PT1272665E - Composições e métodos para identificar e alcançar células de cancro provenientes do tubo digestivo - Google Patents

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Stephanie Schulz
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Description

ΡΕ1272665 1
DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA IDENTIFCICAR E ALCANÇAR CÉLULAS DE CANCRO PROVENIENTES DO TUBO DIGESTIVO"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos de diagnóstico in vitro para detectar células de cancro do canal alimentar, particularmente cancro do estômago e do esófago primário e metastático, e a estojos ("kits") e reagentes para realizar esses métodos. A presente invenção refere-se a compostos e métodos para sistemas de imagem in vivo e tratamento de tumores que têm origem no tubo digestivo, particularmente tumores primários e metastáticos do estômago e do esófago. A presente invenção refere-se a métodos e composições para produzir e utilizar terapia genica direccionada, anti-sentido e composições de fármacos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Há uma necessidade de reagentes, estojos ("kits") e métodos para o rastreio, diagnóstico e monitorização de indivíduos com cancro proveniente do tubo digestivo, particularmente cancro primário e metastático do estômago e do esófago. Há uma necessidade de reagentes, estojos 2 ΡΕ1272665 ("kits") e métodos para identificar e confirmar que um cancro de origem desconhecida tem origem no tubo digestivo e para analisar amostras de tecido e cancro para identificar e confirmar cancro proveniente do tubo digestivo e para determinar o nivel de migração dessas células de cancro. Há uma necessidade de composições que podem especificamente ter como alvo células de cancro do estômago e esófago. Há necessidade de agentes de processamento de imagem que se podem ligar especificamente a células de cancro de estômago e esófago. Há uma necessidade de métodos de processamento de imagem melhorados para células de cancro de estômago e esófago. Há uma necessidade de agentes terapêuticos que se ligam especificamente a células de cancro de estômago e esófago. Há uma necessidade para métodos melhorados de tratamento de indivíduos que são suspeitos de sofrer de cancro primário e/ou metastático do estômago ou esófago. Há uma necessidade de composição de vacinas para tratar o cancro de estômago e esófago. Há uma necessidade de composição de vacinas para tratar e prevenir cancro do estômago e esófago. Há uma necessidade para agentes terapêuticos que possam distribuir especificamente terapêuticos genéticos, compostos anti-sentido e outros fármacos a células de cancro do estômago e esófago.
SUMARIO DA INVENÇÃO A descrição refere-se ainda a métodos in vitro de determinação se um indivíduo tem ou não cancro proveniente 3 ΡΕ1272665 do tubo digestivo, particularmente cancro primário e metastático do estômago e esófago. A presente descrição refere-se a métodos in vitro de exame de amostras de tecido não colorrectal e fluidos corporais de um indivíduo para determinar se a GCC, que é expressa por células do cólon normais e por células de tumores colorrectais, do estômago e esófago, está a ser expressa pelas células em amostras que não sejam do cólon. A presença da proteína GCC ou do transcrito do gene GCC em amostras fora do tracto colorrectal é indicador da expressão de GCC e é evidência de que o indivíduo pode sofrer de cancro do cólon metastizado ou de cancro do primário ou metastático do estômago e/ou esófago. Em doentes suspeitos de sofrer de cancro colorrectal, a presença de proteína GCC ou de transcrito do gene GCC em amostras fora do tracto colorrectal apoia a conclusão de que o indivíduo está a sofrer de cancro metastático colorrectal. 0 diagnóstico de cancro colorrectal metastático pode ser realizado ou confirmado. Em doentes suspeitos de sofrer de cancro do estômago ou do esófago, a presença da proteína GCG ou do transcrito do gene GCG em amostras fora do tracto colorrectal apoia a conclusão de que o indivíduo está a sofrer de cancro primário e/ou metastático do estômago ou esófago. 0 diagnóstico de cancro primário ou metastático do estômago ou esófago pode ser realizado ou confirmado. A descrição adiante refere-se a métodos in vitro para determinar se as células tumorais suspeitas de serem cancro do estômago ou esófago têm ou não origem no estômago 4 ΡΕ1272665 ou esófago. A presente descrição refere-se a métodos in vitro para diagnosticar se um indivíduo suspeito de sofrer de cancro do estômago ou esófago está ou não a sofrer de cancro do estômago ou esófago. A presente descrição refere-se a métodos in vitro para examinar amostras de tumores de um indivíduo para determinar se uma proteína GCC, que é expressa por células de tumores colorrectais, do estômago ou do esófago, está ou não a ser expressa pelas células tumorais. A presença da proteína GCG ou do transcrito do gene GCG numa amostra de um doente suspeito de possuir cancro do estômago ou do esófago é indicativa da expressão de GCC e de evidência de que o indivíduo pode estar a sofrer de cancro do estômago ou esófago. Nos tumores que são suspeitos de serem tumores do estômago ou esófago, a presença de uma proteína GCG ou do transcrito do gene GCG apoia a conclusão de que os tumores são de cancro do estômago ou esófago e o diagnóstico de cancro do estômago ou esófago. A descrição refere-se ainda a estojos ("kits") in vitro para a prática de métodos da invenção e a reagentes e composições úteis como componentes nesses estojos ("kits") in vitro da invenção.
DESCRIÇÃO DE FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS
Definições
Como aqui utilizado, o termo "GCC" pretende 5 ΡΕ1272665 referir-se à proteína celular expressa por células colorrectais normais, assim como células de cancro primárias e metastatizadas colorrectais, de estômago e esófago. Em indivíduos normais, a GCC encontra-se exclusivamente nas células do intestino, em particular em células no duodeno, intestino delgado (jejuno e íleo), o intestino grosso, cólon (cego, cólon ascendente, cólon transversal, cólon descendente e cólon sigmóide) e recto.
Como aqui utilizado, o termo "fragmento funcional" como utilizado no termo "fragmento funcional de um transcrito do gene GCG" pretende referir-se aos fragmentos de transcrito do gene GCG que são funcionais em relação a moléculas de ácido nucleico com sequências de comprimento total. Por exemplo, um fragmento funcional pode ser útil como uma sonda de oligonucleótido ou ácido nucleico, um iniciador, um oligonucleótido ou molécula de ácido nucleico ou uma sequência codificante. As sequências de nucleótidos que codificam as proteínas GCC humanas são reveladas em F.J. Sauvage et al. 1991 J. Biol. Chem. 266:17912-17918.
Como aqui utilizado, o termo "fragmento funcional", como utilizado no termo "fragmento funcional da proteína GCC" designa fragmentos de proteína GCG que funcionam do mesmo modo que a proteína GCG com sequências de comprimento total. Por exemplo, um fragmento imunogenicamente funcional de uma proteína GCG compreende um epitopo reconhecido por um anticorpo anti-GCC. Um fragmento funcional de ligação ao ligando de GCC compreende 6 ΡΕ1272665 uma sequência que forma uma estrutura que se pode ligar a um ligando que reconhece e se liga à proteína GCC.
Como aqui utilizado, o termo "epitopo reconhecido por um anticorpo anti-proteína GCC" refere-se aos epitopos especificamente reconhecidos por um anticorpo anti-proteína GCC.
Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" pretende designar anticorpos completos, intactos, e seus fragmentos Fab e fragmentos F (ab)2· Anticorpos completos, intactos incluem anticorpos monoclonais, tais como anticorpos monoclonais de murino, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados.
Como aqui utilizado, o termo "ligando de GCC" pretende referir-se a compostos que se ligam especifi-camente a uma proteína GCC. Os anticorpos que se ligam a GCC são ligandos de GCC. Um ligando de GCC pode ser uma proteína, péptido ou um não péptido.
Como aqui utilizado, o termo "agente activo" pretende referir-se a compostos que são agentes terapêuticos ou agentes de processamento de imagem.
Como aqui utilizado, 0 termo "radioestável" pretende referir-se aos compostos que não sofrem degradação radioactiva; i.e., compostos que não são radioactivos. 7 ΡΕ1272665
Como aqui utilizado, o termo "agente terapêutico" pretende referir-se a quimioterapêuticos, toxinas, radio-terapêuticos, agentes de direccionamento ou agentes de radiossensibilização.
Como aqui utilizado, o termo "quimioterapêutico" pretende referir-se a compostos que, quando colocados em contacto com e/ou incorporados numa célula, produzem um efeito na célula que inclui provocar a morte celular, inibindo a divisão celular ou induzindo diferenciação.
Como aqui utilizado, o termo "toxina" pretende referir-se a compostos que, quando colocados em contacto com e/ou incorporados numa célula, provocam a morte da célula.
Como aqui utilizado, o termo "radioterapêutico" pretende referir-se a radionuclidos que, quando colocados em contacto com e/ou incorporados numa célula, provocam a morte da célula.
Como aqui utilizado, o termo "agente de direccionamento" pretende referir-se a compostos que podem estar ligados por, e ou reagirem com, outros compostos. Os agentes de direccionamento podem ser utilizados para distribuir quimioterapêuticos, toxinas, enzimas, radioterapêu-ticos, anticorpos ou agentes de processamento de imagem às células que possuem agentes de direccionamento associados com eles, e/ou converter ou de outra forma transformar ou 8 ΡΕ1272665 aumentar agentes activos co-administrado. Um agente de direccionamento pode incluir uma unidade que consiste num primeiro agente que é localizado na célula que, quando colocado em contacto com um segundo agente que é convertido num terceiro agente que possui uma actividade desejada ou provoca a conversação do segundo agente num agente com actividade desejada. 0 resultado é que o agente localizado facilita a exposição de um agente com uma actividade desejada à célula cancerosa.
Como aqui utilizado, o termo "agente de radios-sensibilização" pretende referir-se a agentes que aumentam a susceptibilidade das células aos efeitos lesivos da radiação ionizante. Um agente de radiossensibilização permite que sejam administradas doses menores de radiação e ainda assim proporciona uma dose terapeuticamente eficaz.
Como aqui utilizado, o termo "agente de processamento de imagem" pretende referir-se a compostos que podem ser detectados.
Como aqui utilizado, o termo "unidade de ligação a GCC" pretende referir-se à porção de um composto conjugado que constitui um ligando GCC.
Como aqui utilizado, o termo "unidade activa" pretende referir-se à porção de um composto conjugado que constitui um agente activo. 9 ΡΕ1272665
Como aqui utilizados, os termos "composto conjugado" e "composição conjugada" são utilizados indistintamente e pretendem referir-se a um composto que compreende uma unidade de ligação a GCC e uma unidade activa e que é capaz de ligação a GCC. Os compostos conjugados de acordo com a presente invenção compreende uma porção que constitui um ligando de GCC e uma porção que constitui um agente activo. Assim, os compostos conjugados de acordo com a presente invenção são capazes de se ligar especificamente a GCC e incluem uma porção que é um agente terapêutico ou agente de processamento de imagem. As composições conjugadas podem compreender agentes de ligação reticuladas e/ou moléculas que servem como espaçadores entre as unidades.
Como aqui utilizado, os termos "ligante reticulado", "agente de ligação reticulada", "agente de conjugação", "agente de acoplamento", "reagente de condensação" e "agente de ligação reticulada bifuncional" são utilizados indistintamente e pretendem referir-se a grupos moleculares que são utilizados para se ligarem ao ligando de GCC e o agente activo formando deste modo o composto conjugado.
Como aqui utilizado, o termo "cancro colorrectal" pretende incluir a definição médica bem aceite que define o cancro colorrectal como um estado médico caracterizado por cancro de células do tracto intestinal abaixo do intestino delgado (i.e., o intestino grosso (cólon), incluindo o cego, cólon ascendente, cólon transversal, cólon descendente, e cólon sigmóide, e recto). Adicionalmente, como 10 ΡΕ1272665 aqui utilizado, o termo "cancro colorrectal" pretende ainda incluir estados médicos que são caracterizados por cancro de células do duodeno e intestino delgado (jejuno e ilio). A definição de cancro colorrectal aqui utilizada é mais abrangente do que a definição médica comum mas é apresentada como tal, uma vez que as células do duodeno e intestino delgado também contêm GCC.
Como aqui utilizado, o termo "cancro do estômago" pretende incluir a definição médica bem aceite que define o cancro do estômago como um estado médico caracterizado por cancro de células do estômago.
Como aqui utilizado, o termo "cancro do esófago" pretende incluir a definição médica bem aceite que define cancro do esófago como um estado médico caracterizado por cancro de células do esófago.
Como aqui utilizado, o termo "metástase" pretende referir-se ao processo através do qual as células de cancro com origem num órgão ou parte do corpo são realojadas noutra parte do corpo e continuam a replicar. As células metastizadas formam subsequentemente tumores que podem posteriormente metastizar. A metástase refere-se assim à disseminação do cancro de uma parte do corpo onde ocorreu originalmente para outras partes do corpo.
Como aqui utilizado, o termo "células de cancro colorrectal metastizadas" pretende referir-se a células de 11 ΡΕ1272665 cancro colorrectal que metastizaram. Células de cancro colorrectal cancerosas metastizadas localizadas numa parte do corpo diferentes do duodeno, intestino delgado (jejuno e ilio), intestino grosso (cólon), incluindo o cego, cólon ascendente, cólon transversal, cólon descendente, e cólon sigmóide, e recto.
Como aqui utilizado, o termo "células de cancro do estômago metastizadas" pretende referir-se a células de cancro do estômago que metastizaram. As células do cancro do estômago metastizadas localizadas numa parte do corpo diferente do estômago.
Como aqui utilizado, o termo "células de cancro do esófago metastizadas" pretende referir-se a células de cancro colorrectal que metastizaram. As células do cancro do esófago metastizadas localizadas numa parte do corpo diferente do esófago.
Como aqui utilizado, os termos "amostra não colorrectal" e "amostra extra-intestinal" são utilizadas indistintamente e pretendem referir-se a uma amostra de tecido ou fluido corporal de uma fonte diferente do tecido colorrectal. Em algumas formas de realização preferidas, a amostra não colorrectal é uma amostra de tecido, tal como nódulos linfáticos. Em algumas formas de realização preferidas, a amostra não colorrectal é uma amostra de tecido extra-intestinal que é um adenocarcinoma de origem não confirmada. Em algumas formas de realização preferidas, a amostra não colorrectal é uma amostra de sangue. 12 ΡΕ1272665
Como aqui utilizado, "um indivíduo que sofre de um adenocarcinoma de oriqem não confirmada" pretende referir-se a um indivíduo que possui um tumor no qual a oriqem ainda não foi definitivamente identificada.
Como aqui utilizado, "um indivíduo é suspeito de ser susceptível a cancro do estômaqo ou esófaqo" pretende referir-se a um indivíduo que está num risco particular de desenvolver cancro do estômaqo ou esófaqo. Exemplos de indivíduos num risco particular de desenvolver cancro do estômago ou esófago são aqueles cuja história médica familiar indica incidência acima da média de cancro do estômago ou esófago entre membros da família e/ou aqueles que já desenvolveram cancro do estômago ou esófago e foram tratados eficazmente que por isso enfrentam um risco de recaída e recorrência.
Como aqui utilizado, os termos "composição anti-sentido" e "moléculas anti-sentido" são utilizados indistintamente e pretendem referir-se a compostos que regulam a transcrição ou tradução por hibridação com DNA ou RNA e inibindo e/ou prevenindo a transcrição ou tradução de ocorrer. As moléculas anti-sentido incluem moléculas de ácido nucleico e derivados e seus análogos. As moléculas anti-sentido hibridam com DNA ou RNA do mesmo modo que as sequências de nucleótidos complementares independentemente se a molécula anti-sentido é ou não uma molécula de ácido nucleico ou um derivado ou análogo. As moléculas anti- 13 ΡΕ1272665 sentido podem inibir ou prevenir a transcrição ou tradução de genes cuja expressão está ligada ao cancro.
Como aqui utilizado, o termo "imunogénio de GCC" pretende referir-se a proteína GCG ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende o mesmo ou um seu produto haptenizado, células e partículas que apresentam pelo menos um epitopo de GCC, e células haptenizadas e partículas haptenizadas que apresentam pelo menos um epitopo de GCC.
Como aqui utilizado, o termo "vector de expressão recombinante" pretende referir-se a um plasmídeo, fago, partícula virai ou outro vector que, quando introduzido num hospedeiro apropriado, contém os elementos genéticos necessários para dirigir a expressão da sequência codi-ficante que codifica a proteína. A sequência codificante está ligada operacionalmente às sequências reguladoras necessárias. Os vectores de expressão são bem conhecidos e estão prontamente disponíveis. Exemplos de vectores de expressão incluem plasmídeos, fagos, vectores virais e outras moléculas de ácido nucleico ou molécula de ácido nucleico contendo veículos úteis para transformar células hospedeiras e facilitar a expressão das sequências codi-ficantes.
Como aqui utilizado, o termo "transcrição ilegítima" pretende referir-se ao baixo nível ou expressão de fundo de genes específicos do tecido em células de outros tecidos. 0 fenómeno de transcrição ilegítima proporciona 14 ΡΕ1272665 assim 6 cópias de mRNA para um transcrito especifico para o tecido em outros tecidos. Se as técnicas de detecção utilizadas para detectar a expressão genética forem suficientemente sensíveis para detectar transcrição ilegítima, o nível de expressão do transcrito em amostras negativas devido à transcrição ilegítima deve ser descontada utilizando controlos e/ou ensaios quantitativos e/ou outros meios para eliminar a incidência de falsos positivos devidos à transcrição ilegítima. Alternativamente, a detecção de evidência de expressão do gene GCC na amostra é alcançada sem detectar o transcrito do gene GCG presente devido à transcrição ilegítima. Isto é alcançado utilizando técnicas que não são suficientemente sensíveis para detectar o transcrito do gene GCG presente devido à transcrição ilegítima que está presente como fundo. A Patente U.S. Número 5 518 888, emitida a 21 de Maio de 1996, Patente U.S. Número 5 601 990 emitida a 11 de Fevereiro de 1997, Patente U.S. Número 6 060 037 emitida a 26 de Abril de 2000, Patente U.S. Número 5 962 220 emitida a 5 de Outubro de 1999, Patente U.S. Número 5 879 656 emitida a 9 de Março de 1999, e Pedido de Patente U.S. Número de Série 09/180 237 emitido a 12 de Março de 1997, estão relacionados com o direccionamento de receptores ST para tratar, processar imagem, detectar e vacinar contra cancro colorrectal metastizado. Foi agora descoberto que as células de cancro de estômago e esófago primário e metas-tático expressam receptores ST (GCC). Consequentemente, as composições e métodos descritos nas patentes e pedido acima 15 ΡΕ1272665 listados podem ser utilizados para tratar, processar imagem, detectar e vacinar contra cancro primário e metas-tático do estômago e esófago. A presente invenção adapta a invenção anterior como relacionada com cancro colorrectal metastizado para tratar, processar imagem, detectar e vacinar contra cancro primário e metastático do estômago e esófago.
GCC
Os carcinomas derivados das células colorrectais, estômago ou esófago expressam GCC. A expressão de GCC por esses tumores permite que esta proteína e o seu mRNA sejam um biomarcador específico para a presença de células de cancro em tecidos extraintestinais e no sangue. Na verdade, esta característica permite que a detecção de RNA de GCC por análise de RT-PCR seja um teste de diagnóstico para o estádio de doentes com cancro colorrectal, estômago ou esófago e acompanhar os doentes após cirurgia para a evidência de doença recorrente no seu sangue, assim como para detectar cancros colorrectal, do estômago e esófago. Para além disso, a GCC pode ser marcada como alvo com um ligando conjugados com um agente activo de modo a distribuir o agente activo a células tumorais in vivo. WO 95/11694 revela que os tumores colorrectais metastizados podem ser marcados como alvos para a distribuição de compostos activos através da marcação de receptores ST (também referidos como guanilina ciclase C ou 16 ΡΕ1272665 GCC). A presença de receptores ST em células fora do tracto intestinal como um marcador para cancro colorrectal permite o rastreio, identificação e tratamento de indivíduos com tumores colorrectais metastizados. Os receptores ST podem também ser utilizados para direccionar a distribuição de compostos de terapia génica e de anti-sentido às células colorrectais. WO 97/42506 revela que a detecção da evidência de expressão de receptores ST em amostras de tecido e fluido corporal a partir do exterior do tracto intestinal indica cancro colorrectal metastizado. WO 97/42220 revela que imunogénios com epitopos que podem ser marcados como alvos por anticorpos que reagem com receptores ST podem ser utilizados em composições de vacinas úteis como composições profilácticas e terapêuticas anti-metastáticas de cancro colorrectal.
Foi descoberto que, adicionalmente às células do cólon normais, ao cólon primário e metastizado, as células de carcinoma do estômago e esófago também expressam GCC. Células de estômago e esófago normais não expressam GCC. Assim, a presente invenção proporciona a utilização de GCC como um marcador de diagnóstico molecular específico para o diagnóstico, avaliação do estádio, e vigilância pós-operatória de doentes com cancro do esófago e estômago primário e metastizado. 17 ΡΕ1272665 A detecção da expressão de GCC empregando técnicas moleculares, incluindo, mas não limitado a, RT-PCR, pode ser empregue para diagnosticar e avaliar o estádio dos doentes, monitorizar o desenvolvimento de recorrência após cirurgia e/ou remissão, e, potencialmente, rastrear pessoas normais em relação ao desenvolvimento de cancro colorrectal, do estômago ou do esófago. GCC é única, no sentido em que é apenas expressa em células intestinais normais. As células da mucosa que forram o intestino são unidas conjuntamente através de junções apertadas que formam uma barreira contra a passagem de conteúdos intestinais para a corrente sanguínea e componentes da corrente sanguínea para o lúmen intestinal. Por isso, a localização apical de células que expressam GCC resulta no isolamento dessas células a partir do sistema circulatório, de modo a que possam ser consideradas como existindo separadamente do resto do corpo; essencialmente a "parte de fora" do corpo. Por isso, o resto do corpo é considerado o "exterior" do tracto intestinal. Composições administradas "exteriormente" ao tracto intestinal são mantidas separadas e segregadas das únicas células que expressam GCC normalmente. Contrariamente, as amostras de tecido retiradas de tecido exterior ao tracto intestinal normalmente não contêm células que expressam GCC.
