NO332369B1 - Anvendelse av Lactobacillus casei stammen CNCM I-1518 for fremstilling av et preparat for a forsterke en spesifikk systemisk immunrespons mot et influensa-virus. - Google Patents

Abstract

Det beskrives anvendelse dcv Lactobacillus casei i et preparat for oral administrasjon for å forsterke en immunitet spesifikk for patogene mikroorganismer. Nevnte preparat kan spesielt være mat eller et mat-tilskudd.

Description

Oppfinnelsen vedrører anvendelse av L. casei stammen CNCM 1-1518 for fremstilling av et preparat for å forsterke en spesifikk systemisk immunrespons mot et influensa-virus.

Melkesyrebakterier (LAB) blir konvensjonelt anvendt for å produsere fermenterte matvarer, spesielt meieriprodukter.

Effektene av melkesyrebakterier på helsen ble innledningsvis antydet ved studiene til Metchnikoff (The prologation of life, 1. utgave New York: GP Putman's Sons, 1908), og har siden vært emne for mange undersøkelser.

Det er nå generelt anerkjent at diverse melkesyrebakerier kan spille en rolle som er nyttig for helsen. Disse bakterier kalles også "probiotika", en betegnelse som antyder levende mikroorganismer som, når de tas inn i tilstrekkelig mengde, utøver en positiv effekt på helsen, ut over de konvensjonelle ernæringsmessige effekter. Probiotiske bakterier er spesielt blitt beskrevet blant arter som tilhører slektene Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus og Lactococcus, som det er vanlig å anvende i meieriindustrien.

Probiotika menes å intervenere spesielt ved nivået for tarmfloraen ved å hindre utvikling av patogene mikroorganismer, og/eller ved å virke mer direkte på immunsystemet. Det er for eksempel observert at inntak av probiotiske bakterier eller fermenterte matvarer, for eksempel yogurt, som omfatter disse bakterier, fører til reduksjon i patogene bakterier; på bakgrunn av immunsystemet er forskjellige effekter rapporter: en aktivering av de celler som er involvert i den spesifikke eller ikke-spesifikke immunrespons, for eksempel lymfocytter og makrofager, en økning i nivået av immunoglobuliner og spesielt av IgA; en økning i nivået av immunsystem-aktiverende cytokiner, etc. (for en oversikt, se for eksempel MEYDANI og HA (Am J Clin Nutr, 71, 861-7217, 2000).

Fremfor alt har de studier som er utført på diverse probiotiske melkesyrebakterier tendens til å konkludere med at noen arter, eller i det minste noen stammer av disse arter, har immunostimulerende egenskaper. På den annen side forblir den eller de mekanismer som underligger disse egenskaper, og komponentene i immunsystemet som potensielt er involvert, usikre. Det synes derfor å være nødvendig å belyse disse aspekter, spesielt i den hensikt å foreslå bedre målrettede anvendelser av de forskjellige arter eller stammer av probiotiske bakterier.

Flere studier utført på mennesker og dyr antyder at bakterier av artene L. casei har en velgjørende effekt på helsen, og spesielt en positiv effekt på immunsystemet.

Det er således blitt vist hos mus at inntak av fermentert melk som inneholder L. case/-stammen DN-114 001, øker resistens mot infeksjon med Salmonella typhimurium [PAUBERT-BRAQUET et al., Int J Immunother, 4:153,

(1995)]; aktivering av makrofager og en økning i sirkulerende IgA er samtidig blitt observert.

Stammen DN-114 001 ble deponert 30. desember 1994 hos CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes) [nasjonal samling av mikroorganismekulturer] som drives av Institut pasteur, 25 rue du Docteur Roux i Paris, under betegnelsen 1-1518; denne stamme, og kombinasjonen derav med yogurtfermenter for fremstilling av fermenterte meieriprodukter, er beskrevet i PCT-søknad WO 96/20607 i navnet COMPAGNIE GERVAIS DANONE.

Perdigon et al. (Int. Immunopathol Pharmacol.; 12, 97-102; 1999) har studert i mus effekten av oral administrering av melkesyrebakterier (inkludert Lactobacillus casei) på den mukosale immunresponsen, spesielt på IgA-produserende B celler assosiert med bronkier.

