CN103220921B - 免疫佐剂 - Google Patents

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Abstract

本发明因此涉及一种用于通过共同施用益生菌诸如干酪乳杆菌431或BB-12与流感疫苗来加强疫苗的效率的方法。本发明还涉及用于这种治疗中的组合物。

Description

免疫佐剂
技术领域
本发明涉及乳酸菌用于扩大针对传染原的特异性免疫应答的用途。
背景技术
根据粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的定义，益生菌是当以适当的量施用时对宿主提供健康益处的活细菌(FAO/WHO2001)。益生菌已经显示对不同的病症诸如乳糖吸收不良、急性腹泻、抗生素相关性腹泻、变态反应和炎性肠病具有有益作用(Goldin和Gorbach2008)。
益生菌通常见于乳杆菌属、链球菌属、乳球菌属和双歧杆菌属中。来自这些种属的许多菌株通常用于制备奶酪、酸奶和其他乳制品。
益生菌被认为尤其在肠道菌群水平上通过阻碍病原微生物的发育，和/或更直接地作用于免疫系统进行干预。例如，已经观察到摄入益生菌或包含这些细菌的发酵食品诸如酸奶，导致病原菌的减少；就免疫系统而言，已经报道了许多作用：激活参与特异性或非特异性免疫应答的细胞，诸如淋巴细胞和巨噬细胞，增加免疫球蛋白且特别是IgA的水平；增加激活免疫系统的细胞因子的水平，等等(综述，参见，例如MEYDANI和HA(AmJClinNutr，71，861-7217，2000)。
总之，对各种益生乳酸菌进行的研究倾向于得出这样的结论：一些种属，或这些种属的至少一些菌株具有免疫刺激特性。
在人类和动物中进行的数个研究表明干酪乳杆菌属(L.casei)的细菌对健康具有有益作用，且特别是对免疫系统具有积极作用。
在小鼠中的干酪乳杆菌研究
在小鼠中已经表明摄入含有干酪乳杆菌菌株DN-114001的发酵乳增加对鼠伤寒沙门氏菌感染的抵抗力[PAUBERT-BRAQUET等，IntJImmunother，4：153，(1995)]；已经同时观察到巨噬细胞的激活和循环IgA的增加。
已经饲以副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactobacillusparacaseissp.paracasei)(干酪乳杆菌)的营养不良小鼠形成提高的针对肺炎球菌呼吸道感染的抵抗力(Villena等2005)。这显示为与对照组相比更有效地从血液中清除病原体和显著更少的肺损害。另外，白细胞和嗜中性粒细胞的数目以及抗肺炎球菌的IgA增加(Villena等2005)。
在人中的干酪乳杆菌研究
在健康成人中，在受试者口服接种脊髓灰质炎疫苗的研究中补充含鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)或干酪乳杆菌的化学酸化乳在第8天时导致循环中和抗体滴度增加。特别地，脊髓灰质炎病毒特异性免疫球蛋白A(IgA)、IgG和IgM增加(deVrese等2005)。作者得出结论益生菌诱发免疫应答，其可以通过增加病毒中和抗体的产生来提供使细胞免受病毒感染的增强的全身保护(deVrese等，2005)。该文章报道的结果显示尽管在同一方向上相关且有指示，但差异并非在所有情况下显著。关于干酪乳杆菌的仅有的统计学显著的结果是对血清型-2-特异性IgM的作用是统计学显著的。
在儿童中使用的研究显示增加的粪便IgA
在儿童中的数个研究已经显示益生菌株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalisssp.lactis)， 的免疫调节特性。将在断奶配方中施用于在12个月龄时已经完成了口服脊髓灰质炎病毒疫苗接种的7名儿童(15至31个月大)显著增加了粪便中的总IgA和抗脊髓灰质炎病毒IgA的浓度，这可以促进增强的针对胃肠道感染的粘膜抵抗力(Fukushima等，1998)。在婴儿的饮食中引入牛乳时配方奶喂养的婴儿在其1岁期间摄入和的组合导致牛乳特异性IgA分泌细胞的增加(Rautava等，2006)。与对照组相比，在早产婴儿中，持续21天口服给予导致增加的粪便IgA。另外，体重、粪便中的醋酸盐和乳酸盐的浓度均较高，后一发现表明改善的乳糖硝化。在益生菌组中粪便中的钙卫蛋白减少，证明改善的粘膜免疫力和对饮食抗原和细菌抗原的炎性应答减轻(Mohan等，2008)。
在干酪乳杆菌以外的其他干酪乳杆菌菌株中的流感疫苗模型
对于其他益生菌株的采用流感疫苗模型的早期研究的结果已经被描述。在先导研究中，在86名70岁以上的老年受试者(n＝86)中持续7周摄入含有益生菌株干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)DN-114001的发酵乳制品导致对流感疫苗接种的改善的免疫应答。与对照组中相比，在益生菌组中针对特定流感菌株的血清保护率和血清转换率持续较高。另外，流感特异性抗体滴度在疫苗接种后增加，在益生菌产品组中与对照组相比持续较高。然而，组间的差异在统计学上并不显著(Boge等，2009)。随后，在持续13周摄入含有干酪乳杆菌DN-114001的发酵乳饮料或未发酵的对照乳制品的222名老年志愿者(平均年龄85岁)中进行了验证性研究。还在此研究中，在疫苗接种后与对照组相比，在益生菌产品组中特异性抗体滴度持续较高。在整个产品消费期期间，相对于对照组在益生菌组中，B菌株抗体滴度和血清转换显著较高。在B菌株和H3N2菌株接种后5个月仍然观察到通过治疗意向(ITT)分析的组间血清转换率的显著性差异(Boge等，2009)。
