702, 5.037.929, 5.131.953 e 5.149.799. Ver também, Capítulo XXII- "Production and Use of Pregelatinized Starch", Starch: Chemistry and Technology, Vol. III - Industrial Aspects, R.L. Whistler e E.F. Paschall, Editors, Academic Press, New York 1967. O processo de gelatinização desdobra as moléculas de amido da sua estrutura granular, permitindo portanto ao enzima maior facilidade e uniformidade em degradar as moléculas de amido. mais

Geralmente, o tratamento da enzima é realizado num xarope aquoso ou tamponado ao nível de amidos sólidos de cerca de 10 até cerca de 40%, dependendo da base amido a ser tratada. Na presente invenção é particularmente útil um nível de sólidos de desde cerca de 15 até 35%, 8 ΡΕ1362869 particularmente útil desde cerca de 18 até 30%. Em alternativa, o processo pode utilizar um imobilizado de enzima num suporte sólido.

Tipicamente, a digestão enzimática é realizada nos mais elevados conteúdos sólidos possíveis sem reduzir as velocidades de reacção de forma a facilitar qualquer secagem subsequente desejada da composição do amido. As velocidades de reacção podem ser reduzidas por conteúdo de sólidos elevado enquanto a agitação se torna difícil ou ineficiente e a dispersão de amido se torna difícil de manusear. 0 pH e temperatura do xarope deve ser ajustado para providenciar a hidrólise efectiva da enzima. Estes parâmetros são dependentes da enzima a ser utilizada e são conhecidos na técnica. Na generalidade, é utilizada a temperatura de cerca de 25 até cerca de 70°C, particularmente desde cerca de 50 até cerca de 60°C. Na generalidade, o pH é ajustado para cerca de 3,0 até cerca de 6,0, particularmente desde cerca de 3,5 até cerca de 4,5, utilizando técnicas conhecidas na especialidade. A reacção enzimática é continuada até o amido estar completamente desramifiçado. Geralmente, a reacção enzimática durará desde cerca de 1 até cerca de 24 horas, particularmente cerca de 4 até cerca de 12 horas. O tempo de reacção é dependente do tipo de amido utilizado, a quantidade de amido utilizada e os parâmetros reaccionais da percentagem de sólidos, pH e temperatura. 9 ΡΕ1362869 A quantidade de hidrólise pode ser monitorizada e definida pela medição da concentração de grupos redutores os quais são libertados pela actividade de alfa-l,6-D-glucanohidrolase por métodos bem conhecidos na técnica. Outras técnicas como sejam a monitorização da mudança de viscosidade, reacção do iodo ou a mudança no peso molecular podem ser utilizadas para definir o ponto final da reacção. Quando o amido está totalmente desramifiçado, a medida monitorizada não mudará mais. Tipicamente, o amido estará completamente desramifiçado quando estiver pelo menos cerca de 95%, mais particularmente pelo menos cerca de 98%, o mais particularmente pelo menos cerca de 99% desramifiçado por peso. 0 amido desramifiçado terá tipicamente um comprimento de cadeia médio de 14-25 unidades de glucose e menos do que cerca de 0,2%, particularmente menos do que cerca de 0,1% de ligações alfa-1,6-D-glucosidicas (acoplamentos).

Opcionalmente, a enzima pode ser desactivada (desnaturada) por qualquer técnica conhecida na especialidade como seja calor, desactivação ácida ou básica. Por exemplo, a desactivação ácida pode ser conseguida por ajustamento do pH para valores inferiores a 3,0 durante pelo menos 30 minutos ou a desactivação por calor pode ser conseguida por aumentar a temperatura de desde cerca de 80 até cerca de 90°C e mantê-la a essa temperatura durante pelo menos cerca de 20 minutos para desactivar totalmente a enzrma. 10 ΡΕ1362869

Os amidos tanto podem ser convertidos antes de ou depois da desramificação pela isoamilase e pretende-se incluir fluidez ou amidos de baixa ebulição preparados por oxidação, hidrólise ácida, calor e ou destrinização ácida. Estes processos são bem conhecidos na técnica. O amido pode ser ainda mais modificado, tanto antes ou depois da hidrólise enzimática. Tais modificações podem ser físicas, enzimáticas ou químicas. Modificações físicas incluem inibição por cisalhamento ou térmica, por exemplo pelo processo descrito na patente U.S. N. 5.725.676. O amido pode ser modificado quimicamente, incluindo sem limitação, ligações cruzadas, acetilado e esterificado organicamente, hidroxietilado e hidroxipro-pilado, fosforilado e esterificado inorganicamente, catiónica, aniónica, não iónica e zwiteriónica e seus derivados de succinato substituído. Tais modificações são conhecidas na técnica, por exemplo em Modified Starches: Properties and Uses, Ed. Wurzburg, CRC Press, Inc., Florida (1986).