Em indivíduos que sofrem de cancro colorrectal, as células de cancro são frequentemente derivadas de células que produzem e apresentam a GCC e essas células de 18 ΡΕ1272665 cancro continuam a produzir GCC. Observou-se que GCC é expressa por células de cancro colorrectal. De igual modo, a GCC é expressa por células de cancro de estômago e esófago. A expressão de GCC por células tumorais colorrectais proporciona um alvo detectável para rastreio in vitro, monitorização e avaliação do estádio, assim como um alvo para a distribuição in vivo de composições conjugadas que compreendem agentes activos para o processamento de imagem e tratamento. A GCC pode também servir como alvo para vacinas que podem ser utilizados para proteger contra cancro colorrectal metastizado ou para tratar indivíduos com cancro colorrectal metastizado. A expressão de GCC por células de estômago e esófago tumorais proporciona um alvo detectável para o rastreio in vitro, monitorização e avaliação do estádio, assim como um alvo para a distribuição in vivo de composições conjugadas que compreendem agentes activos para processamento de imagem e tratamento. A GCC pode também servir como alvo para vacinas que podem ser utilizadas para proteger contra cancro primário e metastático do estômago e esófago ou para tratar indivíduos com cancro primário e metastático do estômago e esófago.
Diagnóstico In vitro
De acordo com algumas formas de realizaçao da 19 ΡΕ1272665 invenção, são proporcionadas composições, estojos ("kits") e métodos in vitro para o rastreio, diagnóstico e análise de doentes e amostras de doentes para detectar evidência de expressão de GCC por células exteriores ao tracto intestinal, em que a expressão de GCC pode ser sugestiva de cancro colorrectal metastizado ou cancro do estômago ou esófago primário ou metastático. Em doentes suspeitos de possuírem cancro do estômago ou esófago primário ou metastático, a evidência de expressão de GCC por células exteriores ao tracto intestinal é indicadora de cancro do estômago ou esófago primário ou metastático e pode ser utilizada no diagnóstico, monitorização e avaliação do estádio desses doentes. Para além disso, a presente invenção refere-se a métodos, composições e estojos ("kits") úteis no rastreio in vitro, e na análise de doentes e amostras de doentes para detectar evidência da expressão de GCC por células tumorais exteriores ao tracto intestinal em que a presença de células que expressam GCC sugere ou confirma que um tumor é de origem no cancro colorrectal ou do estômago ou esófago. Num aspecto adicional da invenção, são proporcionadas composições, estojos ("kits") e métodos que são úteis para visualizar células de cancro do estômago ou esófago primário ou metastático.
As composições, métodos e estojos ("kits") de rastreio e diagnóstico in vitro podem ser utilizados na monitorização de indivíduos que estão em grupos de risco elevado para cancro do estômago ou esófago, tais como aqueles a quem foi diagnosticada doença localizada e/ou 20 ΡΕ1272665 doença metastizada e/ou aqueles que estão geneticamente ligados à doença. Podem ser utilizadas composições, métodos e estojos ("kits") de rastreio e diagnóstico in vitro na monitorização de indivíduos que estão a sofrer e/ou foram tratados para cancro do estômago ou esófago primário, para determinar se o cancro metastizou. Podem ser utilizadas composições, métodos e estojos ("kits") de rastreio e diagnóstico in vitro na monitorização de indivíduos que estão a sofrer e/ou foram tratados para cancro do estômago ou esófago para determinar se o cancro foi eliminado. Podem ser utilizadas composições, métodos e estojos ("kits") de rastreio e diagnóstico in vitro na monitorização de indivíduos que são por outra razão susceptíveis, i.e., indivíduos que foram identificados como geneticamente predispostos, tal como por rastreio genético e/ou histórias familiares. Os avanços no conhecimento da genética e os desenvolvimentos na tecnologia, assim como a epidemiologia permitiram a determinação da probabilidade e avaliação de risco de um indivíduo para desenvolver cancro de estômago ou esófago. Utilizando histórias de saúde familiar e/ou rastreio genético, é possível estimar a probabilidade que um indivíduo em particular tem para desenvolver certos tipos de cancro incluindo cancro do estômago ou esófago. Aqueles indivíduos que foram identificados como estando predispostos a desenvolver uma forma particular de cancro podem ser monitorizados ou rastreados para detectar evidência de cancro de estômago ou esófago. Após a descoberta dessa evidência, pode ser realizado tratamento precoce para combater a doença. Consequentemente, 21 ΡΕ1272665 indivíduos que estão em risco de desenvolver cancro de estômago ou esófago podem ser identificados e podem ser isoladas amostras a partir desses indivíduos. A invenção é particularmente útil para monitorizar indivíduos que foram identificados como possuindo antecedentes familiares médicos que incluem familiares que sofreram de cancro de estômago ou esófago. De igual modo, a invenção é particularmente útil para monitorizar indivíduos que foram diagnosticados como possuindo cancro de estômago ou esófago e, particularmente aqueles que foram tratados e tiveram os tumores removidos e/ou estão a passar por outra forma de remissão incluindo aqueles que foram tratados para cancro de estômago ou esófago.
Podem ser utilizadas composições, métodos e estojos ("kits") de rastreio e diagnóstico in vitro na análise de tumores. A expressão de GCC é um marcador para o tipo de célula e sugere a origem de adenocarcinoma de origem não confirmada suspeita de ser gástrica ou do esófago na sua origem, possa ser de tumores de estômago ou esófago. A detecção da expressão de GCC pode também ser utilizada para auxiliar no diagnóstico inicial de cancro de estômago ou esófago ou para confirmar esse diagnóstico. Tumores que se suspeita serem originários no estômago ou esófago podem ser confirmados como tal, utilizando as composições, métodos e estojos ("kits") da invenção.
Podem ser utilizadas composições, métodos e estojos ("kits") de rastreio e diagnóstico da invenção in 22 ΡΕ1272665 vitro para analisar amostras de tecido do estômago ou esófago para identificar cancro primário do estômago ou esófago.
De acordo com a invenção, são proporcionados compostos que se ligam ao transcrito do gene GCG ou proteína. 0 tecido normal no corpo não possui transcrito de GCC ou proteína excepto as células do tracto intestinal. A expressão de GCC é um marcador para o tipo celular e é útil na identificação de cancro de estômago ou esófago em amostras extra-intestinais.
Em algumas formas de realização da invenção, as amostras de tecido e fluido não colorrectal ou amostras de tumor podem ser rastreadas para identificar a presença ou ausência da proteína GCC. Técnicas tais como ensaios de ELISA e transferências de Western podem ser realizadas para determinar se GCC está presente numa amostra.
Em algumas formas de realização da invenção, amostras de tecido e fluido não colorrectal ou amostras de tumor podem ser rastreadas para identificar se os GCC estão a ser expressos em células exteriores ao tracto colorrectal através da detecção da presença ou ausência de transcrito do gene GCG. A presença de transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir daí pode ser determinada utilizando técnicas tais como amplificação por PCR, tecnologia de oligonucleótido ramificado, Transferências de Northern (mRNA), Transferências de Southern (cDNA), ou hibridação de oligonucleótidos. 23 ΡΕ1272665
Em algumas formas de realização da invenção, células de amostras de tecido não colorrectal ou amostras de tumor podem ser examinadas para identificar a presença ou ausência de proteínas GCC. Técnicas tais como transferências de imuno-histoquímica podem ser realizadas em secções de tecido para determinar se estão presentes GCC numa amostra.
Em algumas formas de realização da invenção, as células de amostras de tecido não colorrectal ou amostras de tumor podem ser examinadas para determinar se os GCC estão a ser expressos em células exteriores ao tracto colorrectal detectando a presença ou ausência do transcrito do gene GCG. A presença do transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste em células de secções de tecido podem ser determinadas utilizando técnicas tais como hibridação in situ. A presença de GCC em amostras de tecido e fluido não colorrectal ou em células de amostras de tecido não colorrectal sugere um possível cancro de estômago ou esófago. A presença de GCC numa amostra tumoral ou em células tumorais sugere que o tumor possa ter origem no estômago ou esófago. A presença do transcrito do gene GCG em amostras de tecido e fluido não colorrectal ou em células de amostras de tecido não colorrectal sugere possível cancro de estômago ou esófago. A presença do transcrito do gene GCG em amostras tumorais e células - 24 - ΡΕ1272665 tumorais sugere que o tumor possa ter origem no estômago ou esófago.
As amostras podem ser obtidas a partir de tecido seccionado ou material de biopsia incluindo biopsia por agulha. A preparação da secção de tecido para patologia cirúrgica pode ser congelada e preparada utilizando técnicas convencionais. Os ensaios de imuno-histoquímica e de hibridação in situ em cortes de tecido são realizados em células fixadas. As amostras extra-intestinais podem ser homogeneizadas através de técnicas convencionais, tais como sonicação, rebentamento mecânico ou lise química, tal como lise com detergente. Está também contemplado que as amostras tumorais em fluidos corporais, tais como amostras de sangue, urina, fluido linfático, fluido cerebrospinal, líquido amniótico, fluido vaginal, sémen e fezes podem também ser rastreados para determinar se esses tumores são colorrectais, de estômago ou esófago na sua origem.
Podem ser obtidas amostras de tecido não colorrectal a partir de qualquer tecido excepto aqueles do tracto colorrectal, i.e., o tracto intestinal abaixo do intestino delgado (i.e., o intestino grosso (cólon), incluindo o cego, cólon ascendente, cólon transversal, cólon descendente, e cólon sigmóide, e recto) e adicional- mente o duodeno e intestino delgado (jejuno e íleo). As células normais de todos os tecidos excepto aquelas do tracto colorrectal nao expressam GCC. Assim, se a proteína GCG ou o transcrito do gene GCG são detectados em amostras 25 ΡΕ1272665 não colorrectais, a possível presença de células de cancro colorrectal, do estômago ou esófago é sugerida. Em algumas formas de realização preferidas, as amostras de tecido são nódulos linfáticos.
As amostras de tecido podem ser obtidas através de técnicas cirúrgicas convencionais incluindo a utilização de agulhas de biopsia. Um especialista na técnica aperceber-se-á rapidamente da variedade de amostras de teste que podem ser examinadas para GCC e reconhecerá métodos para obter as amostras de tecido.
As amostras de tecido podem ser homogeneizadas ou de outra forma preparadas para rastreio para a presença de GCC através de técnicas bem conhecidas, tais como soni-cação, rebentamento mecânico, lise química tal como lise com detergente, ou combinações destas.
Exemplos de amostras de fluido corporal incluem sangue, urina, fluido linfático, fluido cerebrospinal, líquido amniótico, fluido vaginal e sémen. Em algumas formas de realização preferidas, é utilizado sangue como uma amostra de fluido corporal. As células podem ser isoladas a partir da amostra de fluido, tal como por centrifugação. Um especialista na técnica reconheceria certamente a variedade de amostras de teste que podem ser examinadas para GCC. As amostras de teste podem ser obtidas por métodos tais como retirar o fluido com uma seringa ou através de uma zaragatoa. Um especialista na técnica 26 ΡΕ1272665 reconheceria rapidamente outros métodos de obter as amostras de teste.
Num ensaio utilizando uma amostra de sangue, o plasma sanguíneo pode ser separado das células sanguíneas. 0 plasma sanguíneo pode ser rastreado para GCC incluindo proteínas truncadas gue são libertadas para o sangue guando um ou mais GCC são clivado a partir de ou desprendidos de células tumorais. Em algumas formas de realização, as fracções de células do sangue são rastreadas guanto à presença de células tumorais do estômago ou do esófago. Em algumas formas de realização, os linfócitos presentes na fracção de células do sangue são rastreados lisando as células e detectando a presença da proteína GCG ou do transcrito do gene GCG que pode estar presente como um resultado da presença de quaisquer células tumorais do estômago ou do esófago que podem ter sido integradas pela células sanguínea. Em algumas formas de realização preferidas, as células CD34+ são removidas antes do isolamento de mRNA das amostras que utilizam imuno-colunas comercialmente disponíveis.
Aspectos da presente invenção incluem vários métodos de determinação se uma amostra contém células que expressam GCC por análise molecular à base da sequência de nucleótidos para detectar o transcrito do gene GCG. Estão disponíveis vários métodos diferentes para o fazer, incluindo aqueles que utilizam a tecnologia da Reacção da Polimerase em Cadeia (PCR), tecnologia de oligonucleótido 27 ΡΕ1272665 ramificada, tecnologia de transferência de Northern, tecnologia da hibridação por oligonucleótidos, e tecnologia de hibridação in situ. A invenção refere-se a sondas de oligonucleótidos e iniciadores utilizados nos métodos de identificação do transcrito do gene GCG e para estojos ("kits") de diagnóstico que compreendem esses componentes.
Os métodos baseados em sequências de mRNA para detectar o transcrito do gene GCG incluem, mas não estão limitados a tecnologia da reacção em cadeia pela polime-rase, tecnologia do oligonucleótido ramificado, tecnologia de transferência de Northern e Southern, tecnologia de hibridação in situ e tecnologia de hibridação de oligonucleótidos.
Os métodos aqui descritos pretendem exemplificar como é que a presente invenção pode ser posta em prática não pretendem limitar o âmbito da invenção. Está contemplado que outra metodologia à base de sequências para detectar a presença do transcrito do gene GCG em amostras não colorrectais podem ser empregues de acordo com a invenção.
Um método preferido para detectar o transcrito do gene GCG em material genético derivado de amostras não colorrectais, utiliza a tecnologia da reacção em cadeia pela polimerase (PCR). A tecnologia da PCR é praticada por rotina por aqueles que são que têm uma experiência de 28 ΡΕ1272665 rotina na técnica e as suas utilizações em diagnóstico são bem conhecidas e aceites. Métodos para a prática da tecnologia de PCR são revelados em "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis, M.A., et al. Eds. Academic Press, Inc. San Diego, CA (1990). Aplicações da tecnologia de PCR são revelados em "Polimerase chain Reaction" Erlich, H.A., et al., Eds. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Patente U.S. Número 4 683 202, Patente U.S. Número 4 683 195, Patente U.S. Número 4 965 188 e Patente U.S. Número 5 075 216, descrevem métodos de realizar PCR. A PCR pode ser realizada por rotina utilizando o Perkin Elmer Cetus GENE AMP RNA PCR estojo ("kit"), Part N°. N808-0017. A tecnologia de PCR permite a criação rápida de múltiplas cópias de sequências de DNA proporcionando iniciadores 5' e 3' que hibridam com as sequências presentes numa molécula de RNA ou DNA, e proporcionam ainda nucleótidos livres e uma enzima que preenche as bases complementares na sequência de nucleótidos entre os iniciadores com os nucleótidos livres para produzir uma cadeia de DNA complementar. A enzima irá preencher as sequências complementares adjacentes aos iniciadores. Se ambos os iniciadores 5' e 3' hibridam com sequências de nucleótidos no mesmo fragmento pequeno de ácido nucleico, resulta a amplificação exponencial de um produto de tamanho especifico de cadeia dupla. Se apenas hibridar um único iniciador com o fragmento de ácido nucleico, a amplificação linear produz produtos de cadeia simples de tamanho variável. 29 ΡΕ1272665
Os iniciadores de PCR podem ser concebidos de rotina por técnicos com experiência de rotina na técnica, utilizando a informação das sequências. A sequência de nucleótidos do transcrito do gene GCG é apresentada na SEQ ID N° : 1. Para realizar este método, o RNA é extraído das células numa amostra e testado ou utilizado para produzir cDNA utilizando métodos bem conhecidos e materiais de partida já disponíveis. Aqueles que têm uma experiência de rotina na técnica podem preparar rapidamente iniciadores de PCR. Um conjunto de iniciadores contém geralmente dois iniciadores. Quando se realiza a PCR em mRNA extraído ou cDNA gerado a partir deste, se o transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste está presente, serão produzidas cópias múltiplas do mRNA ou cDNA. Se não está presente, a PCR não produzirá um produto discreto detectável. Os iniciadores têm geralmente 8-50 nucleótidos, preferencialmente cerca de 15-35 nucleótidos, mais preferencialmente 18-28 nucleótidos, que são idênticos ou complementares a, e por isso hibridam, com o transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste. Em formas de realização preferidas, os iniciadores têm cada um 15-35 nucleótidos, mais preferencialmente fragmentos de 18-28 nucleótidos de SEQ ID N°: 1. 0 iniciador deve hibridar com a sequência a ser amplificada. Os iniciadores típicos têm 18-28 nucleótidos de comprimento e possuem geralmente uma composição de 50% a 60% de G+C. O iniciador inteiro é preferencialmente complementar à sequência com a qual deve hibridar. Preferencialmente, os iniciadores criam produtos de PCR de 100 pares de 30 ΡΕ1272665 bases até 2000 pares de bases. Todavia, é possível criar produtos de 50 até 10 kb e mais. Se for utilizado mRNA como um molde, os iniciadores devem hibridar com sequências de mRNA. Se for utilizado cDNA como um molde, os iniciadores devem hibridar com sequências de cDNA. O mRNA ou cDNA é combinado com os iniciadores, nucleótidos livres e a enzima seguindo protocolos de PCR convencionais. A mistura sofre uma série de alterações de temperatura. Se o transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste estiver presente, isto é, se ambos os iniciadores hibridarem com sequências na mesma molécula, a molécula que compreende os iniciadores e as sequências complementares intervenientes serão amplificadas exponencialmente. 0 DNA amplificado pode ser facilmente detectado por uma variedade de meios bem conhecidos. Se não estiver presente nenhum transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste, nenhum produto de PCR será amplificado exponencialmente. A tecnologia de PCR proporciona por isso um método extremamente fácil, directo e fiável de detecção do transcrito do gene GCG numa amostra.
O produto de PCR pode ser detectado através de vários meios bem conhecidos. O método preferido para detectar a presença de DNA amplificado é separar o material da reacção de PCR através de electroforese em gel e corar o gel com brometo de etídio de modo a visualizar o DNA amplificado, se estiver presente. Um marcador padrão de tamanhos com o tamanho esperado do DNA amplificado é preferencialmente separado no gel como um controlo. 31 ΡΕ1272665
Em alguns casos, tal como quando quantidades invulgarmente pequenas de RNA são recuperadas e apenas pequenas quantidades de cDNA são criada a partir deste, é desejável ou necessário realizar uma reacção de PCR no primeiro produto de reacção de PCR. Isto é, é difícil detectar que quantidades de DNA amplificado são produzidas pela primeira reacção, pode ser realizada uma segunda PCR para produzir múltiplas cópias de sequências de DNA do primeiro DNA amplificado. É utilizado um conjunto de iniciadores internos na segunda reacção de PCR. 0 conjunto de iniciadores interno híbrida com sequências a jusante do iniciador 5' e a montante do iniciador 3' utilizado na primeira reacção. A presente invenção inclui oligonucleótidos que são úteis como iniciadores para realizar métodos de PCR para amplificar o transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste.
De acordo com a invenção, podem ser montados estojos ("kits") de diagnóstico que são úteis para realizar métodos de detecção da presença do transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste em amostras não colorrectais. Esses estojos ("kits") de diagnóstico compreendem oligonucleótidos que são úteis como iniciadores para realizar métodos de PCR. É preferido que os estojos ("kits") de diagnóstico de acordo com a presente invenção compreendam um recipiente compreendendo um marcador de tamanho para ser 32 ΡΕ1272665 corrido como um padrão num gel utilizado para detectar a presença de DNA amplificado. 0 marcador de tamanho é o mesmo tamanho que o DNA criado pelos iniciadores na presença do transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste. Componentes adicionais em alguns estojos ("kits") incluem instruções para realizar o ensaio. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender opcionalmente representações ou fotografias que representam o surgimento de resultados positivos e negativos. Também podem ser proporcionados controlos positivos e negativos.
Os ensaios de PCR são úteis para detectar o transcrito do gene GCG em amostras de tecido homogeneizado e células em amostras de fluido corporal. Está contemplado que a PCR na porção de plasma de uma amostra de fluido pode ser utilizada para detectar o transcrito do gene GCG.
Outro método de determinar se uma amostra contém células que expressam GCC é por análise de hibridação de oligonucleótidos de cadeia ramificada de mRNA extraído de uma amostra. A hibridação de oligonucleótido ramificado pode ser realizada como descrito na Patente U.S. Número 5 597 909, Patente U.S. Número 5 437 977 e Patente U.S. Número 5 430 138. Os reagentes podem ser concebidos seguindo os ensinamentos dessas patentes e a sequência do transcrito do gene GCG.
