PT1290011E - Derivados de melfalano e seu uso como drogas quimioterapêuticas de cancro - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Derivados de melfalano e seu uso como drogas quimioterapêuticas de cancro" A presente invenção refere-se a novos derivados de melfalano úteis como drogas alquilantes quimioterapêuticas de cancro.

ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO O cancro é uma doença importante e frequentemente fatal. Assim, os esforços para o desenvolvimento de novas terapias para o cancro são um empenho constante e contínuo da sociedade de investigação. A grande maioria dos cancros está presente na forma de tumores sólidos, e.g., cancro do pulmão, cancro da mama, cancro da próstata, enquanto o restante são malignidades hematológicas e linfóides, e.g., leucemias e linfomas. A quimioterapia é usada em tentativas de curar ou aliviar a doença. Na maioria dos casos, esta terapia é entregue na forma de quimioterapia de combinação, quando duas ou mais drogas com modos de acção diferentes são usadas em conjunto, a fim de optimizar o efeito antitumoral e de minimizar os efeitos colaterais. Os resultados obtidos com a quimioterapia variam de acordo com o tipo de tumor. Alguns tumores são muito sensíveis e o tratamento tem então uma elevada probabilidade de conduzir à cura. Os exemplos deste tipo de tumores são leucemias agudas, linfomas malignos, cancro testicular, carcinomas do cório e tumor de Wilms. Noutro grupo de tumores a quimioterapia pode resultar num bom tratamento paliativo e sobrevivência prolongada. Os exemplos desses tumores são cancro da mama, cancro colorrectal, cancro do ovário, cancro do pulmão de células pequenas, cancro da bexiga, mieloma múltiplo e leucemias crónicas de ambos os tipos mielóide e linfático. Os tumores resistentes a drogas primárias são, por exemplo, glioma maligno, melanoma, cancro da próstata, sarcomas e tumores gastrointestinais com excepção de cancros colorrectais.

Os agentes alquilantes, como drogas derivadas de mostarda de azoto, ou seja, derivados da bis (2-cloroetil)amina, são 2 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ usados como drogas quimioterapêuticas no tratamento de uma ampla variedade de doenças neoplásicas. Todas estas drogas actuam por interacção covalente com heteroátomos nucleofílicos em ADN ou proteínas. Acredita-se que estes agentes bifuncionais são capazes de reticular uma cadeia de ADN dentro de uma hélice dupla de uma forma intracadeia ou intercadeias, ou de reticular entre ADN e proteínas. A reticulação resulta em efeitos inibitórios na replicação e transcrição do ADN com subsequente morte celular. As drogas podem ser usadas como agentes únicos ou em combinação com outros agentes antineoplásicos. Os agentes alquilantes parecem ter alguma propensão para os tecidos em rápido crescimento. Exercem efeitos num amplo espectro de tumores. Os efeitos colaterais são principalmente restritos à medula óssea e em doses muito elevadas também ao trato gastrointestinal. O melfalano, ou p-bis-(2-cloroetil)aminofenilalanina, é um conjugado da mostarda de azoto e do aminoácido fenilalanina, que foi sintetizado em meados da década de 1950 (US-A-3 032 584). Esta substância clássica alquilante tornou-se desde logo uma droga valiosa no campo quimioterapêutico e é ainda importante no tratamento de, por exemplo, mieloma. O melfalano foi originalmente desenvolvido como um agente citotóxico selectivo contra células de melanoma, que utilizam grandes quantidades de fenilalanina na síntese da melanina. 0 uso clínico de melfalano no tratamento de melanomas metastáticos tem, contudo, eficácia limitada.

Na pesquisa de uma acção mais selectiva em células malignas sintetizaram-se análogos de melfalano. Obteve-se sarcolisina, m-bis-(2-cloroetil)aminofenilalanina, por deslocamento do grupo bis-(2-cloroetil)amino da posição para para a posição meta da fenilalanina. Preparou-se uma mistura de péptidos conhecida como Peptichemio® (PTC) por conjugação covalente de diferentes aminoácidos nos grupos amino e carboxilato da sarcolisina. O PTC consistia em seis péptidos diferentes (de Barbieri, "Proceedings of the symposium on Peptichemio", Milão, 18 de Novembro, 1972). Mostrou-se posteriormente que o PTC é activo em vários tipos de tumores, bem como em tumores resistentes ao tratamento com agentes alquilantes incluindo o melfalano e entrou em ensaios clínicos com resultados promissores. Uma séria desvantagem para a 3 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ compreensão do uso e dos efeitos do PTC foi o facto de este ser uma mistura de seis péptidos. Os efeitos citotóxicos de cada um dos péptidos diferentes contidos no PTC foram, portanto, medidos separadamente (Lewensohn et al., Anticancer Research 11: 321-324 (1991)) e encontrou-se uma ampla variação nas citotoxicidades dos péptidos. Um dos péptidos, o cloridrato do éster etílico da L-propil-m-L-sarcolisil-L-p-fluorofenilalanina (P2) revelou-se mais tóxico para células de melanoma RPMI 8322 do que quaisquer dos outros péptidos.

ANTERIORIDADE

Lopatin et ai. (CA 79:100 709, Farmakol. Toksikol. (Moscow), 1973, 36(4), 479-480) descreve que a administração dos derivados de melfalano asaley e astyron inibiram o crescimento de sarcoma 45 em ratos. O astyron, ou éster etílico da N-acetil-L-melfalanil-L-tirosina, assim como o asaley, ou éster etílico da N-acetil-L-melfalanil-L-valina, têm um grupo amino acetilado, o que geralmente significa que a citotoxicidade do composto para as células tumorais foi consideravelmente reduzida relativamente à forma não acetilada.

Romanova et al. (CA 66:27517, Vopr. Med. Khim, 1966, 12(6), 586-92) refere-se a um composto chamado sarcolisina ou salina que, de acordo com a nomenclatura ocidental, deveria antes ser chamado L-melfalanil-L-valina. Este composto interrompeu a fosforilação oxidativa em mitocôndrias de homogeneizados de fígado de rato e células de sarcoma de Jensen. Há uma pequena confusão quanto à nomenclatura dos derivados de melfalano. Quando, em 1955, um grupo de pesquisa britânico relatou a síntese e actividade citotóxica de um derivado de fenilalanina substituído com um grupo amino-bis-(2-cloroetilo) na posição para do anel aromático, os isómeros DL, L e D foram denominados respectivamente merfalano, melfalano e medfalano. Um grupo russo, ao mesmo tempo, denominou independentemente a forma racémica (DL) de 4-[bis-(2-cloroetilamino)]fenilalanina como sarcolisina. Mais tarde o termo sarcolisina começou a ser usado também para a mostarda de meta-fenilalanina. Esta confusão de nomes continuou, mas 4 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ actualmente melfalano e sarcolisina são normalmente utilizados respectivamente para os derivados para e meta.

Kupczyk-Subotltowaka et al. (Journal of Drug Targeting, 1997, 4(6), 359-370) descreve derivados de melfalano concebidos para melhorar a acumulação de melfalano em células cancerosas. Testou-se uma quantidade de dipéptidos compreendendo melfalano e valina ou ácido glutâmico e concluiu-se que a captação celular dos referidos dipéptidos, assim como a dos seus ésteres, provavelmente ocorreu por difusão passiva e não por um transportador de oligopéptido ou aminoácido.

Um problema com o uso de agentes alquilantes bifuncionais é a resistência primária, i.e., intrínseca, e secundária, i.e., adquirida, do tumor ao tratamento. Foram feitas tentativas para contornar a resistência, aumentando a dose de agentes alquilantes administrada ao paciente. Não é claro, contudo, o quanto isto aumenta a dose eficaz ao nível da célula tumoral. Há uma necessidade urgente de novas drogas antitumorais numa ampla variedade de doenças tumorais, especialmente em tumores com resistência primária à terapia convencional e/ou em doenças tumorais que desenvolveram resistência, resistência secundária, após terem respondido ao tratamento com quimioterápicos convencionais para o cancro.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO 0 objecto da invenção é proporcionar um derivado de melfalano com uma actividade citotóxica melhorada em células tumorais humanas. A invenção refere-se a dipéptidos e tripéptidos contendo uma unidade de melfalano e um ou dois aminoácidos adicionais ou derivados de aminoácidos, à utilização dos referidos péptidos como medicamentos e a composições farmacêuticas compreendendo os péptidos da invenção para uso como medicamentos, especialmente para o tratamento de vários tumores malignos. 5 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Os derivados de melfalano da invenção exibem uma eficácia aumentada numa variedade de tipos de tumores. A hipótese dos inventores é de que a captação das células tumorais e a acumulação intracelular dos péptidos da invenção serão aumentadas.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra as fórmulas químicas dos compostos de melfalano conhecidos, sarcolisina e P2, assim como as fórmulas dos compostos da invenção Jl, J3, e JV28. A Figura 2 mostra uma comparação de CI50 para o melfalano, Jl e P2 em 27 amostras tumorais humanas.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos péptidos de mostarda de fenilalanina compreendendo mostarda de p-[bis(2-cloroetil)amino]-L-fenilalanina, L-PAM e mostarda de p-[bis(2-cloroetil)amino]-D-fenilalanina, D-PAM, ligados por ligações covalentes a um ou dois aminoácidos ou derivados de aminoácidos formando dipéptidos ou tripéptidos alquilantes. As formas L são, contudo, preferidas.

A presente invenção refere-se a novos derivados de melfalano e especialmente a um dipéptido ou tripéptido com a fórmula I

Cl

(I) em que Ri é alquiloxi, cicloalquiloxi, ariloxi, arilalquiloxi, NH2, alquilamino, cicloalquilamino ou arilamino; R2 é independentemente NH2, OH, O-alquilo, N-alquilo, O-acilo, NH-acilo, N (CH2CH2C1) 2, N02, F, CF3 ou H, e n é 1 ou 2; e 6 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ R.3 é um aminoácido aromático ou cíclico natural ou modificado, ou H; assim como seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Nas fórmulas referidas o alquilo é preferivelmente um alquilo inferior, ou seja, um alquilo tendo 1-4 átomos de carbono.

Se n na fórmula I for 1, o substituinte R2 pode estar na posição orto, meta ou para. Se n for 2, os dois substituintes R2 podem ser iguais ou diferentes.

Aminoácidos naturais referem-se a aminoácidos que normalmente existem e exercem as suas funções em organismos vivos. Aminoácidos modificados referem-se a aminoácidos que, de algum modo, tenham sido modificados numa estrutura química e composição química diferente da de um aminoácido natural. Um exemplo de um aminoácido natural cíclico é a prolina. Exemplos de aminoácidos aromáticos são fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina.

Preferivelmente, o terminal N da molécula de melfalano não deve ser protegido como carbamato ou amida, significando isto que preferivelmente R3 não deve ser um grupo protector como formilo, acetilo ou propionilo ou benzoílo, uma vez que a forma protegida do composto tem, em geral, uma menor actividade citotóxica do que a forma livre correspondente.

