CN102858948B - 具有抗氧化作用的乳酸杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗氧化作用的特定乳酸杆菌菌株。

Description

具有抗氧化作用的乳酸杆菌
技术领域
本发明属于包含用于预防或治疗氧化应激的益生菌的组合物的领域。
背景技术
所有活体均在其细胞内维持还原环境。然而，由于线粒体的需氧代谢及其他因素，产生了诸如过氧化物和氧自由基的活性氧源性物质（reactiveoxygen-derivedspecies）。还原环境由诸如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶以及谷胱甘肽过氧化物酶的酶维持。如果正常的氧化还原状态被破坏，活性氧物质可破坏包括蛋白质、脂质且尤其是DNA的所有细胞组分。活性氧物质的产生与去除活性中间体毒性或修复由活性氧物质引起的损害的能力之间的这种失衡被称为氧化应激。
在人体内，氧化应激是衰老和与衰老相关的退行性疾病的重要因素，所述退行性疾病例如癌症、关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、卢伽雷氏症、帕金森氏病、心脏衰竭、阿尔茨海默病以及亨廷顿氏病。衰老的自由基理论认为生物体衰老是由于细胞随时间积累了由活性氧物质导致的损害。
本领域已知数株具有抗氧化特性的乳酸细菌（lacticacidbacteria）。例如，US6,884,415公开了一种通过使含有具有Mn过氧化氢酶活性的植物乳酸杆菌（L.plantarum）菌株的食品在含锰的天然物质存在下发酵而生产的抗氧化食品。该菌株的抗氧化特性依赖于锰的存在。WO03/002131公开了发酵乳酸杆菌（L.fermentum）菌株（ME-3）及其用作抗氧化益生菌的用途。WO00/20013公开了导致肠道中丙酸量增加的乳酸杆菌或丙酸杆菌菌株用于降低诸如IL-6、活性氧物质以及粘附分子的氧化应激因子水平的用途。该文献中公开的优选菌株是植物乳酸杆菌299v。
Ikeda等人（2007,AEM73:6404-6409）对饲喂乳酸细菌（乳酸杆菌和双歧杆菌）的秀丽隐杆线虫（C.elegans）与饲喂大肠杆菌（Escherichiacoli）OP50（秀丽隐杆线虫的标准食物）的线虫的寿命和沙门氏菌抗性进行了比较。他们报道，与大肠杆菌OP50相比，所测试的所有乳酸杆菌或双歧杆菌在提高寿命和沙门氏菌抗性方面均具有相似的作用。然而，未评价乳酸细菌对于经受氧化应激的线虫的作用。
发明内容
本发明的发明人测试了与大肠杆菌饲喂对照相比乳酸细菌对经受氧化应激的秀丽隐杆线虫的作用。他们发现，与Ikeda等人对于有关寿命所观察到的结果相比，仅非常少的特定乳酸杆菌菌株防止了这种施加的氧化应激的损害作用。
因此，本发明提供了本发明的发明人基于缓解过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激对秀丽隐杆线虫的影响的能力而筛选的乳酸杆菌菌株，当其被体内施用于受试者时用作抗氧化剂，并因此用于治疗、缓解或预防氧化应激相关的状态（condition）或临床表现。
本发明的发明人所鉴定的乳酸杆菌菌株特别适于制备施用给（尤其以食物或膳食补充的形式）暴露于氧化应激的哺乳动物的抗氧化组合物，所述哺乳动物特别是人，例如，老年人、轮班工作者、考试期间的学生、消防员、暴露于辐射或空气污染的受试者。特别地，老年人是合适的目标群体，这是因为老化的肠道和免疫衰老往往对氧化应激和ROS的产生的有效抗性较低。因此，本发明的乳酸杆菌菌株特别适于通过营养干预而改善老年人的生活质量。
具体实施方式
乳酸杆菌菌株
本发明的发明人所筛选的三种具体的乳酸杆菌菌株描述如下：
第一种菌株是干酪乳酸杆菌（Lactobacilluscasei）菌株DN114001，其根据布达佩斯条约于1994年12月30日以保藏号I-1518保藏于法国国家微生物保藏中心（CNCM，CollectionNationaledeCulturesdeMicroorganisms,25RueduDocteurRoux,Paris）。该菌株的详细特征在PCT申请WO96/20607中公开。