Outro método de determinar se uma amostra contém células que expressam GCC é por análise de Transferência de 33 ΡΕ1272665
Northern de mRNA extraído de uma amostra não colorrectal. As técnicas para realizar análises de transferência de Northern são bem conhecidas daqueles que têm experiência de rotina na técnica e são descritas em Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Cold Sprinq Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. A extracção de mRNA, separação electroforética do mRNA, transferência, preparação da sonda e hibridação são todas técnicas bem conhecidas que podem ser realizadas de rotina utilizando material de partida prontamente disponível. 0 mRNA é extraído utilizando colunas poli dT e o material é separado por electroforese e, por exemplo, transferido para papel de nitrocelulose. As sondas marcadas produzidas a partir de um fragmento específico isolado ou fragmentos, podem ser utilizados para visualizar a presença de um fragmento complementar fixado ao papel. Sondas úteis para identificar mRNA numa Transferência de Northern possuem uma sequência de nucleótidos que é complementar ao transcrito do gene GCG. Aqueles que possuem experiência de rotina na técnica podem utilizar a informação da sequência em SEQ ID N°:l para conceber essas sondas ou para isolar e clonar o transcrito do gene GCG ou cDNA criado a partir deste para ser utilizado como uma sonda. Essas sondas têm fragmentos de pelo menos 15 nucleótidos, preferencialmente 30-200, mais preferencialmente 40-100 nucleótidos e podem ser o transcrito inteiro do gene GCG.
De acordo com a invenção, podem ser montados 34 ΡΕ1272665 estojos ("kits") de diagnóstico que são úteis para praticar métodos de detectar a presença do transcrito do gene GCG em amostras não colorrectais por análise de transferência de Northern. Esses estojos ("kits") de diagnóstico compreendem oligonucleótidos que são úteis como sondas para hibridar com o mRNA. As sondas podem ser marcadas radioactivamente. É preferido que os estojos ("kits") de diagnóstico de acordo com a presente invenção compreendem um recipiente que compreende um marcador de tamanho para ser corrido como um padrão num gel. É preferido que os estojos ("kits") de diagnóstico de acordo com a presente invenção compreendam um recipiente que contenha um controlo positivo que irá hibridar com a sonda. Componentes adicionais em alguns estojos ("kits") incluem instruções para realizar o ensaio. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender opcionalmente representações ou fotografias que representam o surgimento de resultados positivos e negativos. A análise de transferência de Northern é útil para detectar o transcrito do gene GCG em amostras de tecido homogeneizadas e células em amostras de fluido corporal. Está contemplado que a PCR na porção de plasma de uma amostra de fluido possa ser utilizada para detectar o transcrito do gene GCG.
Outro método de detectar a presença do transcrito do gene GCG pela tecnologia de hibridação de oligonucleótidos. A tecnologia de hibridação de oligonucleótidos é bem conhecida daqueles que possuem experiência de rotina na 35 ΡΕ1272665 técnica. Resumidamente, as sondas detectáveis que contêm uma sequência de nucleótidos especifica que irá hibridar com a sequência de nucleótidos do transcrito do gene GCG. 0 RNA ou cDNA produzido a partir do RNA de uma amostra está fixado, normalmente em papel de filtro ou semelhantes. As sondas são adicionadas e mantidas em condições que permitem hibridação apenas se as sondas complementarem totalmente o material genético fixado. As condições são suficientemente restringentes para remover por lavagem as sondas nas guais apenas uma porção da sonda hibride com o material fixado. A detecção da sonda no filtro lavado indica sequências complementares.
As sondas úteis em ensaios de oligonucleótidos têm pelo menos 18 nucleótidos de complementaridade de DNA e pode ser tão longas como uma sequência complementar completa do transcrito do gene GCG. Em algumas formas de realização preferidas, as sondas da invenção têm 30-200 nucleótidos, preferencialmente 40-100 nucleótidos.
Alguém que tenha experiência de rotina na técnica, utilizando a informação de sequência revelada na SEQ ID N°:l pode conceber sondas úteis na invenção. As condições de hibridação podem ser optimizadas de rotina para minimizar o sinal de fundo através de hibridação não totalmente complementar. Em algumas formas de realização preferidas, as sondas são clones de tamanho total. As sondas são fragmentos que têm pelo menos 15 nucleótidos, preferencialmente 30-200, mais preferencialmente 40-100 nucleótidos e podem ser o transcrito inteiro do gene GCG. 36 ΡΕ1272665 A presente invenção inclui oligonucleótidos marcados que são úteis como sondas para realizar a hibri-dação de oligonucleótidos. As sondas marcadas da presente invenção são marcadas com nucleótidos marcados radioactiva-mente ou são detectáveis de outra forma através de sistemas de detecção não radioactiva prontamente disponível.
De acordo com a invenção, podem ser montados estojos ("kits") de diagnóstico que são úteis para a prática de métodos de hibridação de oligonucleótidos da invenção. Esses estojos ("kits") de diagnóstico compreendem um oligonucleótido marcado que codifica porções do transcrito do gene GCG. É preferido que as sondas marcadas dos estojos ("kits") de diagnóstico de oligonucleótidos de acordo com a presente invenção sejam marcadas com um radio-nucleótido. Os estojos ("kits") de diagnóstico à base de hibridação de oligonucleótidos de acordo com a invenção compreendem preferencialmente amostras de DNA que representam controlos positivos e negativos. Uma amostra de DNA de controlo positivo é uma que compreende uma molécula de ácido nucleico que possui uma sequência de nucleótidos que é totalmente complementar às sondas do estojo ("kit") de modo a que as sondas vão hibridar com a molécula nas condições de ensaio. Uma amostra de DNA de controlo negativo é uma que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucleico, a sequência de nucleótidos da qual é parcialmente complementar com as sequências da sonda do estojo ("kit"). Nas condições de ensaio, a sonda não hibridará com a 37 ΡΕ1272665 amostra de DNA de controlo negativo. Componentes adicionais em alguns estojos ("kits") incluem instruções para realizar o ensaio. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender opcionalmente representações ou fotografias que representam o surgimento de resultados positivos e negativos.
As técnicas de hibridação de oligonucleótidos são úteis para detectar o transcrito do gene GCG em amostras de tecido homogeneizado e células em amostras de fluido corporal. Está contemplado que a PCR na porção do plasma de uma amostra de fluido pode ser utilizada para detectar o transcrito do gene GCG. A presente invenção refere-se a estojos ("kits") in vitro para avaliar amostras de tumores para determinar se têm ou não origem no estômago ou esófago e a reagentes e composições úteis para essa avaliação. Em algumas formas de realização da invenção, podem ser isoladas amostras de tumor de indivíduos que estão a submeter-se ou a recuperar de cirurgia para remover tumores no estômago ou esófago, tumores noutros órgãos ou material de biopsia. A amostra de tumor é analisada para identificar a presença ou ausência do transcrito do gene GCG. Técnicas, tais como ensaios de immuno-histoquimica, podem ser realizadas para determinar se estão presentes GCC nas células na amostra tumoral. A presença do mRNA que codifica a proteína GCG ou o cDNA criado a partir desta pode ser determinada utilizado técnicas tais como hibridação in situ, immuno-histoquimica e ensaio de ligação a ST in situ. 38 ΡΕ1272665 A tecnologia de hibridação in situ é bem conhecida daqueles com experiência de rotina na técnica. Resumidamente, as células são fixadas e as sondas detectáveis que contêm uma sequência de nucleótidos especificas são adicionadas às células fixadas. Se as células que contêm sequências de nucleótidos complementares, as sondas, que podem ser detectadas, irão hibridam com elas.
As sondas úteis em ensaios de oligonucleótidos têm pelo menos 18 nucleótidos de DNA complementar e podem ser tão longas como uma sequência completa complementar ao transcrito do gene GCG. Em algumas formas de realização preferidas as sondas da invenção têm 30-200 nucleótidos, preferencialmente 40-100 nucleótidos.
Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica, utilizando a informação da sequência apresentada em SEQ ID N°:l pode conceber sondas úteis na tecnologia de hibridação in situ para identificar células que expressam GCC. As sondas hibridam preferencialmente com uma sequência de nucleótidos que corresponde ao transcrito do gene GCG. As condições de hibridação podem ser optimizadas de rotina para minimizar o sinal de fundo através de hibridação não totalmente complementar. As sondas hibridam preferencialmente com o transcrito de tamanho total do gene GCG. As sondas têm fragmentos de pelo menos 15 nucleótidos, preferencialmente 30-200, mais preferencialmente 40-100 nucleótidos e podem ser o transcrito do gene GCG, mais preferen- 39 ΡΕ1272665 cialmente fragmentos de 18-28 nucleótidos do transcrito do gene GCG.
As sondas são totalmente complementares e não hibridam bem com seguências parcialmente complementares. Para hibridação in situ de acordo com a invenção, é preferido gue as sondas sejam detectáveis por fluorescência. Um processo comum é marcar a sonda com nucleótido modificado com biotina e depois detectar com avidina marcada com fluorescência. Assim, a sonda não tem ela própria que ser marcada com material florescente, mas pode ser subsequentemente detectadas com marcador fluorescente. A presente invenção inclui oligonucleótidos marcados que são úteis como sondas para realizar a hibridação de oligonucleótidos. Isto é, eles são totalmente complementares com sequências de mRNA mas não sequências genómicas. As sondas marcadas da presente invenção são marcadas com nucleótidos marcados radioactivamente ou são detectáveis de qualquer outro modo através de sistemas de detecção não radioactivos já disponíveis. A presente invenção refere-se a sondas úteis para hibridação in situ para identificar células que expressam GCC.
As células são fixadas e as sondas são adicionadas ao material genético. As sondas irão hibridar com as sequências de ácido nucleico complementares presentes na 40 ΡΕ1272665 amostra. Utilizando um microscópio de fluorescência, as sondas podem ser visualizadas através dos seus marcadores de fluorescência.
De acordo com a invenção, podem ser montados estojos ("kits") de diagnóstico que são úteis para realizar métodos de hibridação in situ da invenção, que são totalmente complementares com as sequências de mRNA mas não com as sequências genómicas. Por exemplo, a sequência de mRNA inclui diferentes sequências de exão. É preferido que sondas marcadas dos estojos ("kits") de diagnóstico in situ de acordo com a presente invenção sejam marcados com um marcador fluorescente.
Podem ser utilizadas técnicas de imuno-histo-quimica para identificar e essencialmente corar células com GCC. Essa "coloração" permite a análise de migração metas-tática. Anticorpos anti-GCC, tais como aqueles descritos acima de contacto com células fixadas e a GCC presente nas células reage com os anticorpos. Os anticorpos são marcados de forma detectável ou são detectados utilizando segundo anticorpo marcado ou proteína A para corar as células.
As técnicas aqui descritas para avaliar secções do tumor podem também ser utilizadas para analisar secções de tecido para amostras de nódulos linfáticos, assim como outros tecidos para identificar a presença de células que expressam GCC. As amostras podem ser preparadas e "coradas" para detectar a expressão de GCC. 41 ΡΕ1272665
Podem ser utilizados métodos de imunoensaio no diagnóstico de indivíduos que sofrem de cancro de estômago ou esófago através da detecção da presença de GCC numa amostra de tecido não colorrectal ou fluido corporal de um indivíduos suspeito de possuir ou sendo susceptível a cancro de estômago ou esófago utilizando anticorpos que foram produzidos em resposta à exposição dessa proteína GCC. Para além disso, podem ser utilizados métodos de imunoensaio para identificar indivíduos que sofrem de cancro de estômago ou esófago através da detecção da presença de GCC na amostra de tumor utilizando anticorpos que foram produzidos em resposta à exposição a essa proteína GCC.
Os anticorpos são preferencialmente anticorpos monoclonais. Os anticorpos são preferencialmente criados contra GCC produzida em células humanas. Os imunoensaios são bem conhecidos e a sua concepção pode ser realizada de rotina por aqueles com experiência de rotina na técnica. Aqueles que têm experiência de rotina na técnica podem produzir anticorpos monoclonais que se ligam especifica-mente a GCC e são úteis nos métodos e estojos ("kits") da invenção utilizando técnicas convencionais e materiais de partida já disponíveis.
As técnicas para produzir anticorpos monoclonais são apresentadas em Harlow, E. e D. Lane, (1988) ANTI-BODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 42 ΡΕ1272665
Cold Spring Harbor NY, que fornece instruções detalhadas para a produção de hibridomas e anticorpos monoclonais que se ligam especificamente às proteínas alvo. Está dentro do âmbito da presente invenção incluir Fabs, Fabs recombinan-tes, F(Ab)2S, F(Ab) 2s recombinantes que se ligam especifi-camente a produtos de tradução de GCC em vez de anticorpos.
Resumidamente, a proteína GCG é injectada em ratinhoos. 0 baço do ratinhoo é removido, as células do baço são isoladas e fundidas com células de ratinhoo imortalizadas. As células híbridas, ou hibridomas, são cultivadas e essas células que segregam anticorpos são seleccionadas. Os anticorpos são analisados e, se se verificar que se ligam especificamente a GCC, o hibridoma que as produz é cultivado para produzir um fornecimento contínuo de anticorpos específicos anti-GCC.
Os anticorpos são preferencialmente anticorpos monoclonais. Os anticorpos são preferencialmente criados contra GCC produzida em células humanas.
Os meios para detectar a presença de uma proteína numa amostra de teste são rotina e alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode detectar a presença ou ausência de uma proteína ou um anticorpo utilizando métodos bem conhecidos. Um método bem conhecido de detecção da presença de uma proteína é um imunoensaio. Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode prontamente entender a variedade de vias para realizar um imunoensaio para detectar a presença de uma proteína GCG numa amostra. 43 ΡΕ1272665
De acordo com algumas formas de realização, os imunoensaios compreendem permitir que as proteinas na amostra se liguem a um suporte de fase sólida, tal como uma superfície de plástico. São então adicionados anticorpos detectáveis que se ligam selectivamente á GCC. A detecção do anticorpo detectável indica a presença de GCC. 0 anticorpo detectável pode ser um anticorpo marcado ou não marcado. 0 anticorpo não marcado pode ser detectado utilizando um segundo anticorpo marcado que se liga especificamente ao primeiro anticorpo ou um segundo anticorpo não marcado que pode ser detectado utilizando proteína A marcada, uma proteína que complexa com anticorpos. São descritos vários processos de imunoensaio em Imunoassays for the 80's, A. Voller et al., Eds., University Park, 1981.
Podem ser realizados imunoensaios simples nos quais um suporte de fase sólida é colocado em contacto com a amostra de teste. Quaisquer proteínas presentes na amostra de teste ligam o suporte de fase sólida e pode ser detectados por uma preparação de anticorpo detectável. Essa técnica é a essência de uma transferência por gota, transferência de Western e outros ensaios semelhantes.
Outros imunoensaios podem ser mais complicados mas na verdade proporcionam excelentes resultados. Ensaios imunométricos típicos e preferidos incluem ensaios em sentido "directo" para a detecção de uma proteína no qual 44 ΡΕ1272665 um primeiro anticorpo anti-proteína ligado a um suporte de fase sólida é colocado em contacto com a amostra de teste. Após um período de incubação adequado, o suporte de fase sólida é lavado para remover proteína não ligada. É então adicionado um segundo anticorpo anti-proteína distinto que é específico para uma porção da proteína específica não reconhecida pelo primeiro anticorpo. 0 segundo anticorpo é preferencialmente detectável. Após um segundo período de incubação para permitir que o anticorpo detectável seja complexado com uma proteína específica ligada ao suporte de fase sólida através do primeiro anticorpo, o suporte de fase sólida é lavado uma segunda vez para remover o anticorpo não ligado detectável. Alternativamente, o segundo anticorpo pode não ser detectável. Neste caso, um terceiro anticorpo detectável, que se liga ao segundo anticorpo, é adicionado ao sistema. Este tipo de ensaio de "sanduíche em sentido directo" pode ser um simples ensaio de sim/não para determinar se a ligação ocorreu ou pode ser feito quantitativamente comparando a quantidade de anticorpo detectável com a que foi obtida num controlo. Esses ensaios de "dois sítios" ou "sanduíche" são descritos por Wide, Radioimmune Assay Method, Kirkham, Ed., E. & S. Livingstone, Edinburgh, 1970; pp. 199-206.
Outros tipos de ensaios imunométricos são os denominados ensaios "simultâneos" e "reversos". Um ensaio simultâneo envolve um único passo de incubação em que o primeiro anticorpo ligado ao suporte de fase sólida, o segundo anticorpo detectável e a amostra de teste são 45 ΡΕ1272665 adicionados ao mesmo tempo. Após a incubação estar completa, o suporte de fase sólida é lavado para remover proteínas não ligadas. A presença de anticorpo detectável associada com o suporte sólido é então determinada como seria num ensaio convencional de "sanduíche em sentido directo". 0 ensaio simultâneo pode também ser adaptado de um modo semelhante para a detecção de anticorpos numa amostra de teste. 0 ensaio "reverso" compreende a adição passo a passo de uma solução de anticorpo detectável à amostra de teste seguido por um período de incubação e a adição de anticorpo ligado a um suporte de fase sólida após um período de incubação adicional. 0 suporte de fase sólida é lavado de um modo convencional para remover complexos de proteína não ligada/anticorpo e o anticorpo detectável que não reagiu. A determinação do anticorpo detectável associado com o suporte de fase sólida é então determinada como nos ensaios "simultâneo" e "de sentido directo". 0 ensaio reverso pode também ser adaptado de um modo semelhante para a detecção de anticorpos numa amostra de teste. 0 primeiro componente do ensaio imunométrico pode ser adicionado a nitrocelulose ou outro suporte de fase sólida que é capaz de imobilizar proteínas. 0 primeiro componente para determinar a presença de GCC numa amostra de teste é um anticorpo anti-GCC. Por "suporte de fase sólida" ou "suporte" pretende designar-se qualquer material capaz de ligar proteínas. Suportes de fase sólida bem 46 ΡΕ1272665 conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses, e magnetite. A natureza do suporte pode ser ou solúvel, até certo ponto, ou insolúvel para os objectivos da presente invenção. A configuração do suporte pode ser esférica, como uma esfera, ou cilíndrica, como na superfície interior de um tubo de ensaio ou a superfície externa de uma vareta. Alternativamente, a superfície pode ser plana, tal como uma folha, fita de teste, etc. Os especialistas na técnica conhecerão muitos outros "suportes de fase sólida" adequados para ligar proteínas ou será capaz de os descobrir através da utilização de experimentação de rotina. Um suporte de fase sólida preferido é uma placa de microtitulação de 96 poços.
Para detectar a presença de GCC, são utilizados anticorpos anti-GCC detectáveis. São bem conhecidos vários métodos para a detecção de anticorpos.
Um método no qual os anticorpos podem ser marcados de forma detectável é por ligação dos anticorpos a uma enzima e subsequentemente utilizando os anticorpos num imunoensaio enzimático (EIA) ou ensaio de imunoabsorção ligado a enzima (ELISA), tal como uma ELISA de captura. A enzima, quando subsequentemente exposta ao seu substrato, reage com o substrato e gera uma unidade química que pode ser detectada, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorométricos ou visuais. As enzimas que podem ser utilizadas para marcar anticorpos de forma detectável 47 ΡΕ1272665 incluem, mas não estão limitadas a malato desidrogenase, nuclease estafilococal, isomerase delta-5-esteróide, álcool desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato desidrogenase, triose fosfato isomerase, peroxidase de rábano, fosfa-tase alcalina, asparaginase, glucose oxidase, betagalacto-sidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-6-fosfato desidrogenase, glucoamilase e acetilcolinesterase. Um especialista na técnica seria capaz de reconhecer rapidamente outras enzimas que também podem ser utilizadas.
Outro método no qual os anticorpos podem ser marcados de forma detectável é através de isótopos radioactivos e utilização subsequente num radioimunoensaio (RIA) (ver, por exemplo, Work, T.S. et al.r Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, N.Y., 1978). 0 isótopo radioactivo pode ser detectado por meios como a utilização de um contador gama ou um contador de cintilações ou por autorradiografia. Os isótopos que são particularmente úteis para o objectivo da presente invenção são 3H, 125I, 131I, 35S, e 14C. Preferencialmente o isótopo é o 1251. Um especialista na técnica irá reconhecer rapidamente outros radioisótopos que também podem ser utilizados. É também possível marcar o anticorpo com um composto fluorescente. Quando o anticorpo marcado fluorescente é exposto à luz do comprimento de onda apropriado, a sua presença pode ser detectada devido à sua fluorescência. Entre os compostos marcados com fluorescência de utilização 48 ΡΕ1272665 mais comum estão o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldeído e fluorescamina. Um especialista na técnica reconhece rapidamente outros compostos fluorescentes que também podem ser utilizados.
Os anticorpos também podem ser marcados de forma detectável utilizando metais que emitem fluorescência tais como Eu, ou outros da serie lantanida. Estes metais podem ser ligados ao anticorpo especifico para proteínas utilizando grupos quelantes de metal como ácido dietilenotriami-napenta-acético (DTPA) ou ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA). Um especialista na técnica reconhece rapidamente outros metais que emitem fluorescência, assim como outros grupos quelantes de metal que também podem ser utilizados. 0 anticorpo também pode ser marcado de forma detectável acoplando-o a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo marcado quimioluminescente é determinada através da detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reacção química. Exemplos de compostos de marcação quimioluminescente particularmente úteis são luminol, isoluminol, éster de acridínio teromá-tico, imidazole, sal de acridínio e éster de oxalato. Um especialista na técnica reconhecerá rapidamente outros compostos quimioluminescentes que também podem ser utilizados .
