PT1283714E - Utilização de lactobacillus casei em composições imunoestimulantes - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE LACTOBACILLUS CASEI EM COMPOSIÇÕES IMUNOESTIMULANTES" A invenção diz respeito à utilização de bactérias lácticas para potenciar a resposta imune específica contra um agente infeccioso das vias respiratórias

As bactérias lácticas (LAB) são tradicionalmente utilizadas para fabricar produtos alimentares fermentados, em especial produtos lácteos.

Os efeitos das bactérias lácticas sobre a saúde forma inicialmente sugeridos nos trabalhos de Metchnikoff (The prolongation of life. Ia Ed. New York: GP Putman' s Sons, 1908), e têm sido desde essa altura objecto de muita investigação. É hoje em dia geralmente aceite que diversas bactérias lácticas podem desempenhar um papel que é benéfico para a saúde. Estas bactérias também são designadas "probióticos", um epíteto que denota organismos vivos que, quando são ingeridos em quantidade suficiente, exercem um efeito positivo sobre a saúde, para além dos seus efeitos nutricionais expectáveis. Têm sido descritas bactérias probióticas, em particular, de entre espécies que 2 pertencem aos géneros dos Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus e Lactococcus, habitualmente utilizados na indústria de produtos lácteos.

Crê-se que os probióticos intervenham em especial ao nível da flora intestinal, impedindo o desenvolvimento de micro organismos patogénicos, e/ou actuando mais directamente sobre o sistema imunitário. Observou-se, por exemplo, que a ingestão de bactérias probióticas ou de alimentos fermentados, tais como o iogurte, que contenham dessas bactérias, leva a uma diminuição das bactérias patogénicas; em termos do sistema imunitário, foram descritos diversos efeitos: uma activação das células envolvidas na resposta imune específica ou não específica, tais como os linfócitos ou os macrófagos, um aumento do teor de imunoglobulinas e em especial da IgA; um aumento do teor das citoquinas activadoras do sistema imunitário, etc. (veja-se uma revisão em, por exemplo, MEYDANI e HA (Am. J. Clin. Nutr., 71, 861-7217, 2000).

No seu conjunto, os trabalhos levados a cabo sobre diversas bactérias lácticas probióticas tendem a concluir que determinadas espécies, ou pelo menos algumas estirpes dessas espécies, apresentam propriedades estimulantes do sistema imunitário. Por outro lado, o(s) mecanismo(s) subjacente(s) a essas propriedades, bem como as componentes do sistema imunitário potencialmente implicadas, permanecem incertos. Parece portanto que será necessário elucidar estes aspectos, em especial para se 3 proporem aplicações mais bem dirigidas das diversas espécies, ou estirpes, de bactérias probióticas.

Diversos estudos levados a cabo sobre seres humanos e sobre animais sugerem um efeito benéfico para a saúde, por parte de bactérias da espécie L. casei, e em particular um efeito positivo sobre o sistema imunitário.

Assim, foi demonstrado em murinos, que a ingestão de leite fermentado contendo a estirpe DN-114 001 de L. casei, aumenta a resistência face a uma infecção com Salmonella typhimurium [PAUBERT-BRAQUET et al. , Int. J. Immunother., 4:153, (1995)]; foram observados em simultâneo a activação de macrófagos e um aumento dos IgA em circulação. A estirpe DN-114 001 foi depositada, a 30 de Dezembro de 1994, na CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) [Colecção Nacional de Culturas de micro Organismos], mantida pelo Instituto Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, em Paris, sob o número 1-1518; esta estirpe, e a sua mistura com fermentos de iogurte para a preparação de produtos lácteos fermentados, são descritos no pedido de PCT WO 96/20607, em nome da COMPAGNIE GERVAIS DANONE.

Um estudo recente levado a cabo sobre seres humanos também descreve que o consumo de leite fermentado contendo a estirpe DN-114 001 de L. casei induz um reforço da resistência à Salmonella typhimurium. Este efeito é 4 atribuído a uma actuação sobre a imunidade não específica congénita [YOON et al. , Int. J. Immunother.; 15, 79-89 (1999)] .

Os investigadores procuraram averiguar se o L. casei também apresentava uma actuação sobre a imunidade adaptativa, a qual, ao contrário da imunidade congénita, se traduz por uma resposta imune específica contra um determinado agente patogénico.