Qualquer base amido tendo propriedades adequadas para utilização aqui neste documento pode ser purificado por qualquer método conhecido na técnica para retirar do amido sabores e cores que são originais no polissacárido ou criados durante o processamento. Processos de purificação 11 ΡΕ1362869 adequados para tratamento de amidos estão publicados na família de patentes representada por EP 554 818 (Kasica et ai.)· São também úteis técnicas de lavagem básica e descritas na família de patentes representada por U.S. 4.477.480 (Seidel) e 5.187.272 (Bertalan et al.) . O amido desramifiçado pode também ser purificado por tais métodos. A solução resultante é tipicamente ajustada ao pH desejado de acordo com a sua utilização final pretendida. Na generalidade, o pH é ajustado de desde cerca de 5,0 até cerca de 7,5, particularmente desde cerca de 6,0 até cerca de 7,0, utilizando técnicas conhecidas na especialidade. Além disso, qualquer cadeia curta de amilose que precipite da dispersão de amido pode ser dispersada de novo. Se se desejar a purificação da composição de amido desramifiçado, as impurezas da reacção e sub-produtos podem ser removidos por diálise, filtração, centrifugação ou qualquer outro método conhecido na técnica para isolamento e concentração das composições de amido. Por exemplo, o amido degradado pode ser lavado utilizando técnicas conhecidas na especialidade para remover fracções solúveis de baixo peso molecular, como sejam oligossacáridos, resultando em amido muito mais cristalino. O amido desramifiçado pode ser cristalizado por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, deixando-se o amido repousar e retroceder. O amido é em seguida recuperado utilizando métodos conhecidos na técnica, particularmente por filtração ou por secagem, incluindo 12 ΡΕ1362869 secagem por spray, secagem gelada, secagem "flash" ou secagem ao ar, mais particularmente por filtração ou secagem "flash". É importante controlar a cristalização, tipicamente por controlar o retrocedimento e secagem de modo a obter o elevado grau de cristalinidade essencial à presente invenção. É ainda importante que o método de secagem e outros processos pós-cristalização não destruam substancialmente os cristais. 0 amido desramifiçado resultante está na forma altamente cristalina de amilose de cadeia curta do amido desramifiçado e é unicamente funcional como um amido resistente. 0 amido é caracterizado por um conteúdo de amido resistente de pelo menos cerca de 70%, particularmente pelo menos cerca de 75%, por peso utilizando a metodologia descrita, infra. O amido é também caracterizado por um pico de temperatura de ponto de fusão, Tp, como medido por DSC utilizando o processo descrito infra, de pelo menos cerca de 90°C, mais particularmente pelo menos cerca de 100°C, o mais particularmente pelo menos cerca de 110°C. O amido é também caracterizado por uma entalpia, ΔΗ, como medida por DSC utilizando o processo descrito infra, de pelo menos cerca de 25 J/g, particularmente pelo menos cerca de 30 J/g. Tais valores de DSC são indicativos da natureza altamente cristalina do produto. O amido desramifiçado é ainda caracterizado por 13 ΡΕ1362869 um equivalente dextrose (DE) de pelo menos cerca de 5,0, mais particularmente de pelo menos 6,0, o mais particularmente pelo menos cerca de 7,0. No entanto, um baixo equivalente dextrose (p. ex., um DE de pelo menos cerca de 4,0) pode ser obtido por alteração das condições de processamento, particularmente por remoção dos produtos de hidrólise de baixo peso molecular. É tolerante no processo, pelo facto do nivel de resistência não decrescer significativamente durante o processamento, incluindo o calor. O amido é unicamente funcional como um amido resistente e pode ser utilizado em vários produtos comestíveis. Pretende-se incluir nos produtos comestíveis sem limitação: cereal, barras, pizza, massa, temperos, incluindo temperos de verter ou molhos de colher; recheios de empadas, incluindo recheios de fruta e creme; molhos, incluindo molhos brancos e molhos à base de leite como sejam doces de queijo; molhos de carne; xaropes "lite"; pudins; custardas; iogurtes; natas; bebidas, incluindo bebidas à base de leite; revestimentos; produtos amassados, incluindo tostas, pães, queques, "bagels", bolachas, biscoitos, caixas de empadas e bolos; condimentos, doces e gomas e sopas.