在健康成人志愿者(n＝50)中，口服摄入含发酵乳杆菌(Lactobacilhusfermentum)CECT5716的胶囊显著地增加流感疫苗接种后的抗原特异性IgA和总IgM并且使得在疫苗接种后2周，与对照组相比在益生菌组中这些抗体的浓度较高。另外，在益生菌组中在流感疫苗接种后2周，自然杀伤(NK)细胞的产生增加。最后，与对照组相比，在摄入益生菌的组中在疫苗接种后5个月期间流感样病的发病率较低，在5个月时(在二月)组间具有显著性差异(Olivares等，2007)。
尽管有这些研究，由于益生菌的健康益处是菌株依赖性的，对一种益生菌株所证明的功能效应不一定能够延伸至其他菌株(联合国粮农组织和世界卫生组织(FoodandAgricultureOrganizationoftheUnitedNationsandWorldHealthOrganization)(2002).GuidelinesfortheEvaluationofProbioticsinFood.ReportofaJointFAO/WHOWorkingGrouponDraftingGuidelinesfortheEvaluationofProbioticsinFood.London/Ontario(食品中益生菌的评价原则。关于起草食品中益生菌的评价原则的FAO/WHO联合工作组。伦敦/安大略)：FAO/WHO和RijkersGT，BengmarkS，EnckP，等(2010)Guidanceforsubstantiatingtheevidenceforbeneficialeffectsofprobiotics：currentstatusandrecommendationsforfutureresearch(用于证明益生菌的有益作用的证据的指导原则：现状和未来研究的建议)JNutr140，671S-676S)。由于关于动物双歧杆菌乳亚种和副干酪乳杆菌副干酪亚种(干酪乳杆菌)的免疫调节作用的人类数据非常稀少，认为在使用流感疫苗接种激发的对照的、足够统计学效力的实验中进一步研究这两种益生菌株的作用是很重要的，因为仍然需要进一步开发更有效的用于引起有效免疫应答的技术。
发明内容
本发明人已经显示将干酪乳杆菌431或BB-12与流感疫苗联合施用产生比仅用疫苗所见的更强的免疫应答。因此本发明涉及用于通过共同施用益生菌诸如干酪乳杆菌431或BB-12与流感疫苗来加强疫苗的效率的方法。本发明还涉及用于这种治疗中的组合物。
附图说明
图1研究组在基线和第42天时的疫苗特异性血浆IgG。
图2研究组在基线和第42天时的疫苗特异性血浆IgG1。
图3研究组在基线和第42天时的疫苗特异性血浆IgG3。
图4研究组在基线和第42天时的疫苗特异性唾液IgG。
图5研究组在基线和第42天时的疫苗特异性唾液IgA。
图6研究组在基线和第42天时的疫苗特异性唾液IgM。
具体实施方式为了检验益生菌对免疫应答的作用，为了下列的原因本研究利用了流感疫苗模型：
●对病原体的天然暴露是高度不可控的和不可预测的，并且通过使用疫苗模型，以对死亡的或减毒的微生物(疫苗)的可控暴露来替代天然暴露。疫苗引发体内免疫应答，免疫应答指示免疫系统引起针对病原体的抗原特异性应答的能力(Albers等，2005)。对疫苗接种的应答是广泛使用的免疫功能的标志物，其提供关于营养素对保护性体内免疫应答性的作用的高质量信息(Albers等，2005)。疫苗模型是经过充分研究的模型，并且因此结果易于与来自先前研究的结果相比较。流感疫苗年年都被使用，并且因此是简单易得的模型。该模型可以在大量的人群中使用，使得其易于招募到足够数目的研究参与者。
本发明人已经研究了副干酪乳杆菌副干酪亚种或动物双歧杆菌乳亚种是否也具有对适应性免疫的作用，适应性免疫不像先天免疫，导致针对指定病原体的特异性免疫应答。
为此目的，本研究被设计为研究副干酪乳杆菌副干酪亚种(干酪乳杆菌以前保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，保藏号ATCC55544)和动物双歧杆菌乳亚种(以前保藏在德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)，保藏号DSM15954)在流感疫苗接种模型中的免疫调节特性。这些菌株均可从Chr.HansenA/S，Horsholm，丹麦商购得到。本研究的目的是确定摄入含有干酪乳杆菌的乳制饮料或补充含有的胶囊分别与安慰剂饮料或安慰剂胶囊相比，对针对疫苗的特异性免疫应答和全身免疫应答的作用。
本文的结果显示摄入含有副干酪乳杆菌副干酪亚种，干酪乳杆菌的迷你饮料或补充含有益生菌株动物双歧杆菌乳亚种，的胶囊导致增强的对流感疫苗的体内免疫应答。在此研究中证明的引起和加强多种补充的效应器机制被认为与针对经粘膜传播的病原体，诸如流感病毒的最佳保护作用相关。因此，由于与相应的安慰剂组相比，在干酪乳杆菌和产品组中流感特异性抗体和总抗体增加，这些结果暗示益生菌对粘膜和全身免疫性的有益作用。
术语“免疫加强”意指包括其中与相应的安慰剂治疗组相比，在治疗组中疫苗特异性抗体诸如IgG、IgG1和IgG3的浓度显著增加的情况。这种免疫加强在预防或治疗例如由透粘膜病毒引起的疾病，例如流感、普通感冒等中可能是有效的。