Sais farmaceuticamente aceitáveis são, por exemplo, sais de adição de ácido, como sais de HC1, HBr e ácido metanossulfónico.

Um dipéptido ou tripéptido preferido da invenção tem a fórmula II α

(II) 7 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ em que Ri é alquiloxi, cicloalquiloxi, ariloxi, arilalquiloxi, NH2, alquilamino, cicloalquilamino ou arilamino; R2 é NH2, OH, O-alquilo, N-alquilo, O-acilo, NH-acilo, N(CH2CH2C1) 2, N02, F, CF3 ou H; e R3 é um aminoácido aromático ou cíclico natural ou modificado, ou H; assim como seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os péptidos da fórmula I ou II, em que R2 é F, constituem um grupo de péptidos especialmente interessantes de acordo com a invenção.

Os dipéptidos de acordo com a invenção são péptidos da fórmula I ou II, em que Ri é alquiloxi; R2 é F, CF3, H, OH, ο-alquilo, N02, N (CH2CH2C1) 2, NH-acilo ou NH2; e R3 é H.

Exemplos de dipéptidos preferidos são o éster etílico da L-melfalanil-p-L-fluorofenilalanina (Jl), o éster isopropílico da L-melfalanil-p-L-fluorofenilalanina (JV28) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os tripéptidos de acordo com a invenção são péptidos da fórmula I ou II, em que Ri é alquiloxi; R2 é F, CF3, H, OH, O-alquilo, NH-acilo, N02, N(CH2CH2C1)2 ou NH2; e R3 é um aminoácido aromático ou cíclico natural ou modificado.

Um exemplo de um tripéptido preferido é o éster etílico da L-prolil-L-melfalanil-p-fluorofenilalanina (J3) e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Todos os derivados dipeptídicos da invenção podem ser sintetizados a partir do melfalano protegido com terc-butoxicarbonilo (Boc). O acoplamento do Boc-melfalano a diferentes ésteres ou amidas foi realizado usando hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)tripirrolidino- fosfónio (PyBOP)/trietilamina ou cloridrato de 1—[3 — dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida (EDC)/N-metilmorfolina (NMM)/1-hidroxibenzotriazole (HOBt) como reagentes de acoplamento. Procedimentos de purificação usando cromatografia em sílica-gel permitiram o isolamento de produtos puros. A remoção do grupo Boc foi realizada em acetato de etilo 8 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ saturado com HC1. Os sais de cloridrato do dipéptido foram purificados por recristalização em etanol/éter dietilico.

Na sintese dos derivados tripeptidicos, aminoácidos protegidos com Boc foram acoplados ao derivado dipeptidico contendo melfalano utilizando EDC/NMM/HOBt como reagentes de acoplamento. A desprotecção utilizando acetato de etilo saturado com HC1 seguida por recristalização (EtOH/éter dietilico ou EtOAc/éter dietilico) permitiu o isolamento de sais puros de cloridrato do tripéptido. A invenção também se refere à utilização de um péptido como acima descrito como um medicamento, assim como para o fabrico de um medicamento para o tratamento de tumores malignos.

Verificou-se que os péptidos alquilantes da invenção exibem um largo espectro de actividade com potência aumentada em comparação com o melfalano e o éster etílico da L-prolil-L-sarcolisil-p-L-fluorofenilalanina (P2) em linhas celulares tumorais de diferentes histologias e também em linhas celulares tumorais que exibem resistência L-PAM. Além disso, verificou-se que os péptidos alquilantes são significativamente mais eficazes comparativamente com o melfalano e ο P2 em amostras tumorais humanas obtidas frescas de diferentes origens, tanto hematológicas como sólidas, como se mostra nos exemplos adiante.

Os péptidos da invenção podem ser usados como tratamento de primeira linha, tanto isoladamente como em combinação com outras drogas, concomitante ou sequenciado com radioterapia, das seguintes doenças tumorais e/ou etapas da respectiva doença: (I) Tumores sólidos: para cancro da mama operável como tratamento adjuvante ou neoadjuvante, bem como para o tratamento do cancro da mama não operável avançado, para cancro do pulmão de células pequenas de tipo DL (Doença Limitada) ou DE (Doença Extensa), para etapas operáveis de cancro do pulmão de células não pequenas como tratamento neoadjuvante, para a etapa não operável III-B ou IV do cancro do pulmão de células não pequenas, para cancros operáveis 9 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ (neoadjuvante) e não operáveis da cabeça e pescoço e cancro do esófago, para cancro do ovário operável como tratamento adjuvante e para cancro avançado do ovário, para cancro avançado do colo do útero, para carcinoma de células escamosas e células basais da pele que não é susceptível de cirurgia ou radioterapia e para neuroblastoma. Os tipos tumorais acima mencionados representam (1) tumores, que demonstraram sensibilidade ao tratamento com agentes alquilantes, mas para os quais esta terapia convencional não é suficientemente eficiente, ou (2) tumores que frequentemente recidivam após uma primeira remissão e nessa fase apresentam menor sensibilidade à terapia convencional (resistência). Outros grupos de tumores que seria razoável tratar com os novos péptidos são os diferentes estágios de cancro da bexiga, cancro da próstata avançado, melanoma maligno, cancro colorrectal e sarcomas das partes moles em que têm sido frequentemente obtidos resultados paliativos com agentes alquilantes. Ainda outro grupo de tumores para tratar é o dos tumores geralmente resistentes a drogas como cancro renal e tumores cerebrais. (II) Tumores linfáticos e hematológicos: mieloma múltiplo, linfomas de grau baixo e elevado, Mb.Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena ou linfocitica aguda e leucemia mielógena crónica.

Outro objecto da invenção é uma composição farmacêutica para o tratamento de tumores malignos, que compreende pelo menos um péptido como acima descrito juntamente com pelo menos um transportador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção pode ser usada para o tratamento de cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do ovário, leucemias, linfomas e mieloma múltiplo.

As composições farmacêuticas são preparadas de forma conhecida por um perito na especialidade farmacêutica. O transportador ou o excipiente pode ser um material sólido, semi-sólido ou liquido que pode servir como um veículo ou meio para o ingrediente activo. São conhecidos na especialidade transportadores ou excipientes adequados. A composição 10 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ farmacêutica pode ser adaptada para utilização parentérica, oral ou tópica e pode ser administrada ao paciente na forma de comprimidos, cápsulas, soluções, suspensões, pomadas ou similares.

Para administração parentérica, os péptidos de acordo com a invenção podem ser incorporados numa solução ou suspensão. A administração parentérica refere-se à administração por injecção, por exemplo por injecção intravenosa, intracapsular, intratecal, intrapleural, intratumoral ou intraperitoneal ou por via intravesical. É preferida a administração intravenosa. A medula óssea pode também ser tratada in vitro. A composição farmacêutica deve conter pelo menos 0,001% em peso de um péptido activo de acordo com a invenção, preferivelmente 0,1-10% em peso.

As soluções ou suspensões podem também compreender pelo menos um dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis como água para injecção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerol, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos, antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio, tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade como dextrose ou cloreto de sódio. A preparação parentérica pode ser inclusa em ampolas, seringas descartáveis ou vasos de plástico ou de vidro de dosagem múltipla.

Para a injecção intravenosa, a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada por meio de dois frascos, em que o frasco I compreende o péptido na forma de um sal cloridrato, com e sem um transportador ou composto que aumente a solubilidade ou consiga a estabilidade e o frasco II compreende uma mistura de propilenoglicol/etanol. O péptido será dissolvido imediatamente antes da administração e misturado com glucose a 5% ou solução salina. A dose dada pode estar no intervalo de 0,1 mg/kg - 1 mg/kg dada na forma de uma infusão curta.

Para administração tópica os péptidos de acordo com a invenção podem ser incorporados numa solução, suspensão ou pomada. As referidas composições podem conter pelo menos 0,1% em peso do péptido activo, preferivelmente 0,1-10% em peso. 11 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ EXEMPLOS - Sínteses de compostos

Nos exemplos seguintes de síntese de derivados de melfalano da invenção, assim como de compostos comparativos, todos os solventes eram de grau analítico ou de síntese. Usaram-se como reagentes de acoplamento 1-hidroxibenzotriazole, HOBt; N-metilmorfolina, NMM; e/ou cloridrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida, EDC; ou hexafluorofosfato de (benzotriazol-l-iloxi)tri-pirrolidinofosfónio, PyBOP; e trietilamina. Os pontos de fusão mediram-se num aparelho Biichi Melting Point B-540. Obtiveram-se os espectros de RMN de XH e 13C num espectrómetro de RMN JEOL JNM-EX 400. Os espectros de 3Η foram registados a 400 MHz e os espectros de 13C a 100 MHz, respectivamente. As reacções foram monitorizadas por cromatografia em camada fina (TLC), em placas de alumínio revestidas com sílica (Sílica-gel 60 F254, E. Merck), detectando as manchas por luz UV e/ou ninidrina a 2% em etanol seguida por aquecimento. A cromatografia em coluna foi efectuada com empacotamento de sílica húmida (Sílica gel 60 (0,040-0,063 mm), E. Merck) utilizando cromatografia flash. O L-melfalano usado como composto de partida foi obtido de Sigma e recristalizado em etanol antes do uso. O intermediário N-terc-butoxicarbonil-L-melfalano foi sintetizado de acordo com Pai, N.N.; Miyawa, J.H.; Perrin, J.H.. Drug Dev. Industr. Pharm. 1996, 22, 181-184. Dissolveu-se o L-melfalano (500 mg, 1,64 mmol) em THF aquoso (5 ml) a 50% e adicionou-se trietilamina (201 μΐ, 1,44 mmol). Arrefeceu-se a solução para 0°C e adicionou-se gota a gota dicarbonato de di-terc-dibutilo (210 mg, 0,96 mmol) dissolvido em THF (3 ml) . A solução foi agitada durante 30 min a 0°C e seguidamente durante 18 h à temperatura ambiente (TA). O solvente foi evaporado e foi adicionada água e a solução foi acidificada a pH 5 com ácido cítrico a 10%. Após a extracção por três vezes com acetato de etilo o extracto orgânico combinado foi seco sobre MgS04. O solvente foi evaporado e o resíduo foi purificado por cromatografia flash em sílica utilizando como eluentes clorofórmio:metanol em 3:1 e 19:1, proporcionando 48% de um produto puro. RMN (CDCI3) δ 7,05 (d, 2H, Ph-B) , 6,58 (d, 2H, Ph-B), 4,98 (s lg, 1H, NH) , 4,47 (s lg, 1 H, α-h), 3,69-3,49 (m, 8H, 4 CB2-mostarda), 3,12-2,91 (m, 2H, CB2-Ph) , 1,40 (s, 9H, CB3-Boc) . 12 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Exemplo 1. Cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina, (Jl)

Dissolveu-se L-p-fluorofenilalanina (217 mg, 1,18 mmol) em EtOH (5 ml) previamente borbulhado com HC1. A mistura reaccional foi levada a 100°C e deixou-se em refluxo durante 18 horas. O solvente foi evaporado e o produto foi seco sob alto vácuo, proporcionando cloridrato do éster etilico da L-p-fluorofenilalanina na forma de cristais brancos secos (98%). ΧΗ RMN: (CD3OD) δ 7,30-7,26 (m, 2H, Ph-H) , 7,13-7,06 (m, 2H, Ph-H) , 4,29-4,22 (m, 2H, CH2-Ph) , 3,31-3,10 (m, 3H, CH2CH3r a-H), 1,24 (t, 3H, CH2CH3) .