Para este efeito, os inventores estudaram o efeito de L. casei, administrado por via oral in vivo, sobre a estimulação ex vivo da proliferação de células T, em resposta a antigénios representativos de diversos tipos de agentes patogénicos comuns: um antigénio bacteriano (tétano); um antigene fúngico (candida) e um antigene virai (gripe).

Eles observaram, para cada um dos antigénios testados, que a ingestão de L. casei leva a um aumento da capacidade proliferativa das células T, e em especial das suas sub-populações CD3, em resposta a uma activação com o antigene referido. Este efeito manifesta-se mais em particular no caso do antigénio da gripe. A invenção presente tem como objecto a utilização de uma estirpe bacteriana da espécie L. casei para preparar uma composição que pode ser administrada por via oral para reforçar uma resposta imunitária sistémica contra um micro 5 organismo patogénico.

Este reforço da resposta imunitária provém de um aumento da capacidade de proliferação das células T específicas para os antigénios do micro organismo patogénico referido.

Os micro organismos patogénicos em questão são sobretudo bactérias ou vírus; entre estes últimos citar-se-ão por exemplo os rinovírus, o vírus respiratório sincitial (V.R.S), e os mixovírus (ortomixovírus tais como os vírus da gripe (influenza A, B ou C) , ou paramixovírus, e em especial os para-influenzae).

No quadro da implementação da invenção presente, pode utilizar-se a estirpe referida de L. casei por si só, ou em conjunto com outras bactérias lácticas da espécie L. casei ou de outras espécies. Ela pode ser utilizada de forma vantajosa, em conjunto com fermentos de iogurte, nomeadamente Lactobacillus bulgaricus e Streptococcus thermophi1us.

Ela pode ser utilizada sob a forma de bactérias inteiras, vivas ou não, e também sob a forma de lisado bacteriano, ou sob a forma de fracções bacterianas.

De preferência, uma composição preparada no quadro de uma utilização consoante a invenção, contém pelo menos 105, de preferência pelo menos 106, e em geral entre 6 1*108 e 1,5*109, células de L. casei, por mL.

Quando se utiliza o L. casei em combinação com fermentos de iogurte, a composição referida contém além disto, de forma vantajosa, pelo menos 107, de preferência entre 2*108 e 1*109, células de S. thermophilus, por mL, e pelo menos 5*105, e de preferência entre 4*106 e 2*107, células de L. bulgaricus, por mL.

Uma estirpe de L. casei que é muito especificamente conveniente para utilização na invenção presente, é a estirpe 1-1518 do CNCM.

Podem administrar-se as composições preparadas de acordo com a invenção sob a forma de alimentos, ou de suplementos alimentares. Pode tratar-se por exemplo de lacticínios, e em especial de lacticínios fermentados contendo pelo menos a estirpe referida de L. casei, misturada opcionalmente com outras bactérias lácticas, por exemplo com fermentos de iogurte.

Podem utilizar-se composições preparadas consoante a invenção presente no contexto da prevenção e do tratamento de estados patológicos de origem infecciosa, e em especial de origem virai, nomeadamente no caso da gripe. De preferência, para se obter um efeito óptimo, eles serão administrados durante pelo menos uma semana, vantajosamente durante pelo menos 10 dias, numa quantidade que corresponda à absorção de pelo menos 107, de preferência pelo menos 7 108, em geral entre 109 e 1012, células de L. casei.

Entender-se-á mais claramente a invenção presente com a ajuda do complemento de descrição que se vai seguir, que se refere a exemplos ilustrando as propriedades de uma estirpe de Lactobacillus casei no que toca ao reforço da resposta específica a antigénios microbianos.

EXEMPLO 1: ACTUAÇÃO DO LACTOBACILLUS CASEI SOBRE A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS T EM RESPOSTA A UMA ESTIMULAÇÃO ANTIGÉNICA

Levou-se a cabo um estudo duplamente cego em relação a um placebo para se testar o efeito da ingestão de um produto lácteo fermentado incluindo a estirpe DN-114 001 (CNCM 1-1518) de Lactobacillus casei, sobre a proliferação de células T em resposta a uma estimulação antigénica.