Pretende-se também incluir nos produtos comestíveis comidas e bebidas nutricionais e medicinais, incluindo produtos dietéticos ou para perder peso, produtos 14 ΡΕ1362869 diabéticos, produtos de libertação de energia sustentada, como sejam bebidas desportivas e barras de potência, substitutos de refeição e suplementos nutricionais. Pretende-se incluir nos tais suplementos nutricionais produtos dietéticos, produtos diabéticos e prebióticos. 0 presente amido pode ser adicionado em qualquer quantidade desejada ou necessária para obter a funcionalidade da composição. Na generalidade, o amido pode ser adicionado numa quantidade de desde cerca de 0,01% até cerca de 100%, particularmente desde cerca de 1% até cerca de 50%, por peso de composição. O amido pode ser adicionado à comida ou bebida do mesmo modo como qualquer outro amido, tipicamente por mistura directa no produto ou por sua adição na forma de uma solução.

As seguintes formas de realização são apresentadas para melhor exemplificar a presente invenção e não devem ser tomadas como limitantes qualquer que seja o modo.

Forma de realização 1. Uma composição de amido resistente preparada por desramificação total de um amido de amilose de baixo peso molecular incluindo α-glucana desramifiçada linear altamente cristalina, em que a composição é caracterizada por a) um conteúdo de amido resistente de pelo menos cerca de 70% por peso; 15 ΡΕ1362869 b) um equivalente dextrose superior a cerca de 4,0; c) um pico de temperatura de ponto de fusão, Tp, como medido por DSC de pelo menos cerca de 90°C; e d) uma entalpia, Δη, como medida por DSC de pelo menos cerca de 25.

Forma de realização 2. A composição da forma de realização 1, em que o amido de amilose de baixo peso molecular inclui não mais do que cerca de 5% de amilose por peso.

Forma de realização 3. A composição da forma de realização 1, em que o equivalente dextrose da composição é superior a cerca de 5,0.

Forma de realização 4. A composição da forma de realização 1, em que o equivalente dextrose da composição é superior a cerca de 6,0.

Forma de realização 5. A composição da forma de realização 1, em que o conteúdo de amido resistente da composição é de pelo menos cerca de 75% por peso.

Forma de realização 6. A composição da forma de realização 1, em que o pico de temperatura de ponto de fusão da composição é de pelo menos cerca de 100°C.

Forma de realização 7. A composição da forma de realiza- 16 ΡΕ1362869 ção 1, em que o pico de temperatura de ponto de fusão da composição é de pelo menos cerca de 110°C.

Forma de realização 8. A composição da forma de realização 1, em que a entalpia é pelo menos cerca de 30 J/g.

Forma de realização 9. A composição da forma de realização 1, em que o amido de amilose de baixo peso molecular é seleccionado a partir do grupo consistindo em milho, batata, mandioca e arroz.

Forma de realização 10. Um método de preparação da composição da forma de realização 1 incluindo: a) desramificar totalmente um amido de amilose de baixo peso molecular utilizando isoamilose; b) deixar o amido desramifiçado cristalizar; e c) secar o amido desramifiçado altamente cristalino.

Forma de realização 11. O método da forma de realização 10, em que o amido de amilose de baixo peso molecular inclui pelo menos 95% de amilopectina por peso.

Forma de realização 12. O método da forma de realização 10, em que o equivalente dextrose da composição é superior a cerca de 5,0. 17 ΡΕ1362869

Forma de realização 13. 0 método da forma de realização 10, em que o equivalente dextrose da composição é superior a cerca de 6,0.