Igualmente, pode ser utilizado um composto 49 ΡΕ1272665 bioluminescente para marcar anticorpos. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência que se encontra em sistemas biológicos nos quais uma proteína catalítica aumenta a eficiência da reacção quimioluminescente. A presença de uma proteína bioluminescente é determinada através da detecção da presença de luminescência. Compostos bioluminescentes importantes para os objectivos da marcação são luciferina, luciferase e aequorina. Um especialista na técnica reconhecerá rapidamente outros compostos bioluminescentes que também podem ser utilizados. A detecção do anticorpo específico para proteínas, fragmentos ou derivados pode ser realizada através de um contador de cintilações se, por exemplo, o marcador detectável é um emissor de gama radioactivo. Alternativamente, a detecção pode ser realizada por um fluorómetro se, por exemplo, o marcador for um material fluorescente. No caso de um marcador enzimático, a detecção pode ser realizada através de métodos clorimétricos que empregam um substrato para a enzima. A detecção também pode ser realizada por comparação visual da extensão da reacção enzimá-tica de um substrato em comparação com padrões preparados de forma semelhante. Um especialista na técnica reconhecerá rapidamente outros métodos de detecção apropriados que também podem ser utilizados. A actividade de ligação de um dado lote de anticorpos pode ser determinada de acordo com métodos bem conhecidos. Os especialistas na técnica serão capazes de 50 ΡΕ1272665 determinar condições de ensaio operacionais e óptimos para cada determinação empregando experimentação de rotina.
Podem ser realizados controlos positivos e negativos nos quais são adicionadas quantidades de proteínas GCC e não proteína GCC, respectivamente, aos ensaios que estão a ser realizados em paralelo com o ensaio de teste. Um especialista na técnica teria o conhecimento necessário para realizar os controlos apropriados. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender instruções para realizar o ensaio. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender opcionalmente representações ou fotografias que representam o surgimento de resultados positivos e negativos.
Pode ser produzido GCC como um reagente para controlos positivos de rotina. Um especialista na técnica irá apreciar os diferentes modos nos quais a proteína GCG pode ser produzida e isolada. A composição do anticorpo refere-se a um anticorpo ou anticorpos necessários para a detecção da proteína. Por exemplo, a composição de anticorpo utilizada para a detecção de uma GCC numa amostra de teste compreende um primeiro anticorpo que se liga à GCC, assim como um segundo ou terceiro anticorpo detectável que se liga ao primeiro ou segundo anticorpo, respectivamente.
Para examinar uma amostra de teste para a presença de uma GCC, pode ser realizado um ensaio imunométrico 51 ΡΕ1272665 padrão, tal como um descrito abaixo. Um primeiro anticorpo anti-GCC, que reconhece uma porção especifica de GCC, é adicionado a uma placa de microtitulação de 96 poços num volume de tampão. A placa é incubada durante um período de tempo suficiente para que a liqação ocorra e subsequentemente lavada com PBS para remover o anticorpo não ligado. A placa é então bloqueada com uma solução de PBS/BSA para prevenir que as proteínas da amostra de se ligarem não especificamente à placa de microtitulação. As amostras de teste são subsequentemente adicionadas aos poços e a placa é incubada durante um período de tempo suficiente para que a ligação ocorra. Os poços são lavados com PBS para remover a proteína não ligada. Os anticorpos anti-GCC marcados, que reconhecem porções de GCC não reconhecidos pelo primeiro anticorpo, são adicionados aos poços. A placa é incubada durante um período de tempo suficiente para que a ligação ocorra e subsequentemente lavada com PBS para remover o anticorpo anti-GCC marcado não ligado. A quantidade de anticorpo anti-GCC marcado e ligado é subsequentemente determinada através de técnicas convencionais.
Os estojos ("kits") que são úteis para a detecção de GCC numa amostra de teste compreendem um recipiente compreendendo anticorpos anti-GCC e um recipiente ou recipientes que compreendem controlos. Os controlos incluem uma amostra de controlo que não contém GCC e/ou outra amostra de controlo que continha a GCC. Anticorpos anti-GCC utilizados no estojo ("kit") são detectáveis como sendo marcados de forma detectável. Se o anticorpo detectável anti-GCC 52 ΡΕ1272665 não está marcado, pode ser detectado pelo segundo anticorpo ou proteína A por exemplo que pode também ser proporcionado em alguns estojos ("kits") em recipientes separados. Componentes adicionais em alguns estojos ("kits") incluem suporte sólido, tampão, e instruções para realizar o ensaio. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender opcionalmente representações ou fotografias que representam o surgimento de resultados positivos e negativos. 0 imunoensaio é útil para detectar GCC em amostras homogeneizadas de amostras de tecido e amostras de fluido corporal incluindo a porção de plasma ou células na amostra de fluido.
As transferências de Western podem ser úteis para auxiliar no diagnóstico de indivíduos que sofrem de cancro de estômago ou esófago detectando a presença de GCC de tecido nao colorrectal ou fluido corporal. As transfe- rências de Western também podem ser utilizadas para detectar a presença de GCC em amostras de tumor de um indivíduo que sofre de cancro. As transferências de Western utilizam anticorpos anti-GCC detectáveis para se ligarem a qualquer GCC presente numa amostra e assim indica a presença do receptor numa amostra. Técnicas de transferência de Western, que são descritas em Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, são semelhantes aos imunoensaios 53 ΡΕ1272665 com a diferença essencial de que antes de expor a amostra aos anticorpos, as proteínas nas amostras são separadas por electrof orese em gel e as proteínas separadas são então rastreadas com sonda com anticorpos. Em algumas formas de realização preferidas, a matriz é uma matriz de gel de SDS-PAGE e as proteínas separadas na matriz são transferidas para um veículo, tal como um filtro de papel antes de rastrear com anticorpos. Os anticorpos anti-GCC descritos acima são úteis em métodos de transferência de Western.
De um modo geral, as amostras são homogeneizadas e as células são lisadas utilizando detergentes tais como Triton-X. 0 material é então separado pelas técnicas convencionais em Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Os estojos ("kits") que são úteis para a detecção de GCC numa amostra de teste por Transferência de Western compreendem um recipiente compreendendo anticorpos anti-GCC e um recipiente ou recipientes que compreendem controlos. Os controlos incluem uma amostra de controlo que não contém GCC e/ou outra amostra de controlo que contém GCC. Os anticorpos anti-GCC utilizados no estojo ("kit") são detectáveis de modo a serem marcados de forma detectável. Se o anticorpo detectável anti-GCC não estiver marcado, pode ser detectado através do segundo anticorpo ou proteína A por exemplo, que pode ser também proporcionado em alguns estojos ("kits") em recipientes separados. Componentes 54 ΡΕ1272665 adicionais em alguns estojos ("kits") incluem instruções para realizar o ensaio. Adicionalmente, o estojo ("kit") pode compreender opcionalmente representações ou fotografias que representam o surgimento de resultados positivos e negativos.
As transferências de Western são úteis para detectar GCC em amostras de tecido homogeneizado e amostras de fluido corporal incluindo a porção de plasma ou células na amostra de fluido.
Processamento de imagem in vivo e Terapêutica
De acordo com algumas formas de realização da invenção, os conjugados de ligando de GCC são utilizados no fabrico de um medicamento para detectar, processar a imagem, ou tratar tumores primários ou metastáticos de estômago ou esófago num indivíduo.
Quando as composições conjugadas da presente invenção são administradas for a do tracto intestinal tal como quando administradas no sistema circulatório, elas permanecem segregadas das células que forram o tracto intestinal e ligar-se-ão apenas a células fora do tracto intestinal que expressam GCC. As composições conjugadas não se ligam às células normais, mas irão ligar-se a células primárias ou metastáticas do estômago ou esófago. Assim, as unidades activas de composições conjugadas administradas fora do tracto intestinal são distribuídas a células que 55 ΡΕ1272665 expressam GCC tais como células de cancro primário ou metastático do estômago ou esófago.
Composições terapêuticas farmacêuticas e de diagnóstico úteis na presente invenção incluem compostos conjugados que se dirigem especificamente a células que expressam GCC. Estes compostos conjugados incluem unidades que se ligam a GCC que não se ligam às células de tecido normal no corpo excepto células do tracto intestinal uma vez que as células de outros tecidos não expressam GCC.
Contrariamente às células colorrectais normais, as células de cancro que expressam GCC são acessíveis a substâncias administradas fora do tracto intestinal, por exemplo administradas no sistema circulatório. A única GCC em tecido normal existe nas membranas apicais de células da mucosa intestinal e desse modo eficazmente isolada a partir de quimioterapêuticos de cancro direccionados e agentes de processamento de imagem administrados fora do tracto intestinal pela barreira da mucosa intestinal. Deste modo, células de cancro primário ou metastático do estômago ou esófago podem ser direccionadas por compostos conjugados da presente invenção introduzindo esses compostos fora do tracto intestinal tal como por exemplo administrando composições farmacêuticas que compreendem compostos conjugados no sistema circulatório.
Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode identificar indivíduos suspeitos de sofrer de 56 ΡΕ1272665 cancro de estômago ou esófago primário ou metastático. Nos indivíduos diagnosticados com cancro de estômago ou esófago, não é invulgar, e em alguns casos é terapia convencional, suspeitar de metástase e tentar agressivamente erradicar as células metastizadas. A presente invenção proporciona composições farmacêuticas e métodos para processamento de imagem e desse modo diagnosticar mais definitivamente a doença primária e metastizada. Para além disso, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo agentes terapêuticos e métodos para direccionar especificamente e eliminar células de cancro primário ou metastático do estômago ou esófago. Para além disso, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas que compreendem agentes terapêuticos e métodos para eliminar especificamente células de cancro primário ou metastático do estômago ou esófago.
As composições farmacêuticas que compreendem composições conjugadas da presente invenção podem ser utilizadas para diagnosticar ou tratar indivíduos que sofrem de tumores primários ou metastáticos do estômago ou esófago. A presente invenção baseia-se na utilização de uma unidade de ligação a GCC numa composição conjugada. A unidade de ligação a GCC é essencialmente uma porção da composição conjugada que actua como um ligando a uma GCC e desse modo liga-se especificamente a ele. A composição conjugada também inclui uma unidade activa que está 57 ΡΕ1272665 associada com a unidade de ligação a GCC; sendo a unidade activa um agente activo que é útil para processar a imagem, direccionar, neutralizar ou matar a célula.
De acordo com a presente invenção, a unidade de ligação a GCC é um anticorpo.
Em algumas formas de realização preferidas, os compostos conjugados compreendem unidades de ligação a GCC que compreendem um anticorpo anti-GCC.
Os anticorpos contra GCC podem ser produzidos de rotina e utilizados em ensaios de competição para identificar ligandos de GCC ou como materiais de partida para compostos conjugados de acordo com a invenção.
De acordo com a presente invenção, a unidade activa pode ser um agente terapêutico ou um agente de processamento de imagem. Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode reconhecer rapidamente as vantagens de serem capazes de se dirigir especificamente a células de cancro com um ligando de GCC e conjugado, um tal ligando com muitos agentes activos diferentes.
Quimioterapêuticos úteis como unidade activas que foram conjugadas com uma unidade de ligação a GCC são especificamente distribuídos a células que expressam GCC, tal como células de cancro do estômago ou esófago, são tipicamente entidades mais químicas produzidas por síntese 58 ΡΕ1272665 química. Quimioterapêuticos incluem fármacos citotóxicos e citostáticos. Quimioterapêuticos podem incluir aqueles que possuem outros efeitos em células, tais como reverso do estado transformado para um estado diferenciado capaz ou aqueles que inibem a proliferação celular. Exemplos de quimioterapêuticos incluem fármacos citotóxicos ou citostáticos comuns, tais como, por exemplo: metotrexato (ametopte-rina), doxorrubicina (adrimicina), daunorrubicina, citosi-nambinósido, etopósido, 5-4 fluorouracilo, melfalano, clo-rambucil, e outras mostardas azoto (e.g., ciclofosfamida), cis-platina, vindesina (e outros vinca alcaloides), mitomi-cina e bleomicina. Outros quimioterapêuticos incluem: purotionina (oligopéptido de farinha de cevada), macromomi-cina. Derivados de 1,4-benzoquinuna e trenimona.
As toxinas são úteis como unidades activas. Quando uma toxina é conjugada com uma unidade de ligação a GCC, a composição conjugada é especificamente distribuída a uma célula que expressa GCC, tal como células de cancro do estômago ou esófago por meio da unidade de ligação a GCC e a unidade de toxina mata a célula. As toxinas são geralmente produtos tóxicos complexos de vários organismos incluindo bactérias, plantas, etc. Exemplos de toxinas incluem, mas não estão limitadas a: ricina, cadeia A da ricina (toxina ricina), exotoxina de Pseudomonas (PE) , toxina da difteria (DT) , fosfolipase C de Clostridium perfringens (PLC), ribonuclease pancreática de bovino (BPR), proteína antiviral de tintureira (PAP), abrina, cadeia A de abrina (toxina de abrina), factor de veneno de 59 ΡΕ1272665 cobra (CVF), gelonina (GEL), saporina (SAP), modecina, viscumina e volkensina. Como discutido acima, quando as toxinas da proteína são empregues com péptidos de ligação a GCC, as composições conjugadas podem ser produzidas utilizando técnicas de DNA recombinantes. Resumidamente, pode ser construída uma molécula de DNA recombinante que codifica tanto o ligando de GCC como a toxina num gene quimérico. Quando o gene quimérico é expresso, é produzida uma proteína de fusão que inclui uma unidade de ligação a GCC e uma unidade activa. As toxinas de proteína são também úteis para formar compostos conjugados com péptidos de ligação a GCC através de ligações não peptidilo.
Adicionalmente, existem outras abordagens para utilizar agentes activos para o tratamento do cancro. Por exemplo, podem ser produzidas composições conjugadas que incluem uma unidade de ligação a GCC e uma unidade activa que é uma enzima activa. A unidade de ligação a GCC localiza especificamente a composição conjugada com as células tumorais. Um pró-fármaco inactivo que pode ser convertido pela enzima num fármaco activo é administrado ao doente. 0 pró-fármaco é apenas convertido num fármaco activo pela enzima que está localizada para o tumor. Um exemplo de um par enzima/pró-fármaco inclui fosfatase alcalina/etoposidefosfato. Nesse caso, a fosfatase alcalina é conjugada com um ligando de ligação a GCC. 0 composto conjugado é administrado e localiza-se na célula de cancro. Após contacto com etoposidefosfato (o pró-fármaco), o etoposidefosfato é convertido no etopósido, o fármaco quimioterapêutico que é incorporado pela célula cancerosa. 60 ΡΕ1272665
Agentes de radiossensibilização são substâncias que aumentam a sensibilidade das células à radiação. Exemplos de exemplos de radiossensibilização incluem nitroimi-dazoles, metronidazole e misonidazole (ver: DeVita, V.T. Jr. em Harrison's Principies of Internai Medicine, p.68, McGraw-Hill Book Co., N.Y. 1983). O composto conjugado que compreende um agente de radiossensibilização como a unidade activa é administrado e localiza-se na célula de cancro primário ou metastático do estômago ou esófago. Após exposição do indivíduo à radiação, o agente de radiossensibilização é "excitado" e provoca a morte da célula.
Podem ser utilizados radionuclidos nas composições farmacêuticas que são úteis para radioterapia ou para processos de processamento de imagem.
Exemplos de radionuclidos úteis como toxinas em _ ___ 470„ 6 7~ 90, 131I, 186Re, 188Re, 199Au,
211 At, 212I ΊΊ-, 103-r , jtj783Rh, 191,-. 193M-,-.. 197, 111, 119, 121, 131, 143 109Pd, 123I, 125 T -L r 212Bi. Outros aqueles com 32P e 33P, cu ei t—1 r- Pr, 161Tb, 177Lu, negativos e/ou incluem: 90Y, auger. Alguns radionuclidos preferidos incluem: Y, 131I211At e 212Pb/212Bi.
De acordo com a presente invenção, as unidades activas podem ser um agente de processamento de imagem. Os 61 ΡΕ1272665 agentes de processamento de imagem são processos de diagnóstico úteis, assim como processos utilizados para identificar a localização de células de cancro. 0 processamento de imagem pode ser realizado através de quaisquer processos bem conhecidos daqueles que têm experiência de rotina na técnica e o agente de processamento de imagem apropriado útil nesses processos pode ser conjugado com ligandos de GCC por meios bem conhecidos. Pode ser realizado o processamento de imagem, por exemplo, por radiocintigrafia, ressonância magnética nuclear, processamento de imagem (MRl) ou tomografia computorizada (ras-treio de CT) . 0 agente de processamento de imagem radio- nuclido empregue de modo mais comum inclui Iodo e índio radioactivos. 0 processamento de imagem por rastreio de CT pode empregar um metal pesado, tal como quelatos de ferro. 0 rastreio de MRI pode empregar quelatos de gadolinio ou manganês. Adicionalmente, a tomografia de emissão de posição (PET) pode ser possível utilizando emissores de positrão de oxigénio, azoto, ferro, carbono, ou gálio.
Exemplo de radionuclidos úteis no nos processos de processamento de imagem incluem: 43K, 52Fe, 37Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 2™Sr, 99MTc, 311In, 113MIn, 123I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb e 206Bi. É preferido que as composições conjugadas sejam não imunogénicas ou immunogénicas a um nível baixo. A unidade de ligação a GCC pode ser um anticorpo humanizado ou primatizado ou um anticorpo humano. 62 ΡΕ1272665
Os ligandos de GCC são conjugados com agentes activos através de uma variedade de técnicas bem conhecidas prontamente realizadas sem experimentação indesejada por aqueles com experiência de rotina na técnica. A técnica utilizada para conjugar o ligando de GCC com o agente activo está dependente da natureza molecular do ligando de GCC e o agente activo. Após o ligando de GCC e o agente activo serem conjugados para formar uma molécula única, podem ser realizados ensaios para assegurar que a molécula conjugada retém as actividades das unidades. 0 ensaio de ligação competitiva descrito acima pode ser utilizado para confirmar que a unidade de ligação a GCC retém a sua actividade de ligação como um composto conjugado. De um modo semelhante, a actividade da unidade activa pode ser testada utilizando vários ensaios para cada tipo respectivo de agente activo. Os radionuclidos retêm a sua actividade, i.e., a sua radioactividade, independentemente da conjugação. Em relação a agentes activos que são toxinas, fármacos e agentes de direccionamento, ensaios padrão para demonstrar a actividade de formas não conjugadas destes compostos podem ser utilizados para confirmar que a actividade foi retida. A conjugação pode ser realizada directamente entre o ligando GCC e o agente activo ou de ligação, podem ser proporcionados grupos moleculares intermédios entre o ligando de GCC e o agente activo. Agentes de ligação reticulada são particularmente úteis para facilitar a conjugação proporcionado sítios de ligação para cada unidade. Os 63 ΡΕ1272665 agentes de ligação reticulada podem incluir grupos moleculares adicionais que servem como espaçadores para separar as unidades uma da outra para prevenir que qualquer uma delas possa interferir com a actividade da outra.
Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode conjugar um ligando de GCC com um fármaco quimioterapêutico utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, Magerstadt, M. Antibody Conjugates and Malignant Disease. (1991) CRC Press, Boca Raton, USA, pp. 110-152) ensina a conjugação de vários fármacos citostáticos com aminoácidos dos anticorpos. Essas reacções podem ser aplicadas a fármacos quimioterapêuticos conjugados com ligandos GCC, com um ligante apropriado. A maioria dos agentes quimioterapêuticos presentemente em utilização no tratamento do cancro possui grupos funcionais que são propícios a ligação reticulada química directamente com proteínas. Por exemplo, os grupos amino livres estão disponíveis em metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinósido, cis-platina, vindesina, mitomicina e bleomicina enquanto que os grupos de ácido carboxílico livres estão disponíveis em metotrexato, melfalano, e clorambucilo. Estes grupos funcionais, isto é aminoácidos e ácidos carboxílicos livres, são alvos para uma variedade de agentes de ligação química reticulada homobifuncional e heterobifuncional que podem ligar reticuladamente estes fármacos directamente ao grupo amino livre único de um anticorpo. Por exemplo, um processo para ligação reticulada de ligandos de GCC que possuem um grupo amino livre aos 64 ΡΕ1272665 agentes activos que possuem um grupo amino livre, tal como metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinó-sido, cis-platina, vindesina, mitomicina e bleomicina, ou fosfatase alcalina, ou toxina à base de proteína ou péptido emprega ésteres de succinimidilo homobifuncionais, preferencialmente com espaçadores da cadeia de carbono, tais como suberato de dissuccinimidilo (Pierce Co, Rockford, IL) . No evento de um composto clivável conjugado ser necessário, o mesmo protocolo seria empregue utilizando 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidil-propionato; Pierce Co.).
De modo a conjugar um ligando de GCC que é um péptido ou proteína a um agente activo baseado no péptido, tal como uma toxina, o ligando de GCC e a toxina podem ser produzidos como uma proteína de fusão simples, quer por síntese de péptidos convencional ou por tecnologia do DNA recombinante, sendo que ambas podem ser realizadas por rotina por aqueles com experiência de rotina na técnica.
Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode conjugar um ligando de GCC a um radionuclido utilizando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, Mager-stadt, M. (1991) Antibody Conjugates and Malignant Disease. CRC Press, Boca Raton, FLA,; e Barchel, S.W. e Rhodes, B.H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, NY, ensinam a conjugação de vários radionuclidos terapêuticos e de diagnóstico com aminoácidos de anticorpos.
As composições farmacêuticas que compreendem os 65 ΡΕ1272665 compostos conjugados da invenção e veículos farmaceutica-mente aceitáveis ou diluentes podem ser formulados por alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica. Veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remin-gton's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência convencional neste campo. Os compostos conjugados da presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outros agentes de diagnóstico, terapêuticos ou adicionais. Esses agentes adicionais incluem excipien-tes, tais como agentes de coloração, estabilização, agentes osmóticos e agentes antibacterianos. As composições farmacêuticas são preferencialmente estéreis e livres de piro-génio .