涉及的病原体特别是细菌或病毒；在后者中，将提到，例如，鼻病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和粘病毒(正粘病毒诸如流感病毒(A、B或C型流感)，或副粘病毒)。
在实施本发明的背景下，菌株副干酪乳杆菌副干酪亚种(干酪乳杆菌ATCC55544)和动物双歧杆菌乳亚种(DSM15954)可以单独使用，或与其他种的其他乳酸菌联合使用。有利地，其可以与酸奶发酵物，即保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)联合使用。
菌株可以以全细菌(可以是活的或死的)的形式使用，并且也可以以细菌溶解产物的形式，或以细菌组分的形式使用。
优选地，在根据本发明的用途的背景下制备的组合物含有至少105，优选至少106，通常1x108-1.5x109个细胞/ml。
当所述菌株与酸奶发酵物联合使用时，所述组合物也有利地包含至少107，优选2x108-1x109，嗜热链球菌细胞/ml，和至少5x105，且优选4x106-2x107个保加利亚乳杆菌/ml。
最特别地适合用于本发明中的菌株是副干酪乳杆菌副干酪亚种(干酪乳杆菌ATCC55544)和动物双歧杆菌乳亚种(DSM15954)菌株。这些菌株是益生菌株。
根据本发明制备的组合物可以以食品或食品增补剂的形式施用。它们可以，例如，是乳制品，并且特别地是包含至少所述菌株的发酵乳制品，任选地包含与其他乳杆菌，例如，酸奶发酵物组合的发酵乳制品。
根据本发明制备的组合物可以在预防和治疗传染原，且特别地病毒原的病理学状况，且特别地流感，的背景下使用。优选地，为了获得最佳效应，它们将以对应于吸收至少107，优选至少108，通常109-1012个干酪乳杆菌或细胞的量施用至少1周，和有利地施用至少10天。
益生菌细胞的施用可以与疫苗同时进行，但优选在施用疫苗前施用益生菌细胞，诸如在疫苗接种前至少1周、2周或3周。益生菌优选地定期施用，诸如一天一次或一天两次。益生菌也可以在疫苗接种后施用，诸如疫苗接种后1周、2周、3周或4周的时期期间。在优选的实施方案中，益生菌的施用在疫苗接种前2周进行并且持续至疫苗接种后4周为止。
本发明因此提供了一种治疗方案，其中益生细菌诸如上面提到的菌株与疫苗以如上所述的剂量和时间表联合施用。
本发明因此提供了用作免疫加强组合物的保藏号为ATCC55544或DSM15954的益生细菌菌株，其中所述组合物在疫苗接种前1天-20天之间，或在疫苗接种前约10天施用。
在一个实施方案中，本发明提供了用作免疫加强组合物的保藏号为ATCC55544或DSM15954的益生细菌菌株，其中所述组合物在6周期间施用。
在进一步的实施方案中，本发明提供了根据权利要求1或2使用的保藏号为ATCC55544或DSM15954的益生细菌菌株，其中所述组合物是乳制饮料或胶囊。
将借助于下面的进一步描述更清楚地理解本发明，下面的进一步描述是指说明干酪乳杆菌或双歧杆菌菌株的用于增强对微生物抗原的特异性应答的特性的非限制性实例。
实施例
实施例1
总体研究设计和计划-描述
这是一个随机化、双盲的、安慰剂作对照的平行组研究，其在疫苗接种模型中评价了两种益生菌株对免疫性的作用。该研究包括至少2周持续时间的筛选阶段，6周持续时间的补充阶段(期间进行疫苗接种(补充2周后))，和10周持续时间的随访期(期间不补充益生菌)。在马上进行补充前(第0天)和补充6周后(第42天)收集用于分析功效参数的血液和唾液样品。在补充阶段期间一直收集关于上呼吸道感染/症状(URTI)和流感样病(ILI)的症状的信息，并且在10周随访后再次收集。
用于此研究的条件如下：
受试者的安排
总共221名受试者入选参与研究，并且随机化至4个治疗组之一。56名受试者被分派至安慰剂饮料组，59名分派至干酪乳杆菌饮料组，52名分派至安慰剂胶囊组和54名分派至胶囊组。总计，10名受试者在研究期间退出，这10名中其中仅1名受试者接受了流感疫苗。
四种治疗方式是含有益生菌株副干酪乳杆菌副干酪亚种，干酪乳杆菌(干酪乳杆菌)的饮料或安慰剂饮料，含有益生菌株动物双歧杆菌乳亚种，的胶囊或安慰剂胶囊。安慰剂产品类似于活性产品，然而，不含活性成分，并且受试者、研究人员和员工不知道受试者摄入哪种产品，仅知道其是饮料或胶囊。
1.1.1筛选(第-14-0天)
在筛选时，对每个可能受试者给予研究目的以及治疗和评价细节的完备解释。通过收集人口统计学信息，包括饮食习惯和健康史来评价受试者参与研究的资格。
另外，指示受试者从筛选访问至研究结束他们不允许摄入哪个发酵产品。
可以通过电话进行筛选。如果在临床中心处筛选受试者并且发现合格，则在同一天进行V2程序。
1.1.2随机化访问(访问2，第0天，基线)
在V2，受试者签署知情同意文件。另外，进行下列的程序和评价：
●资格审核(纳入/剔除标准)
●医学史
●提供空腹血液样品用于分析免疫学标志物
●提供唾液样品用于分析免疫球蛋白
●包括身高和体重、生命体征(心率、血压、体温和呼吸频率)和感染状态的临床检查
●记录伴随用药
●入选受试者的随机化
●分配补充期所需要的所有胶囊或因为有效期而分批分配的部分饮料
●关于在研究期间不允许受试者摄入哪些发酵产品的指示
给受试者提供日记本以收集下列信息：
●按已确定的感冒和流感样症状列表每周记录一次发生率、持续时间和严重性