Dissolveu-se N-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (157 mg, 0,387 mmol) em diclorometano (4 ml). Adicionaram-se PyBOP (201 mg, 0,387 mmol) e trietilamina (54 μΐ, 0,387 mmol) e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante lh. Adicionou-se uma solução de cloridrato de éster etilico da L-p-fluorofenilalanina (92 mg, 0,387 mmol) e trietilamina (54 μΐ, 0,387 mmol) em diclorometano (4 ml) e a mistura reaccional foi agitada durante a noite. A reacção foi parada por extracção com NaHCCd saturado seguido por ácido cítrico a 10%. A camada orgânica foi seca por MgSCg e o solvente foi evaporado para fornecer 200 mg de um óleo amarelo que foi purificado por cromatografia em coluna de gradiente utilizando éter:pentano (1:2, 1:1, 1:0) como eluente para proporcionar 102 mg (43% de rendimento) de éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina que foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. O éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-f luorofenilalanina (64 mg, 0,11 mmol) foi dissolvido em 5 ml de EtOAc previamente borbulhado com HC1 (gasoso). A mistura foi agitada à TA durante 30 minutos. O solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi recristalizado a partir de Et0H/Et20. O cloridrato de éster etílico da L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (Jl) foi isolado na forma de cristais brancos. ΤΗ RMN: (CD3OD) δ 7,23 (d, 2H, Ph-tf, Phe) , 7,13 (d, 2H, Ph-H, Phe) , 7,01 (d, 2H, Ph-H, Mel), 6,72 (d, 2H, ph-H, Mel), 4,68 (dd, 1H, α-CH, Phe), 4,61 (s lg, 1H, a-CH, Mel), 4,12 (q, 2H, CH2CH3) , 3,80-3,62 (m, 8H, Ci72-mostarda) , 3,22-2, 86 (m, 4H, 13 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Ci?2-Ph) , 1,21 (t, 3Η, Ch2CH3) . Análise elementar CHN 53,7;5,8;7,9 (calculado 54,1;6,1;7,9)

Exemplo 2. Cloridrato do éster etílico da L-prolinil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (J3)

Dissolveram-se N-terc-butoxicarbonil-L-prolina (12 mg, 0,054 mmol), cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina, (24 mg, 0,045 mmol), HOBt (8 mg, 0,054 mmol) e NMM (7 μΐ, 0,045 mmol) em diclorometano (5 ml). A solução foi arrefecida a 0°C e foi adicionado cloridrato de EDC (11 mg, 0,045 mmol). A solução foi agitada durante lh a 0°C e em seguida durante a noite à TA. A mistura reaccional foi diluída para 10 ml com diclorometano e a reacção foi parada por extracções sucessivas com ácido cítrico aquoso a 10%, NaHCCt saturado e salmoura. O extracto orgânico foi seco sobre Na3SC>4 anidro e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida para proporcionar 27 mg (86%) do éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-prolinil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina que foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. ΤΗ RMN (CDCI3) δ 7, 08-6, 89 (m, 6H, Ph-H, Phe, Mel), 6,67 (s lg, 1H, NH) , 6,55 (d, 2H, Ph-H) , 6,24 (s lg, 1H, NH) , 4,72 (m, 1H, a-CH) , 4,55 (s lg, 1H, a-CH) , 4,20 (s lg, 1H, a-CH), 4,10 (q, 2H, CH2CH3) , 3, 74-3,54 (m, 8H, CH2-most arda) , 3, 42-3,20 (m, 2H, prolina δ), 3,10-2,86 (m, 4H, CH2-Ph) , 2,20-1, 74 (m, 4H, prolina β, γ) , 1,40 (s, 9H, C/í3-Boc) , 1,18 (t, 3H, CH2CH3). O éster etílico da IV-terc-butoxicarbonil-L-prolinil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (25 mg) foi dissolvido em acetato de etilo saturado em HC1 (3 ml). A mistura foi agitada à TA durante 30 minutos. O solvente foi removido sob vácuo. A recristalização a partir de acetato de etilo e éter dietílico produziu J3 puro na forma de cristais de cor creme com rendimento de 94% (calculado a partir do cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina). ΧΗ RMN (CD3OD) δ 7,26-6, 94 (m, 6H, Ph-H, Phe, Mel), 6,68 (d, 2H, Ph-H) , 6,24 (s lg, 1H, N H) , 4,62-4,55 (m, 2H, a-CH), 4,20-4,05 (m, 3H, a-CH, Cfí2CH3) , 3, 74-3,54 (m, 8H, CTí2-mostarda) , 3,25-2, 75 (m, 6H, CH2-Ph, prolina δ), 2, 40-1,85 (m, 4H, prolina β,γ), 1,23 (t, 3H, CH2CH3) . 14 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Exemplo 3. Cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-fenilalanina (JV22)

Dissolveu-se N-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (150 mg; 0,37 mmol) em 2,6 ml de diclorometano. Adicionou-se PyBOP (199 mg; 0,38 mmol) e triet ilamina. (104 μΐ; 0,75 mmol). Após agitação à TA durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de trietilamina (104 μΐ; 0,75 mmol) e cloridrato do éster etílico da fenilalanina (89 mg; 0,39 mmol) em 2,6 ml de diclorometano. Após 4 h à TA, a reacção foi extinta. Adicionou-se diclorometano até um volume total de 20 ml antes da extracção com 20 ml de NaHC03 aquoso saturado e 20 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgSCq), filtrado e concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em coluna com sílica utilizando um gradiente de éter:pentano (2:1 -► 3:1); seguido por éter e depois por CHCl3:MeOH (19:1) como eluentes. A recolha e a concentração das fracções adequadas originaram o éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-fenilalanina puro na forma de um sólido branco (110 mg, 51%). Pf: 117-3,20°C. 3Η RMN (CDCls) δ 7,29-7,16 (m, 3H, Ph-H, Phe) , 7, 06-6,95 (m, 4H, Ph-H), 6,57 (d, 2H, Ph-H, Mel) 1 , 6 , 28 (s lg, 1H, NH, Phe) , 4, 9 2 (s lg, 1H, NH, Mel), 4, 76 (s ig, 1H, oí- -CH, Phe), 4 , 26 (s lg, 1H, a-CH, Mel) , 4, 1C > (q, 2H, CH2CH3) 1, 3,74-3,50 (m, 8H, CTÍ2- -mostarda), 3,12-2 ,84 (m, 4H, c h2- -Ph) , : L,40 (s, 9H , ch3- Boc ), 1,18 (t, 3H, CH2CH3) • 13C RMN (CDC13) δ 171 , 05 (2 C: s) (c=o amida e éster) t 155,10 (C= 0, Boc), 145 ,10 (C· -4' ) , 135, , 84 (Ph) , 130, 75 (2 C:s) t 129,39 (2 C:s), 128,54 : (2 C: :S) (Ph e C-3 <’ ) , 127 ,13 (Ph), 12 5, 07 (C- 1' ) , 112,27 (2 C: S) (C- 2' ) , 79, 82 (C-Boc) , 61,54 (CH2CH3) , 55, 51 (a-CH), 53,55 (2 C: s) (N -ch2 ) , 53, 32 (a-CH) r 40,51 (2 C : s) (CH2-CI ) , 38, 13, 36, 73 ( CH2-Ph) , 28 ,35 (3 C: S) (ch3- Boc ), 14,17 (CH 2CH3) .

Dissolveu-se o éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-fenilalanina (100 mg; 0,17 mmol) em 6 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à TA durante 30 minutos. O solvente foi removido sob vácuo. A recristalização a partir de acetato de etilo e éter dietílico produziu JV22 puro (37 mg; 42%) na forma de um sólido ligeiramente amarelado/acastanhado. Pf.: 123-125 °C. 3Η RMN (CDCls) δ 7,31-7,13 (m, 7H, Ph-H) , 6,72 (d, 2H, Ph-H,

Mel), 4, 73-4,66 (m, 1H, α-CH-Phe), 4,12 (q, 2H, CH2CH3), 3,99- 15 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ 3,92 (m, 1Η, α-C Η, Mel), 3, 77-3,64 (m, 8H, CH2-mostarda), 3,20-2,85 (m, 4H, CH2-Ph) , 1,18 (t, 3H, CH2CH3) . 13C RMN (CDC13) δ 171,05, 168, 42 (C=0 em amida e éster), 145,96 (C-4' ) , 136,55 (Ph), 130,43 (2 C:s) (C-3' ) , 128, 90 (2 C:s), 128,27 (2 C:s), 126,10 (Ph), 122,35 (C-l'), 112,58 (2 C:s) (C-2'), 61,23 (CH2CH3), 54,29, 54,25 (a-CH) , 53,06 (2 C:s) (N- CH2), 40,26 (2 C: s) (CH2-C1) , 37, 12, 36,29 (CH2-Ph), 13,10 (CH2CH3) .