As condições deste estudo são como se segue:

Sujeitos

Recrutaram-se 88 indivíduos saudáveis, de 18 a 50 anos de idade, no Departamento de Doenças Infecciosas do Washington Hospital Center (Washington, D.C.). Excluiram-se do estudo os indivíduos com uma história de hepatite ou de problemas renais, de disfunções cardiovasculares, de doenças imunitárias ou gastro-intestinais, com asma severa ou com diabetes açucarado, os indivíduos submetidos a 8 tratamento com antibióticos ou com imunossupressores menos de 3 meses antes do início do estudo, os indivíduos apresentando uma história de abuso ou de dependência do álcool, os indivíduos com intolerância ou hipersensibilidade conhecidas em relação a produtos lácteos, os indivíduos que praticavam uma dieta pobre em calorias, os indivíduos que haviam sido vacinados contra a gripe na estação anterior, e também as mulheres grávidas ou as mulheres que estavam a aleitar. O protocolo e as condições do estudo foram aprovados pela Comissão de Investigação do WHC, e também pela Comissão de Revisão Institucional que controla os estudos levados a cabo em seres humanos.

Dividiram-se os indivíduos em 2 grupos, de forma aleatória: - um grupo de 47 indivíduos (26 mulheres e 21 homens) receberam 100 mL por dia de um produto lácteo fermentado contendo 2% de gordura, incluindo fermentos de iogurte (L. bulgaricus e S. thermophilus), bem como a estirpe DN-114 001 de Lactobacillus casei, e comercializados pela DANONE sob a marca registada ACTIMEL. - um grupo de 41 indivíduos (22 mulheres e 19 homens) recebeu um placebo durante 28 dias: 100 mL por dia, de leite diluído com água ([1/5] , em volume), suplementado 9 com açúcar para lhe conferir um valor calórico equivalente ao do ACTIMEL.

Solicitou-se aos indivíduos dos 2 grupos que não consumissem iogurte nem outros produtos lácteos fermentados, durante o período do estudo. A média de idades dos indivíduos (desvio padrão indicado entre parênteses) era de 36 (7,3) e de 32,7 (7,4) anos, respectivamente, para o grupo a ACTIMEL e para o grupo a placebo.

Obteve-se uma amostra de sangue (55 mL) de cada indivíduo dos 2 grupos, antes de se iniciar o consumo de ACTIMEL ou do placebo, para se determinar os valores de base. Fizeram-se visitas de controlo aos indivíduos, nos dias 9, 18 e 28, completando-se um pequeno questionário acerca do seu estado de saúde, de efeitos colaterais possíveis, e também do desenvolvimento de qualquer doença que interferisse possivelmente com a interpretação dos resultados. Obteve-se uma amostra de sangue durante cada visita, destinada a experiências imunológicas.

Para cada amostra de sangue individual, levaram-se a cabo uma contagem completa de células do sangue, e uma análise da química do sangue. Para além disto, levou-se a cabo uma análise fenotípica dos leucócitos e dos seus subgrupos (células T e seus subgrupos, células B, monócitos e células NK), por citometria de fluxo. 10

Medição da proliferação celular

Determinou-se ex vivo a resposta proliferativa dos sujeitos do grupo a ACTIMEL e o dos indivíduos do grupo a placebo, com respeito a três antigénios microbianos: candida, tétano e gripe, medindo a incorporação de 3HTdR, tal como se descreve adiante neste documento.

Preparação das células:

Trataram-se como se segue 30 mL de sangue heparinizado, de cada uma das amostras de sangue obtidas: centrifugou-se o tubo durante 10 mins a 1500 rpm. Transferiu-se cuidadosamente o plasma para criotubos rotulados, e armazenou-se a 70°C. Transferiu-se o sangue para um tubo de centrífuga de a 15 mL e diluiu-se a 1:3 com PBS. Adicionaram-se 10 mL de Ficoll-hypaque a um tubo de centrifugação de 50 mL e recobriram-se com 30 mL do sangue diluído. Centrifugou-se o tubo durante 2 mins a 2000 rpm, à temperatura ambiente. Aspirou-se a camada superior de PBS e juntaram-se as células mononucleares, que se transferiram para um tubo de centrifugação de 15 mL. Adicionaram-se 10 mL de HBSS, agitou-se num vortex e centrifugou-se a 1500 rpm durante 10 mins; aspirou-se o sobrenadante e voltou a suspender-se a pérola em 2-3 mL de HBSS. Adicionaram-se 8 mL de HBSS e centrifugou-se o tubo a 1500 rpm durante 6 mins. Repetiu-se este procedimento duas vezes e voltaram a suspender-se as células assim obtidas em 1-2 mL de PBS, 11 agitando-se num vortex. Contaram-se as células, examinando a sua viabilidade por exclusão com Azul de Trypan, e ajustou-se a sua concentração a 2*108/mL.