●基于症状日记每4周一次记录流感样病(ILI)的症状
●记录整个研究期间的不良作用(AE)
●记录整个研究期间研究的产品的遗漏剂量
在第0天受试者开始摄入研究的产品。
1.1.3疫苗接种访问(访问3，第14天)
在V3，对受试者肌内注射对2008/2009流行病(NovartisVaccinesandDiagnostics，Siena，Italy)中涉及的病毒特异的流感疫苗。另外，进行感染状态的临床检查，并且评价AE。受试者继续摄入研究的产品持续下一个4周。
1.1.4评价访问(访问4，第42天)
在V4，进行下列的程序：
●提供空腹血液样品用于分析免疫学标志物
●提供唾液样品用于分析免疫球蛋白
●包括身高和体重、生命体征(心率、血压、体温和呼吸频率)和感染状态的临床检查
●AE评价
●记录伴随用药
1.1.5随访访问(访问5，第112天)
在V5，进行下列的程序：
●包括身高和体重、生命体征(心率、血压、体温和呼吸频率)和感染状态的临床检查
●不良反应评价
●记录伴随用药
在研究方案中，此最后一次访问包括检查感染状态并收集关于上呼吸道感染/症状(URTI)和流感样病(ILI)的症状的信息。然而，由于在2009年8月进行访问并且发现这些症状的机会很小，因此决定通过电话进行最后一次访问，并且询问受试者关于流感症状、AE和伴随用药的使用的情况。
实施例2
给予的干预
给两组提供安慰剂或研究的饮料(参见表1)。饮料递送约57kcal/100ml。在研究期间以5个不同的批次制备饮料，并且从Chr.Hansen送至研究场所。由于饮料的保质期有限(从生产日起4周)，饮料以较小的批次分批分配给受试者。在访问2，在研究期间受试者接收部分瓶子并且返回至研究场所两次以接收新批次的饮料。
每个饮料上的标签包含下列信息：‘含有益生菌或不含益生菌的IMPRESS-酸化乳’，‘仅用于临床用途’，受试者编号，‘要摇动并且与午餐一起食用’，‘含110mL’，有效期，储存条件，发起人名称，试验代码，和研究人员姓名。
表1对用于IMPRESS-研究的饮料的描述
其他两组提供安慰剂胶囊或含有的胶囊以口服施用(参见表2)。
每个铝管上的标签含有下列信息：‘含有益生菌或不含益生菌的IMPRESS-胶囊’，‘仅用于临床用途’，受试者编号，‘随午餐一起每天服用1个胶囊’，‘含30个胶囊’，有效期(从生产日起24个月)，储存条件，‘避免儿童接触’，发起人名称，试验编号，和研究人员姓名。
表2对用于IMPRESS-研究的胶囊的描述
由Sacco医院的研究人员指导受试者在午餐时间一天饮用一个饮料或一天服用一个胶囊持续6周(42天)。对瓶子和含有胶囊的铝管进行编码以保持盲态。顺应性基于受试者在日记中对遗漏剂量的记录。
在研究中使用的流感疫苗为用于2008/2009季的来自NovartisVaccinesandDiagnostics，西耶那，意大利的疫苗，有效期至2009年6月10日。存在于该疫苗中的菌株为：
A/Brisbane/59/2007(H1N1)-样菌株(A/Brisbane/59/2007，IVR-148)，A/Brisbane/10/2007/(H3N2)-样菌株(A/Uruguay/716/2007，NYMCX-175C)和B/Florida/4/2006-样菌株(B/Florida/4/2006)。该疫苗在医院药房中在4℃保存。在访问3，所有受试者接受0.5mL疫苗接种的肌内注射。
将受试者分派至各治疗组的方法
使用SAS计算机程序来生成由年龄和性别分层的置换区组随机化分派，区组大小为6。年龄分层为20-39岁和40-60岁。由Sprim的统计学团队将随机化列表提供给发起人以依照独特研究ID系统标记胶囊产品。由不知情的研究协调员依照随机化列表在分配前标记饮料。
对于每名受试者的随机化编号的分派基于每个年龄-性别层内按时间前后顺序排列的受试者的递增次序。
对所有产品均设盲。
研究中剂量的选择
选择最小1x109CFU/天或干酪乳杆菌的剂量，因为这是调节免疫系统通常所需的日剂量(Minelli和Benini2008)。
用于每名受试者的剂量的选择和时间安排
由研究人员指导受试者在午餐时间饮用饮料或服用胶囊。对于摄入的指导也书写在研究产品的包装上。选择在午餐时间摄入产品是因为，在意大利，在午餐时间摄入乳制品比在早餐时摄入更常见。
设盲法
分别在安慰剂和益生菌饮料以及在安慰剂和益生菌胶囊之间，外观、形状、气味和味道是不能区分的。受试者、支持人员和研究者对专用产品(活性物质vs.安慰剂)的身份不知情。研究场所药房收到一组包含每个随机化编号的产品身份的密封信封，其在紧急情况下可以揭盲。在研究期间不进行编码揭盲。
功效变量
功效测量评价和流程图
研究措施和程序的时间表的概况在表3中提供。
表3IMPRESS-研究的研究时间表
1用于分析总IgG、IgA、IgM、IgG1和IgG3；疫苗特异性IgG、IgG1和IgG3；IL-2、INF-γ和IL-10；NK活性、CD4+T细胞、吞噬作用；破伤风特异性IgG
2用于分析总的和疫苗特异性唾液IgA、IgG和IgM
3在V2和V4，临床检查包括身高和体重、生命体征(心率、血压、体温和呼吸频率)和感染状态；在V3，检查仅用于感染状态
主要功效变量
抗原特异性免疫应答
疫苗特异性IgG、IgG1和IgG3的血浆水平
疫苗特异性唾液IgG、IgA和IgM的水平
次要变量
适应性免疫系统的应答
总IgG、IgA、IgM、IgG1和IgG3的血浆水平
总唾液IgG、IgA和IgM的水平