Exemplo 4. Cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-tirosina (JV24)

Dissolveu-se o iV-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (150 mg; 0,37 mmol) em diclorometano (3 ml). Adicionou-se PyBOP (199 mg; 0,38 mmol) e trietilamina (104 μΐ; 0,75 mmol). Após agitação à TA durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de trietilamina (104 μΐ; 0,75 mmol) e cloridrato do éster etílico da tirosina (94 mg; 0,38 mmol) em 3 ml de diclorometano. Após 100 min de agitação à TA, a reacção foi extinta. Adicionou-se diclorometano até um volume total de 20 ml antes da extracção com 20 ml de NaHC03 aquoso saturado e 20 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgS04) , filtrado e concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado quatro vezes por cromatografia em coluna com sílica utilizando um gradiente de sistemas de eluentes de éter:pentano (2:1 -► 4:1 -> 1:0) seguido por CHCl3:MeOH (19:1 -> 97:3). O éster etílico da iV-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-tirosina puro foi isolado na forma de um óleo incolor (59 mg; 27%). 3H RMN (CDC13) δ 7, 05-6, 92 (m, 2H, Ph-H-Mel), 6, 86-6, 74 (m, 2H, Ph-H-Phe) , 6,67 (d, 2H, Ph-H, Phe) , 6,59-6,43 (m, 2H, Ph- H, Mel), 6,42-6,36 (m, 1H, NH, Phe), 5,00 (s lg, 1H, NH, Mel), 4,81-4,70 (m, 1H, a-CH, Phe), 4,26 (s lg, 1H, a-CH, Mel), 4,12 (q; 2H, CH2CH3) , 3, 70-3,53 (m, 8H, CH2-mostarda) , 3, 03-2,85 (m, 4H, CH2-Ph), 1,39 (s, 9H, CH3-Boc) , 1,21 (t, 3H, CH2CH3) . 13C RMN (CDC13) δ 171,21 (2 C:s) (C=0 em amida e éster), 155,31 (2 C: s) (C=0 Boc e C-4"), 144, 96 (C-4'), 130, 70 (2 C:s), 130,47 (2 C:s) (Ph e C-3'), 127,12 (Ph), 125,21 (C-l'), 115,52 (2 C: s) (Ph), 112,31 (2 C:s) (C-2'), 80, 09 (C-Boc), 61,61 (CH2CH3), 55, 84 (a-CH), 53,56 (2 C:s) (N-CH2), 53,25 (a-CH), 40,55, 40,50 (CH2-C1), 37, 32 (2 C:s) (CH2-Ph), 28,36 (3 C:s) ( CH3-Boc) , 14,22 (CH2CH3) . 16 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Dissolveu-se ο éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-tirosina (48 mg; 81 pmol) em 4 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à TA durante 30 minutos. O solvente foi removido sob vácuo. A recristalização a partir de acetato de etilo e éter dietílico produziu o JV24 puro (13 ml; 30%) na forma de um sólido ligeiramente acastanhado. Pf: 150-154°C. XH RMN (CDC13) δ 7,16-6,86 (m, 4H, Ph-íí) , 6, 75-6,65 (m, 4H,

Ph-H) , 4, 68-4, 59 (m, 1H, α-CH, Phe) , 4,13 (q, 2H, Cií2CH3) , 4, 02-3,94 (m, 1H, ol-CH, Mel), 3, 77-3,60 (m, 8H, Cífe-mostarda) , 3,21-2,71 (m, 4H, Ctf2-Ph) , 1,20 (t, 3H, CH2Cií3) . 13C RMN (CDCI3) δ 170,94, 168, 08 (C=0 em amida e éster), 156,12 (C-4"), 145, 68 (C-4'), 130,41 (2 C:s), 129,68 (2 C:s), 127, 03, (Ph e C-3'), 125,86 (C-l'), 114,98 (2 C:s) (Ph) , 112,34 (2 C : s) (C—2'), 60,80 (CH2CH3) , 54,48, 54, 27 (α-CH), 53, 07 (2 C : s) (N-CH2) , 40,19 (2 C:s) (CH2-C1) , 36,32 (2 C:s) (CH2-

Ph), 12,64 (CH2CH3)

Exemplo 5. Cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-p-metoxifenilalanina (JV25)

Dissolveu-se o éster etílico da IV-terc-butoxicarbonil-L-tirosina (228 mg; 0,74 mmol) em 15 ml de acetona e adicionou-se K2C03 (123 mg, 0,89 mmol). Adicionou-se cuidadosamente sulfato dimetílico (77,5 μΐ; 0,81 mmol) e a solução sofreu refluxo durante 20 h. Removeu-se o K2C03 sólido por filtração e a acetona foi removida sob vácuo. A purificação por cromatografia em coluna com sílica utilizando CHC13:MeOH:heptano (4:1:5) como eluente produziu 214 mg (90%) de éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-p- metoxifenilalanina na forma de um óleo límpido. Este intermediário foi usado no passo seguinte sem caracterização adicional.

Dissolveu-se o éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-p-metoxifenilalanina (165 mg; 0,51 mmol) em CHC13 (8,5 ml) e adicionou-se iodotrimetilsilano (168 μ; 1,22 mmol). A solução foi agitada durante 40 min à TA. A reacção foi extinta por adição de MeOH (175 μΐ; 4,3 mmol). O solvente e o iodotrimetilsilano em excesso foram removidos sob vácuo para produzir 169 mg (149%) do produto em bruto (éster etílico da L-p-metoxifenilalanina) na forma de um sólido castanho 17 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ alaranjado que foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. 3Η RMN (CD3OD) δ 7,16 (d, 2H, Ph-B) , 6,90 (d, 2H, Ph-B) , 4,28-4,18 (m, 3H, CB2CH3, α-CB) , 3,78 (s, 3H, OCH3) , 3,21-3,08 (m, 2H, CB2-Ph), 1,24 (t, 3H, CH2CB3).

Dissolveu-se N-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (150 mg; 0,37 mmol) em 3 ml de diclorometano. Adicionaram-se PyBOP (199 mg; 0,38 mmol) e trietilamina (104 μΐ; 0,75 mmol). Após agitação à TA durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de trietilamina (104 pL; 0,75 mmol) e L-p-metoxifenilalanina (124 mg; 0,55 mmol) em 3 ml de diclorometano. A solução foi agitada à TA durante a noite. O diclorometano foi adicionado até um volume total de 20 ml antes da extracção com 20 ml de NaHC03 aquoso saturado e 20 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgSCd) , filtrado e concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado quatro vezes por cromatografia flash em coluna com sílica, duas vezes com éter:heptano (3:1) e duas vezes com CHCl3:MeOH (19:1) como eluentes, para produzir éster etílico de N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-metoxifenilalanina na forma de um sólido branco (150 mg; 66%). Pf: 125-127,5°C. 3Η RMN (CDC13) δ 7,06 (d, 2H, Ph-ií, Mel), 6,90 (d, 2H, Ph-ií,

Phe) , 6,76 (d, 2H, Ph-B, Phe) , 6,59 (d, 2H, Ph-ií, Mel), 6,31 (s lg, 1H, NB, Phe), 4,97 (s lg, 1H, NB, Mel), 4,71 (s lg, 1H, α-CB, Phe), 4,27 (s lg, 1H, a-CB, Mel), 4,10 (q, 2H, CB2CH3) , 3,75 (s, 3H, OCB3) , 3,69-3,56 (m, 8H, CB2-mostarda) , 3,00-2,85 (m, 4H, CB2-Ph) , 1,40 ( s, 9H, cb3- -Boc) f 1,19 (t, 3H, CH2CB3) . 13C RMN (CDC13) δ 171,11, 170, 91 (C=0 em amida e éster) i, 158, 72 (C- 4") , 155,30 (C=0, Boc) , 145 , 03 (C -4'), 130,76 (2 C: s ) , 130 ,39 (2 C:s) , (Ph e C-3' ) , 127, 75 (Ph) , 125,36 (C-l ' ); 113 , 96 (2 C:s) (Ph) , 112,28 (2 C: s ) (C-2'), 80,12 (C-Boc ), i—1 KD 50 (CH2CH3) , 55, 81 (oí-CH ) , 55,2 7 (OCH3) 53,55 (2 C: s) (N- ch2) , 53,46 (α-CH) , 40,52 (2 C: s ) (CH2-C1) , 37,33, 37, 23 (CH 2-Ph) , 28,34 (3 C : s) (CH3-Boc) , 14, 20 (CH2CH3) φ O éster etílico da iV-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-metoxif enilalanina (140 mg; 0,23 mmol) foi dissolvido em 17 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à TA durante 3 h. O solvente foi removido sob vácuo. O produto em bruto foi dissolvido em etanol seguido por 18 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ precipitação em éter dietílico proporcionando JV25 (45 mg; 36%) na forma de um sólido branco. Pf: 170-173°C. RMN (CDC13) δ 7,17-7,07 (m, 4H, Ph-H) , 6,83 (d, 2H, Ph-tf,

Phe) , 6,72 (d, 2H, Ph-H, Mel), 4,68-4,61 (m, 1H, α-Cfí, Phe) , 4,13 (q, 2H, CÍÍ2CH3) , 3,99-3.94 (m, 1H, α-C H, Mel), 3,77-3,59 (m, 11H, OCH3 e Ci72-mostarda) , 3,17-2,82 (m, 4H, CH2-Ph) , 1,19 (t, 3H, CH2CÍÍ3) . 13C RMN (CDCI3) δ 171,11, 168,41 (C=0 em amida e éster), 158,91 (C-4'') , 146,10 (C-4') , 130, 44 (2 C:s), 129, 94 (2 C:s) (Ph e C-3'), 128,38 (Ph), 122,18 (C-l'), 113,67 (2 C:s) (Ph), 112,18 (2 C: s) (C-2') , 61,19 (CH2CH3), 54, 45, 54, 37, 54, 29 (a-CH e OCH3), 52,99 (2 C: s) (N-CH2) , 40,31 (2 C:s) (CH2-C1), 36,34, 36,29 (CH2-Ph) , 13,14 (CH2CH3).

Exemplo 6. Cloridrato do éster etílico da L-malfalanil-L-p-nitrofenilalanina (JV26)

Dissolveu-se IV-terc-butoxicarbonil-L-p-nitrofenilalanina (395 mg; 1,27 mmol) em etanol saturado em HC1 (20 ml) . A solução foi aquecida sob refluxo durante 20 h. A mistura foi particionada entre CHCI3 e HC1 1M (pH 4). A camada aquosa foi basificada com KOH a 5% a pH 10 e foi então extraída quatro vezes com CHCI3. Os extractos orgânicos foram combinados, secos (MgS04) , filtrados e concentrados sob vácuo para proporcionar éster etílico da L-p-nitrofenilalanina na forma de um óleo fino amarelado (195 mg; 65%) que foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. 3Η RMN (CDCI3) δ 8,14 (d, 2H, Ph-H) , 7,37 (d, 2H, Ph-H) , 4,14 (q, 2H, CH2CH3), 3,71 (t, 1H, a-CH) , 3,16-2,91 (m, 2H, CH2-Ph) , 1,22 (t, 3H, CH2CH3)

Dissolveu-se N-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (86 mg; 0,21 mmol) em diclorometano (3 ml). Adicionaram-se PyBOP (115 mg; 0,22 mmol) e trietilamina (58 μΐ; 0,42 mmol). Após agitação à TA durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de trietilamina (29 μΐ; 0,21 mmol) e éster etílico da L-p-nitrof enilalanina (55 mg; 0,23 mmol) em 3 ml de diclorometano. A solução foi agitada à TA durante a noite. O diclorometano foi adicionado até um volume total de 10 ml antes da extracção com 10 mL de NaHCCh aquoso saturado e 10 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgS04) , filtrado e concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado duas vezes por cromatografia flash em coluna com sílica utilizando 19 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ CHCl3:MeOH (9:1 e 19:1) como eluente, para produzir éster etílico da IV-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-nitro-fenilalanina puro na forma de um sólido amarelo claro (90 mg; 69%). Pf 152-155°C. 1H RMN (CDC13) δ 8, 09-8, 02 (m, 2H, Ph-H, Phe) , 7,21-7,01 (m, 4H, Ph-H) , 6,57 (d, 2H, Ph-ií, Mel), 6,50-6, 44 (m, 1H, NH,

Phe), 4,92 (s lg, 1H, N H, Mel), 4,77 (s lg, 1H, α-C H, Phe), 4,25 (s lg, 1H, a-C H, Mel), 4,11 (q, 2H, Cií2CH3), 3,70-3,53 (m, 8H, Cií2-mostarda) , 3,25-3,10 (m, 2H, Cií2-Ph, Phe), 2,97- 2,84 (m, 2H, CH2-Ph, Mel) 1,40 (s, 9H, Cií3-Boc) , 1,19 (t, 3H, CH2Cií3) . 13C RMN (CDC13) δ 171,31, 170, 40 (C=0 em amida e éster), 155,46 (C=0, Boc), 147,14 (Ph), 145,10 (C-4'), 143,85 (Ph), 130,68 (2 C:s), 130,41 (2 C:s) (Ph e C-3'), 125,21 (C-l'), 123,62 (2 C: s) (Ph), 112,40 (2 C:s) (C-2' ) , 80,45 (C-Boc), 61,95 (CH2CH3), 55, 98 (a-CH), 53,54 (2 C:s) (N-CH2) , 53,03 (a-CH) , 40, 46 (2 C: s) (CHZ-C1), 37, 86, 37, 00 (CH2-Ph), 28,33 (3 C:s) ( CH3-B0C) , 14,20 (CH2CH3) .