Preparação de Antigénios:

Antigénio do tétano: fez-se a preparação no próprio dia do ensaio. Preparou-se uma solução de base por diluição a 1:1000 de toxóide do tétano (CONNAUGHT LABORATORY, Willowdale, Canada) a 1:10 00 em PBS.

Antigénios de Candida albicans: preparou-se uma solução de base diluindo antigénios de Candida albicans (BAYER CO, Elkert, Ind.) a 1:1000 em PBS.

Antigénios da gripe: preparou-se uma solução de base diluindo antigénios de vírus da gripe (NIBSC, Herts, England) a 1:125 em PBS.

Utilizaram-se placas de microtitulação (96 poços) . Colocou-se em cada poço 100 μΙ; de solução de base de antigénio e 100 μΕ de células, a uma concentração final de 2*105 células por poço. Nos poços de controlo foram colocados 10 0 μΙ, de PBS em vez da solução de base de antigénio. Incubaram-se as placas a 37°C., sob 5% de C02, durante 5 dias; 18 horas antes do final da incubação, adicionaram-se 2 0 pL de 3HTdR a 5 0 μ^/ιτιΕ (NEW ENGLAND NUCLEAR, Boston, Mass.). Recolheram-se sobre filtros as células de cada placa, e contaram-se directamente esses 12 filtros num contador beta MATRIX 9600 (PACKARD INSTRUMENTS) para se medir a incorporação de 3HTdR, que se encontra expressa em CPM (contagens por minuto).

Avaliou-se a proliferação para cada indivíduo do grupo que recebia ACTIMEL, e para cada indivíduo do grupo que recebia placebo, determinando o índice de estimulação (SI) de acordo com a fórmula seguinte: IS = média das CPM em células estimuladas_ média das CPM em células não estimuladas poço de controlo)

Análise estatística:

Utilizaram-se medidas estatísticas descritivas (média, desvio padrão, mediana) para resumir a resposta proliferativa das células T à exposição a cada antigénio, para cada um dos grupos em estudo e a cada instante de medição. Devido ao enviezamento da distribuição da resposta proliferativa, utilizou-se uma transformação dos dados sobre proliferação nos seus logaritmos naturais.

Compararam-se as variações da resposta proliferativa com os valores de base, utilizando-se os resultados para a modelização estatística [LITTELL et al., SAS System for Mixed Model. North Carolina: SAS Institute Inc, (1996)]. Representaram-se as modificações da resposta proliferativa em comparação com os valores de base, em função do tempo, usando a técnica de ajuste tal como 13 descrita por DIGGLE et al. [Analysis of Longitudinal Data. New York: University Press Inc, 1994].

Desenvolveu-se um modelo linear misto para estudar a trajectória da resposta proliferativa. Este modelo permite o ajustamento dos dados sobre proliferação a uma curva quadrática para cada um dos grupos em estudo.

Este modelo é definido pela equação seguinte: Y:=u;: + β1, Τ+β2jT2+8ijt/ i = l, . . . n, j =1, 2, t = l, 2, 3, 4 em que:

Yijt designa a variação na resposta prolif erativa, em comparação com o valor de base, para o indivíduo i no grupo a produto j, no instante t; tendo-se aplicado a transformação em logaritmos naturais a cada uma das variáveis, Yijt = Log (proliferação no instante t)-Log (valor de base); (Xij designa a intercepção para o indivíduo i, no grupo do produto j. Reflecte um efeito aleatório no modelo. a,ij~MVN (0, G) . G contém as componentes da variância na estrutura diagonal (MVN: distribuição multinormal de variáveis);

β 1 j e β2j são os coeficientes de regressão para T 14 e para T2, para o grupo do produto j ; T é o momento da medição (dia 0, 9, 18 ou 28) e T2 é o termo quadrático em T. 8ijt é o coeficiente de erro: £íjt~MVN (0, R) , e R=a2In, em que In designa a matriz identidade n*n.