细胞因子IFN-γ、I1-2和I1-10的血浆浓度
先天免疫系统的应答
NK细胞活性
CD4阳性T淋巴细胞
吞噬作用和吞噬细胞杀伤
对上呼吸道感染/症状和流感样病的作用
向受试者提供纸日记本用于补充和随访期，在此期间受试者通过每周完成症状日记(McDowell2006)评价URTI的症状和每4周基于症状日记完成ILI评价。日记以当地语言提供。
感染状态
通过在访问1至4时的临床检查评价感染状态。通过评估发热、流感样症状(咽喉感染和全身不适和/或身体疼痛)的存在，在临床上确定感染(是/否)率。使用的对感染状态的评价由列举如下的7种症状的世界卫生组织(WHO)标准发展而来。
感染的长度通过天数来记录。感染定义为影响鼻子、咽喉和支气管约7天的病毒感染并且通过下列表征：
●开始发高烧(是/否)
●肌肉疼痛(是/否)
●剧烈头痛(是/否)
●严重不适(是/否)
●非排痰性咳嗽(是/否)
●咽喉痛(是/否)
●鼻炎(是/否)
对于持续超过7天的症状，如果有的话，记录特殊的症状和施用的治疗的类型。
对于上面列举的事件的每个“是”反应，记录下面的细节：
●诊断日期
●症状发作的日期
●症状停止的日期
●服用的药物
●开出的药物适用于哪种症状
生物样品的处理和实验室分析程序
对于每个研究目的和采用的实验室方法测量的参数的概述在下表4中提供。
表4对于IMPRESS研究的功效和安全性变量的实验室分析
实施例3
生物样品的处理
采血
在访问2和4时由研究团队成员通过在肘前静脉中的静脉穿刺将空腹血液样品收集在3个含有EDTA的真空采血管(vacutainertube)(7mL)(BectonDickinson&Co.，Rutherford，NJ)中。血液样品在离心前在环境温度下保持至多2小时。
血浆采集
通过将未凝固的全血(EDTA)在1400rpm和20℃离心10min获得血浆样品。离心后，将2mL血浆转移至2个冻存管/受试者中并且立即在-80℃冷冻直至进行分析。
外周血单核细胞(PBMC)分离
在采集血浆后，从淋巴细胞分离培养基(OrganonTeknicaCorp.，Durham，NC)上的血块黄层分离PBMC，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(OrganonTeknica)中洗涤两次，并在1900rpm离心10分钟。在冰上操作，将1mL冷冻液(补充85％FBS的RPMI+15％DMSO)加入至PBMC片状沉淀物，并将细胞重悬。最后，将细胞悬液转移至2mL冻存瓶中，并以10-15x106活PBMC/瓶的量在-80℃冷冻直至使用(通过台盼蓝拒染测定)。
唾液采样
在访问2和4时依照吐痰法采集唾液。受试者处于直立位，并且被告知将积聚在口底中的唾液吐到无菌测试管中。受试者每60秒吐出唾液，持续5分钟，并将包含唾液的试管立即在-80℃冷冻直至进行分析。在过夜禁食后采集唾液样品。
实施例4
实验室分析方法
使用市售试剂盒并且依照下面的简短描述对所有实验室样品一式两份地进行分析。
血浆中的疫苗特异性抗体
使用ELISA技术依照制造商(IBL-America，Inc.，MN，USA)随A型流感IgGELISA试剂盒提供的说明书分析血浆中的疫苗特异性IgG。这些测定提供的微量滴定板已经预先包被有A型流感抗原，并且通过对人IgG特异的二级酶联抗体检测样品中的IgG抗体和固定化抗原之间的结合。添加底物(四甲基联苯胺，TMB)诱发蓝色的显色。在底物反应后，添加终止溶液，其将颜色转变成黄色，并且在60分钟内用分光光度计在450nm测量光密度(OD)。显色的颜色强度与样品中IgG特异性抗体的量成正比。通过使用标准曲线确定样品中的IgG的量。在此测定中A型流感IgG的检出限为1.09U/mL。
使用ELISA技术依照制造商(IBL-America，Inc.，MN，USA)随上述A型流感IgGELISA试剂盒提供的说明书分析血浆中的疫苗特异性IgG1和IgG3，并且采用下列的改良：通过稀释度为1∶2000的对人IgG1或IgG3特异的二级辣根过氧化物(HRP)缀合抗体(AlphaDiagnosticIntl.Inc.，Texas，USA)检测与固定化抗原结合的样品中的特异性抗体。在底物反应后，添加终止溶液，并且在60分钟内用分光光度计在450nm测量OD。显色的颜色强度与检测到的IgG特异性抗体的量成正比。使用标准曲线直接确定样品中的IgG1或IgG3的量。在此测定中A型流感IgG的检出限为1.09U/mL。
唾液中的疫苗特异性抗体
使用ELISA技术依照制造商(IBL-America，Inc.，MN，USA)随A型流感IgG/IgA/IgMELISA试剂盒提供的说明书分析唾液中的疫苗特异性抗体IgG、IgA和IgM。这些测定提供的微量滴定板已经预先包被有A型流感抗原。通过对人IgG、IgA或IgM特异的二级酶联抗体检测与固定化抗原结合的样品中的特异性抗体。在底物反应后，通过吸取终止溶液在60分钟内用分光光度计在450nm测量OD。显色的颜色强度与检测到的IgG、IgA或IgM-特异性抗体的量成正比。使用标准曲线直接确定每个样品中的特异性抗体的量。在这些测定中A型流感IgG、IgA或IgM的检出限为分别为1.09U/mL、1.29U/mL和1.17U/mL。
血浆中的破伤风特异性IgG