Påtidar et al., (J. Food Sei. Technol.; 34, 181-194; 1997) beskriver metoder for å vurdere de immunostimulerende egenskapene til dietære lactobacilli og beskriver flere eksperimenter som viser at konsumet av lactobacilli fører til immunostimulerende effekter.

Yasui et al. (Antonie Van Leeuwenhoek.; 76, 383-389; 1999) har funnet i mus at oral administrering av Lactobacillus casei stammen Shirota forsterker den cellulære immuniteten og hemmer forekomsten av tumorer og produksjonen av IgE som medierer allergisk reaksjon.

Mihel et al. (Food & Agricultural Immunol.; 2, 205-209) har vist i mus at den intraperitoneale administeringen av levende stammer av L. casei eller L. acidophilus har en beskyttende effekt mot en infeksjon med encephalomyokardititt virus (EMCV).

Pouwels et al. (J. Biotechnol.; 44,183-192; 1996) rapporterer at adjuvantegenskapene til Lactobacillus stammene ble testet med forskjellige antigener i mus: disse adjuvantegenskapene er blitt observert i forsinket type hypersensitivitetsresponsen indusert av trinitrofenylert y-globulin, i en modell av eksperimentell encefalitt indusert av et antigenpeptid, i en a-spesifikk immunrespons mot en atenuert stamme av Chikungunya virus, og i antistoffresponsen mot influensavirus haemagglutinin etter en booster injeksjon med en influensavaksine.

Et studium nylig utført på mennesker, rapporterer også at fortæring av fermentert melk som inneholder L. case/-stammen DN-114 001 induserer en forsterkning av resistens overfor Salmonella typhimurium. Denne effekt tilskrives en virkning på ikke-spesifikk medfødt immunitet [YOON et al., Int J Immunother; 15, 79-89(1999)].

Vi har undersøkt om L. casei også har en virkning på tilegnet immunitet, som, ulik medfødt immunitet, resulterer i en spesifikk immunrespons mot et gitt patogent middel.

For dette formål har vi studert effekten av L. casei, administrert oralt in vivo, på ex wVo-stimulering av T-celleformering i respons til antigener som er representative for diverse typer av vanlige patogene midler: et bakterielt antigen (tetanus); et fungalt antigen (candida) og et viralt antigen (influensa).

Vi har observert, for hvert av de testede antigener, at inntak av L. casei fører til en økning i formeringskapasiteten til T-celler, og spesielt for CD3<+->sub-populasjoner, i respons til aktivering med nevnte antigen. Denne effekt manifesterer seg mer spesielt med hensyn til influensa-antigenet.

En gjenstand for foreliggende oppfinnelse er anvendelse av L. casei stammen CNCM 1-1518 for fremstilling av et preparat som kan administreres oralt for å forsterke i et menneske en spesifikk systemisk immunrespons mot et influensa-virus.

En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er anvendelse som angitt i krav 1, hvor preparatet er i form av en matvare eller et matvaretilskudd.

En ytterligere gjenstand for foreliggende oppfinnelse er anvendelse som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvor preparatet er i form av et fermentert meieriprodukt.

Denne forsterkning av immunresponsen oppstår fra en økning i den formerende kapasitet hos T-cellene som er spesifikke for antigenene for nevnte patogene mikroorganisme.

De angjeldende patogener er virus; det kan nevnes influensavirus (influensa type A, B eller C).

Fortrinnsvis inneholder et preparat fremstilt i forbindelse med anvendelse i henhold til oppfinnelsen, minst 10<5>, fortrinnsvis minst 10<6>, generelt mellom 1x10<8>og 1,5x10<9>, L. caseZ-celler pr. ml. L. casei kan anvendes i kombinasjon med yogurtfermenter og da kan nevnte preparat også omfatte minst 10<7>, fortrinnsvis mellom 2x10<8>og 1x10<9>, S. thermophilus- æWev pr. ml, og minst 5x10<5>, og fortrinnsvis mellom 4x10<6>og 2x10<7>, L. bulgaricus- ceWer pr. ml.