第二种菌株是鼠李糖乳酸杆菌（Lactobacillusrhamnosus）菌株DN116010，其根据布达佩斯条约于2006年11月19日以保藏号I-3690保藏于法国国家微生物保藏中心。该菌株的详细特征在PCT申请WO2009/122042中公开。
第三种菌株是鼠李糖乳酸杆菌菌株DN116063，其根据布达佩斯条约于2009年12月16日以保藏号I-4271保藏于法国国家微生物保藏中心。根据PCR分型和API50CHL试剂盒（Biomerieux,france）上的生化活性，该菌株被鉴定为属于鼠李糖乳酸杆菌。根据Api50CHL结果，I-4271菌株发酵下述糖类和醇类：核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-山梨糖、鼠李糖、甘露醇、山梨醇、甲基-D葡萄糖苷、N-乙酰葡糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷（esculine）、水杨苷、纤维素、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、β-龙胆二糖、D-松二糖、D-塔格糖、葡萄糖酸盐（酯）。
本发明还包括衍生自母体菌株CNMI-1518、I-3690以及I-4271中任一种且仍具有抗氧化活性（即，能够缓解H2O2诱导的氧化应激对秀丽隐杆线虫的影响）的突变菌株或遗传转化菌株用于抗氧化目的的用途。这些突变菌株或遗传转化菌株可为这样的菌株：即，其中母体菌株的一个或多个内源基因已经被突变，例如，修饰其一些代谢特性（例如，其发酵糖的能力、其对于酸的抗性、其经受胃肠道中的运输的存活性、其后酸化作用或其代谢物的产生）。它们还可为一种或多种目的基因遗传转化母体菌株而产生的菌株，例如，赋予所述菌株其他生理特性，或使其表达具有人们期望通过所述菌株而赋予的治疗或接种效果的蛋白。
本发明还包括新菌株I-4271，以及上文所述的其衍生的突变菌株或遗传转化菌株。优选地，这些突变菌株或遗传转化菌株仍旧具有菌株I-4271的抗氧化能力。
组合物
本发明还包括包含乳酸杆菌菌株CNCMI-1518、I-3690以及I-4271中的一株或多株或其所衍生的突变菌株或遗传转化菌株的组合物，当体内施用于受试者时将其用作抗氧化剂。
在本发明的组合物中，所述乳酸杆菌菌株可以以活菌或非活菌的完整细菌形式使用。可选地，它们可以以细菌裂解物形式或细菌级分形式使用，适于该用途的细菌级分的选择可例如通过检测其缓解过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激对秀丽隐杆线虫的影响的特性而进行。
本发明的组合物可为适于施用，特别是口服施用的任何形式。这包括例如固体、半固体、液体以及粉末。液体组合物通常优选用于较容易的施用，例如作为饮料。
当所述细菌为活菌形式时，所述组合物通常可在每克干重组合物中包含105至1013菌落形成单位（cfu），优选至少106cfu，更优选至少107cfu，还更优选至少108cfu，且最优选至少109cfu。在液体组合物的情况下，这通常对应于每毫升为104至1012菌落形成单位（cfu），优选至少105cfu，更优选至少106cfu，还更优选至少107cfu，且最优选至少109cfu。
本发明的组合物的实例为营养组合物，包括食品，特别是乳制品。发酵乳制品形式的施用具有提供低氧化还原电位的食品的优点，该低氧化还原电位不仅有利于乳酸杆菌菌株生长或存活，还有利于消耗所述食品的人受试者的氧化应激的进一步治疗和/或预防。
本发明的营养组合物还包括食物补充剂以及功能性食物。“食物补充剂”是指由通常用于食品的化合物制成的产品，但是该产品为片剂、粉末、胶囊、饮剂或通常与食物无关的任何其他形式，且对人们的健康具有益处。“功能性食物”是对人们的健康也有益处的食物。特别地，食物补充剂和功能性食物可对疾病（例如慢性疾病）具有保护性或治愈性生理作用。
