PT1200436E

PT1200436E - Método para fazer estereoisómeros puros de sais de éster do ácido tetra-hidrofólico e do ácido tetra-hidrofólico por cristalização fraccionada de sais do ácido tetra-hidrofólico

Info

Publication number: PT1200436E
Application number: PT00949322T
Authority: PT
Inventors: Viola Groehn; Hans Rudolf Muller; Rudolf Moser
Original assignee: Merck Eprova Ag
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-12
Publication date: 2009-02-10
Also published as: JP2003504371A; DK1200436T3; EP1200436A1; CH695217A5; CN1206229C; CA2378869C; AU6272700A; ES2316375T3; CA2378869A1; ATE412654T1; JP4949581B2; DE50015428D1; EP1200436B1; US6858731B1; CN1360586A; WO2001004121A1

Description

1 DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA FAZER ESTEREOISÓMEROS PUROS DE SAIS DE ÉSTER DO ÁCIDO TETRA-HIDROFÓLICO E DO ÁCIDO TETRA-HIDROFÓLICO POR CRISTALIZAÇÃO FRACCIONADA DE SAIS DO ÁCIDO TETRA-HIDROFÓLICO" A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação e concentração de sais de éster de ácido (6S, aS)- ou (6S, aR)-tetra-hidrofólico e de ácido (6S, aS)- ou (6S, aR)-tetra-hidrofólico, por se preparar ou dissolver misturas equimolares ou concentradas de diastereómeros de sais de adição de ésteres do ácido tetra-hidrofólico com ácidos sulfónicos aromáticos em um solvente orgânico, seguido pela cristalização destes, pelo menos uma vez, e se for caso disso hidrolisá-los para produzir ácido (6S, aS) - ou (6S, aR)-tetra-hidrofólico e a cristalização destes como o ácido livre ou isolá-los sob a forma dos seus sais. Os sais de adição dos ésteres do ácido (6S, aS)- ou (6S, aR)-tetra-hidrofólico podem ser isolados, com os ácidos sulfónicos correspondentes do licor mãe e os correspondentes ácidos tetra-hidrofólicos ou os seus sais obtidos por hidrólise. 0 ácido fólico é representado na Fórmula I,

em que o átomo α-C assimétrico pode estar presente no residuo do ácido glutamínico na configuração S (aS), ou na configuração R (aR) . A seguir os enantiómeros do ácido fólico vão ser referidos 2 como ácido fólico (aS) e ácido fólico (aR) . 0 mesmo acontece com os ésteres do ácido fólico e os seus derivados. Eles serão referidos como ésteres de ácido fólico (aS) e ésteres de ácido fólico (aR). 0 ácido fólico que ocorre naturalmente corresponde ao ácido fólico (aS) . 0 ácido tetra-hidrofólico é representado na fórmula II,

em que o átomo α-C assimétrico pode estar presente no resíduo do ácido glutamínico na configuração S (aS), ou na configuração R (aR), e o átomo C 6 assimétrico no radical de tetra-hidropterina pode estar presente na configuração S (6S) ou na configuração R (6R). A seguir os diastereómeros do ácido tetra-hidrofólico serão designados como o ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) , (6S, aR) , (6R, aS) e (6R, aR) . 0 mesmo se aplica para os ésteres do ácido tetra-hidrofólico e os seus derivados. Eles serão referidos como ésteres do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS), (6S, aR), (6R, aS) e (6R, aR). 0 ácido tetra-hidrofólico que ocorre naturalmente corresponde ao ácido tetra-hidrofólico (6S, aS). A seguir, o termo ácido fólico, ésteres de ácido fólico e sais de éster de ácido fólico, salvo designação em contrário, compreende sempre os dois enantiómeros (aS) e (aR), e o termo ácido tetra-hidrofólico, ésteres de ácido tetra-hidrofólico e sais de éster do 3 ácido tetra-hidrofólico compreende todos os possíveis diastereómeros.

Verificou-se que o ácido tetra-hidrofólico tem uma ampla aplicação terapêutica, sob a forma de derivados de 5-formil ou de 5-metil e os seus sais fisiologicamente compatíveis. Há muito que se sabe que a actividade biológica de diastereómeros que ocorre naturalmente dos folatos reduzidos, por exemplo, do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) , é de longe a mais vigorosa. Por isso, faz sentido fornecer preparações terapêuticas que contenham somente a forma mais activa ou no qual esta última é, no mínimo, altamente concentrada. A uma escala industrial o ácido tetra-hidrofólico é geralmente feito por hidrogenação heterogénea dos dois grupos imino no esqueleto de pterina do ácido fólico (aS), obtendo-se geralmente uma mistura equimolar de ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) e de ácido tetra-hidrof ólico (6R, aS) . A mistura equimolar pode ser usada para formulações farmacêuticas. Antecipadamente, no entanto, também é possível concentrar o diasterómero (6S, aS) desejado de ácido tetra-hidrofólico por cristalização fraccionada ou recuperá-lo na sua forma pura, para o qual vários processos são conhecidos, ver por exemplo a patente EP-0 495 204. O processo descrito na patente EP-0 495 204 utiliza as misturas equimolares de diastereómeros (6 S, aS) e (6R, aS) sais do ácido sulfónico do ácido tetra-hidrofólico, os quais são dissolvidos em água e depois cristalizados. Este processo resulta na concentração dos diastereómeros (6S, aS) desejados, sendo já possível atingir concentrações muito elevadas no primeiro passo de cristalização (até cerca de 95%) e obter-se ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) puro através de uma cristalização fraccionada adicional. Este processo não é um sério candidato, nomeadamente a partir do ponto de vista 4 económico, uma vez que os ácidos sulfónicos utilizados para a formação de sal só podem ser isolados a partir de licores mãe aquosos com grande esforço, e, por isso, torna-se necessário dispor de grandes volumes de licores mãe contendo ácido sulfónico, o que é economicamente inviável. A patente EP-0 682 026 descreve a preparação do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) e (6R, aS) cristalino estável através da cristalização de um meio aquoso em determinados pHs. No entanto, as concentrações, no caso das cristalisações fraccionadas são tão baixas que são necessários múltiplos passos para concentrar o diastereómero desejado acima de 99,5%. Isto acarreta grandes perdas de substância e o risco de formação de produtos químicos desagregados. A utilização deste processo para a concentração de isómeros sintéticos é especialmente trabalhoso.