Preparater fremstilt i overensstemmelse med oppfinnelsen kan administreres i form av mat eller mattilskudd. De kan for eksempel være meieriprodukter, spesielt fermenterte meieriprodukter som omfatter minst nevnte L. caseZ-stamme, eventuelt kombinert med andre melkesyrebakterier, for eksempel med yogurtfermenter.

Preparater fremstilt i henhold til oppfinnelsen kan anvendes i forbindelse med å forhindre og behandle patologiske tilstander av infeksiøs opprinnelse, og spesielt av viral opprinnelse, og spesielt av influensa. Fortrinnsvis, i den hensikt å oppnå en optimal effekt, vil de bli administrert i minst én uke, fordelaktig minst 10 dager, i en mengde som tilsvarer absorpsjon av minst 10<7>, fortrinnsvis minst 10<8>, generelt mellom10<9>og 10<12>, L. caseZ-celler.

Oppfinnelsen vil lettere bli forstått ved hjelp av den ytterligere beskrivelse som følger og som illustrerer egenskapene ved en Lactobacillus caseZ-stamme for forsterkning av den spesifikke respons mot mikrobielle antigener.

Eksempel 1: Virkning av Lactobacillus casei på T-celle-formering i respons til antigen stimulering

En dobbeltblindstudie kontra placebo ble utført for å teste effekten av å innta et fermentert meieriprodukt omfattende Lactobacillus caseZ-stammen DN-114 001 (CNCM 1-1518) på T-celleformering i respons til antigenstimulering.

Betingelsene for denne studie er som følger:

Individer

88 friske individer, 18-50 år gamle, ble rekruttert i Department of Infectious Diseases, Washington Hospital Center (Washington DC). Indivier med en historie med hepatitt eller nyreproblemer, med kardiovaskulære dysfunksjoner, med immune eller gastrointestinale sykdommer, med alvorlig astma eller sukker- diabetes, individer som har gjennomgått behandling med antibiotika eller immuno-suppresorer mindre enn 3 måneder før studiens begynnelse, individer med en historie med misbruk eller avhengighet av alkohol, individer med kjent intoleranse eller hypersensitivitet overfor meieriprodukter, individer på lavkaloridiett, individer som er vaksinert mot influensa i den forutgående sesong, og også gravide kvinner eller kvinner som ga bryst, ble utelukket fra studien.

Protokollen og betingelsene for studien ble godkjent av Research Committee of the WHC, og også av Institutuonal Review Board som kontrollerer studier utført på mennesker.

De utvalgte individer ble vilkårlig oppdelt i to grupper:

En gruppe på 47 individer (26 kvinner og 21 menn) mottok 100 ml pr. dag av et fermentert meieriprodukt som inneholdt 2% fett, omfattende yogurtfermenter (L. bulgaricus og S. thermophilus) og Lactobacillus casei-stammen DN-114 001, og markedsført av DANONE under varemerket

ACTIMEL.

En gruppe av 41 individer (22 kvinner og 19 menn) mottok en placebo i 28

dager: 100 ml pr. dag av melk fortynnet med vann (1/5 i volum) supplert med sukker slik at det fikk en kaloriverdi ekvivalent med verdien til

ACTIMEL.

Individene fra de to grupper ble bedt om å avstå fra å fortære yogurt eller andre fermenterte meieriprodukter så lenge studien varte.

Den gjennomsnittlige (standardavvik indikert i parentes) alder på individene var henholdsvis 36 (7,3) og 32,7 (7,4) for ACTIMEL-gruppen og placebogruppen.

En blodprøve (55 ml) ble tatt av hvert individ fra de to grupper før start av fortæring av ACTIMEL eller placebo, for å bestemme basisverdiene. Individene fikk kontrollbesøk på dag 9, 18 og 28, og fylte ut et kort spørreskjema med hensyn til deres helse, de eventuelle bivirkninger og også utvikling av eventuell sykdom som muligens interfererte med tolkningen av resultatene. En blodprøve ble tatt under hvert besøk for formål med immunologiske eksperimenter.