Efectuaram-se os seguintes testes de hipótese estatísticos: é 0 . a) Ho

Testar se o coeficiente de regressão estimado βΐ j = 0 vs. Hi: βΐ-j^o (para um termo linear) e quadrático) H0: P2j = 0 vs. Hl: β2^0 (para um termo

Se Plj e β 2 j não forem diferentes de 0, não existe qualquer trajectória.

Se β2j for significativamente diferente de 0, existe uma trajectória quadrática.

Se apenas Pij for significativamente diferente de 0, existe uma trajectória linear. 15 b) Compararam se as trajectórias dos dois grupos são idênticas. H0: β1ι=β12 vs. Hi: βΐι*β12 (para um termo linear) e H0: β2ι=β22 vs. Hl: β2ι^β22 (para um termo quadrático) 0 programa estatístico SAS foi utilizado para se levarem a cabo as análises.

Resultados

Na tabela 1 adiante listam-se os dados demográficos que dizem respeito aos indivíduos, e à avaliação do valor de base da proliferação.

Tabela 1

Dados demográficos e valores de base Placebo ACTIMEL comparação Placebo vs. ACTIMEL Homem 22 26 Teste de Qui2 Sexo Mulher 19 21 P=0,826 Média (DP) 32,7 (7,4) 36,0±7,3 Teste t Idade Mediana 31 37 P=0,038 Branca 26 25 Teste de Qui2 Valor exacto Etnia Negra 12 17 de p=0,652 Outra 3 5 16

Continuação da tabela

Dados demográficos e valores de base Placebo ACTIMEL comparação Placebo vs. ACTIMEL Média(DP) 1932 (567) 2009(554) Teste T Linfócitos Mediana 1812 1993 P=0,519 Média(DP) 865 (327) 927 (325) Teste T CD3+CD4+ Mediana 740 818 P=0,548 Média(DP) 469 (205) 431 (181) Teste T CD3+CD8+ Mediana 417 403 P=0,360 Média(DP) 380 (200) 408 (182) Teste T CD3+CD25+ Mediana 349 392 P=0,489 Média(DP) 1384 (488) 1411 Teste T CD3+CD45+ (434) Mediana 1354 1382 P=0,5783 DP = desvio padrão

Proliferação de Células T em resposta a antigénios microbianos específicos

Na tabela 2, adiante, listam-se os valores das médias, dos desvios padrão e das medianas da proliferação ex vivo das células mononucleares periféricas do sangue (PBMC) , para cada grupo (ACTIMEL e placebo) , aos vários instantes de amostragem.

Tabela 2 17

Placebo ACTIMEL Antigénio Dia 0 Dia 9 Dia 18 Dia 28 Dia 0 Dia 9 Dia 18 Dia 28 Candida Média 2,3 2,7 2,9 1,9 3,0 3,2 4,3 2,3 DP 2,0 3,1 4,1 1,2 3,4 3,5 5,6 2,6 Mediana 1,5 1,7 1,6 1,6 1,7 1,7 2,0 1,4 Tétano Média 7,3 11,8 7,9 8,7 8,4 8,7 10,3 7,8 DP 7,8 12,3 8,0 8,1 15,8 10,4 11,8 8,2 Mediana 5,2 6,3 5,1 6,7 3,5 5,2 5,0 5,1 Gripe Média 14,2 21,7 17,0 17,3 13,0 19,7 20,3 13,9 DP 11,4 19,1 19,6 15,7 12,6 17,1 16,6 12,7 Mediana 11,1 16,5 9,8 12,0 9,6 16,9 17,0 11,0 DP = desvio padrão Não existem diferenças significativas entre os dois grupos em estudo, no que toca aos valores de base (dia 0) da resposta proliferativa em relação aos três antigénios microbianos. A figura 1 ilustra as variações da resposta prolif erativa ao longo do temo para cada patogénico, em ambos os grupos em estudo: o grupo a ACTIMEL: linha contínua; o grupo a placebo: linha a tracejado.