Forma de realização 14. O método da forma de realização 10, em que a composição contém pelo menos cerca de 75% de amido resistente por peso.

Forma de realização 15. 0 método da forma de realização 10, em que o pico de temperatura de ponto de fusão da composição é de pelo menos cerca de 100°C.

Forma de realização 16. O método da forma de realização 10, em que o pico de temperatura de ponto de fusão da composição é de pelo menos cerca de 110°C.

Forma de realização 17. O método da forma de realização 10, em que a entalpia é pelo menos cerca de 30 J/g.

Forma de realização 18. O método da forma de realização 10, em que o amido de amilose de baixo peso molecular é um milho, batata, mandioca e arroz.

Forma de realização 19. Um produto comestível incluindo a composição da forma de realização 1.

Forma de realização 20. Um produto comestível da forma de realização 19, em que o produto é um suplemento prebiótico. ΡΕ1362869 18

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos estão presentes para mais ilustrar e explicar a presente invenção e não devem ser tomados como limitantes em qualquer aspecto. Todas as percentagens utilizadas são numa base peso/peso.

Os seguintes procedimentos de teste são utiliza- dos ao longo dos exemplos. Calorimetria de varrimento diferencial - Realizaram-se as medições de calorimetria de varrimento diferencial num Perkin-Elmer DSC-7 (Norwalk, CT, USA) . Calibrou-se o instrumento com índio. Prepararam-se amostras de aproximadamente 10 mg de amido numa razão de amido:água de 1:3 e aqueceram-se à temperatura de 10°C/min desde 5°C até 160°C. Utilizou-se como referência um recipiente de aço inoxidável vazio.

Comprimento da cadeia e linearidade - Analisaram-se as amostras de amido desramifiçado utilizando RMN para determinar o comprimento de cadeia médio e as razões das ligações alfa-1,4 para alfa 1-6. Prepararam-se as amostras de RMN suspendendo 5-6 mg de amido em 2,5 mL de D20/TSP (trimetil silil propionato de sódio) e cozeu-se sob pressão as suspensões durante aproximadamente 1 hora. Transferiram-se as soluções límpidas resultantes para tubos de RMN de 5 mm e mantiveram-se quentes num banho de vapor até se realizar o espectro de RMN. Este procedimento para o 19 ΡΕ1362869 manuseamento das amostras assegurou que o material amido cristalino permanecesse em solução. Realizaram-se os espectros de RMN à temperatura de 90 °C num espectrómetro Bruker DPX-400 a 400 MHz.

Os valores para os desvios químicos (relativamente a TSP à temperatura de 90°C) para a ressonância de interesse foram os seguintes. As ligações alfa-1,4 a meio da cadeia tinham desvio químico de 5,38 ppm, a alfa-1,6 a meio da cadeia (pontos de ramificação) a 4,96 ppm, a forma alfa dos grupos terminais redutores a 5,23 ppm e a forma beta dos grupos terminais redutores a 4,65 ppm.

Calculou-se o comprimento de cadeia médio para as amostras de amido a partir da razão da ressonância dos grupos terminais redutores para os grupos a meio da cadeia. Calculou-se a percentagem de ligações alfa-1,6 (pontos de ramificação) a partir da quantidade de ligações alfa-1,6 versus ligações alfa-1,4.

Equivalente Dextrose (DE) - Utilizou-se o Método de titulação Volumétrico de Fehling para a medição de DE no processo. Lavou-se um Erlenmeyer de 500 mL com água desionizada (D.I.). Em seguida adicionou-se 50 mL de água D.I.. Seguiu-se a adição de 5 mL de cada uma das Soluções A e B de Fehling e duas gotas de azul de metileno com duas pedras de regulação de ebulição. Depois da determinação dos sólidos da reacção utilizando um Refractómetro, preparou-se num copo uma solução de amido contendo 2-4 porcento de sólidos utilizando-se água D.I. por diluição da solução 20 ΡΕ1362869 reaccional. Antes de prosseguir para o passo seguinte, verificaram-se os sólidos por um Refractómetro para assegurar que a solução estava preparada correctamente. Pesou-se o copo com a solução de amido e registou-se o peso. Adicionou-se 15 gramas da solução de amido para o Erlenmeyer contendo a solução de Fehlings preparada. Depois de 2 minutos de ebulição sob agitação numa placa quente, apareceu normalmente uma coloração azulada. Adicionou-se com uma pipeta graduada solução de amido do copo gradualmente até desaparecer a coloração azulada e se formou um nítido óxido cuproso avermelhado. Agitou-se continuamente a solução de amido com uma pipeta de plástico para manter a solução uniforme. Quando se alcançou o ponto final avermelhado, pesou-se novamente o copo contendo a solução de amido para determinar o peso de amido consumido. 0 cálculo de D.E. pode ser obtido a partir da seguinte equação: _ [factordeFehlingxlOO] [(gramas necessárias da solução de amido) x (cone da solução de amido)]