For hver individuell blodprøve, ble det utført en fullstendig blodcelletelling og blodkjemianalyse. I tillegg ble det utført en fenotypisk analyse av leukocyttene og av undergruppene derav (T-celler og undergrupper, B-celler, monocytter og NK-celler) ved flow-cytometri.

Måling av celleformering

Formeringsresponsen hos T-cellene til individene i ACTIMEL-gruppen og til individene i placebogruppen, med hensyn til de tre mikrobielle antigener: candida, tetanus og influenza, ble bestemt ex vivo ved måling av<3>HTdR-inkorporering som beskrevet nedenunder.

Fremstilling av celler:

30 ml heparinisert blod fra hver av prøvene som ble tatt, ble behandlet som følger: røret ble sentrifugert i 10 min. ved 1500 opm. Plasmaet ble omhyggelig overført til merkede kryorør og lagret ved 70°C [sic]. Blodet ble overført til et 15 ml sentrifugerør og fortynnet til 1:3 med PBS. 10 ml av Ficoll-hypaque ble tilsatt med et 50 ml sentrifugerør og dekket med 30 ml av det fortynnede blod. Røret ble sentrifugert i 2 min. ved 2000 opm ved omgivelsestemperatur. Det øvre sjikt av PBS ble tappet av, og de mononukleære celler ble samlet og overført til et 15 ml sentrifugerør. 10 ml HBSS ble tilsatt, slynget og sentrifugert ved 1500 opm i 10 min.; supernatanten ble tappet av, og pelleten ble resuspendert i 2-3 ml HBSS. 8 ml HBSS ble tilsatt, og røret ble sentrifugert ved 1500 opm i 6 min. Denne protokoll ble gjentatt to ganger, og de gjenvunne celler ble resuspendert i 1-2 ml PBS og deretter slynget. Cellene ble tellet, deres levedyktighet ble undersøkt ved trypanblåttekskludering, og konsentrasjonen derav ble justert til 2 x 10<8>/ml.

Fremstilling av antigener:

Tetanus-antigen: fremstillingen ble utført på analysedagen. En forrådsløsning ble laget ved å fortynne tetanus-toksoid (CONNAUGHT LABORATORY, Willowdale, Kanada) til 1:1000 i PBS.

Candida albicans- antlgener. en forrådsløsning ble laget ved å fortynne Candida a/b/cans-antigener (BAYER CO, Elkert, IN) til 1:1000 i PBS.

Influensa-antigener: en forrådsløsning ble fremstilt ved å fortynne en tillaging av influensavirus-antigener (NIBSC, Herts, England) til 1:125 i PBS).

Mikrotitreringsplater (96 brønner) ble brukt. Hver brønn fikk 100 |xl antigen-forrådsløsning og 100 |xl celler ved en sluttkonsentrasjon på 2 x 10<5>celler pr. brønn. Kontrollbrønner fikk 100 |xl PBS istedenfor antigen-forrådsløsningen. Platene ble inkubert ved 37°C, 5% CO2i 5 dager; 18 timer før slutten av inkuberingen, ble det tilsatt 20^1 av 50 nCi/ml<3>HTdR (NEW ENGLAND NUCLEAR, Boston, Ma). Cellene fra brønnene i hver plate ble innhøstet på filtre, og disse filtre ble tellet direkte i en MATRIX 9600 beta-teller (PACKARD INSTRUMENTS) for å måle<3>HTdR-inkorporeringen som er uttrykt i CPM (tellinger pr. minutt).

For hvert individ i gruppen som har fått ACTIMEL, og for hvert individ i gruppen som har fått placebo, evalueres formeringen ved måling av stimulerings-indeksen (Sl) i henhold til følgende ligning:

Sl: = gjennomsnitt- CPM- stimulerte celler

gjennomsnitt-CPM-ustimulerte celler (kontrollbrønn)

Statistisk analyse

Beskrivende statistikker (gjennomsnitt, standardavvik, median) ble brukt for å oppsummere den proliferative respons hos T-cellene mot eksponering for hvert antigen, for hver av gruppene i studien ved hvert måletidspunkt. På grunn av fordelingsskjevheten for den proliferative respons, ble transformering til naturlig logaritme brukt for proliferasjonsdataene.