Surpreendentemente, verificou-se que os sais de ácido sulfónico aromático (sais de adição) dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico são eminentemente adequados para a preparação dos diastereómeros opticamente puros do ácido tetrahidrofólico porque somente os sais de adição do diastereómero (6 S, aS) ou (6S, aR) cristalizam a partir de solventes orgânicos. A partir de uma mistura de isómero de 70:30, mesmo uma primeira cristalização produz uma concentração anormalmente elevada, talvez até superior a 99%, do diastereómero (6S, aS) ou (6S, aR) , respectivamente, ou as suas misturas no cristalisado, e do diastereómero (6R, aS) ou (6R, aR) , respectivamente, ou as suas misturas, no licor mãe. Com uma cristalização adicional, em seguida, normalmente, é possível obterem-se os diastereómeros opticamente puros. O objectivo da invenção é um processo para a preparação e a concentração de sais do éster do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) 5 ou (6S, aR) e do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) ou (6S, aR) , caracterizado pela preparação ou dissolução de misturas concentradas ou equimolares de diastereómeros de sais de adição de ésteres do ácido tetra-hidrofólico com ácidos sulfónicos aromáticos em solventes orgânicos, seguido pela cristalização deles, pelo menos uma vez, e depois, se for o caso, hidrolizar o cristalizado para produzir o ácido tetra-hidrof ólico (6 S, aS) ou (6 S, aR) , cristalizando este último como um ácido livre ou isolando-o na forma de um sal.

No âmbito da invenção, a cristalização de pelo menos uma vez, significa a cristalização fraccionada para o grau de pureza desejado. 0 número de etapas de cristalização será determinado principalmente em função de quanto do(s) diastereómero(s) desejado(s) está contido no produto de partida.

Os sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico podem ser de fórmula III e abacarem os diastereómeros (6S, aS) , (6S, aR) , (6R, aS) e (6R, aR) ,

H m em que Ri e R2 são H, e um de Ri ou R2, ou ambos Ri e R2 independentemente um do outro representam um radical de hidrocarboneto monovalente ou um radical de hetero-hidrocarboneto anexado através de um átomo C, com heteroátomos seleccionados a partir do grupo que compreende -0-, -S- e -N-, HA representa um ácido sulfónico aromático, 6 e x é um número inteiro de 1 a 6 ou um número fraccionário entre 0 e 6.

Ri e R2 podem ser seleccionados independentemente um do outro, mas são preferencialmente idênticos. É preferível que Ri e R2 representem um radical de hidrocarboneto. Com Ri e R2 como um radical de hidrocarboneto, os radicais de referência podem ser radicais alifáticos que têm de 1 a 20 átomos de carbono, preferivelmente de 1 a 12, mais especificamente de 1 a 8, e mais preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono, os radicais cicloalifáticos ou cicloalifáticos-alifáticos que têm de 3 a 8 átomos de hidrocarboneto cíclicos e de 1 a 6 átomos de carbono no radical alifático, os radicais de hidrocarboneto aromáticos com 6 a 14 átomos de carbono, mais particularmente, de 6 a 10 átomos de carbono, ou os radicais de hidrocarboneto alifáticos, aromáticos que têm de 7 a 15 átomos de carbono, mais particularmente, de 7 a 10 átomos de carbono. O radical de hetero-hidrocarboneto pode ser p heteroalquilo que tem de 2 a 16 átomos de carbono, preferivelmente de 2 a 10 átomos de carbono, e mais especialmente de 2 a 6 átomos de carbono, os radicais heterocicloalifáticos que têm de 3 a 8, preferivelmente 5 ou 6 ligações de anéis, os radicais heterocicloalifáticos-alifáticos que têmde 3 a 8, preferivelmente 5 ou 6 ligações de anéis, e 1 a 6, preferivelmente 1 a 4 átomos de carbono no radical alifático, os radicais heteroaromáticos que têm preferivelmente 4 a 13 átomos de carbono, e mais especialmente 4 a 9 átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo, e os radicais heteroaromáticos-alifáticos que têm preferivelmente 4 a 13 átomos de carbono, e mais especialmente 4 a 9 átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo, e 1 a 6, preferivelmente 1 a 4 átomos de carbono no radical alifático, em que os radicais hetero contêm pelo menos um átomo 7 hetero seleccionado a partir do grupo -0-, -S- e -N- e preferivelmente -0- e -N-.

Os radicais de hidrocarboneto podem, por exemplo, ser seleccionados a partir do grupo que compreende alquilo C1-C20/ cicloalquilo C3-C8 e preferivelmente cicloalquilo C4-C7, cicloalquilo C3_C8_alquilo Ci-Ce e preferivelmente cicloalquilo C4-C7-alquilo C1-C4, arilo C6-C10 ou aralquilo C7-C12 linear e ramificado.

Os radicais de hetero-hidrocarboneto podem, por exemplo, ser seleccionados a partir do grupo que compreende heteroalquilo C2-C16, heterocicloalquilo C2-C7 e preferivelmente heterocicloalquilo C4-C5, heterocicloalquilo C4-C7-alquilo Ci-C6 e preferivelmente heterocicloalquilo C4-Cs-alquilo C1-C6, heteroarilo C4-C9 e preferivelmente heteroarilo C4-C5, e heteroaralquilo C5-C12 e preferivelmente heteroaralquilo C5-C10, em que os radicais hetero contêm 1 a 3, preferivelmente 1 ou 2, heteroátomos a partir do grupo que compreende -0- e -N-.

