CN112351818A - 5-甲基-(6s)-四氢叶酸和l-异亮氨酸乙酯的结晶盐 - Google Patents

5-甲基-(6s)-四氢叶酸和l-异亮氨酸乙酯的结晶盐 Download PDF

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Abstract

本发明涉及5‑甲基‑(6S)‑四氢叶酸和L‑异亮氨酸乙酯的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物以及获得其的方法，其中5‑甲基‑(6S)‑四氢叶酸与L‑异亮氨酸乙酯的摩尔比为1:0.3至1:2.0(以mol/mol计)。

Description

5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐
本发明涉及5-甲基-(6S)-四氢叶酸(N-[4-[[(2-氨基-1,4,5,6,7,8-六氢-5-甲基-4-氧代-(6S)-蝶啶基)甲基]氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐以及获得其的方法。
四氢叶酸盐主要用作5-甲酰基四氢叶酸(亚叶酸和左亚叶酸(levoleucovorin))的钙盐、5-甲基四氢叶酸的钙盐
Figure BDA0002855526510000011
或5,10-亚甲基四氢叶酸的硫酸盐
Figure BDA0002855526510000012
最突出的应用领域是用于治疗巨成红细胞叶酸性贫血，用作解毒剂以增加叶酸拮抗剂(尤其是氨蝶呤和甲氨蝶呤)在癌症治疗(“抗叶酸抢救(antifolaterescue)”)中的相容性，用于提高氟化嘧啶的治疗效果以及用于治疗自身免疫性疾病，例如牛皮癣和类风湿性关节炎，用于提高某些抗寄生虫药(例如甲氧苄氨嘧啶-磺胺甲噁唑)对突变的相容性，以及用于降低双去氮四氢叶酸在化学疗法中的毒性。
5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐特别用作药物和食品添加剂，用作维生素制剂，用于预防神经管缺陷，用于治疗抑郁症和用于影响同型半胱氨酸水平。
已知5-甲基-(6S)-四氢叶酸及其盐非常不稳定。特别是它们极易氧化(在这方面也参见A.L.Fitzhugh，Pteridines 4(4)，187-191(1993))，因此难以以药物活性成分或食品添加剂可接受的纯度水平生产。
为了克服5-甲基四氢叶酸及其盐的不稳定性，已经采用了各种方法，例如尽可能完全地排除氧气或添加抗氧化剂如抗坏血酸或还原的L-谷胱甘肽。
US 6,441,168 B1公开了5-甲基四氢叶酸的碱土金属盐，特别是钙盐，其结晶及其用途。5-甲基-(6S)-四氢叶酸的这样的结晶钙盐的缺点是它在其晶型中存在多达四个多晶型变体。因此，必须非常精确地控制5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐的制备过程。另外，US 6,441,168 B1的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐通常在其所有多晶型形式的晶格中每当量5-甲基-(-6S)-四氢叶酸含有至少一个但最多四个当量的水。
US 2016207925 A1要求保护包含L-天冬酰胺或L-精氨酸以及5-甲基-(6S)-四氢叶酸的冻干的、喷雾干燥的或煮干的(boiled down)组合物。但是，所公开的组合物是简单的非化学计量的混合物，并且以无定形状态存在。
药学上有用的化合物的新晶体形式提供了改善药物和/或维生素/医疗食品的性能特征的机会。它扩大了配方科学家可用于设计具有改进特性的新剂型的材料库。
本发明涉及的技术问题是提供包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸的晶型，其克服了本领域已知的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐的缺点。
另外，新的晶型通常显示出所需的不同的物理和/或生物学特性，其可以帮助活性化合物的制造或配制，达到监管批准所需的纯度水平和均匀性。
为了四氢叶酸的稳定性，一直以来的目的是提供在储存时具有低的吸水率并且在制造过程中可以被充分干燥的化合物。另外，非常需要在环境条件下不吸收大量水的药物。特别需要的是当环境相对湿度变化时不会改变其水含量的物质，因为由于环境相对湿度的变化而导致的水含量的大变化使得就剂型而言更难以实现很高的精度。
通过5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物解决了该技术问题，其中5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为1:0.3至1:2.0(以mol/mol计)。
本发明的固体形式具有改善的药理学特性，因此提供了调节和设计改善的药物产品的增强的可能性。与本领域已知的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的结晶多晶型相比，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐的吸水率显著较低，导致显著改善的对药物产品中的目标剂型水平的控制，因为在改变相对湿度条件下吸附的水量的变化显著不那么明显。
5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐的另一个有利方面是，可以在一个单一结晶步骤中获得5-甲基-(6S)-四氢叶酸的高化学和光学纯度。因此，从显示出95％的非对映异构纯度的四氢叶酸苯磺酸盐开始，可以最终获得超过99％的非对映异构纯度的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的单结晶。另一方面，当结晶5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐时，需要具有至少97.0％的非对映异构纯度的起始原料，以获得显示出超过99％的非对映异构纯度的最终产物。
通常，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐具有1:0.3至1:2.0(以mol/mol计)的5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比。
优选地，结晶盐具有1:0.5至1:1.5(以mol/mol计)的5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比。
甚至更优选地，结晶盐具有1:0.75至1:1.5(以mol/mol计)的5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比。
在另一个优选的实施方案中，5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为1:0.75至1:1.25(以mol/mol计)。
最优选地，5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的比率为约1:1(以mol/mol计)。
优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于5.8、6.9、14.0、17.5和22.2的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱，以下称为(晶型A)。