Na tabela 3 adiante listam-se os resultados da modelização. 18

Antigénio Variável Estimativa do parâmetro Erro padrão Teste H0. parâmetro=0 Comparação das duas curvas Placebo T 0,017 0,014 P=0,232 H0: βΐ1=βΐ2 -0,0007 0,0005 P=0,208 P=0,540 Cândida ACTIMEL T 0,028 0,013 P=0,030 Η0:β21=β22 rp2 -0,0012 0,0005 P=0,013 P=0,458 Placebo T 0,034 0,014 P=0,022 Η0:β1Ι=β12 T2 -0,0008 0,0005 P=0,141 P=0,630 Tétano ACTIMEL T 0,043 0,013 P=0,001 Η0:β21=β22 ip2 -0,0011 0,0005 P=0,020 P=0,626 Placebo T 0,022 0,017 P=0,181 H0:βΐι = βΐ2 T2 -0,0004 0,0006 P=0,475 P=0,045 Gripe ACTIMEL T 0,068 0,015 P=0,0001 Η0:β21=β22 rp2 -0,023 0,0006 P=0,0001 P=0,027 Cândida:

No grupo a ACTIMEL, a resposta de base é de 3, 0±3,4 no dia 0 e aumenta até 3,2+3,5 no dia 9, e para 4,3±5,6 no dia 18, e cai para 2,3±2,6 no dia 28 (Tabela 2). Os coeficientes estimados para o termo linear T e para o termo quadrático T2 são, respectivamente, de 0,028 e de 0,0012, (Tabela 3). Os dois valores são significativamente diferentes de zero de um ponto de vista estatístico (respectivamente com p-0,030 e 0,013). Estas observações implicam que existe uma tendência positiva significativa para a variação da resposta proliferativa ao antigene da Candida. A resposta proliferativa começa por aumentar e depois diminui, tal como se ilustra na figura la. 19 O grupo do placebo evidencia pouca alteração durante o período do estudo. Os coeficientes de regressão estimados para T e para T2 são de 0,017 e de 0,0007. Estes valores não diferem significativamente de 0 (respectivamente com p=0,232 e 0,208). Estas observações implicam que não existe uma tendência positiva significativa para a variação da resposta proliferativa ao antigene da Candida, durante o período do estudo. Tal como a figura la o demonstra, a curva para o grupo de placebo é mais chata do que a curva para o grupo a ACTIMEL. Embora o grupo a ACTIMEL demonstre uma trajectória significativa, ao contrário do grupo a placebo, a diferença entre as duas curvas não atinge o nível da significância estatística (p=0,540 para T e p=0,458 para T2, Tabela 3). Tétano:

Para o grupo a ACTIMEL, a resposta aumentou gradualmente desde o nível da base até ao dia 18, e depois diminuiu. Os coeficientes de regressão estimados para T e para T2 são, respectivamente, de 0,043 e de 0,0011, (Tabela 3). Estes dois valores são significativamente diferentes de 0 (respectivamente com p=0,001 e 0,020). Tal como no caso da Candida, a variação positiva da resposta proliferativa ao longo do período do estudo é significativa para o grupo a ACTIMEL. No grupo a placebo, o valor médio aumentou desde 7,3 no dia 0, até 11,8 no dia 9, e depois diminuiu para 7,9 no dia 18, e aumentou de novo para 8,7 no dia 28 (figura 1 b). Mesmo com um coeficiente não significativo para o termo 20 do segundo grau, T2, (-0,0008, com p=0,141, Tabela 3), o coeficiente estimado significativo de T (0,034, com p=0,022, Tabela 3) mostra um efeito de trajectória. No entanto, ao comparar o grupo a ACTIMEL com o grupo a placebo, os testes estatísticos não evidenciam quaisquer diferenças significativas entre as duas curvas (p=0,630 e 0,626, respectivamente para T e para T2) .

Gripe: O grupo a ACTIMEL evidenciou uma alteração mais clara do que o grupo a placebo. O valor médio aumentou desde 13±12,6 no dia 0, até 19,7±17,1 no dia 9, permaneceu a esse nível até ao dia 18, e depois diminuiu para 13,9±12,7 no dia 28 (figura lc) . Os dois coeficientes estimados para T e para T2 são significativamente diferentes de zero (p=0,001). Estas estatísticas indicam que a alteração positiva da resposta proliferativa durante o período do estudo é significativo (Tabela 2). O grupo a placebo demonstrava variações semelhantes às observadas no caso do tétano. Os valores médios aumentaram até ao dia 9, diminuíram até ao dia 18, e aumentaram até ao dia 28 tal como se ilustra na figura lc. Os dois coeficientes de regressão estimados não são significativamente diferentes de 0 (os valores de p são, respectivamente, de 0,181 e de 0,475, para T e para T2) , indicando que não existe uma trajectória significativa de variações da resposta proliferativa ao antigénio da gripe. 21