Ri e R2 podem ser alquilo linear ou ramificado que preferivelmente contém de 1 a 12 átomos de carbono, mais especificamente de 1 a 8, e mais preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono. Os exemplos são metilo, etilo, e os isómeros de propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo, octadecilo e eicosilo. 0 alquilo é preferivelmente linear e o alquilo é preferencialmente metilo, etilo, n-propilo e n-butilo. É o mais preferido de todos se o alquilo for metilo.

Como cicloalquilo, Ri e R2 contêm preferencialmente de 4 a 7 e mais preferivelmente 5 ou 6 átomos de hidrocarboneto ciclicos. Os exemplos de cicloalquilo são ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo. 0 ciclo- hexilo é especialmente preferido.

Como cicloaquilo-alquilo, Ri e R2 contêm preferencialmente de 4 a 7 e mais preferivelmente 5 ou 6 átomos de hidrocarboneto ciclico e, preferencialmente, de 1 a 4 e mais preferivelmente 1 ou 2 átomos de carbono no radical alifático. Os exemplos de cicloalquilo-alquilo são metilo de ciclopropilo ou etilo de ciclopropilo, metilo de ciclobutilo ou propilo de ciclobutilo, metilo de ciclopentilo ou etilo de ciclopentilo, metilo de ciclo-hexilo ou etilo de ciclohexilo, metilo de ciclo-heptilo e metilo de ciclo-octilo. 0 metilo de ciclo-hexilo ou o etilo de ciclo-hexilo é especialmente preferido.

Como arilo, Ri e R2 podem ser naftilo e preferivelmente fenilo. Como aralquilo, Ri e R2 são preferencialmente alquilo de fenilo tendo preferivelmente de 1 a 4 átomos de carbono no alquilo. Os exemplos são benzilo e β-etilo de fenilo.

Como heteroalquilo, Ri e R2 podem, por exemplo, ser Ci-C4-alquilo-Xi-C2-C4-alquilo, em que Xi representa 0 ou NCi-C4-alquilo. Os exemplos são etilo de metoxilo e etilo de etoxilo.

Como heterocicloalquilo, Ri e R2 podem, por exemplo, ser pirrolidinilo, piperidinilo, morfolinilo, tetra-hydropiranilo ou piperazinilo.

Como heterocicloalquilo-alquilo, Ri e R2 podem, por exemplo, ser metilo de pirrolidinilo ou etilo de pirrolidinilo, metilo de piperidinilo ou etilo de piperidinilo, metilo de morfolinilo ou etilo de morfolinilo, metilo de tetra-hidropiranilo ou etilo de 9 tetra-hidropiranilo ou metilo de piperazinilo ou etilo de piperazinilo.

Como heteroarilo, Ri e furanilo, piranilo, pirimidinilo, pirazinilo, oxazolilo. R2 podem, por exemplo, ser tiofenilo, pirrolilo, imidazolilo, piridinilo, indolilo, quinolinilo, oxazolilo ou iso-

Como heteroaralquilo, Ri e R2 podem, por exemplo, ser metilo de furanilo ou etilo de furanilo, metilo de piranilo ou etilo de piranilo, metilo de pirrolilo ou etilo de pirrolilo, metilo de imidazolilo ou etilo de imidazolilo, metilo de piridinilo ou etilo de piridinilo, metilo de pirimidinilo ou etilo de pirimidinilo, metilo de pirazinilo ou etilo de pirazinilo, metilo de indolilo ou etilo de indolilo, metilo de quinolinilo ou etilo de quinolinilo.

Um grupo preferido de compostos de fórmula III são aqueles em que Ri e R2 independentemente um do outro representam alquilo C1-C4, cicloalquilo C5 ou cicloalquilo C6, fenilo, fenilo de alquilo C1-C4, benzilo ou benzilo de alquilo C1-C4. Ri e R2 são preferencialmente radicais idênticos. É o mais preferido de todos, se Ri e R2 representarem alquilo C1-C4, por exemplo, metilo ou etilo.

Na fórmula III, x preferencialmente denota um número inteiro ou fraccionário de 0,5 a 4, mais especificamente um número inteiro ou fraccionário de 0,5 a 3 e, mais especialmente um número inteiro ou fraccionário de 0,5 a 2.

Os ácidos sulfónicos aromáticos podem conter de um a três, preferivelmente um ou dois, e mais especialmente um grupo ácido sulfónico. Os ácidos sulfónicos de hidrocarbonetos aromáticos são preferidos. Os ácidos sulfónicos aromáticos podem ser substituídos 10 ou não substituídos com halogéneo, alquilo Ci-Cs linear ou ramificado, preferivelmente alquilo C1-C4, alcoxilo Ci-Cs linear ou ramificado, preferivelmente alcoxilo C1-C4, e haloalquilo Ci-Cs linear ou ramificado, preferivelmente haloalquilo C1-C4. Alguns exemplos de substituintes são metilo, etilo, propilo, butilo, metoxilo, etoxilo, trifluorometilo ou triclorometilo, flúor e cloro. O radical aromático contém preferivelmente um substituinte. O fenilo e o naftilo são preferidos entre os grupos aromáticos. A maioria dos ácidos sulfónicos aromáticos são preferivelmente de fórmula IV, R3-SO3H (IV), em que R3 representa fenilo, substituído ou não substituído com F, Cl, Br, alquilo C1-C4, haloalquilo C1-C4 ou alcoxilo C1-C4. Alguns exemplos específicos de R3 são fenilo, fenilo de metilo, fluorofenilo, clorofenilo, fenilo de triclorometilo e fenilo de trifluorometilo.