Dissolveu-se éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-nitrofenilalanina (80 mg; 0,13 mmol) em 6 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à TA durante 1,5 h. O solvente foi removido sob vácuo. O produto em bruto foi dissolvido em etanol seguido por precipitação em éter dietílico para proporcionar JV26 (55 mg; 76%) na forma de um sólido laranja claro. Pf: 138-142°C. 1R RMN (CDCI3) δ 8,20-8, 06 (m, 2H, Ph-ií, Phe), 7, 52-7, 33 (m, 2H, Ph-ií, Phe) , 7,17-6,85 (m, 2H, Ph-ií, Mel), 6, 77-6,60 (m, 2H, Ph-ií, Mel), 4,16 (q, 2H, Cií2CH3), 4, 00-3, 94 (m, 1H, a-CH,

Mel), 3, 79-3,54 (m, 8H, Cíí2-mostarda) , 3,19-2,71 (m, 4H, C H2-

Ph), 1,21 (t, 3H, CH2Cií3) . 13C RMN (CDC13) δ 170,46, 168,29 (C=0 em amida e éster), 147,16 (Ph), 145,61 (C-4'), 144,67 (Ph), 130,96 (2 C:s), 130,24 (2 C: s) (Ph e C-3'), 126, 72 (C-l'), 123,26 (2 C:s) (Ph), 115,45 (2 C: s) (C-2'), 61,53 (CH2CH3), 54, 76, 54, 08 (a-CH), 53,54 (2 C: s) (N-CH2), 39,22 (2 C:s) (CH2-C1), 36, 75, 36,33 (CH2-Ph), 13,16 (CH2CH3) .

Exemplo 7. Cloridrato do éster etílico do L-melfalanil-L-melfalano (JV27)

Dissolveu-se iV-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (35 mg; 86 pmol) em diclorometano (2 ml). Adicionaram-se PyBOP (43 mg; 20 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ 83 μιηοΐ) e trietilamina (23 μΐ; 162 μmol) . Após agitação à ΤΑ durante 30 minutos adicionou-se uma solução de trietilamina (23 μΐ; 162 μιηοΐ) e cloridrato do éster etílico do L-melfalano (32 mg; 87 μιηοΐ) em 2 ml de diclorometano. A solução foi agitada à TA durante a noite, e foi adicionado mais diclorometano (até 10 ml) antes da extracção com 10 ml de NaHCCh aguoso saturado e 10 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgSCg) , filtrado e concentrado sob vácuo. A purificação por cromatografia em coluna com sílica utilizando CHCI3 :MeOH:heptano (4:1:7) e CHCl3:MeOH (19:1) como eluentes originou éster etílico do N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-melfalano puro na forma de uma goma castanha (29 mg; 49%). 1H RMN (CDCI3) δ 7,06 (d, 2H, Ph-H) , 6,87 (d, 2H, Ph-H) , 6,61-6,46 (m, 4H, Ph-H), 6,24 (s lg, 1H, NH), 4,99 (s lg, 1H, NH), 4.68 (s lg, 1H, a-CH) , 4,25 (s lg, 1H, α-Cfí) , 4,12 (q, 2H, CH2CH3), 3, 72-3,47 (m, 16H, CH2-mostarda) , 3,02-2, 87 (m, 4H, CH2-Ph), 1,40 (s, 9H, CH3-B0C) , 1,21 (t, 3H, CH2CH3). 13C RMN (CDCI3) δ 171,16, 170,71 (C=0 em amida e éster), 154,87 (C=0, Boc) , 145,19 (2 C:s) (C-4' e C-4"), 130, 79 (2 C:s), 130.68 (2 C: s) (C-3' e C-3"), 125, 08, 124,33 (C-l', C-l"), 112,30 (2 C:s), 112,04 (2 C:s) (C-2' e C-2"), 79,65 (C-Boc), 61,50 (CH2CH3), 55, 83 (α-CH) , 53,57 (2 C:s) (N-CH2) , 53,53 (a-CH), 40,55, 40, 47 (CH2-C1), 37, 04, 36, 98 (CH2-Ph) , 28,36 (3 C : s ) ( CH3-B0C) , 14,24 (CH2CH3) .

Dissolveu-se éster etílico do N-terc-butoxicarbonil-L-melf alanil-L-melf alano (20 mg; 28 pmol) em 3 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à TA durante 1,5 h. O solvente foi removido sob vácuo. O produto em bruto foi dissolvido em etanol seguido por precipitação em éter dietílico para proporcionar JV27 (11 mg; 62%) na forma de um sólido castanho claro. Pf: 157-160°C. 3H RMN (CDCI3) δ 7,19-7,01 (m, 4H, Ph-H), 6,80-6,63 (m, 4H, Ph-H), 4,66-4,61 (m, 1H, a-CH), 4,13 (q, 2H, CH2CH3) , 4,02-3,96 (m, 1H, a-CH), 3, 83-3,54 (m, 16H, 8 CH2-mostarda) , 3,18-2,81 (m, 4H, CH2-Ph) , 1,17 (t, 3H, CH2CH3) .

Exemplo 8. Cloridrato do éster isopropílico da L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (JV28)

Dissolveu-se L-p-fluorofenilalanina (266 mg, 1,45 mmol) em isopropanol saturado em HC1 (10 ml). A solução foi aquecida 21 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ sob refluxo durante 2,5 h. O solvente foi evaporado obtendo-se o produto na forma de um sólido branco semelhante ao algodão (350 mg, 91%) . O produto foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. Pf 226-229°C. 3H RMN (CD3OD) δ 7,31-7,23 (m, 2H, Ph-H) , 7,12-7,03 (m, 2H,

Ph-H), 5,10-5,00 (m, 1H, CH-isopropilo) , 4,22 (t, 1H, Oí-CH) , 3,22-3,11 (m, 2H, CH2-Ph) , 1,25 (d, 3H, CH3-isopropilo) , 1,18 (d, 3H, CH3-isopropilo) .

Dissolveu-se o N-terc-butoxicarbonil-L-melfalano (52 mg; 0,13 mmol) em diclorometano (2 ml) . Adicionaram-se PyBOP (71 mg, 0,14 mmol) e trietilamina (38 μΐ; 0,27 mmol). Após agitação à TA durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de trietilamina (38 μΐ; 0,27 mmol) e éster isopropílico da L-p-fluorofenilalanina (39 mg; 0,15 mmol) em 2 ml diclorometano. A solução foi agitada à TA durante a noite. O diclorometano foi adicionado até um volume total de 10 ml antes da extracção com 10 ml NaHCC>3 aquoso saturado e 10 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgS04) , filtrado e concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado por cromatografia flash em coluna com sílica utilizando CHCl3:MeOH (19:1) como eluente, para proporcionar éster isopropílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina puro na forma de um semi-sólido de cor laranja pálido (57 mg; 71%). 3Η RMN (CDCI3) δ 7, 06-6,85 (m, 6H, Ph-H), 6,56 (d, 2H, Ph-H, Mel), 6,40 (s lg, 1H, N H, Phe), 5, 00-4, 85 (m, 2H, CH-isopropilo, N H, Mel), 4,68 (s lg, 1H, oí-CH, Phe), 4,27 (s lg, 1H, oí-C H, Mel), 3,69-3,52 (m, 8H, CH2-mostarda) , 3,02-2,85 (m, 4H, CH2-Ph) , 1,37 (s, 9H, CH3-Boc) , 1,18 (d, 3H, CH3-isopropilo), 1,14 (d, 3H, CH3-isopropilo). 13C RMN (CDCI3) δ 171, 00, 170,43 (C=0 em amida e éster), 161,95 (d, J =245,0 Hz, C-4"); 155,35 (C=0, Boc), 145,12 (C-4'), 131,60 (C-l"), 130,99 (2 C:s) (d, J =7,75 Hz, C-2"), 130,72 (2 C:s) (C-3'), 125,26 (C-l'), 115,29 (2 C:s) (d, J=20,6 Hz, C-3"), 112,27 (2 C:s) (C-2'), 80,24 (C-Boc), 69,52 (CH- isopropilo) , 55, 82 (α-CH) , 53,53 (2 C:s) (N-CH2) , 53,40 (a-CH), 40, 48 (2 C: s) (CH2-C1), 37,29 (2 C:s) (CH2-Ph), 28,33 (3 C:s) (CH3-B0C), 21,81, 21,73 (CH3-isopropilo) .

Dissolveu-se éster isopropílico da IV-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (48 mg; 79 pmol) em 4 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à 22 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ ΤΑ durante 30 minutos. Ο solvente foi removido sob vácuo. O produto em bruto foi dissolvido em etanol seguido por precipitação em éter dietilico para proporcionar JV28 (22 mg; 50%) na forma de um sólido branco. Pf: 192-195°C. 3Η RMN (CDC1 3) δ 7,28- 7, 17 (m, 2H, Ph-H, Phe), 7,14 (d, 2H, Ph-H, Phe) , 7,04-6,96 (m, 2H, Ph-H, Mel) , 6,76-6,67 (m, 2H, Ph-H, Mel) , 4,68-4,60 (m, 1H, α-CH, Phe) , 4,00-3,93 (m, 1H, a-CH, Mel) , 3,76-3,58 (m, 8H, CH2-mostarda ), 3,18-2,80 (m, 4H, CH2-Ph), 1,24 (d, 3H, CH3-isopropilo) , 1,15 (d, 3H, CH3- isopropilo) 13C RMN (CDCI3) δ : 170,49, 168,42 (C=0 em amida e ést er) , 162, 06 (d, J = 242 . 4 Hz, C-4"), 146.13 (C-4 ) , 132,48 (C- 1") , 130, 72 (2 C: s) (d, J = 7 ,64 Hz, C-2"), 130, 40 (2 C: s) (C- 3' ) , 122, 10 (C- -1' ) , 114 ,87 (2 0 ω a > Ch II 21.2 Hz, C- -3") , 112 , 45 (2 C: s) (C- -2'), 69, 27 (CH-isopropilo) , 54,2 :8 (2 C: s) (oí- -CH) , 52, 97 (2 C: s) (N- ch2 ) , 40,26 (2 C : s) (ch2- -Cl) f 36,31 (2 C: s) (ch2- Ph) , 20 , 70, 20 , 56 (CH3-isopropil 0) .