As composições conjugadas podem ser, por exemplo, formuladas como uma solução, suspensão ou emulsão em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável. Exemplos desses veículos são água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose, e albumina do soro humano a 5%. Também podem ser utilizados lipossomas. 0 veículo pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (e.g., cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (e.g., tampões e conservantes). A formulação é esterilizada através de técnicas que são de utilização comum. Por exemplo, uma composição parentérica adequada para administração por injecção é preparada dissolvendo 1,5% em peso de ingrediente activo em 0,9% de solução de cloreto de sódio.
As composições farmacêuticas podem ser adminis- 66 ΡΕ1272665 tradas quer como uma dose única ou em doses múltiplas. As composições farmacêuticas podem ser administradas quer como agentes terapêuticos individuais ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Os tratamentos podem ser combinados com terapias convencionais, que podem ser administradas sequencialmente ou simultaneamente.
As composições farmacêuticas podem ser administradas através de qualquer meio que permita que a composição conjugada alcance as células tomadas como alvo. Em algumas formas de realização, as vias de administração incluem aquelas seleccionadas a partir do grupo que consiste em administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, administração local para o fornecimento de sangue do órgão em que o tumor reside ou directamente no próprio tumor. A administração intravenosa é o modo de administração preferido. Pode ser realizado com o auxílio de uma bomba de infusão. Adicionalmente a um spray intraoperacional, os compostos conjugados podem ser distribuídos intratecalmente, intraventricularmente, estereo-tacticamente, intra-hepaticamente, tal como através da veia porta, por inalação, e intrapleuralmente. A dosagem administrada varia dependendo de factores tais como: a natureza da unidade activa; a natureza da composição conjugada; características farmacodinâ-micas; o seu modo e via de administração; idade, saúde, e peso do recipiente; natureza e extensão dos sintomas; tipo de tratamento concorrente; e frequência do tratamento. 67 ΡΕ1272665
Dado que os compostos conjugados são especifica-mente direccionados a células com uma ou mais moléculas de GCC, os compostos conjugados que compreendem quimioterapêu-ticos ou toxinas são administrados em doses inferiores aquelas que são utilizadas quando os quimioterapêuticos ou toxinas são administrados como agentes activos não conjugados, preferencialmente em doses que contêm até 100 vezes menos agente activo. Em algumas formas de realização, os compostos conjugados que compreendem quimioterapêuticos ou toxinas são administrados em doses que contêm 10-100 vezes menos agente activo como uma unidade activa do que a dosagem de quimioterapêuticos ou toxinas administrados como agente activos não conjugados. Para determinar a dose apropriada, a quantidade de composto é preferencialmente medida em moles em vez de ser em peso. Desse modo, o peso variável de diferentes unidades de ligação a GCC não afecta o cálculo. Presumindo uma proporção de um para um da unidade de ligação a GCC para a unidade activa em composições conjugadas da invenção, podem ser administradas menos moles de compostos conjugados em comparação com as moles de compostos não conjugados administradas, preferencialmente até 100 vezes menos moles.
Tipicamente, os conjugados quimioterapêuticos são administrados intravenosamente em doses múltiplas divididas . É administrado tipicamente até 20 g IV/dose de 68 ΡΕ1272665 metotrexato numa forma não conjugada. Quando o metotrexato é administrado como a unidade activa num composto conjugado da invenção, existe uma redução de dose de 10 até 100 vezes. Deste modo, presumindo que cada composto conjugado inclui uma molécula de metotrexato conjugada com uma unidade de ligação a GCC, da quantidade total de composto conjugado administrada, até cerca de 0,2 - 2,0 g de metotrexato está presente e é por isso administrada. Em algumas formas de realização, da quantidade total de composto conjugado administrada, até cerca de 200 mg - 2g de metotrexato está presente e é por isso administrada.
Para dosear as composições conjugadas que compreendem unidades de ligação a GCC ligadas a unidades activas que são os radioisótopos em composições farmacêuticas úteis como agentes de processamento de imagem, presume-se que cada unidade de ligação a GCC está ligada a uma unidade activa radioactiva. A quantidade de radioisótopo a ser administrada está dependente do radioisótopo. Aqueles que possuem experiência de rotina na técnica podem facilmente formular a quantidade de composto conjugado a ser administrada com base na actividade especifica e energia de um dado radionuclido utilizado como uma unidade activa. Tipicamente, são administrados 0,1-100 milicuries por dose de agente de processamento de imagem, preferencialmente Ι-ΙΟ milicuries, mais frequentemente 2-5 milicuries. Assim, as composições farmacêuticas úteis como agentes de processamento de imagem que compreendem as composições conjugadas compreendem uma unidade de ligação a GCC e uma 69 ΡΕ1272665 unidade radioactiva compreende 0,1-100 milicuries, em algumas formas de realização preferencialmente 1-10 milicuries, em algumas formas de realização preferencialmente 2-5 milicuries, em algumas formas de realização mais preferencialmente 1-5 milicuries. Exemplos de dosagens incluem: 131I = entre cerca de 0,1-100 milicuries por dose, em algumas formas de realização preferencialmente 1-10 milicuries, em algumas formas de realização 2-5 milicuries, e em algumas formas de realização cerca de 4 milicuries; ιηΙη = entre cerca de 0,1-100 milicuries por dose, em algumas formas de realização preferencialmente 1-10 milicuries, em algumas formas de realização 1-5 milicuries, e em algumas formas de realização cerca de 2 milicuries; 99mTc = entre cerca de 0,1-100 milicuries por dose, em algumas formas de realização preferencialmente 5-75 milicuries, em algumas formas de realização 10-50 milicuries, e em algumas formas de realização cerca de 27 milicuries. Wessels B.W. e R.D. Rogus (1984) Med. Phys. 11:638 e Kwok, C.S. et al. (1985) Med. Phys. 12:405, revelam detalhadamente os cálculos da dose para 18 conjugados de diagnóstico e terapêutico que podem ser utilizados na preparação de composições farmacêuticas que incluem compostos radioactivos conjugados.
Indivíduos suspeitos de sofrerem de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático podem ser tratados administrando ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende um veículo ou diluente farmaceuti-camente aceitável e um composto conjugado que compreende um anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um 70 ΡΕ1272665 agente terapêutico radioestável. A composição farmacêutica pode compreender um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende um anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um agente activo radioestável e a unidade de ligação a GCC é um anticorpo. A composição farmacêutica pode compreender um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende um anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um agente terapêutico radioestável. A composição farmacêutica pode compreender um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende um anticorpo e uma unidade de ligação a GCC e uma unidade activa em que a unidade activa é um agente activo radioestável seleccionado a partir do grupo que consiste em: meto-trexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-4 fluorouracilo, melfalano, clorambucilo, cis-platina, vindesina, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona, trenimon, ricina, cadeia A da ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina da difteria, fosfolipase C de Clostridium perfrin-gens, ribonuclease pancreática de bovino, proteína antivi-ral de tintureira, abrina, cadeia A de abrina, factor de veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volkensina, fosfatase alcalina, nitroimidazole, metronida-zole e misonidazole. O indivíduo que está a ser tratado pode ser diagnosticado como possuindo cancro de estômago ou esófago metastizado ou pode ser diagnosticado como possuindo cancro de estômago ou esófago primário e pode sofrer o 71 ΡΕ1272665 tratamento proactivamente no caso de existir algumas metástases ainda não detectadas. A composição farmacêutica contém uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição conjugada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que é eficaz para provocar um efeito citotóxico ou citostático em células de cancro sem provocar efeitos colaterais letais no indivíduo. É descrito um método para tratar indivíduos suspeitos de sofrer de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático. Esses indivíduos podem ser tratados administrando ao indivíduo uma composição farmacêutica que compreende um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende uma unidade de ligação a GCC de anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um radioactivo. A composição farmacêutica compreende um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende uma unidade de ligação a GCC de anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um radioactivo. Em algumas formas de realização, a composição farmacêutica compreende um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende uma unidade de ligação a GCC de anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um agente radioactivo seleccionado do grupo que consiste em: 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131i, 188Re, 188Re, 199Au, 211 At 212Pb, 212Bi, 32P e 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 111 Ag, 119Sb 121Sn, 131Cs, 143Pr , 161Tb, 177Lu, 1910s , 193MPt, 197Hg , 32P e 33P 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh i:L1Ag, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb 72 ΡΕ1272665 177Lu, 1910s, 193Mpt, 197Hg, todos emissores beta negativos e/ou auger. 0 indivíduo a ser tratado pode ser diagnos ticado como possuindo cancro metastizado ou pode ser diagnosticado como possuindo cancro localizado e pode sofrer o tratamento pró-activamente no caso de existirem algumas metástases ainda não detectadas. A composição farmacêutica contém uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição conjugada. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que é eficaz para provocar um efeito citotóxico ou citostático em células de cancro do estômago ou esófago primário ou metastático sem provocar efeitos colaterais letais no indivíduo. A composição pode ser injectada intratumoralmente em tumores primários.
Um aspecto da presente invenção refere-se à utilização de um conjugado de ligando de GCC para detectar células de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático num indivíduo suspeito de sofrer de cancro de estômago ou esófago primário ou metastizado por radioprocessamento de imagem. Os indivíduos podem ser suspeitos de possuir tumores primários de estômago ou esófago cujo diagnóstico pode ser confirmado administrando ao indivíduo, um agente de processamento de imagem que se liga a GCC. Os tumores podem ser processados por imagem detectando a localização no estômago ou esófago. Os indivíduos podem ser diagnosticados como sofrendo de cancro de estômago ou esófago metastizado e as células de cancro de estômago ou esófago metastizadas podem ser detectadas administrando ao indivíduo, preferencialmente por 73 ΡΕ1272665 administração intravenosa, uma composição farmacêutica que compreende um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitáveis e um composto conjugado que compreende uma unidade de ligação a GCC de anticorpo e uma unidade activa em que a unidade activa é um radioactivo e detectar a presença de uma acumulação ou agregação localizada de radioactividade, indicando a presença de células com GCC. A unidade activa pode ser um agente radioactivo seleccionado a partir do grupo consistindo em: metais pesados radioactivos tais como quelatos de ferro, quelatos radioactivos de gadolinio ou manganês, emissores de positrão de oxigénio, azoto, ferro, carbono, ou gálio, 43K, 52Fe, (_n -J o o > 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81MKr , 87MSr, 99MTC, 171In, 113MIn, 1231 , 1251 , 127Cs, 129Cs, 131-1--L t 132 r I 197Hg 203Pb e 206Bi . Um indivíduo a ser tratado pode ser diagnosticado como possuindo cancro de estômago ou esófago mestastizado ou pode ser diagnosticado como possuindo cancro de estômago ou esófago localizado e pode ser submetido a tratamento pró-activamente no caso de existir algumas metástases ainda não detectadas. A composição farmacêutica contém uma quantidade diagnosticavelmente eficaz da composição conjugada. Uma quantidade diagnosticavelmente eficaz é uma quantidade que pode ser detectada num sitio no corpo onde as células com GCC são localizadas sem provocar efeitos colaterais letais no indivíduo.
Processamento fotodinâmico de imagem e terapia
De acordo com algumas formas de realizaçao da 74 ΡΕ1272665 invenção, as unidades de ligação de GCC do anticorpo são conjugados com agentes de processamento de imagem foto-activados ou terapêuticos. Maier A. et al. Lasers in Surgery and Medicine 26:461-466 (2000) que é aqui incorporado por referência, revela um exemplo de terapia foto-dinâmica. QLT, Inc (Vancouver, BC) agentes activos fotos-sensíveis distribuídos comercialmente que podem ser ligados aos ligandos de GCC. Esses compostos conjugados podem ser utilizados em protocolos de terapêutica fotodinâmica e processamento de imagem para activar os agentes conjugados ligados a GCC que são assim direccionados para as células tumorais. Em algumas formas de realização, os compostos conjugados são aplicados como um spray intraoperativo que é subsequentemente exposto à luz para activar compostos ligados às células que expressam GCC.
Em algumas formas de realização, o agente foto-dinâmico é fluoróforo ou porfirinas. Exemplos de porfirina incluem: derivado de hematoporfirina (HPD) e porfímero de sódio (Photofrin®). Um fotossensibilizador de segunda geração é BPD verteporfina. Em algumas formas de realização, o fluoróforo é tetrametilrotamina. Os lasers são geralmente a principal fonte de luz utilizada para activar as porfirinas. Também podem ser utilizados Díodos de Emissão de Luz (LEDs) e fontes de luz fluorescente em algumas aplicações.
Em algumas formas de realização, o agente fotodi-nâmico está ligado a GCC no terminal N de GCC. 75 ΡΕ1272665
Adicionalmente a um spray intraoperativo, os compostos conjugados podem ser distribuídos intratecal-mente, intraventricularmente, estéreotacticamente, intra-hepaticamente tal como através da veia porta, por inalação, e intrapleuralmente.
Distribuição de Fármaco Direccionado a Células de Cancro do Estômago ou do Esófago de um modo Geral
As composições conjugadas que compreendem um ligando de GCC de anticorpo podem ser utilizadas para distribuir agentes terapêuticos a células que compreendem uma GCC tal como células de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático. Em algumas formas de realização, o agente é um fármaco ou toxina tal como: metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinósido, etopó-sido, 5-4 fluorouracilo, melfalano, clorambucilo, cis-pla-tina, vindesina, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona, trenimon, ricina, cadeia A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina da difteria, fosfolipase C de Clostridium perfrin-gens, ribonuclease pancreática bovina, proteína antiviral de tintureira, abrina, cadeia A de abrina, factor de veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volken-sina, fosfatase alcalina, nitroimidazole, metronidazole e misonidazole. 0 material genético é distribuído a células de cancro para produzir um antigénio que pode ser direccionado pelo sistema imunitário ou para produzir uma proteína que mata a célula ou inibe a sua proliferação. Em 76 ΡΕ1272665 algumas formas de realização, o ligando GCC do anticorpo é utilizado para distribuir ácidos nucleicos que codificam moléculas de ácido nucleico que substituem genes endógenos defeituosos ou que codificam proteínas terapêuticas. Em algumas formas de realização, as composições são utilizadas em protocolos de terapia génica para distribuir a indivíduos, material genético necessário e/ou desejado para compensar uma deficiência genética.
Em algumas formas de realização, o ligando de DCC de anticorpo é combinado com ou incorporado num veículo de distribuição convertendo desse modo o veículo de distribuição num veículo de distribuição especificamente direcci-onado. Em algumas formas de realização, um ligando de GCC pode ser integrado ou de outra forma incorporado em lipos-somas em que o ligando de GCC é exposto ou de outra forma fica acessível no exterior do lipossoma tornando esses lipossomas especificamente direccionados para células que contêm GCC. 0 agente activo pode ser um fármaco, toxina ou molécula de ácido nucleico. 0 ácido nucleico pode ser RNA ou preferencialmente DNA. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico é uma molécula anti-sentido ou codifica uma sequência anti-sentido cuja presença na célula inibe a produção de uma proteína indesejável. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma ribozima cuja presença na célula inibe a produção de uma proteína indesejável. Em algumas formas de realização, 77 ΡΕ1272665 a molécula de ácido nucleico codifica uma proteína ou péptido que é desejavelmente produzida na célula. Em algumas formas de realização, a molécula de ácido nucleico codifica uma cópia funcional de um gene que é defeituoso na célula constituída alvo. A molécula de ácido nucleico está preferencialmente ligada operacionalmente a elementos reguladores necessários para expressar a sequência codificante na célula.
Os lipossomas são vesículas pequenas compostas por lípidos. As construções genéticas que codificam proteínas que são desejadas para serem expressas em células que contêm GCC são introduzidas no centro dessas vesículas. A capa externa dessas vesículas compreende um ligando de GCC. Liposomes Volumes 1, 2 e 3 CRC Press Inc. Boca Raton FLA, que é aqui incorporado por referência, revela a preparação de agentes activos encapsulados em lipossomas que incluem anticorpos na capa externa. Na presente invenção, um ligando de GCC tal como por exemplo anticorpos anti-GCC está associado à capa externa. Composições não conjugadas que compreendem um ligando de GCC na matriz de um lipossoma com um agente activo dentro incluem essas composições nas quais o ligando de GCC é preferencialmente um anticorpo.
Numa forma de realização, a distribuição de cópias normais do gene supressor de tumor p53 às células de cancro é realizada utilizando o ligando de GCC para direccionar o gene terapêutico. Mutações do gene supressor de tumor p53 parece desempenhar um papel proeminente no 78 ΡΕ1272665 desenvolvimento de muitos cancros. Uma abordagem para combater esta doença é a distribuição de cópias normais deste gene às células de cancro que expressam formas mutantes deste gene. As construções genéticas que compreendem genes supressores de tumor normal p53 são incorporadas nos lipossomas que compreendem um ligando de GCC. A composição é distribuída ao tumor. Os ligandos de GCC direccionam especificamente e dirigem os lipossomas contendo o gene normal para corrigir a lesão criada pela mutação do gene supressor p53. A preparação das construções genéticas é realizada com as competências de quem tem experiência de rotina na técnica. A presente invenção permite que essa construção seja especificamente direccionada utilizando os ligandos de GCC da presente invenção. As composições da invenção incluem um ligando de GCC tal como um anticorpo anti-GCC associado a um veículo de distribuição e uma construção de gene que compreende uma sequência codificante para uma proteína cuja produção é desejada nas células do tracto intestinal ligadas às sequências reguladoras necessárias para a expressão nas células. Para incorporação pelas células do tracto intestinal, as composições são administradas oralmente ou por enema através da qual elas entram no tracto intestinal e contactam as células que compreendem GCC. Os veículos de distribuição associados com a GCC em virtude do ligando de GCC e o veículo é interiorizado na célula ou o agente activo/construção genética é de outra forma incorporada pela célula. Uma vez interiorizada, a construção pode proporcionar um efeito terapêutico no indivíduo. 79 ΡΕ1272665
Anti-sentido
Composições, estojos ("kits") e métodos são úteis para prevenir e tratar células de cancro do estômago ou do esófago proporcionando os meios para distribuir especifica-mente compostos anti-sentido às células de cancro do estômago ou do esófago e desse modo parar a expressão os genes nessas células em que a expressão genética indesejável está a decorrer sem afectar negativamente as células nas quais essa expressão não ocorre.
As composições conjugadas da presente invenção são úteis para direccionar células que expressam GCC incluindo células de cancro do estômago ou do esófago. As composições conjugadas não se ligarão a células derivadas não colorrectais. Células não colorrectais, sem GCC, não incorporam as composições conjugadas. Células colorrectais normais têm GCC e incorporarão as composições. A presente invenção proporciona composições e métodos de distribuição de composições anti-sentido a células de cancro do estômago ou do esófago. A presente invenção proporciona uma abordagem especifica para a célula na qual apenas células colorrectais normais e cancerosas e células de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático são expostas à porção activa do composto e apenas essas células são afectadas pelo composto conjugado. A unidade de ligação a GCC liga-se a células colorrectais normais e cancerosas e a células de 80 ΡΕ1272665 cancro de estômago ou esófago primário ou metastático. Após ligação a essas células, o composto conjugado é interiorizado e a distribuição do composto conjugado incluindo a porção anti-sentido da molécula é afectada. A presença do composto conjugado em células colorrectais normais não tem efeito nessas células porque o gene associado ao cancro para a qual a molécula anti-sentido que constitui a unidade activa do composto conjugado é complementar não está a ser expressa. Todavia, em células de cancro colorrectais, o gene do cancro para o qual a molécula anti-sentido que constitui a unidade activa do composto conjugado é complementar está a ser expressa. A presença do composto conjugado em células de cancro colorrectal serve para inibir ou prevenir a transcrição ou tradução do gene do cancro e desse modo reduz ou elimina o fenótipo transformado. A invenção pode ser utilizada para combater cancro de estômago ou esófago primário e/ou metastizado colorrectal assim como para prevenir a emergência do fenótipo transformado em células do cólon normais. Assim, a invenção pode ser utilizada terapeuticamente, assim como profilacticamente.
Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode identificar rapidamente indivíduos suspeitos de sofrer de cancro de estômago ou esófago. Nestes indivíduos diagnosticados com cancro de estômago ou esófago, é uma terapia convencional suspeitar metástases e tentar agressivamente erradicar as células metastizadas. 81 ΡΕ1272665 A presente invenção baseia-se na utilização de uma unidade de ligação a GCC de anticorpo numa composição conjugada. A unidade de ligação ao produto de GCC é essencialmente uma porção da composição conjugada que actua como um ligando à GCC e desse modo ligar-se especificamente a esses receptores. A composição conjugada também inclui uma unidade activa que está associada com a unidade de ligação a GCC; sendo a unidade activa uma composição anti-sentido útil para inibir ou prevenir a transcrição ou tradução da expressão de genes cuja expressão está associada ao cancro.