Quando se comparam os parâmetros estimados para o grupo a ACTIMEL com os obtidos para o grupo a placebo, são obtidas diferenças significativas, tanto para os parâmetros lineares como para os parâmetros quadráticos (p=0,045 para T e p=0,027 para T2) (Tabela 3). Estas conclusões indicam que as variações da resposta proliferativa são significativamente diferentes, entre os dois grupos em estudo,

EXEMPLO 2: ACTUAÇAO DO LACTOBACILLUS CASEI SOBRE A PROLIFERAÇÃO DE SUBCONJUNTOS DE LINFÓCITOS T, EM RESPOSTA A UMA ESTIMULAÇÃO COM O ANTIGÉNIO DA GRIPE Não é conhecida a natureza exacta do(s) subconjunto(s) de T que responde(m) in vitro a antigénios microbianos. Ou cada um dos subconjuntos específicos de linfócitos T, tais como aqueles que são representados pelos fenótipos CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+, e CD3+CD45+, podem ser considerados como sendo entidades primárias de que provém a resposta, ou estes conjuntos em combinação podem contribuir para a resposta proliferativa total, contra os antigénios utilizados.

Partindo do princípio que os subconjuntos específicos de linfócitos são os principais responsáveis pela resposta aos antigénios utilizados, levaram-se a cabo as análises utilizando o modelo estatístico descrito no Exemplo 1 acima, para os subconjuntos de células T 22 CD3+CD4 +, CD3+CD8+, CD3+CD25+, e CD3+CD45 + , para se conseguir determinar se a resposta proliferativa obtida para cada um dos 4 subconjuntos diferia significativamente entre o grupo a ACTIMEL, e o grupo a placebo.

Nestas análises, os valores para a resposta proliferativa baseada inicialmente no total de PBMC foram transformados, para cada subconjunto, em novos valores calculados consoante a frequência total de células T CD3+CD4 +, CD3+CD8+, CD3+CD25+, e CD3+CD45 + , em cada amostra de sangue. Em seguida, levaram-se a cabo análises estatísticas para cada subconjunto, tal como se descreveram no Exemplo 1 acima.

Os valores das médias, dos desvios padrão, e das medianas de cada um dos grupos, a ACTIMEL e a placebo, quanto aos quatro subconjuntos de linfócitos, são listados na Tabela 4 adiante.

Tabela 4

Subconjunto Placebo ACTIMEL de Dia 0 Dia 9 Dia 18 Dia Dia 0 Dia 9 Dia Dia linfócitos 28 18 28 CD3+CD4+ Média 101 149 113 125 87,4 131 133 107 DP 84,0 130 117 127 104 90,2 112 127 Mediana 72 ,8 111 74,8 91,0 63,0 103 92,0 64,5 CD3+CD8+ 23 Média 192 268 251 251 230 301 365 244 DP 155 250 289 336 375 286 554 302 Mediana 167 218 140,5 168 105 180 214 126 CD3+CD25+ Média 250 377 260 354 177 267 310 270 DP 219 374 208 462 139 163 210 305 Mediana 185 263 228 247 159 262 251 177 CD3+CD45+ Média 63,5 87,6 73,0 76,2 52,1 78,7 87,1 69,1 DP 54,1 70, 9 81,3 79,7 72,2 56,3 79,2 95,2 Mediana 47,5 66,6 43,1 51,4 34,0 64,0 67,8 41,0 DP = desvio padrão Não existem diferenças significativas entre os dois grupos em estudo, no que toca aos valores de base.

Utilizando o modelo estatístico descrito no exemplo 1 acima, as variações da proliferação em relação a esses valores de base, no que toca ao antigénio da gripe, forma analisados para cada um dos subconjuntos de linfócitos. A figura 2 ilustra as variações da proliferação, em escala logarítmica, para cada um desses subconjuntos e para cada um dos dois grupos em estudo.

Na Tabela 5 adiante listam-se os resultados da modelização estatística.