Exemplo 9. Cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-p-aminofenilalanina (JV29)

Dissolveu-se IV-terc-butoxicarbonil-L-p-nitrofenilalanina (510 mg; 1,64 mmol) em etanol a 80% (12,5 ml). Adicionou-se uma solução de CaCl2 (150 mg; 1,35 mmol) em água (1 ml) juntamente com zinco em pó (3,79 g; 58 mmol). Após aquecimento sob refluxo durante 3,5 h a suspensão foi filtrada e o pó de zinco foi lavado com etanol em excesso. O filtrado foi concentrado sob vácuo para proporcionar 600 mg (130%) de N-terc-butoxicarbonil-L-p-aminofenilalanina na forma de um sólido amarelo claro que ainda continha algum etanol. O produto foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. 3Η RMN (CD3OD) δ 6,96 (d, 2H, Ph-H) , 6,63 (d, 2H, Ph-H) , 4,16-4,07 (m, 1H, oé-CH) , 3,05-2, 76 (m, 2H, CH2-Ph) , 1,38 (s, 9H, CH3-Boc) .

Dissolveu-se N-terc-butoxicarbonil-L-p-aminofenilalanina (201 mg; 0,72 mmol) em etanol saturado em HC1 (10 ml). A solução foi aquecida sob refluxo durante 3 h. A mistura foi particionada entre CHCI3 e HC1 1M (pH 4) . O extracto aquoso foi basificado com KOH a 5% para pH 10 e foi seguidamente extraído quatro vezes com CHCI3. Os extractos orgânicos foram combinados, secos (MgS04) , filtrados e concentrados sob vácuo para proporcionar o éster etílico da L-p-aminofenilalanina na 23 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ forma de um óleo amarelado (90 mg; 60%) que foi usado no passo seguinte sem purificação adicional. XH RMN (CDC13) δ 6,97 (d, 2H, Ph-H) , 6,61 (d, 2H, Ph-H) , 4,13 (q, 2H, CÍÍ2CH3), 3,71 (t, 1H, ol-CH) , 3,04-2, 78 (m, 2H, CH2-Ph) , 1,23 (t, 3H, CH2CÍÍ3) .

Dissolveu-se iV-terc-butoxicarbonil-L-melf alano, (44 mg; 0,11 mmol) em diclorometano (2 ml). Adicionou-se PyBOP (55 mg; 0,11 inmol) e trietilamina (28 μΐ; 0,20 inmol). Após agitação à TA durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de trietilamina (14 μΐ; 0,10 mmol) e éster etílico da L-p-aminofenilalanina (21 mg; 0,10 mmol) em 2 ml de diclorometano. A solução foi agitada à TA durante a noite. Adicionou-se diclorometano até um volume total de 10 ml antes da extracção com 10 ml de NaHCCb saturado aquoso e 10 ml de ácido cítrico a 10%. O extracto orgânico foi seco (MgS04) , filtrado e concentrado sob vácuo. O produto em bruto foi purificado duas vezes por cromatografia flash em coluna com sílica utilizando CHCl3:MeOH (9:1 e 19:1) como eluentes, para proporcionar éster etílico da IV-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p- aminofenilalanina na forma de um óleo castanho alaranjado (28 mg; 4 7%) . 3Η RMN (CDCI3) δ 7,03 (d, 2H, Ph-H, Mel) , 6,75 (d, 2H, Ph-ií, Phe), 6,59-6,52 (m, 4H , Ph-Fí) , 6,26 (s lg , 1H, N H, Phe) , 4, 96 (s lg, 1H, N H, Mel), 4,68 (s lg, 1H, ot-CH, Phe) , 4,26 (s lg, 1H, oí-CH, Mel), 4,10 (q, 2H, CH2C H3), 3, 70-3,53 (m, 8H, CH2- mostarda) , 2, 97-2, 88 (m, 4H, CH2-Ph) , 1,38 (s, 9H, CH3-B0C) , 1,19 (t, 3H, CH2CA3) · 13C RMN (CDCI3) δ 171,21, 170,83 (C=0 em amida e éster), 145,37, 144,96 (C-4', C-4"), 130,78 (3 C:s), 130,21 (2 C:s) (Ph e C-3'), 125,37 (C-l'), 115,2 (2 C:s) (Ph), 112,26 (2 C:s) (C-2 ' ) , 80, 09 (C-Boc), 61,42 (CH2CH3), 55,61 (α-CH) , 53,56 (2 C: s) (N-Cií2), 53,48 (oí-CH) , 40,56 (2 C:s) (CH2-C1), 37,37, 37,17 (CH2-Ph) , 28,34 (3 C:s) (CH3-Boc), 14,21 (CH2CH3) .

Dissolveu-se éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-L-p-aminofenilalanina (20 mg; 34 pmol) em 3 ml de acetato de etilo saturado em HC1. A mistura foi agitada à TA durante 30 minutos. O solvente foi removido sob vácuo. O produto em bruto foi dissolvido em etanol seguido por precipitação em éter dietílico para proporcionar JV29 (4 mg; 22%) na forma de um sólido castanho claro. 24 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ λΕ RMN (CDC13) δ 7, 46-7, 29 (m, 4Η, Ph-fí, Phe) , 7,18-7,07 (m, 2Η, Ph-ií, Mel), 6, 78-6,66 (m, 2H, Ph-ií, Mel), 4, 73-4, 66 (m, 1H, oí-C H, Phe), 4,10 (q, 2H, Cií2CH3), 4, 06-3, 99 (m, 1H, α-C H, Mel), 3, 79-3,56 (m, 8H, Cií2-mostarda) , 3,22-2, 83 (m, 4H, C H2-

Ph), 1,15 (t, 3H, CH2CiÍ3) .

Exemplo 10. Éster etílico da L-melfalanil-D-fenilalanina (T4)

Dissolveu-se D-fenilalanina (250 mg, 1,52 mmol) em 5 ml de EtOH previamente borbulhado com HC1 (gasoso). A solução foi levada a 100°C e deixada sob refluxo durante a noite. O solvente foi evaporado proporcionando 280 mg de produto em bruto. A recristalização a partir de EtOH/EtOAc/pentano originou 239 mg (rendimento de 81%) de éster etílico da D-fenilalanina na forma de cristais brancos. RMN (CD3OD) δ 7,4-7,22 (m, 5H, Ph-ií), 4,31-4,14 (m, 3H, Cíí2CH3, oí-H), 3,35-3, 08 (m, 2H, Cií2-Ph) , 1,25-1,20 (t, 3H, CH2CiÍ3) .

Dissolveram-se iV-text-butoxicarbonil-L-melfalano (65 mg, 0,16 mmol), éster etílico da D-fenilalanina (53 mg, 0,23 mmol), HOBT (32 mg, 0,24 mmol) e NMM (25 μΐ, 0,23 mmol) em 4 ml de diclorometano. Arrefeceu-se esta solução a 0°C e adicionou-se EDC (44 mg, 0,23 mmol). A solução foi agitada durante 0,5 h a 0°C e seguidamente durante 3 h à TA. A mistura reaccional foi então diluída para 20 ml com diclorometano e a reacção parada por extracções sucessivas com ácido cítrico aquoso a 10% (25 ml), NaHC03 saturado (25 ml) e salmoura (25 ml) . O extracto orgânico foi então seco sobre Na2SC>4 anidro e o solvente evaporado sob pressão reduzida para proporcionar 60 mg de um óleo amarelo. O produto em bruto foi então separado por cromatografia flash utilizando um sistema de gradiente de eluente de éter:pentano (2:3 -> 1:1 -> 1:0). As fracções puras foram recolhidas e o solvente evaporado para proporcionar 25 mg (25%) do éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-D-fenilalanina na forma de cristais brancos.

Dissolveu-se éster etílico da N-terc-butoxicarbonil-L-melfalanil-D-fenilalanina (90 mg, 0,16 mmol) em 5 ml de EtOAc previamente borbulhado com HC1 (gasoso). A mistura foi agitada à TA durante 30 minutos. O solvente foi removido sob vácuo. O resíduo foi recristalizado a partir de Et0H/Et20. O cloridrato 25 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ do éster etílico da L-melfalanil-D-fenilalanina (T4) foi isolado na forma de cristais brancos com rendimento de 62% (46 mg).

Exemplo Comparativo. Éster etílico da N-acetil-L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (AcJl)

Dissolveu-se cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-L-p-fluorofenilalanina (10 mg, 0,019 mmol), em diclorometano (0,5 ml) e adicionou-se piridina (4 μΐ, 0,044 mmol). Adicionou-se anidrido acético (2 μΐ, 0,22 mmol) e a mistura foi agitada durante 1 h à TA. Adicionou-se mais piridina (2 μΐ, 0,022 mmol) e anidrido acético (2 μΐ, 0,22 mmol), tendo sido obtida uma solução límpida após agitação durante uma hora. A solução foi extraída com ácido cítrico aquoso a 10% e salmoura. O extracto orgânico foi seco sobre Na2S04 anidro e o solvente evaporado sob pressão reduzida. O resíduo sólido foi recristalizado em EtOH/éter dietílico para proporcionar AcJl na forma de cristais brancos. ΧΗ RMN: (CDC13) δ 7, 09-6, 90 (m, 6H, Ph-ií, Phe, Mel), 6,60 (d, 2H, Ph-H, Mel), 6,25 (br d, 1H, NH) , 6,04 (br d, 1H, NH) , 4,73 (dd, 1H, oí-CH) , 4,55 (dd, 1H, a-CH) , 4,14 (q, 2H, Cfí2CH3) , 3, 76-3,58 (m, 8H, Ci72-mostarda) , 3,12-2,88 (m, 4H, Cíí2-Ph) , 1,98 (s, 3H, CH3CO), 1,22 (t, 3H, CH2CB3).