本发明的组合物的其他实例为药物组合物或化妆品组合物。
本发明的组合物还可包含益生或非益生性乳酸细菌中的一种或多种其他菌株，例如选自乳酸杆菌属、乳球菌属、链球菌属以及双歧杆菌属的一种或多种菌株。特别地，所述一种或多种其他菌株可包括一种或多种嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus）菌株和/或一种或多种保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillusbulgaricus）菌株。
应用
本发明的乳酸杆菌菌株和组合物可用于抵御氧化应激和/或预防氧化应激导致的损害。因此，它们可用作被施用以用于治疗或预防涉及氧化应激的疾病的抗氧化剂。
优选地，所述乳酸杆菌菌株和组合物被施用于人，特别是遭受氧化应激的人，更优选老年人、轮班工作者、考试期间的学生、消防员以及暴露于辐射和/或空气污染的受试者。
因此，本发明提供了一种用于治疗、缓解或预防有相应需要的受试者的氧化应激相关状态的方法，其中，所述方法包括向所述受试者施用本发明的乳酸杆菌菌株或组合物。
特别地，老年人是合适的目标群体，这是因为老化的肠道和免疫衰老往往对氧化应激和ROS的产生的有效抗性较低。氧化应激也是衰老的重要因素：衰老的自由基理论认为生物体衰老是由于细胞随时间积累了由活性氧物质导致的损害。因此，本发明的乳酸杆菌菌株特别适于通过营养干预而改善老年人的生活质量。老年人是年龄为55岁以上的人，特别是年龄为65岁以上的人。
在人体中，氧化应激还是退行性疾病的重要病原因素，所述退行性疾病例如癌症、关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、卢伽雷氏症、帕金森氏病、心脏衰竭、阿尔茨海默病以及亨廷顿氏病。因此，本发明的菌株和组合物可有利地施用于患有选自癌症、关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、卢伽雷氏症、帕金森氏病、心脏衰竭、阿尔茨海默病以及亨廷顿氏病组成的组中的疾病和/或具有患这些疾病的风险的人受试者。
实施例1：在液体培养基中存在或不存在氧化应激的情况下乳酸细菌对于秀 丽隐杆线虫存活的影响
使用秀丽隐杆线虫突变株（BA17fem-1(hc17)）进行试验，该突变株在25°C下不增殖但仍保留野生型的寿命特征。如下进行BA17线虫的同步化：在20°C下从妊娠成虫分离虫卵，在加有5ug/ml胆固醇的M9培养基（10vol%MRS，氟代脱氧尿苷110ug/ml）中过夜孵化虫卵，并在微滴定板的孔中分离L1期线虫。在不振荡的情况下于25°C和80-85%的相对湿度下培养线虫3天。将这些幼虫转移至包含加有胆固醇的M9培养基的培养板中，并于25°C和80-85%的湿度下培养3天，同时进行对照或试验性饲喂。每孔中具有至少50条线虫。
3天后，当线虫达到成虫期时，通过添加5mM浓度的过氧化氢（H2O2）施加氧化应激。对照则不使用H2O2。抗氧化抗性用5小时后通过显微镜评价的存活力（viability）表示。将线虫在这些条件下温育5小时。为了评价抗氧化能力，如果线虫不能活动，则认为它们死亡（受应激）。
给线虫饲喂4*106cfu/ml的标准饲料大肠杆菌OP50或属于双歧杆菌属、乳酸杆菌属或链球菌属的乳酸细菌的不同菌株。添加30μg/ml的卡那霉素以防止测定过程中大肠杆菌OP50或所试验的乳酸细菌的生长。
不存在氧化应激下的存活
在温育期间不存在氧化应激的情况下，饲喂大肠杆菌的线虫的存活力在100%至约90%之间变化。如表1对于一些测试菌株所显示的，乳酸细菌产生相似或更好的存活率，这提示具有相似或提高的寿命。
表1：饲喂乳酸细菌对秀丽隐杆线虫寿命的影响
株-种 存活力（%）
S2A-嗜热链球菌 95.7
S1B-嗜热链球菌 98.0
S2B-嗜热链球菌 94.1
S1C-嗜热链球菌 94.5
S 1D-嗜热链球菌 98.2
S1E-嗜热链球菌 100.0
S1F-嗜热链球菌 95.