Os compostos de fórmula III especialmente preferidos são aqueles em que Ri e R2 representam cada um metilo, x representa 1 ou 2 ou um número fracionário entre 0,5 e 2, e HA denota ácido fenilsulfónico, ácido toluilsulfónico, ácido fluorosulfónico, ácido clorosulfónico ou ácido sulfónico de trifluorometilfenilo. Os radicais substituídos preferidos são p-fenilo de p-toluilmetilo, fenilo de p-fluormetilo, fenilo de p-clorometilo ou fenilo de p- trifluorometilo. A maior parte dos compostos de fórmula III preferidos de todos são aqueles em que Ri e R2 representam cada um metilo, x representa 1 ou 2 ou um número fracionário entre 0,5 e 2, e HA denota ácido fenilsulfónico ou ácido p-toluilsulfónico. 11

Os sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico utilizados de acordo com a invenção são novos e podem, por exemplo, ser preparados pela esterificação do ácido tetra-hidrofólico, na presença de ácidos sulfónicos, ou pela esterificação dos sais de ácido tetra-hidrofólico em um solvente orgânico polar.

Também é possivel iniciar a partir de ácido fólico, e hidrogenar este último com hidrogénio de uma maneira conhecida em si mesma, na presença de catalisadores de hidrogenação heterogéneos ou homogéneos. A hidrogenação também pode ser realizada diastereoselectivamente se a hidrogenação for realizada com hidrogénio em um meio de reacção polar, por exemplo, um meio de reacção alcoólico ou aquoso, na presença de catalisadores de hidrogenação quirais que são solúveis no meio reaccional. Os catalisadores de hidrogenação adequados são conhecidos. Em particular, estes são complexos metálicos de Rh, Ir ou Ru com difosfinas di-terciárias, como, por exemplo, descrito por H. Brunner e W. Zettlmeier, Handbook of Enantioselective Catalysis, volume II: Referências de Ligandos, publicado pela VCH mbH, Weinheim (1993). 0 ácido tetra-hidrofólico resultante pode ser posteriormente esterifiçado de uma maneira conhecida por si só. Se a hidrogenação ocorrer em um álcool como solvente e na presença de um ácido sulfónico sob condições de reacção que resultam na esterificação do ácido fólico, isto resulta directamente nos sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico correspondente e dos ácidos sulfónicos.

Em alternativa, no entanto, é possivel iniciar a partir de ésteres de ácido fólico, e hidrogená-los de uma maneira conhecida por si só com hidrogénio na presença de catalisadores de hidrogenação heterogéneos ou homogéneos. A hidrogenação também pode ser realizada diastereoselectivamente se a hidrogenação for realizada 12 com hidrogénio em um meio de reacção polar, por exemplo, um meio de reacção alcoólico, na presença de catalisadores de hidrogenação quirais que são solúveis no meio reaccional. Os ésteres do ácido tetra-hidrofólico resultante podem ser posteriormente convertidos com ácidos sulfónicos em sais de adição. A hidrogenação pode ser realizada, conforme descrito anteriormente, utilizando complexos metálicos solúveis em álcool de Ir, Rh ou Ru e difosfinas di-terciárias como catalisadores de hidrogenação. Se a hidrogenação ocorrer em um álcool como solvente e na presença de um ácido sulfónico, isso resulta directamente nos sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico e dos ácidos sulfónicos correspondentes. Se os sais de adição dos ésteres do ácido fólico com os ácidos sulfónicos forem utilizados para a hidrogenação, este resulta da mesma maneira directamente nos sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico e dos ácidos sulfónicos.

As misturas concentradas ou equimolares no âmbito da invenção são tomadas no sentido de misturas que contêm quer quantidades idênticas de diastereómeros com a configuração (6S) e (6R) ou um excedente de um diastereómero com a configuração (6S) ou (6R) . E também possível empregar misturas de diastereómeros com a configuração (6S) e (6R) que possui, quer a configuração (aS) ou (aR), ou misturas de pares de diastereómeros com a configuração (6S) e (6R) e uma configuração diferente no átomo α-C. As misturas podem conter respectivamente os diastereómeros (6S, aS) ou (6S, aR) numa proporção de pelo menos 5%, preferivelmente pelo menos de 20%, e mais preferivelmente pelo menos de 30% e até cerca de 75% ou mais.

Os solventes orgânicos adequados são solventes orgânicos polares, que são preferivelmente capazes de dissolver pelo menos 1 g de sal de adição de um éster do ácido tetra-hidrofólico por litro de 13 solvente à temperatura de ebulição. Os exemplos de solventes são halo-hidrocarbonetos (cloreto de metileno, clorofórmio, tetracloroetano, clorobenzeno); éteres (éter dietilico, éter dibutilico, tetra-hidrofurano, dioxano, éter de dimetilo de etileno-glicol ou éter etílico de etileno-glicol); ésteres de ácido carboxílico e lactonas (acetato de metilo, acetato de etilo, propionato de metilo, valerolactona); amidas de ácido carboxílico N,N-substituído e lactamas (formamida de dimetilo, acetamida de dimetilo, pirrolidona de N-metilo); cetonas (acetona, cetona de isobutilo de metilo, ciclo-hexanona); sulfóxidos e sulfonas (sulfóxido de dimetilo, sulfona de dimetilo, sulfona de tetrametileno); e álcoois (metanol, etanol, n-propanol ou i-propanol, n-butanol, i-butanol ou t-butanol, pentanol, hexanol, ciclo-hexanol, ciclo-hexanodiol, ciclo-hexano de hidroximetilo ou ciclo-hexano de di-hidroximetilo, álcool benzílico, etileno-glicol, dietileno glicol, propanodiol, butanodiol, éter de monometilo de etileno-glicol ou éter monoetílico de etileno-glicol, e éter de monometilo de dietileno glicol ou éter monoetílico de dietileno glicol. 0 etanol e especialmente o metanol são preferidos. As misturas de pelo menos dois solventes também podem ser utilizadas. É especialmente preferido usar álcoois, ou misturas de álcoois com pelo menos um solvente adicional. A proporção de um álcool equivale preferivelmente a pelo menos 30%, mais especialmente, pelo menos, 50% e mais preferivelmente pelo menos 70% em volume. O mais preferido de todos é a utilização de álcool por si só, por exemplo, metanol, ou misturas de álcool com solventes miscíveis em álcool, por exemplo, metanol com éteres.