Digestão Simulada - (Englyst et al, European Journal of Clinica Nutrition, 1992, 46, S33-S50) - As amostras de comida são trituradas/picadas como se masticadas. Crivaram-se as amostras de amido em pó para um tamanho de partícula de 250 micra ou menos. Pesou-se uma amostra de 500-600 mg ± 0,1 mg e adicionou-se para o tubo de amostra. Adicionou-se para cada tubo 10 mL de solução de uma pepsina (0,5%), goma guaré (0,5%) e HC1 (0,05 M) . 21 ΡΕ1362869

Prepararam-se tubos de ensaio em branco e de padrão de glucose. 0 ensaio em branco é 20 mL de um tampão contendo acetato de sódio 0,25 M e cloreto de cálcio 0,02%. Os padrões de glucose são preparados por mistura de 10 ml de tampão acetato de sódio (descrito anteriormente) e 10 mL de solução de glucose 50 mg/mL. Prepararam-se os padrões em duplicado.

Preparou-se a mistura de enzima por adição de 18 g de pancreatina de suino (Sigma P-7545) para 120 mL de água desionizada, misturou-se bem, em seguida centrifugou-se a 3000 g durante 10 minutos. Recolheu-se o sobrenadante e adicionou-se 48 mg de invertase seca (Sigma 1-4504) e 0,5 mL AMG 400 (Novo Nordisk).

Pré-incubaram-se os tubos de amostra à temperatura de 37°C durante 30 min., em seguida removeram-se do banho e adicionou-se 10 ml de tampão acetato de sódio juntamente com bolas/berlindes de vidro (para ajudar à quebra física da amostra durante a agitação).

Adicionou-se 5 mL de mistura de enzima para as amostras, ensaio em branco e padrões. Agitaram-se os tubos horizontalmente num banho de água a 37°C a aproximadamente 180 batidas/min.. O tempo "zero" representa a primeira adição da mistura de enzima ao primeiro tubo.

Depois de 20 e 120 minutos, retiraram-se alíquotas de 0,5 mL das amostras incubadas e colocaram-se 22 ΡΕ1362869 num tubo separado com 20 mL de etanol a 66% (para parar a reacção). Depois de 1 hora, centrifugou-se uma alíquota a 3000 g durante 10 minutos.

Mediu-se a concentração de glucose em cada tubo utilizando o método glucose oxidase/peroxidase (Megazyme Glucose Assay Procedure GLC9/96). Este é um procedimento colorimétrico. Também pode ser utilizado HPLC para detectar glucose, como publicado anteriormente em literatura utilizando esta experiência. O grau de digestão de amido é determinado por cálculo da concentração de glucose contra os padrões de glucose, utilizando um factor de conversão de 0,9. Os resultados são apresentados como "% de amido digerido" (com base no peso seco) depois de 20 e 120 minutos. RS (amido resistente) é 100% menos o valor de 120 minutos.

Cada grupo de amostras analisadas inclui uma amostra de referência do amido de milho não cozido. O intervalo aceite de valores de% de digestão para o amido de milho são:

Amostra 20s 120s RS Amido de milho1 17,5 ± 2,5 80 ± 5 Aprox. 37,5 1amido Melogel®, disponível comercialmente da National Starch and Chemical Company, Bridgewater, NJ, USA. 23 ΡΕ1362869

Modelos cozidos - Utilizou-se vim modelo para imitar o processamento de comida comercial com baixa humidade. O modelo utiliza amido em água a 50% de sólidos e amassa a pasta num forno à temperatura de 190SC durante aproximadamente 20 minutos. A amostra é em seguida triturada e crivada para um tamanho de partícula de 250 micra ou menos.