TESTES BIOLÓGICOS

Nos testes seguintes a actividade citostática dos péptidos da invenção foi analisada e comparada com a actividade do melfalano (na forma do cloridrato, substância de injecção Alkeran, Glaxo Wellcome) , P2 (cloridrato do éster etílico da L-prolil-m-L-sarcolisil-p-L-fluorofenilalanina; do Istituto Sieroterapico Milanese, Milão, Itália), sarcolisina (Istituto Sieroterapico Milanese, Milão, Itália) e uma quantidade de drogas padrão em diferentes culturas primárias de células tumorais humanas de pacientes (PHTC) e linhas celulares tumorais humanas. As drogas padrão testadas foram AraC (Cytosar), 5-FU (Flurablastin) e doxorrubicina (Adramycin) de Pharmacia & Upjohn, vincristina (Oncovin) e vinorrelbina (Navelbine) de Pierre Fabre, docetaxel (Taxotere) de Rhone Poulenc Rorer, cisplatina (Platinol) e etoposido (Vepesid) de Bristol-Myers Squibb e topotecano de SmithKline Beecham. 26 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ Ο ensaio de citotoxicidade em microculturas por fluorometria (FMCA, do inglês "Fluorometric Microculture Cytotoxicity Assay") (Larsson, R., et ai. 1992: Int J Câncer, 50, 177-185) foi usado para avaliar os compostos. Resumidamente, são preparadas placas de microtitulação de 96 poços (NUNC, Roskilde, Dinamarca) com 20 μΐ de solução de droga a dez vezes a concentração desejada e armazenadas até dois meses a -70°C. Em geral as substâncias são primeiro dissolvidas em etanol acidico ou absoluto para concentrações de 4,0 a 8,2 mM e adicionalmente diluídas com água estéril ou tampão fosfato salino estéril (PBS, Sigma Chemicals). Todas as diluições com água são feitas directamente antes das experiências para minimizar a influência da hidrólise da mostarda. As concentrações finais de etanol não excedem 1% v/v. No dia zero da experiência adicionam-se 180 μΐ de suspensão celular de concentração adequada aos poços da placa descongelada, seis poços servem como controlos (unicamente suspensão celular) e seis poços como brancos (meio celular unicamente). Após 72 horas de incubação as células são lavadas uma vez com PBS e são adicionados 100 μΐ de diacetato de fluoresceína (10 pg/ml) num tampão fisiológico. Após outros 45 min a fluorescência gerada (ex 485 nm; em 528 nm) é medida num fluorímetro de varrimento de 96 poços (Fluoroscan II, Labsystems Oy, Helsinki, Finlândia). A fluorescência gerada é proporcional ao número de células vivas e os dados são apresentados como índice de sobrevivência (fluorescência no poço de teste em percentagem de poços controlo com os valores do branco subtraídos) e CI50 (concentração inibitória de 50%, conforme calculado pelo software GraphPad Prism® (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, EUA)). Os critérios de qualidade para um ensaio bem sucedido incluem um coeficiente de variação inferior a 30% nos poços de branco (seis poços), controlo (seis poços) e teste (três poços) respectivamente, um sinal do controlo mais de dez vezes superior ao do branco e, finalmente, uma viabilidade celular inicial de mais de 70% (culturas humanas do tumor primário) ou 90% (linhas celulares), a julgar pelo teste de exclusão do azul de tripano.

Dissolveu-se diacetato de fluoresceína (FDA, Sigma) em DMSO para 10 mg/ml e manteve-se congelado no escuro na forma de solução de armazenamento. Foi usado meio celular de 27 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ crescimento RPMI-1640 (Sigma) suplementado com soro fetal bovino a 10% inactivado por calor (FCS, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 2 mM de glutamina, 100 yg/ml de estreptomicina, e 100 pg/ml de penicilina.

Muito trabalho com FMCA centrou-se na previsão da actividade clinica de drogas anticancerigenas para pacientes individuais. A capacidade de previsão deste ensaio para esta aplicação verificou-se ser comparável com a de muitos outros procedimentos de testes clinicamente aceites com sensibilidade e especificidade no intervalo de 80-90 e 60-70, respectivamente.

Teste 1. Actividade citotóxica em espécimes frescos de tumor humano

Foi comparada a actividade citotóxica do melfalano, P2 (cloridrato do éster etílico da L-prolil-m-L-sarcolisil-p-L-fluorofenilalanina) e J1 (cloridrato do éster etílico da L-melfalanil-p-L-fluoro fenilalanina) em amostras tumorais humanas utilizando o ensaio de citotoxicidade em microculturas por fluorometria (FMCA). Cada droga foi testada em seis concentrações variando de 82 a 0,131 μΜ, cada concentração em triplicado.

Analisaram-se no total vinte e sete espécimes frescos de tumor humano, estes eram de origens diferentes: catorze amostras hematológicas (das quais pelo menos cinco foram previamente tratadas com drogas citotóxicas na clinica) e treze amostras de tumores sólidos (cinco previamente tratadas). As curvas de concentração-resposta foram traçadas e os valores de CI50 foram determinados. Os resultados são apresentados na Figura 2, em que as linhas diagonais sólidas representam equipotência e pontos acima desta linha favorecem a droga no eixo do x e vice-versa. O resultado mostra que J1 foi mais activo em todos os casos do que P2, o qual por sua vez foi mais activo do que o melfalano.

Utilizando o mesmo ensaio FMCA, foi novamente testada a actividade citotóxica do melfalano, P2 e Jl, desta vez num total de sessenta e quatro espécimes frescos de tumor humano. Os tumores eram de origens diferentes: foram analisadas quarenta e duas amostras hematológicas e vinte e duas de 28 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ tumores sólidos. Foi analisada em paralelo a actividade de algumas substâncias padrão clinicamente bem conhecidas e usadas a concentrações desde 0,92 a 10,3 μΜ. As drogas padrão foram araC, vincristina, vinorrelbina, docetaxel, cisplatina, doxorrubicina, e etoposido. É apresentada na Tabela 1 abaixo uma comparação das actividades como o indice de sobrevivência a uma concentração definida. J1 mostra uma actividade superior a 0,66 μΜ.

Tabela 1. Actividade de Jl, melfalano, P2 e drogas padrão em PHTC

Droga Concentração μΜ índice de sobrevivência da célula tumoral % Hematológico Sólido (n=42) (n=22) Jl 0,66 13, 7 46,9 Melfalano 3,3 41 88,8 P2 0,66 34, 7 86,0 AraC 10,3 - 102 Vincristina 3,0 39 93 Vinorrelbina 3,1 50 73 Docetaxel 6,2 - 67 Cisplatina 6, 7 63 79 Doxorrubicina 0,92 29 97 Etoposido 8,5 47 81

Teste 2. Actividade citotóxica num painel de dez linhas celulares tumorais humanas A actividade citotóxica de nove péptidos diferentes da invenção (preparados nos Exemplos 1-9) foi comparada com melfalano, P2 (Cloridrato do éster etílico da L-prolil-m-L-sarcolisil-p-L-fluorofenilalanina), sarcolisina e as drogas padrão doxorrubicina, vincristina, cisplatina, 5-Fu e topotecano em dez linhas celulares utilizando o método FMCA. Cada droga foi testada em seis concentrações variando de 40 a 0,013 μΜ (melfalano de 1,6 mM a 0,51 μΜ) e cada concentração em duplicado. A experiência foi repetida três vezes e todos os 29 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ dados de sobrevivência foram depois usados para calcular o IC50 para cada droga em cada linha celular. A selecção de células no painel de linha celular foi descrita anteriormente (Dhar, S., et al. 1996: Br J Câncer, 74, 888-896). Foram incluídas quatro linhas parentais de diferentes origens (linfoma U-937 GBT; mieloma RPMI 8226; cancro do pulmão de pequenas células NCI-H69; e leucemia CCRF-CEM) , cinco sublinhas seleccionadas para várias drogas e uma linha celular primária resistente (carcinoma renal ACHN). A sublinha U-937-vcr é escolhida por resistência à vincristina, as sublinhas 8226Dox40 e H69AR por resistência à doxorrubicina, a sublinha 8226LR5 por resistência ao melfalano. O crescimento e a morfologia da linha celular foram monitorizados numa base semanal, a resistência todos os dois ou três meses.

Os resultados são apresentados na Tabela 2 e mostram que a actividade citotóxica varia entre os péptidos e compara-se favoravelmente com melfalano, m-L-sarcolisina e P2. Além disso, alguns dos péptidos mostram actividades superiores em certas linhas celulares do que algumas das substâncias quimioterapêuticas padrão testadas.

Tabela 2. Actividade de péptidos da invenção comparada com melfalano, sarcolisina, P2 e drogas padrão num painel de linha celular representando formas definidas de resistência a drogas citotóxicas, CI50 (μΜ)

Linha celular J1 J3 JV22 JV2 4 JV2 5 JV26 JV2 7 JV28 JV2 9 CEM/S 0, 03 0, 06 0, 02 0, 05 0, 04 0, 05 0, 14 0, 06 0, 06 CEM/R 0, 01 0, 02 0, 01 0, 03 0, 02 0, 03 0, 1 0, 04 0, 03 ACHN 0,4 1, 72 0,17 0,32 0,2 0,22 0, 21 0, 05 0, 19 H69 0, 04 0,2 0, 04 0, 08 0, 04 0, 06 0, 29 0, 05 0, 09 H6 9AR 0,9 1,36 0,39 0, 48 0,28 0, 51 1,4 0,37 0, 46 8226S 0, 81 1, 51 0,67 1,11 0,65 1,05 1-01 0, 51 0, 9 8226Dox40 1, 76 5,66 1,38 5, 54 1,2 1, 73 1, 58 0, 89 2, 01 8226LR5 2, 47 3, 52 1,86 2, 5 1,82 1,99 2, 46 1, 88 2, 73 U93 7gtb 0, 07 0, 23 0, 14 0, 2 0,15 0,23 0, 16 0, 1 0, 15 U93 7vcr 0, 11 0, 42 0, 13 0,21 0, 16 0,26 0, 26 0, 15 0, 19 MÉDIA 0, 66 1, 47 0, 48 1,05 0, 46 0,61 0, 76 0, 41 0, 68 30 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Linha celular Melfalano P2 Sarco- lisina Doxor- rubicina Vincris- tina Cisplatina 5-FU Topotecano CEM/S 1, 48 0, 94 2,54 0, 18 0, 08 2, 50 57, 4 0, 02 CEM/R 0, 94 0,63 1, 70 1,31 0, 01 1, 87 44, 5 0, 02 ACHN 133,32 4, 59 390 14,2 109 17, 8 769 16,3 H69 13, 44 4, 59 41, 15 1, 66 69,8 92, 47 769 1, 72 H69AR 48, 74 4,27 61, 4 11,6 121 13,5 769 180, 5 8226S 10, 82 5,11 30, 4 0, 13 0, 01 14, 8 75,6 0, 87 8226Dox40 35, 18 5, 43 41, 38 4, 97 0,9 15, 66 60,6 0, 59 8226LR5 30, 61 7,4 31, 88 0, 55 0, 08 16, 33 5, 30 0, 21 U93 7gtb 1,8 1, 78 3, 78 0, 11 0, 01 2, 57 88, 4 0, 02 U93 7vcr 2, 95 1, 79 6,64 0, 42 0, 08 3,0 572, 0 0, 02 MÉDIA 27-93 3,35 61, 09 3, 51 30,1 18, 0 321 20, 0

Teste 3. Actividade citotóxica de J1 em linhas celulares de cancro do pulmão J1 foi também testado contra um painel de linhas celulares de cancro do pulmão e comparado com melfalano e alguns agentes quimioterapêuticos padrão utilizando o FMCA. No total, foram analisadas quatro linhas celulares de cancro do pulmão de células pequenas (U-1906 L e E, U-1285, e U-1690) e sete linhas celulares de cancro do pulmão de células não pequenas (NCI-H23, U-1752, NCI-H611, NCI-H157, U-1810, NCI- H125 e U-1568). Os resultados são apresentados na Tabela 3.