使用ELISA技术依照制造商(武汉生物制品研究所，武汉，中国)随破伤风抗体Elisa试剂盒提供的说明书分析血浆中的破伤风特异性抗体。在此试剂盒中提供的微量滴定板已经预先包被有对破伤风特异性IgG特异的抗体。然后向适宜的微量滴定板孔中添加标准品或样品。对破伤风特异性IgG特异的生物素缀合的多克隆抗体制剂和与HRP缀合的抗生物素蛋白也添加至每个微量滴定板孔中并孵育。然后向每孔添加TMB底物溶液，并且含有破伤风特异性IgG、生物素缀合抗体和酶联抗生物素蛋白的孔显示颜色变化。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度计在450nm的波长测量颜色变化。通过将样品的OD与标准曲线比较来确定样品中破伤风特异性IgG的浓度。在此测定中破伤风特异性IgG的检测范围为0.1-40IU/L，且检测低限为0.1IU/L。
血浆中的总抗体
使用ELISA技术依照制造商(GroundworkBiotechnologyDiagnosticate，SanDiego，USA)随人免疫球蛋白ELISA试剂盒提供的说明书分析血浆IgA、IgG、IgM、IgG1和IgG3的总浓度。对于使用ELISA法的这些抗体，终止溶液将颜色从蓝色改变为黄色，并且使用分光光度计在450nm测量颜色的强度。为了测量样品中抗体的浓度，每个ELISA试剂盒包括一组校准标准品。在与样品同时一式两份地测定校准标准品，并且得到相对于抗体浓度的OD标准曲线。然后通过将样品的OD与标准曲线比较来确定样品中抗体的浓度。对于IgG1和IgG3的检出限为0.01mg/mL。IgG、IgA和IgM测定的灵敏度分别为1.0mg/mL、0.01mg/mL和0.1mg/mL。
唾液中的总抗体
使用ELISA技术并且依照制造商(USCNLIFETM武汉，中国)随人分泌性免疫球蛋白A，SIgAELISA试剂盒提供的说明书分析唾液SIgA的总浓度。在此试剂盒中提供的微量滴定板已经预先包被有对SIgA特异的抗体。然后向适宜的微量滴定板孔中添加标准品或样品。对SIgA特异的生物素缀合的多克隆抗体制剂和与HRP缀合的抗生物素蛋白也添加至每个微量滴定板孔中并孵育。然后向每孔添加TMB底物溶液，并且含有SIgA、生物素缀合抗体和酶联抗生物素蛋白的孔显示颜色变化。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并通过分光光度计在450nm的波长测量颜色变化。通过将样品的OD与标准曲线比较来确定样品中SIgA的浓度。在此测定中SIgA的检出限一般为3.9ng/mL，并且检测低限定义为可与0区分的最低蛋白浓度。
使用ELISA技术依照制造商(ZeptoMetrixCorporation，NY，USA)随定量人IgGELISA/定量人IgMELISA试剂盒提供的说明书分析唾液IgG或IgM的总浓度。调整样品的浓度以获得最适检测浓度。在这些测定中提供的微量滴定板已经预先包被有对人IgG或IgM特异的多克隆抗体。将标准品或样品一式两份地添加至适宜的微量滴定板孔并孵育。吸取与HRP缀合的检测剂抗体至每个标准品和样品孔中。孵育后，向每孔添加TMB底物溶液，并且含有人IgG或IgM的孔中显示蓝色。通过添加硫酸溶液终止酶-底物反应，并且发生从蓝色至黄色的颜色变化。通过分光光度计在450nm的波长测量颜色变化。通过将样品的OD与标准曲线比较来确定样品中IgG或IgM的浓度。在这些测定中IgG和IgM的检出限一般为3.9ng/mL，并且检测低限定义为可与0区分的最低蛋白浓度。
血浆中的Il-2，INF-γ和IL-10
使用ELISA技术依照制造商(R&DSystems，Inc.，MN，USA)随人IL-2/INF-γ/IL-10免疫测定试剂盒提供的说明书分析细胞因子的血浆浓度。在这些测定提供的微量滴定板已经预先包被有对IL-2、IFN-γ或IL-10特异的单克隆抗体。一式两份吸取标准品和样品至孔中，并且存在的细胞因子被固定化抗体结合。洗掉任何未结合物质后，将对IL-2、IFN-γ或IL-10特异的酶联多克隆抗体加入至孔中。洗涤去除任何未结合的抗体-酶试剂后，将底物溶液加入至孔中，并且与初始步骤中结合的细胞因子的量成比例地显色。停止显色，并且通过分光光度计在450nm的波长测量颜色的强度。通过将样品的OD与标准曲线比较来确定样品中细胞因子的浓度。在这些测定中IL-2、IFN-γ或IL-10的检出限一般分别小于7.0、8.0和3.9pg/mL。
吞噬作用和吞噬细胞杀伤
根据以前由Saresella及同事(1997)描述的方法确定吞噬作用和杀伤。全血白细胞(CD13+细胞)与经调理的异硫氰酸荧光素-标记的(FITC-标记)白色念珠菌芽生孢子孵育用于吞噬作用和杀伤测定。仅活的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子用作对照。
通过对吞噬细胞(CD13+细胞)设门(gating)和计算吞噬细胞相关的绿色荧光细胞的百分比来确定吞噬作用和杀伤。此程序基于下列的观察：FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子在用溴化乙锭(EtBr)染色后丧失其绿色荧光且获得红色荧光。因此，内化的白色念珠菌芽生孢子仍然是绿色的，而贴壁的和未被吞噬的芽生孢子染成红色。吞噬和杀死的PMN的百分比与绿色的-和双重标记的-绿色和红色的数目相等。