De acordo com a presente invenção, a unidade activa pode ser uma composição anti-sentido. Em particular, a molécula anti-sentido que constitui a unidade activa de um composto conjugado híbrida com DNA ou RNA numa célula de cancro de estômago ou esófago e inibe e/ou previne a transcrição ou tradução do DNA ou RNA de ocorrer. As composições anti-sentido podem ser uma molécula de ácido nucleico, um seu derivado ou um análogo. A natureza química da composição anti-sentido pode ser a de uma molécula de ácido nucleico ou uma molécula de ácido nucleico modificada ou uma molécula que não seja de ácido nucleico que possui grupos funcionais que mimetizam uma molécula de DNA ou RNA que é complementar à molécula de DNA ou RNA cuja expressão é ser inibida ou de outra forma prevenida. As composições anti-sentido inibem ou previnem a transcrição ou tradução de genes cuja expressão está ligada ao cancro de estômago ou esófago, i.e., genes associados ao cancro. 82 ΡΕ1272665
Inserções de mutações pontuais e deleções em K-ras e H-ras foram identificadas em muitos tumores. As caracteristicas complexas das alterações dos oncogenes HER-2/ERBB-2, HER-l/ERBB-1, HRAS-1, C-MYC e anti-oncogenes p53, RB1 . A carcinogénese química num modelo de rato demonstrou mutações pontuais em fos, um oncogene que media a regulação da transcrição e a proliferação. Ver: Alexander, RJ, et al. Oncogene alterations in rat colon tumors induced by N-methyl-N-nitrosourea. American Journal of the Medicai Sciences. 303(1):16-24, 1992, Jan. A carcinogénese química num modelo de rato demonstrou mutações pontuais no oncogene abl. Ver: Alexander, RJ, et al. Oncogene alterations in rat colon tumors induced by N-methyl-N-nitrosourea. American Journal of the Medicai Sciences. 303(1):16-24, 1992, Jan. MYC é um oncogene que desempenha um papel na regulação da transcrição e proliferação. Um oligonucleótido anti-sentido de 15 bases para myc complementar à região de iniciação da tradução do exão II foi incubado com células de cancro colorrectais. Esta molécula anti-sentido inibiu a proliferação de células de cancro colorrectais de um modo dependente da dose. Facto interessante, a incorporação deste oligonucleótido foi baixa (0,7%). Também, a transferência de um cromossoma 5 normal para células de cancro colorrectal resultou na regulação da expressão de myc e 83 ΡΕ1272665 perda de proliferação. Estes resultados sugerem que um gene supressor do tumor importante na regulação de myc está contido neste cromossoma.
Uma nova proteína fosfatase da tirosina, Gl, foi identificada. 0 exame do mRNA que codifica esta proteína nas células tumorais colorrectais revelou que sofre mutações pontuais e deleções nestas células e pode desempenhar um papel na proliferação característica destas células. Takekawa, M. et al. Chromosomal localization of the protein tyrosine phosphatase Gl gene and characterization of the aberrant transcripts in human colon câncer cells. FEBS Letters. 339(3): 222-8, 1994 Fev. 21. A gastrina regula o crescimento de células de cancro do cólon através de um mecanismo dependente de AMP cíclico, mediado por PKA. Oligodesoxinucleótidos anti-sen-tido para a subunidade reguladora de uma classe específica de PKA inibiu os efeitos de promoção de crescimento de AMP cíclico em células do carcinoma do cólon. Ver: Bold, RJ, et al. Experimental gene therapy of human colon câncer. Surgery. 116 (2):189-95; discussão 195-6, 1994 Aug. e Yokozaki, H., et al. An antisense oligodeoxynucleotide that depletes RI alpha subunit of cyclic AMP-dependent protein kinase induces growth inhibition in human câncer cells. Câncer Research. 53(4):868-72, 1993 Fev 15. CRIPTO é um gene relacionado com o factor de crescimento epidérmico expresso numa maioria de tumores de 84 ΡΕ1272665 cancro colorrectal. Oligodesoxinucleótidos anti-sentido de fosforotioato para a extremidade 5' de RNA de CRIPTO reduziram significativamente a expressão de CRIPTO e inibiram o crescimento da célula tumoral colorrectal in vitro e in vivo. Ciardiello, F. et al. Inhibition of CRIPTO expression and tumorigenicity in human colon câncer cells by antisense RNA and oligodeoxynucleotides. Oncogene. 9(1):291-8, 1994 Jan.
Muitas células de carcinoma segregam o factor alfa de crescimento de transformação. Um oligonucleótido de 23 nucleótidos anti-sentido para mRNA de TGF alpha inibiu ambos a síntese de DNA uma proliferação de células de cancro colorrectal. Sizeland, AM, Burgess, AW. Antisense transforming growth factor alpha oligonucleotides inhibit autocrine stimulated proliferation of a colon carcinoma cell line. Molecular Biology of the Cell. 3(11):1235-43, 1992 Nov.
Composições anti-sentido incluindo oligonucleóti-dos, seus derivados e análogos, protocolos de conjugação, e estratégias anti-sentido para inibição de transcrição e tradução são geralmente descritas em: Antisense Research and Applications, Crooke, S. e B. Lebleu, eds. CRC Press, Inc. Boca Raton FLA 1993; Nucleic Acids in Chemistry and Biology Blackburn, G. e M.J. Gait, eds. IRL Press at Oxford University Press, Inc. New York 1990; e Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach Eckstein, F. ed., IRL Press at Oxford University Press, Inc. New York 1991. 85 ΡΕ1272665
As moléculas anti-sentido da presente invenção compreendem uma sequência complementar ao fragmento de um gene de cancro colorrectal. Ver Ullrich et al., EMBO J., 1986, 5:2503.
Composições anti-sentido que podem constituir uma unidade activa em compostos conjugados da invenção incluem oligonucleótidos formados por homopirimidinas podem reconhecer séries locais de homopurinas na dupla hélice do DNA e liga-se a eles na dobra principal para formar uma hélice tripla. Ver: Helen, C e Toulme, JJ. Specific regulation of gene expression by antisense, sense, and antigene nucleic acids. Biochem. Biophys Acta, 1049:99-125, 1990. A formação da hélice tripla deveria interromper a capacidade do gene especifico para sofrer transcrição pela RNA polimerase. A formação da hélice tripla utilizando oligonucleótidos específicos para myc foram observados. Ver: Cooney, M, et al. Science 241:456-459.
Os oligonucleótidos anti-sentido de DNA ou RNA complementar às sequências na fronteira entre intrões e exões podem ser empregues para prevenir a maturação de transcritos de RNA nuclear criados de novo nuclear de genes específicos em mRNA para transcrição. O RNA anti-sentido complementar para genes específicos pode hibridar com o mRNA for o gene tat e prevenir a sua tradução. O RNA anti-sentido pode ser pro- 86 ΡΕ1272665 porcionado à célula como RNA "pronto-a-utilizar" sintetizado in vitro ou como um gene anti-sentido transfectados de forma estável nas células que irão produzir RNA anti-sentido após transcrição. A hibridação com mRNA resulta na degradação da molécula hibridada por RNAse H e/ou inibição da formação de complexos de tradução. Ambos resultam numa falha na produção do produto do gene original.
Sequências de DNA ou RNA anti-sentido podem ser distribuídas às células. Foram desenvolvidas várias modificações químicas para prolongar a estabilidade e melhorar a função destas moléculas sem interferir na sua capacidade para reconhecer sequências específicas. Estes incluem aumentar a sua resistência à degradação por DNases, incluindo fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforotioatos, alfa-anómeros, aumentando a sua afinidade para o seu alvo através de ligação covalente a vários agentes intercalantes tais como psoralenos, e aumentando a incorporação pelas células por conjugação com vários grupos incluindo poli-lisina. Estas moléculas reconhecem sequências específicas codificadas em mRNA e a sua hibridação previne a tradução de e aumenta a degradação dessas mensagens.
As composições conjugadas da invenção proporcionam um meio específico e eficaz para terminar a expressão de genes que provocam transformação neoplásica. A GCC sofre endocitose induzida pelo ligando e pode distribuir compostos conjugados como o citoplasma das células. 87 ΡΕ1272665
As unidades de ligação a GCC são conjugadas directamente com composições anti-sentido, tal como ácidos nucleicos que são activos na indução de uma resposta. Por exemplo, os oligonucleótidos anti-sentido para MYC são conjugados directamente com um anticorpo anti-GCC. Isto foi realizado empregando péptidos que se ligam ao receptor CD4. Ver: Cohen, IS, ed. Oligodeoxynucleotides: Antisense Inhibitors of Gene Expression. Topics in Molecular and Structural Biology. CRC Press, Inc., Boca Raton, 1989. A estrutura precisa e a sua síntese não é especificada e pode ser seleccionada a partir de técnicas bem estabelecidas. A síntese envolve que conjugação química ou síntese directa da molécula quimérica através de síntese de fase sólida empregando FMOC química, Ver: Haralambidis, J, et al. (1987) Tetrahedron Lett. 28:5199-5202. Alternativamente, o conjugado de péptido-ácido nucleico pode ser sintetizado directamente através de síntese de fase sólida como uma quimera de ácido nucleico péptido-péptido através de síntese em fase sólida. Nielsen, PE, et al. (1994) Sequence-specific transcription arrest by peptide nucleic acid bound to the DNA template strand. Gene 149:139-145.
Em algumas formas de realização, a polilisina pode ser complexada com composições conjugadas da invenção de um modo não covalente com ácidos nucleicos e utilizada para aumentar a distribuição destas moléculas no citoplasma das células. Adicionalmente, os péptidos e proteínas podem ser conjugados com polilisina de um modo covalente e este conjugado complexado com ácidos nucleicos de um modo não ΡΕ1272665 covalente para aumentar ainda mais a especificidade e a eficiência da incorporação dos ácidos nucleicos pelas células. Assim, o ligando de GCC é conjugado quimicamente com polilisina através de técnicas estabelecidas. 0 conjugado do ligando do produto da tradução de polilisina-GCC-1 pode ser complexado com os ácidos nucleicos de escolha. Assim, os conjugados polilisina-orosomucóide foram empregues para plasmídeos específicos contendo genes para serem expressos em células de hepatoma que expressam o receptor orosomucóide. Esta abordagem pode ser utilizada para distribuir genes totais, ou oligonucleótidos. Assim, tem o potencial de terminar a expressão de um gene indese-jado (e.g. MYC, ras) ou substituir a função de um gene perdido ou eliminado (e.g. hMSH2, hMLIIl, HPMS1, e hPMS2).
De acordo com a forma de realização preferida, Myc serve como um gene cuja expressão é inibida por uma molécula anti-sentido numa composição conjugada. As unidades de ligação a GCC são utilizadas para distribuir um oligonucleótido anti-sentido de 15 bases para myc complementar à região de iniciação de tradução do exão IT. 0 oligonucleótido anti-sentido de 15 bases para MYC é sintetizado como relatado em Collins, JF, Herman, P, Schuch, C, Bagby GC, Jr. Journal of Clinicai Investigation. 89(5): 1523-7, 1992 Maio. Em algumas formas de realização, a composição conjugada é conjugada com polilisina como relatado anteriormente. Wu, GY, e Wu, CH. (1988) Evidence for ed gene delivery to Hep G2 hepatoma cells, in vitro. Biochem. 27:887-892. 89 ΡΕ1272665
As composições conjugadas podem ser sintetizadas como uma molécula quimérica directamente através de sintese em fase sólida, concentrações pmolar até nanomolar deste conjugado suprimem a sintese de MYC em células de cancro colorrectal in vitro.
Moléculas anti-sentido são preferencialmente hibridadas com, i.e., são complementares a, uma sequência de nucleótidos que tem 5-50 nucleótidos de comprimento, mais preferencialmente 5-25 nucleótidos e em algumas formas de realização 10-15 nucleótidos.
Adicionalmente, desemparelhamentos dentro das sequências identificadas acima, que alcançam os métodos da invenção, de modo a que as sequências desemparelhadas sejam substancialmente complementares às sequências do gene do cancro são também consideradas como estando dentro do âmbito da revelação. Os desemparelhamentos que permitem complementaridade substancial com as sequências do gene do cancro serão conhecidos dos especialistas na técnica, uma vez dotados com a presente revelação. Os oligos também podem ser modificados ou não modificados.
Podem ser utilizadas composições e métodos terapêuticos para combater o cancro de estômago ou esófago nos casos em que o cancro está localizado e/ou metastizado. Os indivíduos são administrados com uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de composto conjugado. Uma quantidade 90 ΡΕ1272665 terapeuticamente eficaz é uma quantidade que é eficaz para provocar um efeito citotóxico ou citostático nas células de cancro sem provocar efeitos colaterais letais no indivíduo. Um indivíduo que tenha sido administrado com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição conjugada possui hipóteses aumentadas de eliminar o cancro de estômaqo ou esófago em comparação com o risco que tinha o indivíduo que não recebeu a quantidade terapeuticamente eficaz.
Para tratar o cancro de estômago ou esófago localizado, é administrada uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto conjugado, de modo a que entrará em contacto com o tumor localizado. Assim, o composto conjugado pode ser administrado oralmente ou intratumoralmente. As formulações oral e rectal são ensinadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, 1990, Mack Publishing Co., Easton PA.
As composições farmacêuticas podem ser administradas quer como dose única ou em doses múltiplas. As composições farmacêuticas podem ser administradas quer como agentes terapêuticos individuais ou em combinação com outros agentes terapêuticos. Os tratamentos da presente invenção podem ser combinados com terapias convencionais, que podem ser administradas sequencialmente ou simultaneamente. Compreendem uma unidade de ligação a GCC conjugada com um oligonucleótido anti-sentido que possui uma sequência que é complementar à região de DNA ou RNA de um gene de cancro. 91 ΡΕ1272665
Os compostos conjugados podem ser administrados a mamíferos numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, seleccionado em função da via de administração pretendida e a prática farmacêutica convencional. As dosagens serão estabelecidas em função do peso, e do estado clínico do doente. As composições conjugadas serão administradas durante um tempo suficiente para os mamíferos serem isentos de células indiferenciadas e/ou células que possuem um fenótipo anormal em métodos de tratamento terapêutico que se estendem durante um tempo suficiente para inibir as células transformadas de proliferarem e as composições conjugadas podem ser administradas em conjunção com outros agentes quimioterapêuticos para ferir e combater o cancro do doente.
Os compostos conjugados podem ser empregues no método da invenção isoladamente ou em combinação com outros compostos. A quantidade a ser administrada irá também depender de factores tais como a idade, peso, e estado clínico do doente. Ver Gennaro, Alfonso, ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, 1990, Mack Publishing Co., Easton PA. Pelo menos um epitopo de uma proteína GCG, tal como quando o vector infeccioso é administrado a um indivíduo, o epitopo é expresso e serve como um alvo para uma resposta imunitária; 3) vacinas mortas ou inactivadas que a) compreendem células mortas ou partículas virais inac- 92 ΡΕ1272665 tivadas que apresentam pelo menos um epitopo de uma proteína GCG e b) quando administradas a um indivíduo servem como um alvo para uma resposta imunitária; 4) vacinas haptenizadas mortas ou inactivadas que a) compreendem células mortas ou partículas virais inactivadas que apresentam pelo menos um epitopo de uma proteína GCC, b) são haptenizadas para serem mais imunogénicas e c) quando administradas a um indivíduo servem como um alvo para uma resposta imunitária; 5) vacinas de subunidade que são vacinas que incluem moléculas de proteína que incluem pelo menos um epitopo de uma proteína de GCC; e 6) vacinas de subunidade haptenizada que são vacinas que a) incluem moléculas de proteína que incluem pelo menos um epitopo de uma proteína GCG e b) são haptenizadas para serem mais imunogénicas . A presente invenção refere-se à administração a um indivíduo de uma proteína ou molécula de ácido nucleico que compreende ou codifica, respectivamente, um epitopo imunogénico contra o qual pode ser induzida uma resposta imunitária terapêutica e profiláctica. Esses epitopos têm geralmente pelo menos 6-8 aminoácidos de comprimento. As vacinas da invenção compreendem por isso proteínas que têm pelo menos, ou ácidos nucleicos que codificam pelo menos, 6-8 aminoácidos de comprimento da proteína GCC. As vacinas 93 ΡΕ1272665 da invenção podem compreender proteínas que têm pelo menos, ou ácidos nucleicos que codificam pelo menos 10 até cerca de 1000 aminoácidos de comprimento. As vacinas da invenção podem compreender proteínas que têm pelo menos, ou ácidos nucleicos que codificam pelo menos, cerca de 25 até cerca de 500 aminoácidos de comprimento. As vacinas da invenção podem compreender proteínas que têm pelo menos, ou ácidos nucleicos que codificam pelo menos, cerca de 50 até cerca de 400 aminoácidos de comprimento. As vacinas da invenção podem compreender proteínas que têm pelo menos, ou ácidos nucleicos que codificam pelo menos, cerca de 100 até cerca de 300 aminoácidos de comprimento. A presente invenção refere-se a composições e métodos para o tratamento de indivíduos que são conhecidos por possuírem células de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático. O cancro de estômago ou esófago primário ou metastático pode ser diagnosticado por aqueles com experiência de rotina na técnica utilizando os métodos aqui descritos ou protocolos de patologia clínica e laboratorial aceites na técnica. A presente invenção proporciona uma vacina imunoterapêutica útil para tratar indivíduos que foram diagnosticados como sofrendo de cancro de estômago ou esófago primário ou metastático. As vacinas imunoterapêuticas da presente invenção podem ser administradas em combinação com outras terapias. A presente invenção refere-se a composições para e métodos de prevenção de cancro de estômago ou esófago 94 ΡΕ1272665 primário ou metastático em indivíduos suspeitos de serem susceptíveis a cancro de estômago ou esófago. Esses indivíduos incluem aqueles cujo historial médico familiar indica incidência acima da média de cancro de estômago ou esófago entre membros da família e/ou aqueles que já desenvolveram cancro de estômago ou esófago e foram tratados eficazmente que por isso enfrentam um risco de recaída e recorrência. Esses indivíduos incluem aqueles que foram diagnosticados como possuindo cancro de estômago ou esófago incluindo cancro de estômago ou esófago apenas localizado ou localizado e metastizado que foi ressecado ou de outra forma tratado. As vacinas da presente invenção podem ser para indivíduos susceptíveis profilacticamente para prevenir e combater cancro de estômago ou esófago primário e metastático. A invenção refere-se a composições que são os componentes activos dessas vacinas ou necessárias para produzir os componentes activos, os métodos para preparar essas composições incluindo os componentes activos, e a métodos de preparação e utilização das vacinas.
As sequências de nucleótidos e de aminoácidos da GCC são apresentadas como SEQ ID N°:l. A presente invenção refere-se a vectores recombi-nantes, incluindo vectores de expressão, que compreendem o transcrito do gene GCG ou um seu fragmento. A presente invenção refere-se a vectores recombinantes, incluindo vec- 95 ΡΕ1272665 tores de expressão que compreendem sequências de nucleóti-dos que codificam uma proteína GCG ou um seu fragmento funcional. A presente invenção refere-se a células hospedeiras que compreendem esses vectores e a métodos de produzir a proteína GCG utilizando essas células recombinantes. A presente invenção refere-se ao transcrito isolado do gene GCG e às proteínas GCC isoladas e aos anticorpos isolados específicos para essa proteína e a hibridomas que produzem esses anticorpos. A presente invenção refere-se à GCC isolada e aos seus fragmentos funcionais. Consequentemente, alguns aspectos da invenção referem-se a proteínas isoladas que compreendem pelo menos um epitopo de uma GCC.
Alguns aspectos da invenção referem-se às proteínas isoladas acima descritas que são haptenizadas para torná-las mais imunogénicas. Isto é, alguns aspectos da invenção referem-se a proteínas haptenizadas que compreendem pelo menos um epitopo de GCC.
Consequentemente, alguns aspectos da invenção referem-se a moléculas isoladas de ácido nucleico que codificam proteínas que compreendem pelo menos um epitopo de GCC. 96 ΡΕ1272665 São descritas vacinas de DNA desprotegido em PCT/US90/01515. Outros ensinam a utilização a transferência de DNA mediada por lipossomas, distribuição de DNA utilizando microprojécteis (Patente U.S. N°. 4 945 050 atribuída em 31 de Julho de 1990 a Sanford et al.,), e distribuição de DNA utilizando electroporação. Em qualquer dos casos, o DNA pode ser DNA de plasmídeo que é produzido numa bactéria, isolado e administrado ao animal a ser tratado. As moléculas de DNA de plasmídeo são incorporadas pelas células do animal nas quais as sequências que codificam a proteína de interesse são expressas. A proteína assim produzida proporciona um efeito terapêutico ou profiláctico no animal. A utilização de vectores incluindo vectores virais e outros meios de distribuir moléculas de ácido nucleico a células de um indivíduo de modo a produzir um efeito imunológico terapêutico e/ou profiláctico no indivíduo é igualmente bem conhecida. Vacinas recombinantes que empregam vectores de vaccinia são, por exemplo, revelados na Patente U.S. Número 5 017 487 emitida em 21 de Maio de 1991 por Stunnenberg et al.