Especificamente, o processo pode ser realizado por exemplo por se misturarem misturas equimolares ou concentradas de de diastereómeros a partir de sais de adição de ésteres do ácido 14 tetra-hidrofólico e dos ácidos sulfónicos aromáticos com um solvente e em seguida aquecer a mistura para dissolver os sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico e dos ácidos sulfónicos aromáticos. 0 aquecimento pode ser realizado até à temperatura de ebulição do solvente. Depois disto, a solução é arrefecida a não mais além do ponto em que um solvente solidifica, imediatamente os diastereómeros (6 S, aS) ou (6 S, aR) ou ambos os diastereómeros cristalizam fora, quer espontaneamente ou por deposição com o diastereómero ou diastereómeros desejados, ou então através da concentração da solução por evaporação, e pode depois ser separada da maneira habitual, por filtração.

Ficou provado ser particularmente vantajoso que, para a preparação ou concentração dos sais de adição de ésteres do ácido tetra-hidrofólico com ácidos sulfónicos aromáticos, também é possível utilizar directamente as soluções de reacção a partir da hidrogenação dos ésteres de ácido fólico, ou a partir da hidrogenação dos sais de adição dos ésteres do ácido fólico e dos ácidos sulfónicos aromáticos. A partir de uma mistura de 70:30 de isómero, uma concentração extremamente elevada já é observada na primeira cristalização, o que, de uma maneira totalmente surpreendente, pode, por exemplo, ser superior a 99%. Consequentemente, menos passos de cristalização são agora necessários a fim de preparar os diastereómeros (6S, aS) ou (6S, aR) puros, por exemplo, até três, ainda surpreendentemente muitas vezes, apenas um único passo de cristalização. O grau em que os diastereómeros (6S, aS) ou (6S, aR) são observados para se concentrarem no cristalisado é tão elevado e a capacidade de cristalização desses isómeros tão excelente, que o processo de acordo com a invenção pode até ser empregue para isolar os 15 diastereómeros (6S, aS) ou (6S, aR) dos licores mãe que contêm predominantemente os diastereómeros (6R, aS) ou (6R, aR) . 0 método de acordo com a invenção é perfeitamente adequado para os processos de separação a uma escala industrial.

Os sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) ou (6S, aR) com ácidos sulfónicos obtidos a seguir à separação podem ser posteriormente hidrolisados de uma maneira conhecida por si, por exemplo, utilizando bases, tais como NaOH ou KOH. Os ácidos tetra-hidrofólicos (6S, aS) ou (6S, aR) correspondentes são obtidos em conformidade. Estes ácidos tetra-hidrofólicos podem ser isolados em uma forma estável como ácidos livres através da cristalização, como por exemplo descrito na patente EP-A-0 682 026. Através dos ácidos de adicção, por exemplo os ácidos sulfónicos, os sais dos ácidos tetra-hidrofólicos podem da mesma maneira ser cristalizados e concentrados adicionalmente se desejado (EP-0 495 204).

Os exemplos que se seguem podem ser realizados com sucesso semelhante, substituindo os reagentes genericamente ou especificamente descritos e/ou as condições do processo desta invenção, com aqueles que estão definidos nos exemplos seguintes. Do mesmo modo, as formas de realização exemplares seguintes são dadas a titulo de exemplo apenas e não devem ser consideradas, de forma alguma, como limitando o restante da divulgação.

No seu conjunto, a divulgação inclui todos os pedidos, patentes e publicações citados neste texto, em virtude de a eles se fazer referência.

Com base na descrição precedente será possível para qualquer especialista na matéria deduzir facilmente os elementos decisivos da invenção e, sem se desviar do conceito subjacente e do âmbito de 16 aplicação da invenção, de fazer alterações e complementos a ela e, assim, adaptar a invenção para diferentes necessidades e condições.

As seguintes abreviações são utilizadas:

(R-8SNAP) (2S.4S-BPPM) E COD é ciclo-octadieno. 0 rendimento visual, ou a relação do diastereómero (6S, cxS) para o diastereómero (6R, aS) ou do diastereómero (6S, aR) para o diastereómero (6R, aR) , é determinado da seguinte maneira utilizando cromatografia liquida de elevada pressão directamente no cristalisado ou no licor mãe: 0,5 mg do cristalisado ou 15 mg do licor mãe são dissolvidos em 1 mL de solvente preparado a partir de 6,8 g de β-ciclodextrina e 270 mL de 37% de formaldeido em 1000 mL de água. A separação é feita por meio de 5 mm, 240 x 4 mm de uma coluna de Nucleosil C-8 feita pela empresa Macherey-Nagel e um solvente móvel preparado da seguinte maneira: 6,8 g de β-ciclodextrina são dissolvidos em uma mistura de 8,5 mL de trietilamina, 850 mL de água e 150 mL de acetonitrilo. O pH da solução é ajustado para pH 7,5 através da adição de ácido acético, e 270 mL adicionais de 37% de formaldeido são adicionados. A detecção dos diastereómeros ocorre no comprimento de onda de 300 nm. A preparação e a concentração das soluções e das suspensões, bem como a sua transferência, tem lugar sob exclusão de oxigénio, e 17 usando gases protectores tais como, por exemplo, azoto ou gases inertes.