S1G-嗜热链球菌 98.2
S1H-嗜热链球菌 97.1
L2A-嗜酸乳酸杆菌（L.acidophilus） 91.9
L5A-干酪乳酸杆菌 100
L6A-德氏乳酸杆菌（L.delbrueckii） 94.1
L8A-约氏乳酸杆菌（L.johnsoni） 96.0
L9A-植物乳酸杆菌 91.75
OP50 89.5
这与Ikeda等人（2007，见上文）的发现相一致。
氧化应激下的存活
使用2mM、3mM以及5mMH2O2测试99株乳酸细菌对氧化应激情况下的存活的影响。与不存在应激相比，在5mMH2O2存在下，存在大肠杆菌OP50的存活力为约93%。这表示对抗氧化应激的保护作用为93%。下表2显示了所选择的乳酸细菌对抗氧化应激保护作用的影响，将对照大肠杆菌OP50产生的保护性作用作为参照水平设定为100%。
表2：与大肠杆菌OP50相比，由乳酸细菌产生的对5mMH2O2氧化应激的保护水平
株-种 保护水平（%）
大肠杆菌OP50 100
乳酸杆菌
L8F植物乳酸杆菌(299v) 14.6
L9F鼠李糖乳酸杆菌(LGG) 21.6
L10F鼠李糖乳酸杆菌 9.7
L1G嗜酸乳酸杆菌 102.5
L3G干酪乳酸杆菌 7
L4G-干酪乳酸杆菌 30
L6G-发酵乳酸杆菌 23
L7G-瑞士乳酸杆菌（L.helveticus） 95
L8G-植物乳酸杆菌 18
L9G-鼠李糖乳酸杆菌(HN001) 81
L10G-鼠李糖乳酸杆菌 77
L1H-食淀粉乳酸杆菌（L.amylovorus） 70
L4H-干酪乳酸杆菌 87
L5H-德氏乳酸杆菌 6
L7H-约氏乳酸杆菌 3
L8H-植物乳酸杆菌 9
L10H-鼠李糖乳酸杆菌 8
L8B-约氏乳酸杆菌 76.8
L9A-植物乳酸杆菌 18.7
L9B-植物乳酸杆菌 13.3
L10B-鼠李糖乳酸杆菌 5.2
L11B-鼠李糖乳酸杆菌 70.9
L2C-德氏乳酸杆菌 15.7
L4C-短小乳酸杆菌（L.brevis） 12.8
L6C德氏乳酸杆菌 0.0
L8C约氏乳酸杆菌 59.3
L10C鼠李糖乳酸杆菌 105
L11C鼠李糖乳酸杆菌 96.3
L4D干酪乳酸杆菌 7.5
L6B德氏乳酸杆菌 21.2
L8B约氏乳酸杆菌 82.2
L5C干酪乳酸杆菌 4.1
L7C-乳酸杆菌种 5.7
L2D-保加利亚乳酸杆菌 0.0
L5D-干酪乳酸杆菌 0.0
L2E-保加利亚乳酸杆菌 0.0
L3F-干酪乳酸杆菌 0.0
L4F-干酪乳酸杆菌 85.1
L6F-发酵乳酸杆菌 0.0
L7F-瑞士乳酸杆菌 11.0
L11A-鼠李糖乳酸杆菌 102
L4B-干酪乳酸杆菌 109
L3B-保加利亚乳酸杆菌 80.1
L6A-德氏乳酸杆菌 26.3
L2A-嗜酸乳酸杆菌 100
L2B-短小乳酸杆菌 16.0
L5A-干酪乳酸杆菌 9.8
L7B-发酵乳酸杆菌 0.0
L5B-干酪乳酸杆菌 89.6
L8A-约氏乳酸杆菌 111
L8D-约氏乳酸杆菌 87.1
L9D-罗伊氏乳酸杆菌（L.reuteri） 91.6
L10D-鼠李糖乳酸杆菌 94.1
L11D-鼠李糖乳酸杆菌 100
L3E-干酪乳酸杆菌 104
L4E-干酪乳酸杆菌 59.4
L5E-德氏乳酸杆菌 34.2
L6E-发酵乳酸杆菌 56.7
L8E-戊糖乳酸杆菌（L.pentosus） 54.2
L9E-高加索乳酸杆菌（L.gasseri） 58.1
L10E-鼠李糖乳酸杆菌 88.6
L1F-乳酸杆菌种 87.5
L2F-保加利亚乳酸杆菌 52.2
L3A-乳酸杆菌种 3
L1B-嗜酸乳酸杆菌 1
双歧杆菌
B1B-动物双歧杆菌（B..animalis） 35.8
B1C-动物双歧杆菌 26.2
B1D-动物双歧杆菌 7.4
B1E-动物双歧杆菌 0.0
B1G-两歧双歧杆菌（B.bifidum） 9.0
B2G-长双歧杆菌（B.longum） 5.9
链球菌
S2A-嗜热链球菌 84.3
S1B-嗜热链球菌 61.5
S2B-嗜热链球菌 85.0
S1C-嗜热链球菌 45.8
S1D-嗜热链球菌 93.8
S1E-嗜热链球菌 89.7
S1F-嗜热链球菌 8.2
S1G-嗜热链球菌 11.7