Variasjonene i den proliferative respons sammenlignet med basisverdien ble brukt for den statistiske modellering [LITTELL et al. SAS system for Mixed Modell. North Carolina: SAS Institute Inc, (1996)]. Modifikasjonene i respons sammenlignet med basisverdien, som funksjon av tid, var representert ved anvendelse av den kurveutglattingsteknikk som er beskrevet av DIGGLE et al.

[Analysis of Longitudinal Data. New York: University Press Inc, 1994].

En blandet lineær modell ble utviklet for å studere trajektorien til den proliferative respons. Denne modell tillater justering av proliferasjonsdataene til en kvadratisk kurve for hver gruppe i studien.

Denne modell er definert ved følgende ligning:

Yijt<=>au<+><p>1j T<+>(52j T2 +8ijt, i=1, ...n, j=1, 2, t=1,, 3, 4

hvor:

Yijt betegner variasjonen i den proliferative respons sammenlignet med basisverdien for individet i i produktgruppen j ved tid t; tansformasjon til naturlig logaritme er blitt anvendt på hver variable, Yijt = Log (proliferason ved tid t) - Log (basisverdi).

dy betegner avkjøringen for individet i i produktgruppen j. Den reflekterer en vilkårlig effekt i modellen, ay~MVN { 0, G), G inneholder komponentene i variansen i diagonal struktur (MVN: multinormal variabel fordeling).

og (52j er regresjonskoeffisientene til T og T<2>for produktgruppen j;

T er momentet for måling (dag 0, 9, 18 eller 28) og

T2 er den kvadratiske verdi av T.

Byt er feilkoeffisienten:

8yt- MVN (0, R) og R=a2ln, hvor ln betegner identitetsmatriksen n x n.

Statistiske tester for følgende hypoteser ble utført:

a) Test om den estimerte regresjonskoeffisient er 0.

H0: |51j = 0vs. H-i: (51 j * 0 (for en lineær verdi)

og H0: (52j = 0 vs. H-i: (52j * 0 (for en kvadratisk verdi)

Hvis (51j og (52j ikke er forskjellige fra 0, så er det ingen trajektorie.

Hvis (J2j er signifikant forskjellig fra 0, så er det en kvadratisk trajektorie. Hvis bare (51 j er signifikant forskjellig fra 0, så er det en liner trajektorie.

b) Sammenlign om trajektoriene til de to grupper er identiske.

Ho: (511= PI2vs. H^ (51! * (512(foren lineær verdi)

og H0: (52!= p22vs. H^ p21 * (J22 (for en kvadratisk verdi)

Den SAS-statistiske pakning ble brukt for å utføre analysene.

Resultater

Tabell I nedenunder gir de demografiske data med hensyn til individene og vurderingen av basisverdien for formering.

T- celleproliferasion I respons til spesifikke mikrobielle antigener

Gjennomsnittene, standard-avvikene og medianene for ex vivo-proliferasjonen til de perifere blod-mononukleære celler (PBMCs) for hver gruppe

(ACTIMEL og placebo) ved de forskjellige prøvetakingstider er gitt i tabell 2 nedenunder.

Det er ingen signifikante differanser mellom de to grupper i studien for basisverdiene (dag 0) for den proliferative respons med hensyn til de tre mikrobielle antigener.

Fig. 1 illustrerer variasjonene i den proliferative respons over tid for hvert antigen for de to grupper i studien: ACTIMELgruppe: kontinuerlig linje; placebogruppe: brokken linje.

Resultatene for den statistiske modellering er gitt i tabell 3 nedenunder.

Candida:

I ACTIMEL-gruppen øker basisresponsen 3,0±3,4 ved dag 0 til 3,2±3,5 ved dag 9, og 4,3+5,6 ved dag 18, og faller deretter til 2,3+2,6 ved dag 28 (tabell 2). Koeffisientene som er estimert for den lineære verdi T og den kvadratiske verdi T<2>er henholdsvis 0,028 og 0,0012 (tabell 3). De to verdier er statistisk signifikant forskjellige fra 0 (p=0,030 og 0,013, respektive). Disse observasjoner innebærer at det er en signifikant positiv tendens for variasjonen i proliferativ respons overfor Canc//'c/a-antigenet. Den proliferative respons øker først og avtar så, som vist i figur 1a.