Exemplos

Preparação de soluções de sais de adição de ésteres do ácido tetra-hidrofólico e de ácidos sulfónicos

Exemplo AI a Preparação de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido fólico (aS) 800 g de di-hidrato de ácido fólico (aS) (1,68 mmol) são carregados a 40°C em uma solução de 530 g de ácido sulfónico de benzeno (3,35 mmol) e 20 litros de metanol anidro em uma atmosfera de azoto. A mistura é aquecida durante meia hora com refluxo, arrefecida e concentrada por evaporação até um volume de 5 litros. 0 precipitado é filtrado para fora por sucção, lavado com 1 litro de metanol e seco em uma câmara de secagem a 40 °C e 20 mbars. 966 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo de ácido fólico (aS) são obtidos (1,45 mmole, 86% do rendimento teórico). 0 produto contém 26,2% de ácido sulfónico de benzeno, 1,67% de água e 2,26% de metanol. A substância decompõe-se acima de 150 °C. 1H-RMN em DMSO-d6: 8,78 (1 H, s) , 8,46 (2H, bs) , 8,32 (1H, d), 7, 64-7, 68 (m) , 7,35-7,40 (m) , 6,66 (2H, d), 0,8 (2H, s) , 4,39 (1H, m) , 3,62 (3H, s) , 3,57 (3H, s) , 2,42 (2H, m) , 1,98-2,11 (2H, m) . b Preparação de uma solução de uma mistura de diastereómero de sulfonato de benzeno do éster de dimetilo do ácido tetra- 18 hidrofólico (6S, <xS)/(6R, aS) através da hidrogenação de sulfonato de benzeno do éster de dimetilo do ácido fólico (aS) 6.72 mg [Ir(C0D)Cl]2 (10 μιηοΐ) e 15,57 mg (25 pmol) de R-BINAP são pesados, desgaseifiçados e dissolvidos em diclorometano. O diclorometano é condensado sob um elevado vácuo e o residuo é tomado em 5 mL de metanol. 1,25 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo de ácido fólico (aS) como para o Exemplo Ala (2 mmol) são suspensos em 25 mL de metanol e adicionados ao catalisador. A suspensão é adicionada em uma contra-corrente de azoto para um autoclave de 100 mL e hidrogenada até a retenção de hidrogénio ter cessado. O COD mantém-se no ciclo-octadieno. É obtido sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico. A proporção de diastereómeros (6S, aS) : (6R, aS) é de 74:26. c Preparação de uma solução de uma mistura de diastereómero (6S, aS)/(6R, aS) de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico com um excedente do diastereómero (6R, aS) através da hidrogenação do sulfonato de benzeno do éster de dimetilo do ácido fólico (aS) 6.72 mg [Ir(COD)Cl]2 (10 pmol) e 13,84 mg (25 pmol) de (2S, 4S)-BPPM são pesados, desgaseifiçados e dissolvidos em diclorometano. O diclorometano é condensado sob um elevado vácuo e o residuo é tomado em 5 mL de metanol. 1,25 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido fólico (aS) como para o Exemplo Ala (2 mmol) são suspensos em 25 mL de metanol e adicionados ao catalisador. A suspensão é adicionada em uma contra-corrente de azoto para uma autoclave de 100 mL e hidrogenada durante 17 horas. É obtido sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico. A proporção dos diastereómeros (6S, oíS):(6R, aS) é de 34:66. 19

Exemplo A2

Preparação de uma solução de uma mistura de diastereómero equimolar (6S, <xS)/(6R, aS) de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico por esterificação do ácido tetra-hidrofólico 20 g de uma mistura equimolar de (6S, aS) e ácido tetra-hidrofólico (6R, aS) (44,9 mmol) são adicionados a 10,65 g de ácido sulfónico de benzeno (67,35 mmol) em 900 mL de metanol e aquecidos durante 7 horas com refluxo. Uma solução de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) e (6R, aS) é obtido.

Exemplo A3

Preparação de uma solução de uma mistura de 70:30 de diastereómero (6S, olS) / (6R, aS) de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico através da esterificação de ácido tetra-hidrofólico em iima proporção de diastereómero (6S, aS)/(6R, aS) de 70:30 5,31 g de ácido tetra-hidrofólico (11,92 mmol), em uma proporção de 70:30 de diastereómero (6S, aS):(6R, aS) (preparado como na patente EP 0 495 204 Bl) são aquecidos em 230 mL de metanol com 2,83 g de ácido sulfónico de benzeno (17,88 mmol) durante 7 horas com refluxo. Uma solução de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico em uma proporção de 70:30 de diastereómero (6S, aS):(6R, aS) é obtidao.

Exemplo A4 20

Preparação de uma solução equimolar dos dlastereómeros de sulfonato de tolueno de éster de dimetllo do ácido tetra-hidrofóllco (6S, aS) e (6R, aS) 10 g de uma mistura equimolar de ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) e (6R, aS) (22,45 mmol) são adicionados a 6,41 g de mono-hidrato de ácido sulfónico de tolueno (33,67 mmol) em 450 mL de metanol e aquecidos durante 7 horas com refluxo. Uma solução de sulfonato de tolueno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico em uma proporção de 1:1 de diastereómero (6S, aS): (6R, aS) é obtida.