使用装配有在488nm下工作的风冷的15mW氩离子激光的CoulterEPICSXL流式细胞仪进行吞噬作用和杀伤的细胞计数分析。基于约10,000次事件的登记采集多参数数据并且使用CoulterSystemII软件分析。借助于525nm带通滤波器测量来自FITC的绿色荧光，而通过620nm带通滤波器测量来自EtBr的红色荧光。
鉴定四个不同的组：吞噬细胞与贴壁的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子(％贴壁率)，吞噬细胞与摄入的和贴壁的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子(％贴壁和摄入率)，吞噬细胞与仅摄入的FITC-标记的白色念珠菌芽生孢子(％摄入率)，和无相互作用的吞噬细胞(％无相互作用)。
自然杀伤细胞活性
通过用50mL预温(37℃)的完全培养基填充50mL测试试管开始自然杀伤(NK)细胞评估。通过在37℃水浴中快速搅动来快速复温解冻一小瓶K562靶细胞。当冰熔化时，从水浴移除小瓶，将细胞悬液转移至含有温完全培养基的试管中并轻轻混合。细胞悬液在室温下在1500rpm离心5min。弃去上清液，并将细胞沉淀物重悬于1mL完全培养基中。通过台盼蓝拒染实验确定细胞数目，并且将细胞浓度在完全培养基中调整至1x105/mL。如靶细胞一样复温解冻和制备效应器细胞。通过台盼蓝拒染实验确定细胞数目，并且将细胞浓度在完全培养基中调整至1x105/mL。对于“高对照”样品，将30μlIL-2(200U/mL)加入至效应器细胞悬液中。将效应器细胞与K562靶细胞以25∶1E∶T的比率以200μl的最终体积混合。使用单独的靶细胞作为对照。将所有试管涡旋并在1500rpm离心3min。然后在湿化CO2孵箱中将试管孵育120min。每个试管加入50μlDNA染色溶液，涡旋并在冰上孵育5min。最后，加入250μlPBS，并通过流式细胞仪分析样品。NK细胞活性计算为以25∶1的E∶T比率杀死的％靶细胞。
CD4阳性T淋巴细胞
采用流式细胞检测技术使用与人CD4(由大多数胸腺细胞，成熟T辅助细胞的亚群，和单核细胞(以低水平)表达的59kDa细胞表面受体)反应的单克隆抗体(藻红蛋白抗人CD4；eBioscienceTM，SanDiego，USA)分析CD4+T细胞。此抗体被预滴定且通过正常人PBMC的流式细胞检测分析进行测试。其以100μl的总染色体积以5μl(0.125μg)/百万个细胞使用。
实施例5
使用SAS包9.2版(SASInstituteInc.，Cary，NC，USA)进行统计学分析。
多重比较(MC)
为多重性的缘故通过Holm-Bonferroni法(Holm1979)调整主要功效变量。仅相关的配对进行统计学比较：干酪乳杆菌次料与安慰剂饮料比较，胶囊与安慰剂胶囊比较，使得每个参数有两个比较。有6个主要功效终点(血浆中的特异性IgG、IgG1和IgG3以及唾液中的特异性IgA、IgG和IgM)，和比较数加起来达到12个用于主要功效评价。
在Holm-Bonferroni法中，首先在不调整的条件下进行所有12种比较，并且将p-值从最小至最大进行排序。最小的p-值与经调整的显著性水平比较，经调整的显著性水平等于αadj＝5％/12(α/比较数目)＝0.004。如果最小的p-值大于αadj，则得出结论，所有比较是不显著的。如果最小的p-值小于αadj，则相应比较的结论是在5％的水平上是统计学显著的。在下一步骤，使用如上所述的相同方法将第二小的p-值与αadj＝5％/11比较。继续此过程直至发现大于αadj的p-值，并且剩余的比较被认为是不显著的。
对于次要目的终点的统计学分析不对多重检验进行调整。
功效分析
主要目的的分析
统计学分析的主要功效变量是从基线的变化，即，第42天和第0天评估之间的差异。使用单变量方差分析来鉴定研究效应。
在基线内，第42天内和对于平均倍数增加(MFI)还进行组间的统计学分析。MFI定义为(第42天-第0天)/第0天。
另外，从基线至第42天至少2倍的特异性抗体增加被认为是实质性的，并且定义为差值(第42天-第0天)≥2x第0天(Stephanova等2002，Kurstak1985)，并且计算疫苗特异性抗体实质性增加的每组中受试者的数目。
仅相同产品内的各组进行比较，即，干酪乳杆菌饮料vs.安慰剂饮料，以及胶囊vs.安慰剂胶囊。
所有ANOVA模型包含治疗、性别、年龄和基线的项目，例外是对于基线内的分析，其中模型包含治疗、性别和年龄的项目。由于BMI在组间具有显著性差异，因此使用BMI作为ANOVA模型中的附加协变量进行事后分析。
计算几何平均数评价并且描述性地报告。通过取对数值的算术平均数的逆对数来计算几何平均数。
次要目的的分析
这些分析遵循与对主要目的所概述的相同方法学策略。
数据和描述统计学的概述
使用均数、标准差(SD)、中位数、95％置信区间(CI)、5％和95％-分位数以及最小值和最大值总结治疗组的连续变量如人口统计学和基线变量以及免疫球蛋白值。对于按类别的变量如性别和其抗体值达到实质性增加的受试者的比例依赖于每个治疗组内的计数和频次。
分布假设验征
对于连续结果量度，焦点集中于确定数据的正态性(高斯分布)。这使用Wilk和Shapiro(1965)技术以及QQ图来评估。
对于一些参数，不遵守正态分布假设。在这些情况下，也进行非参数法，即，Mann-Whitney检验作为替代分析。这些替代分析的所有结果与来自参数分析的结果一致。
随机化方案的验证