Em alguns casos, as células tumorais do doente são mortas ou inactivadas e administradas como um produto de vacina. Berd et al. Maio de 1986 Câncer Research 46:2572-2577 e Berd et al. Maio de 1991 Câncer Research 51:2731-2734, descrevem a preparação e utilização de produtos de vacina à base de células tumorais. De acordo com 97 ΡΕ1272665 alguns aspectos da presente invenção, os métodos e técnicas descritos em Berd et ai. são adaptados utilizando células de cancro do estômago ou esófago em vez de células de melanoma. 0 fabrico e a utilização de produtos de tradução isolados e seus fragmentos úteis por exemplo como reagentes de laboratório ou componentes de vacinas de subunidade são bem conhecidos. Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode isolar o transcrito do gene GCG ou a sua porção especifica que codifica GCC ou um seu fragmento. Uma vez isolada, a molécula de ácido nucleico pode ser inserida num vector de expressão utilizando técnicas convencionais e materiais de partida já disponíveis. 0 vector de expressão recombinante que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica a molécula de ácido nucleico que codifica GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende a GCC ou um seu fragmento. Os vectores de expressão recombinantes da invenção são úteis para transformar hospedeiros para preparar sistemas de expressão recombinantes para preparar as proteínas isoladas da invenção. A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o vector de expressão recombinante que inclui uma sequência de nucleótidos que codifica a proteína GCC ou um seu fragmento ou uma GCC ou um seu fragmento. As células hospedeiras para utilização em siste- 98 ΡΕ1272665 mas de expressão recombinante bem conhecidos para a produção de proteínas são bem conhecidas e estão prontamente disponíveis. Exemplos de células hospedeiras incluem células de bactérias, tais como células de E. coli, leveduras, tais como S. cerevlsiae, células de insecto tal como S. frugiperda, células de cultura de tecidos de mamíferos não humanos, células de ovário de hamster chinês (CHO) e células de cultura de tecido humano, tal como células HeLa. A presente invenção refere-se a um mamífero não humano transgénico que compreende o vector de expressão recombinante que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas da invenção. Mamíferos trans-génicos não humanos úteis para produzir proteínas recombi-nantes são bem conhecidos assim como o são os vectores de expressão necessários e as técnicas para criar animais transgénicos. Geralmente, o animal transgénico compreende um vector de expressão recombinante no qual a sequência de nucleótidos que codifica GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende GCC ou um seu fragmento ligado operacionalmente a um promotor específico de células de mamífero em que a sequência codificante é apenas expressa em células de mamíferos e a proteína recombinante assim expressa é recuperada do leite do animal.
Em algumas formas de realização, por exemplo, alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica pode, utilizando técnicas bem conhecidas, inserir essas moléculas 99 ΡΕ1272665 de DNA num vector de expressão disponível comercialmente para utilização em sistemas de expressão bem conhecidos, tais como aqueles aqui descritos. 0 vector de expressão incluindo o DNA que codifica uma GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende uma GCC ou um seu fragmento funcional é utilizado para transformar o hospedeiro compatível que é então cultivado e mantido nas condições em que a expressão do DNA estranho ocorre. A proteína da presente invenção assim produzida é recuperada da cultura, seja por lise das células ou a partir do meio de cultura como apropriado e conhecido dos especialistas na técnica. Os métodos de purificar a GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende a mesma utilizando anticorpos que se ligam especificamente à proteína são bem conhecidos. Os anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína particular podem ser utilizados para purificar a proteína a partir de fontes naturais utilizando técnicas bem conhecidas e materiais de partida prontamente disponíveis. Esses anticorpos podem também ser utilizados para purificar a proteína a partir do material presente quando se produz a proteína através da metodologia do DNA recombinante. A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a um epitopo que está presente em um ou mais produtos da tradução de GCC-1 ou um seu fragmento ou uma proteína que o compreende. Os anticorpos que se ligam a um epitopo que está presente na GCC são úteis para isolar e purificar a proteína a partir de fontes naturais ou sistemas de 100 ΡΕ1272665 expressão recombinante utilizando técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade. Técnicas de imunoafinidade são descritas, de um modo geral, em Waldman et al. 1991 Methods of Enzymol. 195:391-396. Os anticorpos são úteis para detectar a presença dessa proteína numa amostra e para determinar se as células expressam a proteína. A produção de anticorpos e as estruturas de proteína de anticorpos completos, intactos, fragmentos Fab e fragmentos F(ab)2 e a organização das sequências genéticas que codificam essas moléculas são bem conhecidas e estão descritas, por exemplo, em Harlow, E. e D. Lane (1988) ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
Em algumas formas de realização da invenção, são criados animais transgénicos não humanos. Os animais transgénicos de acordo com a invenção contêm nucleótidos que codificam GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende os mesmos sob o controlo de regulação de um promotor específico de mamíferos. Alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica utilizando técnicas convencionais, tais como aquelas ensinadas na Patente U.S. N°. 4 873 191 atribuída em 10 de Outubro de 1989 a Wagner e a Patente U.S. N° . 4 736 866 atribuída a 12 de Abril de 1988 a Leder, podem produzir animais transgénicos que produzem GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende a mesma. Animais preferidos são cabras e roedores, particularmente ratos e ratinhoos. 101 ΡΕ1272665
Adicionalmente à produção dessas proteínas por técnicas recombinantes, podem também ser empregues sinte-tizadores de péptidos automatizados para produzir GCC ou um seu fragmento ou um seu fragmento ou uma proteína que a compreende. Essas técnicas são bem conhecidas daqueles que têm experiencia de rotina na técnica e são úteis se os derivados que possuem as substituições não forem fornecidos para a produção da proteína codificada pelo DNA.
Em algumas formas de realização, a proteína que constitui uma vacina de subunidade ou as células ou partículas de uma vacina morta ou inactivada pode ser haptenizada para aumentar a imunogenicidade. Em alguns casos, a haptenização é a conjugação de uma estrutura molecular maior para GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende a mesma. Em alguns casos, as células tumorais do doente são mortas e haptenizadas como um meio para produzir um produto de vacina eficaz. Nos casos em que outras células, tais como células de bactérias ou eucarióticas que são proporcionadas com a informação genética para produzir e apresentar uma GCC ou um seu fragmento ou uma proteína que a compreende, são mortas e utilizadas como o componente da vacina activa, essas células são haptenizadas para aumentar a imunogenicidade. A haptenização é bem conhecida e pode ser rapidamente realizada.
Os métodos de haptenização de células em geral e das células tumorais em particular estão descritos em Berd 102 ΡΕ1272665 et al. Maio de 1986 Câncer Research 46:2572-2577 e Berd et al. Maio de 1991 Câncer Research 51:2731-2734. São revelados protocolos adicionais de haptenização em Miller et al. 1976 J. Immunol. 117(5:1):1591-1526.
As composições e métodos de haptenização que podem ser adaptados para serem utilizados para preparar imunogénios de GCC haptenizados de acordo com a presente invenção incluem aqueles descritos na seguinte Patente U.S. Número 5 037 645 atribuída em 6 de Agosto de 1991 a
Strahilevitz; Patente U.S. Número 5 112 606 atribuída em 12 de Maio de 1992 a Shiosaka et al.; Patente U.S. Número 4 526 716 atribuída em 2 de Julho de 1985 a Stevens; Patente U.S. Número 4 329 281 atribuída em 11 de Maio de 1982 a Christenson et al.; e Patente U.S. Número 4 022 878 atribuída em 10 de Maio de 1977 a Gross. Vacinas de péptidos e métodos para aumentar a imunogenicidade dos péptidos que podem ser adaptados para modificar imunogénios de GCC da invenção são também descritos em Francis et al. 1989 Methods of Enzymol. 178:659-676. Sad et al. 1992 Immunolology 76:599-603, ensinam métodos de produzir vacinas imunoterapêuticas conjugando a hormona da libertação da gonadotropina para a toxóide da difteria. Os imunogénios de GCC podem ser conjugados de modo semelhante para produzir uma vacina imunoterapêutica da presente invenção. MacLean et al. 1993 Câncer Immunol. Immunother. 36:215-222, descreve metodologias de conjugação para produzir vacinas imunoterapêuticas que podem ser adaptáveis para produzir uma vacina imunoterapêutica da presente 103 ΡΕ1272665 invenção. O hapteno é hemocianina de lapa, que pode ser conjugada com um imunogénio de GCC.
As vacinas de acordo com alguns aspectos da invenção compreendem um veiculo farmaceuticamente aceitável em combinação com um imunogénio de GCC. São bem conhecidas formulações farmacêuticas e as composições farmacêuticas que compreendem essas proteínas podem ser formuladas de rotina por alguém que tenha uma experiência de rotina na técnica. Veículos farmacêuticos adequados são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, um texto de referência padrão nesta área. A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica injectável que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e um imunogénio de GCC. O imunogénio de GCC é preferencialmente estéril e combinado com um veículo farmacêutico estéril.
Em algumas formas de realização, por exemplo, a GCC ou um seu fragmento ou um seu fragmento ou uma proteína que compreende a mesma pode ser formulada como uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Exemplos desses veículos são água, soro fisiológico, solução de Ringer, solução de dextrose, e albumina de soro humano a 5%. Podem também ser utilizados lipossomas e veículos não aquosos, tais como óleos fixados. 0 veículo ou pó liofilizado pode conter aditivos que mantêm a isotonicidade (e.g., cloreto de sódio, manitol) e estabilidade química (e.g., tampões e conservantes). A formulação é esterilizada através de técnicas normalmente utilizadas. 104 ΡΕ1272665
Uma composição injectável pode compreender o imunogénio GCC num agente de diluição, tal como, por exemplo, água estéril, electrólitos/dextrose, óleos gordos de origem vegetal, ésteres gordos, ou polióis, tais como propilenoglicol e polietilenoglicol. O injectável deve ser estéril e isento de pirogénios.
As vacinas da presente invenção podem ser administradas através de qualquer meio que permita ao agente imunogénico ser apresentado ao sistema imunitário do corpo para o reconhecimento e indução de uma resposta imunogénica. As composições farmacêuticas podem ser administradas parentericamente, i.e., por via intravenosa, subcutânea, intramuscular. A dosagem varia dependendo de factores conhecidos, tais como as caracteristicas farmacodinâmicas do agente particular, e o seu modo e via de administração; idade, saúde, e peso do receptor; natureza e extensão dos sintomas, tipo de tratamento concorrente, frequência do tratamento, e o efeito desejado. Uma quantidade de imunogénio é distribuída para induzir uma resposta imunitária protectora ou terapeuticamente eficaz. Aqueles que possuem uma experiência de rotina na técnica podem determinar com facilidade o intervalo e a dosagem óptima através de métodos de rotina.
Os exemplos seguintes são ilustrativos mas não pretendem ser limitantes da presente invenção. 105 ΡΕ1272665
EXEMPLOS
Como referido acima, a unidade de ligação a GCC é um ligando de GCC que pode ser um anticorpo, uma proteína, um polipéptido, um péptido ou um não péptido. Os ligandos de GCC péptidos e não péptidos podem ser identificados utilizando tecnologia bem conhecida.
Ao longo dos últimos 10 anos, foi reconhecido que a interacção específica de afinidade elevada de um receptor e um ligando, por exemplo uma GCC e um anticorpo anti-GCC, tem a sua base no espaço conformacional tridimensional do ligando e da configuração tridimensional complementar da região da molécula envolvida na ligação ao ligando. Adicionalmente, foi reconhecido que várias matrizes de aminoácidos que ocorrem naturalmente, de aminoácidos não naturais, e de moléculas orgânicas podem ser organizadas em configurações que não estão relacionadas com os ligandos naturais na sua estrutura linear, mas parecem-se com a estrutura tridimensional dos ligandos naturais no espaço conformacional e, deste modo, são reconhecidos pelos recep-tores com elevada afinidade e especificidade. Além disso, foram descritas técnicas na literatura que permitem que uma pessoa com experiência de rotina na técnica para produzir grandes bibliotecas destas matrizes de aminoácidos naturais, aminoácidos não naturais e compostos orgânicos identifiquem de uma forma prospectiva compostos individuais que interagem com receptores com elevada afinidade e 106 ΡΕ1272665 especificidade que não são relacionados com o ligando nativo desse receptor. Deste modo, é uma tarefa relativamente fácil de realizar para uma pessoa com experiência de rotina na técnica para identificar matrizes de aminoácidos que ocorrem naturalmente, aminoácidos não naturais, ou compostos orgânicos que se podem ligar especificamente e fortemente à GCC, que não comportam uma relação estrutural com um anticorpo anti-GCC.
Para identificar os ligandos de GCC que são péptidos, os que possuem experiência de rotina na técnica podem utilizar qualquer uma das metodologias bem conhecidas para o rastreio de bibliotecas de péptidos aleatórios de modo a identificar péptidos que se ligam a GCC. Na maioria das metodologias mais básicas, os péptidos que se ligam ao alvo são isoladas e sequenciadas. Em algumas metodologias, cada péptido aleatório está ligado a uma molécula de ácido nucleico que inclui a sequência codificante para esse péptido aleatório particular. Os péptidos aleatórios, cada um com uma sequência codificante ligada, são colocados em contacto com uma GCC e os péptidos que não são ligados à GCC são removidos. A molécula de ácido nucleico que inclui a sequência codificante do péptido que se liga a GCC pode então ser utilizada para determinar a sequência de aminoácidos do péptido assim como produzir grandes quantidades do péptido. É também possível produzir bibliotecas de péptidos em suportes sólidos em que a localização espacial no suporte corresponde a uma síntese específica e deste modo a um péptido específico. Estes métodos utilizam 107 ΡΕ1272665 frequentemente passos do tipo fotolitografia para criar diversas bibliotecas de péptidos em suportes sólidos de modo a que o direccionamento espacial no suporte permita a determinação da sequência. A produção de bibliotecas de compostos orgânicos em suportes sólidos pode também ser utilizada para produzir bibliotecas combinatórias de compostos não péptido tais como oligonucleótidos e açúcares, por exemplo. Como no caso das bibliotecas de péptidos em suportes sólidos, a localização espacial no suporte corresponde a uma síntese específica e deste modo a um composto específico. Estes métodos utilizam frequentemente passos do tipo fotoli-tografia para criar bibliotecas de diversos compostos em suportes sólidos de modo que o direccionamento espacial no suporte permite a determinação do esquema de síntese que produziu o composto. Uma vez identificado o esquema de síntese, a estrutura do composto pode tornar-se conhecida.
Gallop et al. 1994 J. Medicinal Chemistry 37:1233, proporciona uma revisão de várias das muitas metodologias de rastreio de bibliotecas de péptidos aleatórios e identificação de péptidos destas bibliotecas que se ligam a proteínas alvo. Seguindo estes ensinamentos, os ligandos específicos de GCC que são péptidos e que são úteis como unidades específicas de ligação a GCC podem ser identificados pelos que possuem experiência de rotina na técnica.
Os péptidos e proteínas apresentados em parti- 108 ΡΕ1272665 cuias de fago são descritos em Gallop et al. Supra. As matrizes aleatórias de ácidos nucleicos podem ser inseridos em genes que codificam proteínas de superfície do bacterió-fago que são empregues para infectar bactérias, produzindo fagos que expressam os péptidos codificados pela matriz aleatória de nucleótidos na sua superfície. Este fago que apresenta o péptido pode ser empregue para determinar se os péptidos se podem ligar a proteínas específicas, recepto-res, anticorpos, etc. A identidade do péptido pode ser determinada pela sequenciação do DNA recombinante do fago que expressa o péptido. Esta abordagem tem o potencial para produzir bastantes matrizes de péptidos numa biblioteca (até 109 péptidos únicos) . Esta técnica tem sido empregue para identificar novos péptidos de ligação ao receptor de fibrinogénio nas plaquetas, que não possuem homologia de sequência com os ligandos deste receptor que ocorrem naturalmente (Smith et al., 1993 Gene 128:37). Do mesmo modo, esta técnica tem sido aplicada para identificar péptidos que se ligam ao receptor MHC de classe II (Hammer et al., 1993 Cell 74: 197) e ao receptor de chaperonina (Blond-Elguindi et al., 1993 Cell 75:717).
Os péptidos apresentados em plasmídeos são descritos em Gallop et al. Supra. Nesta abordagem, os oligonucleótidos aleatórios que codificam a biblioteca de péptidos podem ser expressos num plasmídeo específico cuja expressão está sob o controlo de um promotor específico, tais como o operão lac. Os péptidos são expressos como proteínas de fusão acopladas à proteína Lac I, sob o 109 ΡΕ1272665 controlo do operão lac. A proteína de fusão liga-se especificamente ao operador de lac no plasmídeo e deste modo o péptido aleatório é associado com o elemento específico de DNA que o codifica. Desta forma, a sequência do péptido pode ser deduzida, por PCR do DNA associado com a proteína de fusão. Estas proteínas podem ser rastreadas em fase de solução para determinar se estas se ligam a receptores específicos. Empregando esta abordagem, foram identificados novos substratos para enzimas específicas (Schatz 1993) .
Pode ser empregue uma variação da técnica acima, também descrita em Gallop et al. Supra, em que oligo-nucleótidos aleatórios que codificam bibliotecas de péptidos em plasmídeos podem ser expressos em sistemas isentos de células. Nesta abordagem, uma biblioteca molecular de DNA pode ser construída contendo a matriz aleatória de oligonucleótidos, que são depois expressos num sistema bacteriano in vitro de transcrição/tradução. A identidade do ligando é determinada pela purificação do complexo de cadeia nascente de péptido/polissoma contendo o mRNA de interesse em resinas de afinidade compostas pelo receptor e depois sequenciação após amplificação com RT-PCR. O emprego desta técnica permite a produção de grandes bibliotecas (até 1011 recombinantes) . Os péptidos que reconhecem anticorpos especificamente dirigidos para dinorfina foram identificados empregando esta técnica (Cull et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:1865). 110 ΡΕ1272665
As bibliotecas de péptidos podem ser produzidas para rastreio contra um receptor por síntese química. Por exemplo, a preparação simultânea de grande número de péptidos diversos foi produzida empregando a abordagem de síntese de péptidos múltipla como descrito em Gallop et al. Supra. Numa aplicação, são produzidos péptidos aleatórios por síntese de Merrifield convencional em fase sólida em placas de microtitulação de poliacrilamida (síntese multipin) que são subsequentemente rastreados quanto à sua capacidade para competir com a ligação ao receptor num ensaio de ligação competitiva convencional (Wang et al., 1993 Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:447). De facto, esta abordagem foi empregue para identificar novos péptidos de ligação ao receptor da substância P (Wang et al. Supra). Do mesmo modo, as bibliotecas de péptidos podem ser construídas através de síntese de péptido múltipla empregando o método da "saco de chá" em que os sacos de resina de suporte sólido são sequencialmente incubados com vários aminoácidos para produzir matrizes de diferentes péptidos (Gallop et al. Supra). Empregando esta abordagem, os péptidos que se ligam ao receptor de integrina (Ruggeri et al., 1986 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5708,) e ao receptor do neuropéptido Y (Beck-Sickinger et al., 1990 Int. J. Peptide Protein Res. 36:522,) foram identificados.
Em geral, a produção e utilidade de bibliotecas combinatórias depende de (1) um método para produzir diversas matrizes de blocos de construção, (2) um método para identificar membros da matriz que produzem a função 111 ΡΕ1272665 desejada, e (3) um método para resolver a estrutura desse membro. Foram definidas várias abordagens para estes constrangimentos. 0 que se segue é a descrição de métodos de produção de biblioteca que podem ser utilizados em procedimentos para identificar os ligandos de GCC de acordo com a invenção.
As modificações das abordagens acima podem ser empregues para produzir bibliotecas de vasta diversidade molecular através da ligação com membros de um conjunto de blocos de construção química, tais como aminoácidos, em todas as possíveis combinações (Gallop et ai. Supra). Em uma abordagem, misturas de monómeros activados são acopladas a uma cadeia em crescimento de aminoácidos num suporte sólido em cada ciclo. Isto é um sistema de síntese multivalente.
Também, a síntese dividida envolve a incubação da cadeia de crescimento em reacções individuais contendo apenas um único bloco de construção (Gallop et al. Supra). Após ligação, a resina de todas as reacções são misturadas e fraccionadas em reacções individuais para o passo seguinte de acoplamento. Estas abordagens produzem uma colecção estocástica de nx diferentes péptidos para rastreio, em que n é o número de blocos de construção e x é o número de ciclos da reacção. 112 ΡΕ1272665
Alternativamente, podem ser produzidas matrizes de moléculas em que uma ou mais posições contêm aminoácidos conhecidos, enquanto os restantes são aleatórios (Gallop et ai. Supra). Isto produz uma biblioteca limitada que é rastreada para membros com a desejada actividade. Estes membros são identificados, a sua estrutura determinada, e a estrutura regenerada com outra posição contendo aminoácidos definidos e rastreados. Esta abordagem interactiva produz no final péptidos que são óptimos para reconhecer a ligação à bolsa conformacional de um receptor.
Adicionalmente, as matrizes não são limitadas aos aminoácidos que formam os péptidos, mas podem ser estendidas a matrizes lineares e não lineares de moléculas orgânicas (Gordon et al., 1994 J. Medicinal Chemistry 37:1385,). De facto, empregando esta abordagem de produção de bibliotecas de blocos de construção inorgânicos distribuídos aleatoriamente na matriz, foram identificados ligandos que se ligam aos receptores 7-transmembranares (Zuckermann et ai., 1994 J. Med. Chem. 37:2678,).
Estão a ser presentemente construídas bibliotecas que podem ser modificadas após síntese para alterar os grupos químicos laterais e ligações, para produzir matrizes "concebidas" para testar a sua interacção com receptores (Osteresh et ai., 1994 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:11138). Esta técnica, que produz "bibliotecas de bibliotecas", foi aplicada à permetilação de uma biblioteca de péptidos que produziu compostos com actividade antimicrobiana selectiva contra bactérias gram positivas. 113 ΡΕ1272665
As bibliotecas estão também a ser construídas para expressar matrizes de motivos farmacológicos, em vez de matrizes estruturais específicas de aminoácidos (Sepetov et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:5426,). Esta técnica procura identificar motivos estruturais que possuem afinidades específicas para receptores, que podem ser modificados em refinamentos posteriores que empregam bibliotecas para definir as relações de estrutura-actividade. Empregando esta abordagem de pesquisa de motivos de bibliotecas, a produção de "bibliotecas de bibliotecas", reduz o número de componentes membros necessários para o rastreio na fase precoce do exame da biblioteca. 0 que se segue é uma descrição de métodos de identificação dos ligandos de GCC, de acordo com a invenção, de bibliotecas de moléculas aleatoriamente produzidas.