Exemplo 1 - Preparação de Amido de Milho Resistente A. Fez-se um xarope de 10 kg de amido de milho ceróide em 30 litros de água. Cozeu-se o xarope a jacto com vapor total à temperatura de 310-315°F (154,4-157,2°C) e contra- pressão de 80 psi (5,52 x 105 Pa). Em seguida colocou-se o amido cozido numa caldeira reaccional e arrefeceu-se para a temperatura de 55°C. Ajustou-se o pH da solução para 4,0 por adição de água:HCl 3:1. Adicionou-se 0,2% de isoamilase baseado no peso de amido para se iniciar a reacção de desramificação. Depois de 24 horas de reacção a pH 4,0 e temperatura de 55°C, ajustou-se o pH para 6,0 utilizando NaOH 3% e aqueceu-se a amostra para a temperatura de 85°C durante 20 minutos para desnaturar o enzima. Em seguida, desligou-se o aquecimento e arrefeceu-se a amostra para a temperatura ambiente e cristalizou durante a noite (16 horas). Obteve-se um bolo reaccional a seguir a filtração e o produto seco ao ar. B. Fez-se um xarope de 4 kg de amido Amioca™ 5 0 (amido de milho ceróide convertido por ácido, disponível - 24 - ΡΕ1362869 comercialmente da National Starch and Chemical Company, Bridgewater, NJ, USA) em 6 litros de água. Ajustou-se o pH do xarope para 4,0 por adição de água:HCl 3:1. Em seguida, cozeu-se a amostra a jacto e colocou-se num vaso reaccional e arrefeceu-se para a temperatura de 55°C. Adicionou-se 0,2% de isoamilase e deixou-se a reacção prosseguir durante 24 horas. Ajustou-se o pH para 2,0 por adição de água:HCl 3:1 e manteve-se durante 30 minutos para matar o enzima. Neutralizou-se o pH para 6,0 utilizando NaOH 3%. Arrefeceu-se a amostra para a temperatura ambiente e cristalizou durante a noite (16 horas). Obteve-se um bolo reaccional a seguir a filtração e o produto seco ao ar. C. Repetiu-se o método do exemplo 1B com a excepção de se utilizar o amido FloMax™ 5 (amido de milho ceróide convertido por ácido, disponível comercialmente da National Starch and Chemical Company, Bridgewater, NJ, USA) D. Fez-se um xarope de 1,8 kg de amido de milho ceróide em 5,4 litros de água. Cozeu-se o xarope a jacto com vapor total à temperatura de 310-315°F (154, 4-15 7,2°C) e contra-pressão de 80 psi (5,52 x 105 Pa). Sob agitação constante, diluiu-se a solução de amido cozido para 10% de sólidos e colocou-se num vaso reaccional num banho de agua à temperatura de 55°C. Ajustou-se o pH da amostra para 4,0 por adição de água:HCl 3:1. Adicionou-se 0,2% de isoamilase baseado no peso de amido seco para se iniciar a reacção de desramificação. Depois de 24 horas de tempo reaccional, aumentou-se o pH da amostra para 5,5 com NaOH 3% e aqueceu- 25 ΡΕ1362869 se a amostra para a temperatura de 85°C num banho de água em ebulição durante 20 minutos para desnaturar o enzima. Arrefeceu-se a amostra para a temperatura ambiente durante a noite (16 horas) para cristalizar o produto. Obteve-se um bolo reaccional por filtração e secou-se o produto ao ar.

Obtiveram-se para estas amostras DSC e conteúdo em amido resistente. A Tabela 1 resume os resultados.

Tabela 1:

Amostra % RS DSC To (°C) Tp (°C) Tc (°C) ΔΗ (J/g) IA 84, 9 120,5 127, 7 134,3 26,6 1B 75,2 76,6 110,9 131,8 39, 7 1C 76,6 87, 7 111,9 131,8 35,5 1D 81, 9 70, 8 97,7 112, 1 35, 0

Todas as amostras apresentaram mais do que 70% RS. Todas as amostras têm picos de temperatura por DSC superiores à temperatura de 110°C.