Tabela 5 24

Subconjunto de Linfócitos Variável Estimativa do parâmetro (EP) Teste H0. parâmetro=0 Comparação das duas curvas Placebo T 0,015 (0,016) P=0,352 Η0:βΐ1=βΐ2 T2 -0,0003 (0,0006) P=0,597 P=0,015 CD3+CD45+ ACTIMEL T 0,071 (0,015) P<0,001 Η0:β2ι=β22 T2 -0,0024 ¢0,0006) P<0,001 P=0,016 Placebo T 0,024 (0,016) P=0,144 Η0:βΐχ=βΐ2 -0,0004 (0,0006) P=0,463 P=0,031 CD3+CD25+ ACTIMEL T 0,071 (0,015) P<0,001 Η0:β21=β22 T2 -0,0022 ¢0,0006) P<0,001 P=0,030 Placebo T 0,014 (0,017) P=0,410 Η0:βΐ1=βΐ2 IJ|2 -0,0003 (0,0006) P=0,671 P=0,013 CD3+CD8+ ACTIMEL T 0,070 (0,015) P<0,001 Η0:β21=β22 -0,0024 (0,0006) P<0,001 P=0,012 Placebo T 0,022 (0,017) P=0,203 Η0:β1ι=βΐ2 rjn2 -0,0005 (0,0006) P=0,436 P=0,028 CD3+CD4+ ACTIMEL T 0,072 (0,015) P<0,001 Ho :β2! = β22 rji2 -0,0025 (0,0006) P<0,001 P=0,024 ΕΡ = erro padrão

As respostas proliferativas de cada um dos quatro subconjuntos de linfócitos estão de acordo com as observadas para as PBMC totais. Durante a exposição ao antigénio da gripe, observaram-se variações significativas no grupo a ACTIMEL, para os quatro subconjuntos de linfócitos. Estas variações podem ser representadas por uma função quadrática do tempo.

Observaram-se pequenas variações para os quatro 25 subconjuntos, no grupo a placebo.

Para além disto, as diferenças entre os dois grupos foram significativas para todos os subconjuntos de linfócitos:

CONCLUSÃO

Estes resultados mostram, no que toca aos 3 antigénios testados, um aumento da resposta proliferativa induzida por um agente antigénico, o qual era maior para o grupo a ACTIMEL do que para o grupo a placebo. No caso do antigénio da gripe, o aumento observado no grupo a ACTIMEL é estatisticamente significativo, quando comparado com o observado para o grupo a placebo, tanto no que toca ao número total de PBMC como no que toca a cada um dos subconjuntos de células T CD3+CD4 + , CD3+CD8 + , CD3+CD25+ e CD3+CD45+. É portanto aparente que o consumo de ACTIMEL induziu, nos indivíduos que o consumiram, um arranque imunológico in vivo, o qual levou a uma resposta ex vivo das suas células T aos antigénios microbianos, e em especial aos antigénios da gripe, resposta essa que era melhor do que a observada no grupo a placebo.

Este aumento da resposta correlaciona-se com a frequência e com o estatuto de activação das células T CD3+, e os dos seus subconjuntos, nos indivíduos que 26 pertenciam ao grupo a ACTIMEL.

Por outro lado, a correlação positiva com a presença do marcador de activação CD25 sugere a intervenção de uma activação in vivo de células T específicas para a gripe, exprimindo os receptores CD25 IL-2, e capazes de responder mais eficazmente aos antigénios da gripe. A análise dos subconjuntos de células T também sugere que a resposta proliferativa envolve tanto os subconjuntos CD4+ como CD8+ correspondendo ao antigénio da gripe. A importância do subconjunto de células T CD3+/CD8+ na análise da proliferação, sugere a possibilidade de se fazer aumentar in vivo a quantidade de células citotóxicas CD8+ específicas contra a gripe.

Lisboa, 2 de Outubro de 2006

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma estirpe bacteriana da espécie L. casei para se preparar uma composição administrável por via oral para reforçar a resposta imunitária específica contra um micro organismo patogénico das vias respiratórias.

2. A utilização tal como se reivindicou na reivindicação 1, caracterizada por o micro organismo patogénico ser um vírus, seleccionado de entre os rinovírus, o vírus respiratório sincital, e os mixovírus.

3. A utilização tal como se reivindicou na reivindicação 2, caracterizada por o referido vírus ser um vírus da gripe.

4. A utilização tal como se reivindicou em qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a estirpe referida de L. casei ser a estirpe 1-1518 do CNCM.

5. A utilização tal como se reivindicou em qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizada por a referida composição assumir a forma de um alimento ou de um complemento alimentar.

6. A utilização tal como se reivindicou em qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada por a 2 2 um lacticínio composição referida assumir a forma de fermentado. Lisboa, 2 de Outubro de 2006