Exemplo A5

Preparação de uma solução equimolar de dlastereómeros de naftalino-1-sulfonato de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) e (6R, aS) 3 g de uma mistura equimolar de ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) e (6R, aS) (6,73 mmol) são adicionados a 2,33 g de sal de sódio do ácido naftalino-l-sulfónico (10,1 mmol) e 4,7 mL de 2 M de HC1 em 130 mL de metanol e aquecidos durante 7 horas com refluxo. Uma solução de naftalino-l-sulfonato de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico em uma proporção de 1:1 de diastereómero (6S, aS):(6R, aS) é obtido.

B Processos de Isolamento e de Concentração Exemplo BI

Isolamento e concentração de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) 21 a A solução de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico obtida em conformidade com o Exemplo A1B com uma proporção de 74% do diastereómero (6 S, aS) é concentrada por evaporação para 1/6 do volume sob exclusão de oxigénio. A suspensão assim obtida é armazenada em uma atmosfera de azoto durante 2 horas a 4 °C, o precipitado é aspirado para fora, lavado com um pouco de metanol frio e seco a 40 °C e 20 mbars. 0,55 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico é obtido (0,87 mmole, 44% do rendimento teórico). A proporção dos diastereómeros do sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS): (6R, aS) é de 99:1. [a]5s9=— 69,8° (c = 1 em sulfóxido de dimetilo). A substância decompõe-se acima de 150 °C.

1H-RMN em DMSO-d6: 10,61 (1 H, bs) , 8,35 \—1 d) , 7, 6-7,74 (m) 7,51 (1H, bs), 7,30-7,37 (m) , 6,70 (2H, d, 2H, bs) , 4, 42 (2H, m) 3, 63 (3H, s) , 3,58 (3H, s ) 3,50 (1H, m) , 3, 38 (1H, m) , 3,28 (1H m), 2,44 (2H, m), 2,01-2,13 (2H, m). b Isolamento e concentração de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) a partir da solução, de acordo com o Exemplo Alc A solução de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico obtida em conformidade com o Exemplo Alc com uma proporção de 34% do diastereómero (6 S, aS) é armazenada em uma atmosfera de azoto durante 2 horas a 4 °C, com exclusão de oxigénio. Posteriormente, o precipitado é aspirado para fora, lavado com um pouco de metanaol frio e, em seguida, seco a 40 °C e 20 mbars. 0,2 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico com uma proporção de 96,6% do diastereómero (6S, aS) é obtido. 22 c Isolamento e concentração do sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) a partir da solução de acordo com o Exemplo A2 A solução clara do Exemplo A2 é arrefecida até à temperatura ambiente e agitada durante a noite. 0 precipitado sólido é aspirado para fora, lavado com metanol e éter terc-butilmetilo e seco a 30 °C e 10 mbars. 9,62 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico cristalino incolor (15,24 mmol), com uma proporção de 99,1% do diastereómero (6S, aS) são obtidos (o sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6R, aS) pode ser preparado a partir do licor mãe Blc como descrito no Exemplo B5). 4 g (6,34 mmol) do sulfonato de benzeno do éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico resultante com uma proporção de 99,1% do diastereómero (6 S, aS) são dissolvidos em 220 mL de metanol em ebulição. A solução é deixada a arrefecer à temperatura ambiente, deixada em repouso durante a noite e o precipitado sólido é aspirado para fora. É lavada com metanol e éter de metilo de terc-butilo e seca a 35 °C e 10 mbars. 3,08 g (4,88 mmol) do sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico cristalino incolor com uma proporção de 99,5% do diastereómero (6S, aS) são obtidos. d Isolamento e concentração do sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) a partir da solução de acordo com o Exemplo Ά3 A solução obtida sob o Exemplo A3 é deixada a arrefecer à temperatura ambiente e a solução é depositada a 60 °C com sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) 23 do diastereómero puro. Depois de repousar durante a noite o sólido precipitado é aspirado para fora, lavado com metanol e éter de metilo de terc-butilo e seco a 35 °C e 10 mbars. 3,46 g (5,48 mmol) do sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico com uma proporção de 99,9% do diastereómero (6S, aS) são obtidos.

Exemplo B2

Isolamento e concentração de sulfonato de tolueno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) A mistura equimolar do sulfonato de tolueno do éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico obtida sob o Exemplo A4 é arrefecida até à temperatura ambiente e agitada durante a noite. 0 precipitado sólido é aspirado para fora, lavado com metanol e éter de metilo de terc-butilo e seco a 30 °C e 10 mbars. 5,53 g de sulfonato de tolueno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico cristalino incolor (9,54 mmol) com uma proporção de 99,1% do diastereómero (6S, oíS) são obtidos. 5,2 g (8,97 mmol) do sulfonato de tolueno do éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico obtidos dessa maneira com uma proporção de 99,1% do diastereómero (6 S, aS) são dissolvidos em 182 mL de metanol em ebulição. A solução é deixada a arrefecer à temperatura ambiente, agitada durante três horas à temperatura ambiente e o precipitado sólido é aspirado para fora. É lavado com metanol e éter de metilo de terc-butilo e seco a 35 °C e 10 mbars. 4,43 g (7,64 mmol) do sulfonato de tolueno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico cristalino incolor com uma proporção de 99,8% do diastereómero (6S, aS) são obtidos. 24

Exemplo B3

Isolamento e concentração de naftalino-l-sulfonato de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) A solução obtida sob o Exemplo A5 é arrefecida até à temperatura ambiente e agitada durante a noite. 0 precipitado sólido é aspirado para fora e seco a 30 °C e mbars. 0,34 g de naftalino-l-sulfonato de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico incolor (0,55 mmole), com uma proporção de 62,7% do diastereómero (6S, aS) é obtido.