Placebogruppen viser en liten endring over tidsrommet for studien. Regresjonskoeffisientene som er anslått for T og T<2>er 0,017 og 0,0007. Disse verdier er ikke signifikant forskjellige fra 0 (p=0,232 og0,208, respektive). Disse observasjoner indikerer at det ikke er noen signifikant endring i den proliferative respons for perioden for studien i kontrollgruppen. Som vist i figur 1a, er kurven for placebogruppen flatere enn kurven for ACTIMEL-gruppen. Selv om ACTIMEL-gruppen viser en signifikant trajektorie, i motsetning til placebogruppen, når differansen mellom de to kurver ikke nivået for statistisk signifikans (p=0,540 for T og p=0,458 for T<2>, tabell 3).

Tetanus:

For ACTIMEL-gruppen øket responsen gradvis fra basisnivå opp til dag 18 og falt deretter. Regresjonskoeffisientene som var estimert for T og T<2>er henholdsvis 0,043 og 0,0011 (tabell 3). Disse to verdier er signifikant forskjellige fra 0 (henholdsvis p=0,001 og 0,020). Som i tilfellet Candida, er den positive variasjon i proliferativ respons over perioden for studien signifikant for ACTIMEL-gruppen. I placebogruppen øket gjennomsnittsverdien fra 7,3 ved dag 0 til 11,8 ved dag 9, falt deretter til 7,9 ved dag 18 og øket igjen til 8,7 ved dag 28 (figur 1b). Selv med en ikke-signifikant koeffisient for annengradsverdien, T<2>(-0,0008, p=0,141, tabell 3), viser den signifikante estimerte koeffisient T (0,034, p=0,022, tabell 3) en trajektorieeffekt. Hvis imidlertid ACTIMEL-gruppen sammenlignes med placebogruppen, viser de statistiske tester ikke noen signifikante differanser mellom de to kurver (henholdsvis p=0,630 og 0,626 for T og T<2>).

Influensa:

ACTIMEL-gruppen viste en klarere endring enn placebogruppen. Gjennomsnittsverdien øket fra 13+12,6 ved dag 0 til 19,7+17,1 ved dag 9, holdt seg på dette nivå til dag 18, og falt til 13,9+12,7 ved dag 28 (figur 1c). De to koeffisienter som var estimert for T og T<2>er signifikant forskjellige fra null (p=0,001). Disse statistikker indikerer at den positive endring i proliferativ respons under perioden for studien er signifikant (tabell 2).

Placebogruppen viste variasjoner lik dem som ble observert for tetanus Gjennomsnittsverdiene øket til dag 9, falt til dag 18, og øket igjen til dag 28 som illustrert i figur 1c. De to estimerte regresjonskoeffisienter er ikke signifikant forskjellige fra 0 (p-verdiene er 0,181 og 0,475 for henholdsvis T og T<2>), hvilket indikerer at det ikke er noen signifikant trajektorie av variasjoner i proliferativ respons på influensa-antigenet.

Når parameterne som er estimert for ACTIMEL-gruppen og placebogruppen blir sammenlignet, observeres signifikante differanser, både forde lineære parametere og de kvadratiske parametere (p=0,045 for T og p=0,027for T<2>) (tabell 3). Disse konklusjoner indikerer at variasjonene i proliferativ respons er signifikant forskjellige mellom de to grupper i studien.

Eksempel 2: Virkning av Lactobacillus casei på proliferasjon av T-lymfocytt-undersett i respons på stimulering med influensa-antigenet

Den eksakte natur av det eller de T-undersett som in vitro tilsvarer mikrobielle antigener er ikke kjent. Hvert av de spesifikke undersett av T-lymfocytter, for eksempel slike som er representert ved fenotypene CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ og CD3+CD45+, kan anses å være en primær responder, eller disse kombinerte undersett kan bidra til den totale proliferative respons på booster-antigener.