更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于5.8、6.9、14.0、17.5和22.2的峰的至少三个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型A)。甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并具有含有在5.8、6.9、14.0、17.5和22.2的峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射表示))的PXRD图谱(晶型A)。
甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于5.8、6.9、8.5、12.5、12.9、14.0、14.9、16.2、17.5、17.9、18.9、19.2、22.2、24.4、25.4、25.8、25.9和34.6的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型A)。
最优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有基本上如图1所示的PXRD图谱(晶型A)。
5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐可以替代地通过拉曼光谱表征，因此优选该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸的结晶盐，并且具有含有选自以下位于1607、1571、1506、1250和650的峰的至少一个特征峰(以波数cm-1±2cm-1表示)的拉曼光谱(晶型A)。
更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于1607、1571、1506、1250和650的峰的至少三个特征峰(以波数cm-1±2cm-1表示)的拉曼光谱(晶型A)。甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有在1607、1571、1506、1250和650的峰(以波数cm-1±2cm-1表示)的拉曼光谱(晶型A)。
甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于2961、2938、1607、1571、1506、1468、1332、1250、1153、922、860和650的峰的至少一个特征峰(以波数cm-1±2cm-1表示)的拉曼光谱(晶型A)。
最优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有基本如图4所示的拉曼光谱(晶型A)。
本发明的另一方面是具有含有选自以下位于5.3、7.0、14.0、17.7和24.5的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，以下称为晶型B。
更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于5.3、7.0、14.0、17.7和24.5的峰的至少三个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型B)。甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有在5.3、7.0、14.0、17.7和24.5的峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型B)。
甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于5.3、7.0、8.4、13.0、13.2、14.0、14.7、15.9、17.4、17.7、18.1、18.7、20.7、21.2、22.9、24.5和25.4的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型B)。
最优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并具有基本上如图2所示的PXRD图谱(晶型B)。
尽管晶型A适用于片剂制剂，但晶型B在水性环境中稳定并因此非常适合于表现出高水分活度的软膏配制剂、混悬配制剂或乳膏配制剂。
本发明的另一方面是具有含有选自以下位于7.0、8.8、14.0、17.6、20.2、23.4和26.9的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，以下称为晶型C。
更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有选自以下位于7.0、8.8、14.0、17.6、20.2、23.4和26.9的峰的至少三个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型C)。甚至更优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并且具有含有在7.0、8.8、14.0、17.6、20.2、23.4和26.9的特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型C)。
甚至更优选地，该盐是具有含有选自以下位于5.3、7.0、8.8、11.2、13.0、14.0、15.1、15.9、16.8、17.4、17.6、20.2、20.5、20.8、21.2、21.4、23.4、24.5、26.9和32.2的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐(晶型C)。
最优选地，该盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，并具有基本上如图3所示的PXRD图谱(晶型C)。
甚至更优选地，上述结晶盐具有至少99wt％或更高的化学和/或立体异构纯度。
还有利的是具有包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸的晶型，其具有非常低的水含量和尤其是低的吸收/解吸水的倾向，例如当在温度/湿度受控的环境中或在热带国家(其中相对湿度通常很高)中处理用于配混的物质时。5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐通常显示低于1％的水含量，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐通常具有超过10％的水含量。结果在实施例9或图5中形象地说明。
另外，除了5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的水含量非常低之外，该盐还令人惊讶地在宽的湿度范围内显示出特别低的吸收/解吸水的倾向。因此，当在20-75％r.h.的相对湿度的最相关范围内比较5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐(晶型A)的水含量与5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的水含量时，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐(晶型A)的水含量变化小于0.8％，与此相反，根据现有技术，5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的水含量变化超过6％。结果在实施例9或图5中形象地说明。该结果对于本领域技术人员而言是非常令人惊讶的，并且在考虑US 6,441,168 B1的教导时是无法预料到的。此外，本发明的晶型清楚地解决了本发明所涉及的技术问题。