Tabela 3. Actividade citotóxica em linhas celulares de cancro do pulmão, CI50 (μΜ)

Linha celular J1 Melfalano Cisplatina Doxorrubicina Docetaxel Topotecano NCI-H23 7,6 125 11,6 0,14 1,5 5, 84 U-1752 1,3 39,3 11,7 0,42 0, 46 28, 0 NCI-H611 3,17 78,3 50,7 183 1,1 236 NCI-H157 3,9 125 27, 0 0,2 0,1 4, 33 U-1810 0,01 1,0 10,3 22,8 0,1 0, 08 NCI-H125 9,73 85, 2 7,0 0,5 0,16 236 U-1568 1,64 34, 7 23,4 183 5, 94 115 U1906L 0,22 36, 7 12,2 0,92 0,1 0, 12 U1285 0,04 1,97 2,93 0,52 0,1 0, 17 U-1906E 1,17 20,9 21,1 0,44 0,1 0, 08 U1690 1,39 12, 4 6,73 2,21 7,7 0,92 31 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Os resultados mostram que numa base molar J1 compara-se favoravelmente com melfalano e a maioria dos agentes padrão usados na terapia clinica do cancro do pulmão e também mostra uma actividade global similar à observada para docetaxel, uma droga activa da tubulina que tem sido introduzida recentemente na terapia do cancro do pulmão. Uma vez que J1 e outros derivados do melfalano não possuem resistência cruzada com taxanos (julgado por análise de correlação dos padrões de actividade), estas duas classes de droga podem formar combinações de tratamento atraentes.

Teste 4. Actividade citotóxica de J3 e JV28 em culturas primárias de células tumorais humanas de pacientes (PHTC)

Noutro conjunto de experiências foi comparada a actividade de Jl, J3 e JV28 com a do melfalano, sarcolisina e P2 em 31 culturas PHTC utilizando o FMCA. Os resultados são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Actividade citotóxica de drogas em PHTC índice de sobrevivência da células tumorais (%) Droga Cone. μΜ Tumores Hematológicos Tumores Sólidos Total n=7-ll n=12-20 i—1 00 1 Ch i—1 II £ J3 4 7 36,3 25, 9 JV2 8 4 6,7 44,2 30,4 Jl 4 6,6 56,5 40,9 Melfalano 10 47,6 91,0 73,4 Sarcolisina 10 47,1 93,2 76,2 P2 4 7 68,9 46,1

Os resultados mostram que J3 e JV28 foram significativamente (P< 0,001, teste t de Student) mais activos contra amostras hematológicas PHTC do que o melfalano e a sarcolisina. J3 e JV28 foram também significativamente (P< 0,01) mais activos contra amostras de tumor sólido comparados não unicamente a melfalano e sarcolisina mas também comparados a P2. A diferença entre Jl e melfalano assim como sarcolisina e P2 foi estatisticamente significativa para ambos 32 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ os tumores hematológico e sólido. Os resultados demonstram uma actividade inesperadamente elevada dos novos péptidos contra tumores sólidos na forma de um grupo que não foi partilhado pelos compostos de referência.

Teste 5. Actividade citotóxica em diferentes modelos tumorais

Analisou-se o espectro específico da actividade antitumoral de tipos tumorais em linhas celulares e culturas primárias de células tumorais humanas de pacientes. Embora o melfalano tenha sido classificado como activo contra todos os diagnósticos hematológicos, não foi observada actividade, i.e. <50% de redução na sobrevivência das células tumorais, contra os tipos tumorais sólidos. J3, J1 e JV28, por outro lado, mostraram actividade contra vários tipos de tumores sólidos incluindo cancro da mama, carcinoma ovariano e cancro do pulmão. A diferença na actividade específica de tipos tumorais entre Jl, J3 e JV 28 versus P2 é retratada na Tabela 5.

Tabela 5. Actividade citotóxica em diferentes modelos de tumor

Sistema de células tumorais Número Resposta mediana a 4, 0 μΜ >50% de redução na sobrevivência de células tumorais P2 Jl J3 JV2 8 Carcinoma ovariano 8 Não Sim Sim Sim Cancro da mama 4 Não Sim Sim Sim Cancro do pulmão CNP 8 Não Sim Sim Sim Cancro da próstata 1 Não Não realizado Sim Sim Cancro do corpo do útero 4 Não Não Sim Não realizado Adenocarcinoma 5 Não Sim Sim Sim

Enquanto P2 foi determinado inactivo nos diagnósticos listados da Tabela 5, verificou-se que J3 é activo. Verificou-se que Jl e JV28 são activos na maior parte destes diagnósticos. Estes dados mostram que o espectro específico de 33 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ actividade dos tipos tumorais para Jl, J3 e JV28 é mais amplo do que para os compostos de referência e inclui tipos importantes de tumores sólidos.

Teste 6. Contorno da resistência ao melfalano

Investigou-se a capacidade para contornar a resistência ao melfalano em 27 amostras de PHTC de 9 pacientes com tumores hematológicos e 18 pacientes com tumores sólidos. As amostras foram classificadas de acordo com a resistência ao melfalano baseada em resultados de teste FMCA (índice de sobrevivência) de várias centenas de amostras PHTC previamente testadas para melfalano. Estes dados foram usados para estabelecer linhas de corte para dividir amostras em três categorias: Baixa, Intermédia ou Extrema resistência à droga (BRD, IRD e ERD, respectivamente) utilizando o valor da mediana e a mediana + 1 desvio padrão daquela base de dados. O melfalano e os novos compostos Jl, J3, e JV28 foram subsequentemente classificados nestes grupos. A classificação da resistência ao melfalano foi efectuada de acordo com os princípios descritos por Larsson e Nygren, Anticancer Research 13; 1825-1830, 1993. Os novos péptidos e P2 foram testados a uma concentração de 4 μΜ e o melfalano a 10 μΜ. Os resultados deste estudo são apresentados na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6. Contorno da resistência ao melfalano Número de amostras (%) BRD IRD ERD Total Melfalano 8 (30%) 10 (37%) 9 (33%) 27 Jl 13 (76%) 3 (18%) 1 (6%) 17 J3 23 (85%) 4 (15%) 0 (0%) 27 JV2 8 14 (82%) 2 (12%) 1 (6%) 17 P2 14 (74%) 4 (21%) 1 (5%) 19

Os resultados mostram que foram classificadas como IRD e ERD significativamente menos amostras dos novos péptidos, indicando que estas drogas têm a capacidade de contornar a resistência ao melfalano. Nesta análise assume-se que pelo menos metade da concentração de melfalano pode ser conseguida na montagem clínica com os novos péptidos. 34 ΕΡ 1 290 011/ΡΤ

Teste 7. Comparando a actividade de Jl e AcJl

De modo a investigar a diferença de actividade entre um composto com um grupo amino livre no terminal N e o mesmo composto tendo o referido grupo amino protegido, sintetizou-se a forma acetilada de Jl e comparou-se a actividade com Jl utilizando o procedimento FMCA acima descrito com as linhas celulares U-937 e RPMI 8226S. Os resultados mostraram uma potência várias vezes menor (CI50 mais elevada; 0,61 e 2,9 μΜ respectivamente) para a forma acetilada comparativamente com Jl tendo uma amina livre, indicando uma preferência pela última forma relativamente à actividade antitumoral.

CONCLUSÕES

Os resultados globais demonstram uma actividade significativamente mais elevada dos novos compostos que constituem a invenção comparativamente com todos os compostos de referência (melfalano, sarcolisina e P2). Além disso, os novos compostos também demonstraram um espectro mais amplo de actividade especifica para o tipo de tumor comparativamente com os compostos de referência com actividade documentada observada para muitos diagnósticos de tumor sólido. Uma vez que estes compostos mostram também uma actividade relativa semelhante ou ligeiramente melhor em células malignas vs normais, avaliada tomando a razão de IC50 obtida em linfócitos malignos (leucemias linfociticas crónicas) sobre os normais, o potencial clinico destes novos compostos tem que ser considerado elevado.

Lisboa, 2010-05-04

Claims (12)

1. ΕΡ 1 290 011/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Di- ou tripéptido tendo a fórmula I, Cl RaHN

   'Cl (R2)n (I) em que Ri é alquiloxi, cicloalquiloxi, ariloxi, arilalquiloxi, NH2, alquilamino, cicloalquilamino ou arilamino; R2 é independentemente NH2, OH, O-alquilo, N-alquilo, O-acilo, NH-acilo, N (CH2CH2C1)
2. 2, N02, F, CF3 ou H e n é 1 ou 2; e R3 é um aminoácido aromático ou cíclico natural ou modificado, ou H; assim como os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

   (II) em que R3 é alquiloxi, cicloalquiloxi, ariloxi, arilalquiloxi, NH2, alquilamino, cicloalquilamino ou arilamino; R2 é NH2, OH, O-alquilo, N-alquilo, O-acilo, NH-acilo, N(CH2CH2C1) 2, N02, F, CF3 ou H; e R3 é um aminoácido aromático ou cíclico natural ou modificado, ou H; assim como seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
3. 3. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para utilização como medicamento. ΕΡ 1 290 011/ΡΤ 2/2
4. 4. Utilização de um péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de tumores malignos.
5. 5. Péptido de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que R2 é F.
6. 6. Péptido de acordo com a reivindicação 2, em que o péptido é um dipéptido e Ri é alquiloxi; R2 é F, CF3, H, OH, 0-alquilo, NO2, N (CH2CH2CI) 2, NH-acilo ou NH2; e R3 é H.
7. 7. Péptido de acordo com a reivindicação 6, o qual é o éster etílico da L-melfalanil-p-L-fluorofenilalanina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
8. 8. Péptido de acordo com a reivindicação 6, o qual é o éster isopropílico da L-melfalanil-p-L-fluorofenilalanina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
9. 9. Péptido de acordo com a reivindicação 2, em que o péptido é um tripéptido e Ri é alquiloxi; R2 é F, CF3, H, OH, 0-alquilo, NH-acilo, NO2, N(CH2CH2C1)2 ou NH2; e R3 é um aminoácido aromático ou cíclico natural ou modificado.
10. 10. Péptido de acordo com a reivindicação 9, o qual é o éster etílico da L-prolil-L-melfalanil-p-fluorofenilalanina ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Composição farmacêutica para o tratamento de tumores malignos, caracterizada por compreender pelo menos um composto peptídico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 5-10, juntamente com pelo menos um transportador e/ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
12. 12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, para o tratamento de cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do ovário, leucemias, linfomas e mieloma múltiplo. Lisboa, 2010-05-04