S1H-嗜热链球菌 42.3
从上表2可以得出结论，双歧杆菌菌株未产生对氧化应激的抗性，令人惊讶地，仅非常少的链球菌菌株和乳酸杆菌菌株能够产生高于对照菌株的水平的对氧化应激的抗性。在不存在氧化应激的情况下提高存活力的菌株不一定是也产生针对氧化应激的最佳保护作用的菌株。这表明，乳酸细菌对存活力的提高作用似乎与对氧化应激的作用不具相关性。这些结果还表明抗氧化作用具有高菌株特异性，实际上仅非常少的链球菌菌株和乳酸杆菌菌株具有体内降低氧化应激作用的能力。
实施例2：所筛选的乳酸细菌菌株对在琼脂平板上培养的野生型秀丽隐杆线 虫氧化应激抗性的影响
在NG琼脂平板上培养野生型秀丽隐杆线虫（N2）5天，该NG琼脂平板具有大肠杆菌OP50菌苔或来自实施例1筛选的乳酸细菌菌株的菌苔，并使用3mMH2O2温育5小时。在5小时温育前后评价存活力，并通过测定在温育时间中死亡的线虫的百分数来确定氧化应激下的存活力（%）。结果示于表3。在使用琼脂平板而非孔的测定中，特定的乳酸细菌菌株也显示了对氧化应激的保护作用，但并非实施例3中所测试的所有菌株均显示有效。在99种菌株中，有3株乳酸杆菌菌株10C、11D以及3E有效。菌株10C是鼠李糖乳酸杆菌DN116063(CNCMI-4271)，菌株11D是鼠李糖乳酸杆菌DN116010(CNCMI3690)，菌株3E是干酪乳酸杆菌DN114001(CNCM-1518)。
所测试的链球菌菌株（S2B、S1E和S1D）无一能够以高于大肠杆菌OP50的水平抵御氧化应激。
表3：在琼脂平板上，相对于大肠杆菌OP50产生的保护水平，乳酸细菌产生的对5mMH2O2氧化应激的保护水平
实施例3：发酵乳制品
如本领域已知制备鼠李糖乳酸杆菌CNCMI-4271的浓缩冻干制品。如本领域已知通过发酵乳类而制备酸奶饮料。在酸奶饮料制备结束时，将鼠李糖乳酸杆菌CNCMI-4271添加至约5×108cfu/ml的终浓度。将该产品储存在约7℃下。

Claims (14)

1.乳酸杆菌(Lactobacillus)菌株用作抗氧化剂在制备用于治疗、预防或缓解与氧化应激相关的状态的药物中的用途，所述菌株能够缓解由过氧化氢诱导的氧化应激对秀丽隐杆线虫(C.elegans)的影响，其中，所述菌株选自鼠李糖乳酸杆菌( Lactobacillusrhamnosus)菌株CNCMI-3690以及鼠李糖乳酸杆菌菌株CNCMI-4271。
2.组合物用作抗氧化剂在制备用于治疗、预防或缓解与氧化应激相关的状态的药物中的用途，所述组合物包含权利要求1所述的一种或多种乳酸杆菌菌株。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，用于治疗、预防或缓解受试者的氧化应激状态，所述受试者选自老年人、轮班工作者、考试期间的学生、包括消防员在内的暴露于辐射和/或空气污染的受试者。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，用于治疗、预防或缓解选自癌症、关节炎、糖尿病、动脉粥样硬化、卢伽雷氏症、帕金森氏病、心脏衰竭、阿尔茨海默病以及亨廷顿氏病的氧化应激状态。
5.根据权利要求2所述的用途，其中，所述组合物是液体产品。
6.根据权利要求2或5所述的用途，其中，所述组合物是乳制品。
7.根据权利要求2或5所述的用途，其中，所述组合物是发酵产品。
8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述组合物是发酵产品。
9.根据权利要求2或5所述的用途，其中，所述组合物每克干重包含105至1013cfu所述菌株。
10.根据权利要求6所述的用途，其中，所述组合物每克干重包含105至1013cfu所述菌株。
11.根据权利要求7所述的用途，其中，所述组合物每克干重包含105至1013cfu所述菌株。
12.根据权利要求8所述的用途，其中，所述组合物每克干重包含105至1013cfu所述菌株。
13.鼠李糖乳酸杆菌菌株CNCMI-4271。
14.包含权利要求13所述菌株的组合物。
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