这些分析的目标是为了确定就“已知的”预测协变量如年龄、性别和基线免疫球蛋白值而言在研究组间是否存在显著性差异(不平衡)。这些分析依赖于ANOVA或非参数检验以评价相关组(即，干酪乳杆菌饮料vs.安慰剂饮料和胶囊vs.安慰剂胶囊)内的平均值的相等性。
分析的数据组
总体来说，211名受试者的数据包含在ITT分析组内，并且196名受试者的数据包含在PP分析组内。
在此仅报告来自ITT分析的结果。
人口统计学和其他基线特征
在表中，显示了ITT分析组中受试者的人口统计学和基线特征。总平均(SD)年龄为33.2岁(13.1岁)，且范围为从19至60岁。总体来说，女性多于男性：118名(55.9％)女性，和93名(44.1％)男性。
表5IMPRESS-研究(ITT分析组)的受试者的人口统计学和基线特征
*p＜0.05与安慰剂饮料组相比较的差异，采用Kruskal-Wallis检验分析
功效结果
主要目的
血浆中的疫苗特异性IgG、IgG1和IgG3
在对从基线的变化的主要分析中证明对于所有三种参数在益生菌和安慰剂组之间均存在显著性差异。当比较第42天和基线之间的差异时，组中的疫苗特异性抗体值与安慰剂组相比，从基线至第42天显著增加更多(对于所有参数p＜0.001)。同样，干酪乳杆菌组中的特异性抗体值与相应的安慰剂组相比增加显著更多(对于IgG，p＝0.010，且对于IgG1和IgG3，p＜0.001)。
另外的分析显示疫苗特异性IgG、IgG1和IgG3的基线值在所有研究组之间时相似的。第42天值的横截面分析显示对于组相比于安慰剂组和干酪乳杆菌组相比于安慰剂组所有参数均具有显著较高的值(对于所有三个参数，p＜0.001)(图1、图2和图3)。
流感疫苗-特异性IgG、IgG1和IgG3的值也评价平均倍数增加(MFI)。对于组相比于安慰剂组的IgG观察到MFI的显著组间差异(p＝0.016)，对于组相比于安慰剂组以及干酪乳杆菌组相比于安慰剂组的IgG1和IgG3的显著组间差异(对于所有，p＜0.001)(表6)。
表6研究组的流感疫苗-特异性血浆IgG、IgG1和IgG3的平均倍数增加
*：对于采用ANOVA分析的MFI组间差异，使用性别、年龄和基线作为协变量来源：附录16.1.9表3.1，3.2，3.3，8.1，8.2和8.3
疫苗特异性IgG、IgG1和IgG3的至少2倍的平均倍数增加被定义为实质性增加，并且对每组计算达到实质性增加的受试者的比例。与相关的安慰剂组相比，在每个益生菌组中具有特异性抗体值实质性增加的受试者的数目均相当大(表7)。
表7研究组的具有IgG、IgG1和IgG3值实质性增加的受试者的数目
唾液中的疫苗特异性IgG、IgA和IgM
对于疫苗特异性唾液IgG、IgA或IgM，对从基线的变化的组间差异的主要分析显示无显著性差异。然而，对于IgA，在胶囊组和相应的安慰剂组之间显示有趋于显著性差异的趋势(经调整的p＝0.084)。
IgG和IgA的基线值在组间是相似的，而与安慰剂组相比，在基线处在组中IgM值稍高(p＝0.007)(图4、图5和图6)。
第42天值的横截面分析显示与安慰剂组相比，在组中IgA值较高(p＝0.014)且与安慰剂组相比，在干酪乳杆菌组中IgA值较高(p＝0.047)(图4、图5和图6)。同样，平均倍数增加的分析表明与相关的安慰剂组相比，在每个益生菌组中疫苗特异性IgA的MFI均较高(表8)。
在第42天时和在MFI方面组间均未观察到IgM或IgG的显著性差异(图4和图6)。
表8研究组的流感疫苗-特异性唾液IgA、IgG和IgM的平均倍数增加
*：对于采用ANOVA分析的MFI组间差异，使用性别、年龄和基线作为协变量

Claims (13)

1.保藏号为DSM15954的益生细菌菌株动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalisssp.lactis)在用于制备与流感疫苗联合的用于增加疫苗特异的IgG的免疫加强组合物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物在疫苗接种前至少2周施用。
3.根据权利要求1的用途，其中疫苗特异性的IgG1增加。
4.根据权利要求1的用途，其中疫苗特异性的IgG3增加。
5.根据权利要求1的用途，其中流感疫苗中的病毒是正粘病毒。
6.根据权利要求5的用途，其中所述正粘病毒为A型流感病毒。
7.根据权利要求5的用途，其中所述正粘病毒为B型流感病毒。
8.根据权利要求5的用途，其中所述正粘病毒为C型流感病毒。
9.根据权利要求1所述的用途，其中所述益生细菌菌株与其他种的其他乳酸菌联合使用。
10.根据权利要求9所述的用途，其中所述益生细菌菌株与酸奶发酵物联合使用。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述酸奶发酵物是保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)或嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)。
12.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物在6周期间施用。
13.根据权利要求1所述的用途，其中所述组合物是乳制饮料或胶囊。
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