Under forutsetning av at spesifikke lymfocytt-undersett er hoved-responderne på booster-antigener, ble analyser av den statistiske modell som er beskrevet i eksempel 1 ovenfor, utført for T-celle-undersettene CD3<+>CD4<+>, CD3+CD8\ CD3<+>CD25<+>og CD3<+>CD44<+>, i den hensikt å bestemme om den proliferative respons som ble oppnådd for hvert av de fire undersett avvek signifikant mellom ACTIMEL-gruppen og placebogruppen.

I disse analyser ble verdiene for den proliferative respons som innledningsvis var basert på de totale PBMC konvertert, for hvert undersett, til nye verdier som ble beregnet i henhold til den totale frekvens av CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ og CD3+CD45+ T-celler i hver blodprøve. Så ble det utført statistiske analyser for hvert undersett, som beskrevet i eksempel 1 ovenfor. Gjennomsnittene, standardavvikene og medianene for hver av placebo- og ACTIMEL-gruppene for de fire lymfocytt-undersett, er gitt i tabell 4 nedenunder. Differansene i basisverdiene mellom de to grupper i studien er ikke statistisk signifikant.

Ved anvendelse av den statistiske modell som er beskrevet i eksempel 1 ovenfor, ble variasjonene i proliferasjon i forhold til disse basisverdier, i respons til influensa-antigenet, analysert for hvert av de fire lymfocytt-undersett. Figur 2 illustrerer variasjonene i proliferasjon, på en logaritmisk skala, for hvert av disse undersett og for hver av de to grupper i studien.

Resultatene for den statistiske modellering er gitt i tabell 5 nedenunder.

De proliferative responser for hvert av de fire lymfocytt-undersett stemmer overens med dem som ble observert for de totale PBMC. Under eksponering for influensa-antigenet, observeres signifikante variasjoner i ACTIMEL-gruppen for de fire lymfocytt-undersett. Disse variasjoner kan være representert som en kvadratisk funksjon av tid.

Små variasjoner ble observert for de fire undersett i placebo-gruppen.

I tillegg var differansene mellom de to grupper signifikante for alle lymfocytt-undersettene.

Konklusjon

Disse resultater viser, for de 3 antigener som ble testet, en økning i den proliferative respons indusert ved en antigen-booster, som var større i ACTIMEL-gruppen enn i placebo-gruppen. Hva influensa-antignet angår, er økningen i ACTIMEL-gruppen statistisk signifikant sammenlignet med den som ble observert i placebo-gruppen, både for de totale PBMC og for hvert av T-celle-undersettene CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3+CD25+ og CD3+CD45+.

Det er synes derfor som om forbruket av ACTIMEL induserte, i de angjeldende individer, en immunologisk priming in vivo, som førte til en ex vivo-respons hos deres T-celler til de mikrobielle antigener, og spesielt til influensa-antigenene, som var bedre enn hva som ble observert placebo-gruppen.

Denne økning i respons stemmer overens med sekvensen og status for aktivering av CD3<+>T-cellene, og for undersettene derav, hos individene i ACTIMEL-gruppen.

I tillegg antyder den positive overensstemmelse med nærvær av CD25-aktiveringsmarkøren involvering av en in v/Vo-aktivering av influensa-spesifikke T-celler som uttrykker CD25 IL-2-reseptorer og som er i stand til å respondere mer effektivt på influensa-antigenene. Analysen av T-celle-undersettene antyder også at den proliferative respons sannsynligvis involverer både CD4<+->og CD8<+->undersettet som tilsvarer influensa-antigenet. Betydningen av CD3<+>/CD8<+>T-undersettet i analysen av formeringen, antyder muligheten av in wVo-priming av oppsamlingen av influensa-spesifikke CD8+ cytotoksiske celler.

Claims (3)

1. Anvendelse av L. casei stammen CNCM 1-1518 for fremstilling av et preparat som kan administreres oralt for å forsterke i et menneske en spesifikk systemisk immunrespons mot et influensa-virus.

2. Anvendelse som angitt i krav 1, hvor preparatet er i form av en matvare eller et matvaretilskudd.

3. Anvendelse som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 2, hvor preparatet er i form av et fermentert meieriprodukt.