Exemplo B4

Preparação do sulfonato de benzeno do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) através da hidrólise do sulfonato de benzeno do éster de dimetilo do ácid tetra-hidrofólico 0,55 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetiulo do ácido tetra-hidrofólico (0,95 mmole), em conformidade com o Exemplo Bla e 0,32 g de carbonato de sódio (3,02 mmol) são dissolvidos em 4 mL de água sob exclusão de oxigénio. A solução é aquecida a 85 °C e depois de 30 minutos, o pH é ajustado para pH 7,5 com 37% de ácido cloridrico. 0,2 g de ácido sulfónico de benzeno é adicionado a 75 °C em 0,6 mL de água e, em seguida, o pH é ajustado para pH 8 com 37% de ácido cloridrico. A solução é deixadaa arrefecer à temperatura ambiente e agitada durante mais três horas. O produto é filtrado para fora por sucção e seco durante 4 dias em uma câmara de secagem a 30 °C e 20 mbars. 8,4 g de sulfonato de benzeno do ácido tetra-hidrofólico são obtidos (13,92 mmol, 88% do rendimento teórico). 25 A proporção de diastereómero do sulfonato de benzeno do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) : (6R, aS) é de 99:1.

As propriedades do sulfonato de benzeno do ácido tetra-hidrofólico são idênticas às do produto descrito na patente EP 0495204 Bl.

Exemplo B5

Isolamento de concentrado de sulfonato de benzeno de éster de dlmetilo do ácido tetra-hidrofólico (6R, aS)

O licor mãe do Exemplo Blc é concentrado por evaporação até um quarto do seu volume. É arrefecido a 0 °C, depositado com sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico do diastereómero puro (6S, aS) , e 1,5 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico é aspirado para fora em uma proporção de 97:3 dos diastereómeros (6S, aS):(6R, aS) . O licor mãe é concentrado até à secura por evaporação. 200 mL de éter dietilico são adicionados ao resíduo oleoso e este é agitado durante 2 horas a 0 °C. O precipitado sólido é aspirado para fora, lavado com éter etílico e seco a 30 °C e 20 mbars. 14,8 g de sulfonato de benzeno de éster de dimetilo do ácido tetra-hidrofólico em uma proporção de 80:20 do diastereómero (6R, cxS)/(6S, aS) são obtidos.

Lisboa, 29 de Janeiro de 2009

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a realização e enriquecimento dos sais de éster do ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) ou (6S, aR) e, caracterizado pelo facto das misturas equimolares ou enriquecidas de diastereómeros de sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico e dos ácidos sulfónicos aromáticos serem feitos ou dissolvidos em solventes orgânicose depois cristalizados, pelo menos uma vez e, se necessário, o cristalisado é depois hidrolisado para o ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) ou (6S, aR) e cristalizado como ácido livre ou isolado, sob a forma de um sal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico corresponderem à fórmula III, a qual compreende os diastereómeros (6S, aS) , (6S, aR) , (6R, aS) e (6R, aR).

em que Ri e R2 são H, e um de Ri ou R2, ou ambos Ri e R2 independentemente um do outro representam um radical de hidrocarboneto monovalente ou um radical de hetero-hidrocarboneto anexado através de um átomo C, com heteroátomos seleccionados a partir do grupo que compreende -0-, -S- e -N-, HA representa um ácido sulfónico aromático, e x é um número inteiro de 1 a 6 ou um número fraccionário entre 0 e 6. 2

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de Ri e R2 significarem alquilo C1-C4.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de Ri e R2 serem metilo.

5. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de x na fórmula III, representar os números 1 ou 2, ou um número fracionário entre 0,5 e 2.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos ácidso sulfónicos aromáticos corresponderem à fórmula IV, R3-SO3H (IV), em que R3 representa fenilo, substituído ou não substituído com alquilo C1-C4, alquilo de halogéneo C1-C4 ou alcoxilo C1-C4.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto do ácido sulfónico aromático ser o benzeno ou o ácido ρ-tolueno sulfónico.

8. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto dos compostos na fórmula III, Ri e R2 representarem cada um metilo, x representar 1 ou 2 ou um número fracionário entre 0,5 e 2 e HA significar fenilo, toluilo, flúor, cloro ou ácido sulfónico de fenilo de metilo de trifluoro.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto dos compostos na fórmula III, Ri e R2 representarem cada um metilo, x representar 1 ou 2 ou um número fracionário entre 0,5 e 2 e HA significar fenilo ou ácido sulfónico de p-tolueno. 3

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto das misturas conterem os diastereómeros (6S, oíS) ou (6S, aR) numa proporção de pelo menos 5 por cento em peso ou mais.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos solventes orgânicos serem solventes orgânicos polares os quais dissolvem, pelo menos 1 g de sal de adição de um éster de ácido tetra-hidrofólico por litro de solvente à temperatura de ebulição.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto dos álcoois ou misturas de álcoois com pelo menos um outro solvente serem utilizados.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto das misturas equimolares ou enriquecidas de diastereómeros de sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico serem misturados com ácidos sulfónicos aromáticos em um solvente e a mistura, em seguida, é aquecida para dissolver os sais de adição dos ésteres do ácido tetra-hidrofólico e dos ácidos sulfónicos aromáticos, depois do qual a solução é arrefecida, em que o diastereómero (6S, aS) ou (6S, aR) cristaliza, ou ambos os diastereómeros cristalizam e é, ou são depois separados por filtração.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto das soluções de reacção da hidrogenação dos ésteres de ácido fólico ou a partir da hidrogenação dos sais de adição dos ésteres do ácido fólico e dos ácidos sulfónicos aromáticos, ou a partir da hidrogenação de ácido fólico na presença de ácidos sulfónicos sob condições de esterificação serem utilizados. 4

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto dos sulfonatos do éster do ácido tetra- hidrofólico (6S, aS) ou (6S, aS) ou as suas misturas serem alcalinos hidrolisados para formar o ácido tetra-hidrofólico (6S, aS) ou (6S, aS) ou as suas misturas. Lisboa, 29 de Janeiro de 2009