Os componentes na biblioteca que interagem com os receptores podem ser identificados através da sua ligação a receptores imobilizados num suporte sólido (Gordon et al. Supra).
Estes podem também ser identificados pela sua capacidade para competir com o ligando nativo para a ligação a receptores conhecidos em fase de solução (Gordon et al. Supra).
Os componentes podem ser identificados através da 114 ΡΕ1272665 sua ligação a receptores solúveis quando os componentes sao imobilizados em suportes sólidos (Gordon et al. Supra).
Uma vez identificado um membro de uma biblioteca que se liga aos receptores, a estrutura desse membro deve ser resolvida (deduzida) de modo a identificar a estrutura e produzir grandes quantidades para trabalho, ou desenvolver outros análogos para estudar as relações de estrutura-actividade. 0 que se segue é uma descrição de métodos de descodificação para deduzir a estrutura das moléculas identificadas como potenciais ligandos de GCC de acordo com a invenção.
As bibliotecas de péptidos podem ser expressas à superfície de partículas de bacteriófago (Gallop et al. Supra) . Quando o péptido que interage com o receptor foi identificado, a estrutura pode ser deduzida através de isolamento do DNA do fago e determinação da sua sequência por PCR.
As bibliotecas expressas em plasmídeos, sob o controlo do operão Lac podem ser destorcidas uma vez que estes péptidos são fundidos com a proteína lac I que especificamente interage com o operão lac no plasmídeo que codifica o péptido (Gallop et al. Supra). A estrutura pode ser deduzida através de isolamento do plasmídeo ligado à proteína de lac I e deduzindo a sequência de nucleótidos e péptidos por PCR. 115 ΡΕ1272665
As bibliotecas expressas em plasmídeos podem também ser expressas em sistemas isentos de células empregando sistemas de transcrição/tradução (Gallop et al. Supra). Neste paradigma, a proteína que interage com os receptores é isolada com os seus ribossomas e mRNA ligados. A sequência do péptido é deduzida através de RT-PCR do mRNA associado. A construção de bibliotecas pode ser acoplada com fotolitografia, de modo que a estrutura de qualquer membro da biblioteca pode ser deduzida pela determinação da sua posição na matriz substrato (Gallop et al. Supra). Esta técnica é denominada direccionamento posicionai, uma vez que a informação estrutural pode ser deduzida através da exacta posição do membro.
Os membros de uma biblioteca podem também ser identificados por marcação da biblioteca com matrizes identificáveis de outras moléculas (Ohlmeyer et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10922, e Gallop et al. Supra). Esta técnica é uma modificação de associação do péptido com o plasmídeo do fago que codifica a sequência, acima descrita. Alguns métodos empregam matrizes de nucleótidos para codificar a história sequencial da síntese do péptido. Deste modo, os nucleótidos são ligados ao péptido crescente sequencialmente, e podem ser descodificados por PCR para produzir a estrutura do péptido associado. Alternativamente, as matrizes de pequenas moléculas orgânicas podem ser empregues como marcas sequenciáveis que 116 ΡΕ1272665 codificam a história sequencial da síntese do péptido. Deste modo, os nucleótidos são ligados ao péptido crescente sequencialmente, e podem ser descodificados por PCR para produzir a estrutura do péptido associado. Alternativamente, as matrizes de pequenas moléculas orgânicas podem ser empregues como marcas sequenciáveis que codificam a história sequencial da síntese do membro da biblioteca.
Finalmente, a estrutura de um membro da biblioteca pode ser directamente determinada por análise de sequência de aminoácidos.
As patentes que se seguem, que são, cada uma, aqui incorporadas por referência, descrevem métodos de produzir bibliotecas de péptidos aleatórios ou de não péptidos e de rastreio destas bibliotecas para identificar compostos que se ligam a proteínas alvo. Como utilizado na presente invenção, as GCC podem ser os alvos utilizados para identificar os ligandos péptidos e não péptidos produzidos e rastreados como revelado nas patentes. A Patente U.S. Número 5 270 170 atribuída a Schatz et al. em 14 de Dezembro, 1993, e a Patente U.S. Número 5 338 665 atribuída a Schatz et al. Em 16 de Agosto, 1994, referem-se a bibliotecas de péptidos e métodos de rastreio que podem ser utilizados para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 395 750 atribuída a Dillon et al. Em7 de Março, 1995, refere-se a métodos para produzir 117 ΡΕ1272665 proteínas que se ligam a antigénios pré-determinados. Estes métodos podem ser utilizados para produzir ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 223,409 atribuída a Ladner et ai. Em 29 de Junho, 1993, refere-se a evolução dirigida para novas proteínas de ligação. Estas proteínas podem ser produzidas e rastreadas como aqui revelado para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 366 862 atribuída a Venton et ai. Em 22 de Novembro, 1994, refere-se a métodos para produzir e rastrear péptidos úteis. Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 340 474 atribuída a Kauvar em 23 de Agosto,1994 assim como a Patente U.S. N° 5 133 866, a Patente U.S. N° 4 963 263 e a Patente U.S. N° 5 217 869, podem ser utilizadas para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 405 783 atribuída a Pirrung et ai. Em 11 de Abril, 1995, refere-se a síntese fotoli-tográfica em fase sólida em larga escala de uma matriz de polímeros. Os ensinamentos desta podem ser utilizados para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 143 854 atribuída a Pirrung et al. em 1 de Setembro, 1992, refere-se a uma síntese fotolitográfica de fase sólida em larga escala de polipé-ptidos e respectivo rastreio de ligação a receptor. 118 ΡΕ1272665 A Patente U.S. N° 5 384 261 atribuída a Winkler et al. Em 24 de Janeiro, 1995, refere-se a síntese em muito larga escala de polímeros imobilizados utilizando padrões de fluxo mecanicamente direccionados. Estes métodos são úteis para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 221 736 atribuída a Coolidge et al. Em 22 de Junho, 1993, refere-se a síntese sequencial de péptido e oligonucleótido utilizando técnicas de imunoafinidade. Estas técnicas podem ser utilizadas para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 412 087 atribuída a McGall et al. Em 2 de Maio, 1995, refere-se a imobilização espacialmente direccionada de oligonucleótidos e outros polímeros biológicos em superfícies. Estes métodos podem ser utilizados para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 324 483 atribuída a Cody et al. Em 28 de Junho, 1994, refere-se a um equipamento para síntese múltipla simultânea. O equipamento e método aqui revelado podem ser utilizados para produzir compostos múltiplos que podem ser rastreados para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 252 743 atribuída a Barrett et al. Em 12 de Outubro, 1993, refere-se a imobilização espacialmente direccionada de anti-ligandos em superfícies. Os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para identificar ligandos de GCC. 119 ΡΕ1272665 A Patente U.S. N° 5 424 186 atribuída a Foder et al. Em 13 de Junho, 1995, refere-se a uma síntese em muito larga escala de polímero imobilizado. 0 método de síntese de oligonucleótidos aqui descrito pode ser utilizado para identificar ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 420 328 atribuída a Campbell em 30 de Maio, 1995, refere-se a métodos de síntese de ésteres de fosfonato. Os ésteres de fosfonato assim produzidos podem ser rastreados para identificar compostos que são ligandos de GCC. A Patente U.S. N° 5 288 514 atribuída a Ellman em 22 de Fevereiro, 1994, refere-se a síntese em fase sólida e combinatória de compostos de benzodiazepina num suporte sólido. Estes métodos e compostos podem ser utilizados para identificar ligandos de GCC.
Como notado acima, os ligandos de GCC podem também ser anticorpos e seus fragmentos. De facto, os anticorpos produzidos contra determinantes únicos destes recep-tores reconhecerão que a proteína, e apenas essa proteína e, consequentemente, podem servir como uma molécula específica de direccionamento a qual pode ser utilizada para direccionar novos produtos de diagnóstico e terapêuticos para este marcador único. Adicionalmente, estes anticorpos podem ser utilizados para identificar a presença de GCC ou seus fragmentos em amostras biológicas. 120 ΡΕ1272665
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Thomas Jefferson University Waldman. Scott A. Park, Jason Schulz, Stephanie <120> Composições e Métodos Para Identificar e Alcançar Células de cancro com origem no Tubo digestivo <130> TJU2469 <150> 60/192,229 <151> 2000-03-27 <160> 2 <170> Patentln versão 3.0
<210> 1 <211> 3787 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (118)..(3336) <400> 1 tggagtgggc tgsgggactc cactagaggc tgtccatctg gattccctgc ctccctagga 60 geccaacaga gcaaagcaag fcgggcacaag gagtatggtt ctsacgtgat tggggtc 117 atg aag acg ttg ctg ttg gae ttg gct ttg tgg cca ctg ctc ttc cag 165 Met 1 Lys Thr leu leu 5 teu Asp teu Alá teu 10 Trp Ser teu teu Ptee 15 Gin ccc 999 tgg ctg tcc ttt agt tcc cag gtg agt cag aac tgc cac aat 213 Pr o Gly ttp leu 30 Ser Phe Ser Ser Gin 25 vai Ser Gin Asn Cys 30 «is Asn ggc age tat gaa ate age gtc ctg atg atg ggc aac tea gee ttt gea 261 Gly Ser fyr 35 Glu lie Ser vai teu 40 «et Met Gly Asn Ser 45 Ala Phe Ala gag ccc etg aaa aac ttg gae gat gcg gtg aat gag 999 ctg gaa ata 309 Glu Pro 50 tes lys Asn teu Glu 55 Aap Ala vai Asn Glu 60 Gly teu Glu Xle gtg aga 99« cgt ctg caa aat gct ggc cta aat gtg act gtg aac gct 357 «ai 65 Arg Gly Arg leu Gin 70 Asn Ala Gly teu as» val 75 Thr val Asn Ala 80 act ttc afcg tat teg gat ggt ctg att cat aac tea 99« gae tgc cgg 405 Ihr Phe Met Tyr Ser SS Asp Gly teu Ile His 90 Asn Ser Gly Asp Cys 95 Arg • agt age acc tgt gaa 99Ç ctc gac cta ctc agg aaa att tea aat gea 453 Ser Ser Thr Cya 100 Glu Gly teu ASp teu 105 teu Arg tys lie Ser iio Asn Ala caa cgg atg 99C tgt gtc ctc ata ggg ccc tea tgt aca tac tcc acc 301 Gin Arg Met 115 Gly Cys Vai teu 11« 120 Gly Pro Ser Cys Thr 125 Tyr Ser Thr 121 ΡΕ1272665 tce cag atg tac ctt gac aca gaa ttg age tac ccc atg ate tea gct 549
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<210> 2 <211> 1073 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 125 ΡΕ1272665 mt tys Thr teu teu teu Asp teu Ala teu Trp ser teu teu Phe Cio 1 S 10 15
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Lisboa, 24 de Agosto de 2010

Claims (45)

  1. ΡΕ1272665 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro de rastreio, num indivíduo que é suspeito de ter cancro de estômago ou esófago primário ou metastático, para células de cancro do estômago ou esófago primárias ou metastáticas compreendendo os passos de exame de uma amostra de tecido extraintestinal e/ou fluidos corporais de um indivíduo para determinar se GCC está a ser expressa pelas células na referida amostra em que a expressão da referida GCC indica uma possibilidade de células de cancro do estômago ou esófago primárias ou metastáticas na referida amostra.
  2. 2. Método da reivindicação 1, em que a expressão da referida GCC pelas referidas células é determinada pela detecção da presença do produto da transcrição do gene GCC.
  3. 3. Método da reivindicação 1, em que a expressão da referida GCC pelas referidas células é determinada pela reacção em cadeia pela polimerase em que a referida amostra é colocada em contacto com iniciadores que selecti-vamente amplificam o transcrito do gene GCG ou o cDNA criado a partir deste.
  4. 4. Método da reivindicação 1, em que a expressão da referida GCC pelas referidas células é determinada pelo imunoensaio em que a referida amostra é colocada em 2 ΡΕ1272665 contacto com anticorpos que especificamente se ligam ao produto da tradução do gene GCC.
  5. 5. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é fluido corporal.
  6. 6. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é sangue.
  7. 7. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é tecido linfático e ou fluido.
  8. 8. Método da reivindicação 1, em que a referida amostra é uma amostra de nódulo linfático.
  9. 9. Método da reivindicação 1, em que o indivíduo foi previamente diagnosticado como tendo cancro de estômago ou esófago.
  10. 10. Método da reivindicação 1, em que o indivíduo foi previamente diagnosticado com e tratado para cancro de estômago ou esófago.
  11. 11. Método de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que a amostra é uma célula de tumor.
  12. 12. Método in vitro de rastreio um indivíduo, suspeito de ter cancro de estômago ou esófago primário ou metastático, para células de cancro do estômago ou esófago 3 ΡΕ1272665 primárias ou metastáticas compreendendo os passos de exame de uma amostra de tecido extraintestinal e/ou fluidos corporais de um indivíduo para determinar se o produto de transcrição ou de tradução do gene GCC está presente na referida amostra em que a presença produto de transcrição ou de tradução do gene GCC na referida amostra indica que o indivíduo pode ter células de cancro do estômago ou esófago primárias ou metastáticas na referida amostra.
  13. 13. Método da reivindicação 12 compreendendo os passos de exame de uma amostra de tecido extraintestinal e/ou fluidos corporais de um indivíduo para determinar se o produto da transcrição do gene GCC está presente na referida amostra.
  14. 14. Método da reivindicação 13, em que a presença do produto da transcrição do gene GCC é determinada pela reacção em cadeia pela polimerase em que a referida amostra é colocada em contacto com iniciadores que selectivamente amplificam o transcrito do gene GCG ou o cDNA criado a partir deste.
  15. 15. Método da reivindicação 12, em que a presença do produto da tradução do gene GCC é determinada pelo imunoensaio em que a referida amostra é colocada em contacto com anticorpos que especificamente se ligam ao produto da tradução do gene GCC. 4 ΡΕ1272665
  16. 16. Método da reivindicação 12, em gue a referi- da amostra é fluido corporal.
  17. 17. Método da reivindicação 12, em que a referi- da amostra é sangue.
  18. 18 . Método da reivindicação 12, em que a referi- da amostra é tecido linfático e ou fluido.
  19. 19 . Método da reivindicação 12, em que a referi- da amostra é uma amostra de nódulo linfático.
  20. 20 . Método da reivindicação 12, em que o indiví- duo foi previamente diagnosticado como tendo cancro de estômago ou esófago.
  21. 21. Método da reivindicação 12, em gue o indivíduo foi previamente diagnosticado com e tratado para cancro de estômago ou esófago.
  22. 22. Método de diagnosticar um indivíduo gue tem cancro do estômago compreendendo os passos de exame de uma amostra de tecido do estômago para detectar a presença de produto do transcrito ou da tradução de GCC em gue a presença do produto do transcrito ou da tradução de GCC numa amostra de estômago indica cancro do estômago.
  23. 23 . Método da reivindicação 22 compreendendo os passos de exame da referida amostra de tecido do estômago 5 ΡΕ1272665 para determinar se o produto da transcrição do gene GCC está presente na referida amostra.
  24. 24. Método da reivindicação 23, em que a presença do produto da transcrição do gene GCC é determinada pela reacção em cadeia pela polimerase em que a referida amostra é colocada em contacto com iniciadores que selectivamente amplificam o transcrito do gene GCG ou o cDNA criado a partir deste.
  25. 25. Método da reivindicação 23, em que a presença do produto da tradução do gene GCC é determinada pelo imunoensaio em que a referida amostra é colocada em contacto com anticorpos que especificamente se ligam ao produto da tradução do gene GCC.
  26. 26. Método de diagnosticar um indivíduo que tem cancro do esófago compreendendo os passos de exame de uma amostra de tecido do esófago para detectar a presença do produto do transcrito ou da tradução de GCC em que a presença do produto do transcrito ou da tradução de GCC numa amostra esofágica indica cancro do esófago.
  27. 27. Método da reivindicação 26 compreendendo os passos de exame da referida amostra de tecido esofágico para determinar se o produto da transcrição do gene GCC está presente na referida amostra.
  28. 28. Método da reivindicação 27, em que a presen- 6 ΡΕ1272665 ça do produto da transcrição do gene GCC é determinada pela reacção em cadeia pela polimerase em que a referida amostra é colocada em contacto com iniciadores que selectivamente amplificam o transcrito do gene GCG ou o cDNA criado a partir deste
  29. 29. Método da reivindicação 26, em que a presença do produto da tradução do gene GCC é determinada pelo imunoensaio em que a referida amostra é colocada em contacto com anticorpos que especificamente se ligam ao produto da tradução do gene GCC.
  30. 30. Utilização de um ligando de GCC conjugado com um agente activo em que o agente activo é seleccionado a partir de uma enzima activa, um quimioterapêutico, toxina, radioterapêutico, agente de direccionamento ou agente radiossensibilização para utilização no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro de estômago ou esófago, primário ou metastático, em que o referido ligando de GCC é um anticorpo.
  31. 31. Utilização da reivindicação 30, em que o referido um agente activo é seleccionado a partir do grupo consistindo em: metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, citosinarabinósido, etopósido, 5-4 fluorouracilo, melfala-no, clorambucil, cis-platina, vindesina, mitomicina, bleo-micina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzo-quinona, trenimona, ricina, cadeia A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de difteria, fosfolipase C de 7 ΡΕ1272665 Clostridium perfringens, ribonuclease pancreática bovina, proteína antiviral de tintureira, abrina, cadeia A de abrina, factor do veneno de cobra, gelonina, saporina, modecina, viscumina, volkensina, fosfatase alcalina, nitroimidazole, metronidazole, misonidazole, 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125 T -L f 131 T t 186Re, 188Re, 199Au, 211 At, 212Pb, 212Bi, 32P e 33P, 71Ge, 77 As, 103 Pb, 105Rb, inAg, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb , 177Lu , 1910s, 193Mp^_ 197 Hg, 43 K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81M- Kr, 87MSr, 99MTc, ^in, 113MIn, 123 y -L t 123-r -1- f 127Cs, 129Cs, 131 T -L f 132 I, 197Hg, 203Pb e 206Bi .
  32. 32. Utilização da reivindicação 31, em que o referido anticorpo é humanizado, primatizado ou humano.
  33. 33. Utilização da reivindicação 31, em que o referido ligando de GCC é um anticorpo monoclonal de murino ou um anticorpo quimérico.
  34. 34. Utilização de qualquer uma das reivindicações 30-33, em que o referido ligando de GCC é um anticorpo completo, intacto, um fragmento Fab ou um fragmento F(ab)2.
  35. 35. Utilização de qualquer uma das reivindicações 30 a 34, em que o agente activo é um agente quimio-terapêutico que causa a morte celular, inibe a divisão celular ou induz diferenciação.
  36. 36. Utilização de um ligando de GCC ligado a um agente detectável no fabrico de um medicamento para radio- ΡΕ1272665 processamento de imagem de células de cancro do estômago ou esófago primárias ou metastáticas em que o referido ligando de GCC é um anticorpo.
  37. 37. Utilização da reivindicação 36, em que o referido agente detectável é seleccionado a partir do grupo consi stindo em: 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123 y -L r 125 T r 131i, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 32P e 33p, 71Ge, 11 As, 103Pb, 105Rh, xllAg, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 1910s 193MPt 197Hg, 43K, 52 Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga , 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81MKr, 8™Sr 99MTc, niIn, 113MIn, 123I 125I, 127Cs, 129CS, 131i, 132 y -L r 197Hg, 203Pb e 206Bi.
  38. 38. Método de detectar evidência de expressão do gene GCC em amostra de tecido esofágico de um indivíduo susceptível ao cancro de estômago ou esófago, compreendendo o método o passo de exame de uma amostra de tecido esofágico de um indivíduo para detectar a presença de proteína GCG na amostra.
  39. 39. Método da reivindicação 38 compreendendo ainda o passo de remover a amostra de tecido esofágico de um indivíduo antes da detecção da presença da proteína GCC.
  40. 40. Método da reivindicação 38 ou reivindicação 39, em que a proteína GCC é detectada pelo imunoensaio em que a referida amostra é colocada em contacto com anticorpos que especificamente se ligam à proteína GCC. 9 ΡΕ1272665
  41. 41. Método de detectar evidência de expressão do gene GCC numa amostra de tecido esofágico de um indivíduo susceptível ao cancro de estômago ou esófago, compreendendo o método o passo de exame de uma amostra de tecido esofágico de um indivíduo para detectar a presença do mRNA que codifica GCC.
  42. 42. Método da reivindicação 41 compreendendo ainda o passo de remover a amostra de tecido esofágico de um indivíduo antes da detecção da presença de mRNA que codifica GCC.
  43. 43. Método da reivindicação 41 ou reivindicação 42 em que o mRNA que codifica GCC é detectado por reacção em cadeia pela polimerase utilizando iniciadores que selectivamente amplificam mRNA que codifica GCC ou o cDNA criado a partir deste.
  44. 44. Método da reivindicação de qualquer uma das reivindicações 38, 39, 41 ou 42 em que o indivíduo foi previamente diagnosticado como tendo cancro do esófago. Lisboa, 24 de Agosto de 2010 1 ΡΕ1272665 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição US 551SSSS A us seo ·«* & US®B6®33?A US 596222® A US S879656 A m 16023737 à WO S511894 A WQ 9742506 A 1WO 9742220 A US 4863202 A. US46831S5A US 4565168 A OS 507521¾ A US 5597B03 A OS 5437977 A OS 5439138 A US 9001515 W •JS 4945050 A, Ssntor-á OS 501:7497 A. Statefibetig OS 4873191 A, Ws§ner OS 475688®· A. 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