Exemplo 2 - Preparação de Amido de Batata Resistente

Fez-se um xarope de três kilogramas de amido de batata de amilose de baixo peso molecular (disponível comercialmente na Lyckeby na Alemanha) em 9 litros de água e cozeu-se a amostra a jacto com vapor total. Arrefeceu-se 26 ΡΕ1362869 a solução de amido cozido para a temperatura de 55°C e ajustou-se o pH para 4,0 utilizando água:HCl 3:1. Adicionou-se 0,2% de isoamilase baseado no peso de amido para se iniciar a reacção de desramificação., mantendo a temperatura da amostra a 55°C. Depois do DE da amostra alcançar 7,5 (cerca de 8 horas de reacção), baixou-se o pH para 2,0 durante 30 minutos para desnaturar o enzima e em seguida aumentou-se para 6,0 utilizando hidróxido de sódio 3%. Em seguida arrefeceu-se a amostra para a temperatura ambiente e cristalizou durante a noite (16 horas). Obteve-se um bolo reaccional a seguir a filtração e o produto seco ao ar. A Tabela 2 resume os resultados de conteúdo em amido resistente e DSC.

Tabela 2:

Amostra % RS DP DSC To (°C) Tp (°C) Tc (°C) ΔΗ (J/g) 2 85,6 17 9 6,6 112, 4 126, 7 32, 7 A amostra de amido de batata de amilose de baixo peso molecular desramifiçada e cristalina apresentou mais do que 70% RS e tinha um pico de temperatura por DSC superiores à temperatura de 110°C.

Exemplo 3 - Tolerância de processo do amido resistente

Processaram-se vários dos amidos desramifiçados resistentes utilizando o modelo de baixa humidade e 27 ΡΕ1362869 apresenta-se o amido resistente de cada comparado com o do amido não processado. Os resultados apresentam-se na Tabela 3, em seguida.

Tabela 3

Amostra % RS pré-processamento % RS pós-processamento 3A 75,2 81,5 3B 74,2 81,0 3C 76,6 79, 7

Como se pode ver da Tabela 3, os amidos da presente invenção são tolerantes ao processo uma vez que o conteúdo em amido resistente não é destruído.

Lisboa, 28 de Dezembro de 2006

Claims

ΡΕ1362869 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de amido resistente preparada por desramificação total de um amido de amilose de baixo peso molecular incluindo α-glucana desramifiçada linear altamente cristalina, em que a composição é caracterizada por a) um conteúdo de amido resistente de pelo menos 70% por peso; b) um equivalente dextrose superior a 4,0; c) um pico de temperatura de ponto de fusão, Tp, como medido por DSC de pelo menos 90°C; e d) uma entalpia, ΔΗ, como medida por DSC de pelo menos 25.
2. A composição da reivindicação 1, em que o amido de amilose de baixo peso molecular inclui não mais do que 5% de amilose por peso.
3. A composição da reivindicação 1 ou 2, em que o equivalente dextrose da composição é superior a 5,0.
4. A composição da reivindicação 3, em que o equivalente dextrose da composição é superior a 6,0. 2 ΡΕ1362869
5. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o conteúdo de amido resistente da composição é de pelo menos 75% por peso.
6. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o pico de temperatura de ponto de fusão da composição é de pelo menos 100°C.
7. A composição da reivindicação 6, em que o pico de temperatura de ponto de fusão da composição é de pelo menos 110°C.
8. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que a entalpia é pelo menos 30 J/g.
9. A composição de qualquer uma das reivindicações 1-8, em que o amido de amilose de baixo peso molecular é seleccionado a partir do grupo consistindo em milho, batata, mandioca e arroz.
10. Um método de preparação da composição de qualquer uma das reivindicações 1-9 incluindo: a) desramificar totalmente um amido de amilose de baixo peso molecular utilizando isoamilose; b) deixar o amido desramifiçado cristalizar; e c) secar o amido desramifiçado altamente cristalino. 3 ΡΕ1362869 11. 0 método da reivindicação 10, em que o amido de amilose de baixo peso molecular inclui pelo menos 95% de amilopectina por peso.
12. Um produto comestível incluindo a composição de qualquer uma das reivindicações 1-9.
13. Um produto comestível da reivindicação 12, em que o produto é um suplemento prebiótico. Lisboa, 28 de Dezembro de 2006