另外，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐显示出比以前已知的钙盐好得多的稳定性。因此5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐当在25℃/60％rh下储存超过12个月时仍然显示出超过98％w/w的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的相对含量(相对于开始时的初始含量测量)，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐中5-甲基-(6S)-四氢叶酸的相对含量在达到9个月之前已降至低于98％w/w。结果在实施例10(表4b)或图6中形象地说明。并行地，当在25℃/60％rh下储存超过12个月时，主要降解产物4α-羟基-5-甲基-THF的吡嗪并-s-三嗪衍生物[MeFox]的含量低于0.05％，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐的MeFox含量在达到9个月之前已经增加到超过0.6％。结果在实施例10(表5)或图7中形象地说明。
当比较在40℃/75％rh下的稳定性值时，甚至更特别强调了5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的惊人的高稳定性。即使在这些升高的条件下，5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在储存超过12个月时仍然显示出超过99％的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的相对含量(相对于开始时的初始含量测量)，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐中的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的相对含量在相同条件下储存时在达到9个月之前已降至低于99％。结果在实施例10(表6b)或图8中形象地说明。并行地，当在25℃/60％rh下储存12个月时，主要降解产物4α-羟基-5-甲基-THF的吡嗪并-s-三嗪衍生物[MeFox]的含量仅为0.06％，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的MeFox含量在达到9个月之前已经增加到超过0.6％。结果在实施例10(表7)或图9中形象地说明。
因此，即使在这些条件下，本发明的晶型也表现出改善的储存稳定性。在考虑美国专利6,441,168 B1的教导的情况下，也无法导出这些改进的性质。
本发明的另一方面是用于获得5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐的方法，该方法包括以下步骤：
i)制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸在水中的混合物，并添加L-异亮氨酸乙酯，任选地在合适的溶剂或溶剂混合物中；
ii)添加碱，任选地在合适的溶剂或溶剂混合物中，以实现溶解；
iii)加热组合物至至少60℃；
iv)添加合适的酸以将pH调节至4至7的范围；
v)将混合物结晶并冷却至1℃至30℃的温度，任选地在最终温度下搅拌获得的悬浮液；和
vi)分离获得的固体材料，并任选干燥产物。
根据所公开的方法可以令人惊讶地以高效率和高化学、立体异构和结晶纯度获得5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，即使在由95.0％光学纯度的5-甲基-(6S)-四氢叶酸(其由(6S)-四氢叶酸苯磺酸盐与光学纯度仅为95.0％的(6S)-四氢叶酸原位形成)制备时也如此。因此，当从光学纯度为95.0％的(6S)-四氢叶酸苯磺酸盐开始时，最终获得光学纯度超过99％的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐。通常，根据所公开的方法制备的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐具有大于99％，优选大于99.5％的光学纯度，和大于98％，优选大于99％，甚至更优选大于99.5％的化学纯度。
优选地，在步骤i)中，由(6S)-四氢叶酸苯磺酸(根据EP 0495204 B1制备)原位制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸在水中的混合物，其中通过在惰性气氛中使用甲醛和硼氢化钠来使(6S)-四氢叶酸苯磺酸经受还原甲基化。
优选地，在步骤i)中，以其盐酸盐的形式添加L-异亮氨酸乙酯。
优选地，步骤i)中的5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯盐酸盐的摩尔比为1:1至1:3。
优选地，在步骤ii)中，用于使得能够溶解5-甲基-(6S)-四氢叶酸的碱是碱金属氢氧化物。更优选地，在步骤ii)中，碱是NaOH、KOH和/或其混合物。在步骤ii)中最优选的碱是氢氧化钠水溶液。
甚至更优选地，在步骤ii)或步骤iii)中，添加碱之后的pH在6.5至9.0的范围内。
最优选地，步骤i)和/或步骤ii)中使用的溶剂是水。
任选地，在步骤iii)中添加炭(charcoal)，然后将溶液澄清过滤。
优选地，在步骤iv)中，盐酸水溶液用作合适的酸。
更优选地，在步骤iv)中，通过添加酸获得的pH值被设置在4.4至6.4的范围内。最优选地，在步骤iv)中，在添加酸之后，pH在5.4至6的范围内。
在步骤iii)、iv)和/或v)中，可以添加晶种，甚至更优选为所需晶型的晶种。
本发明的另一方面是药物组合物、食品添加剂和/或制剂，其包含5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐以及任选的一种或多种可接受的赋形剂。
5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐可以用作药物生产的成分和/或用作食品添加剂。
5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐可用于治疗贫血、神经管缺损(NTD)、心血管疾病(CVD)、抑郁症、阿尔茨海默氏病和骨质疏松症和/或用于低血浆和/或低红细胞叶酸(医疗食品)的饮食管理。
根据本发明的药物组合物可以用于所有施用方式，优选用于口服、肠胃外、肌内、脊柱内、鞘内、牙周、局部或直肠施用。
总之，本发明的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐所提供的性能特征有利于用于药物或用作食品添加剂。尤其是，当结晶5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐时，增强的稳定性、在20％到75％相对湿度的环境中水含量的低变化以及增加的光学纯化对于本领域技术人员而言是无法预见的。
实施例
粉末X射线衍射
装有Mythen1K检测器的Stoe Stadi P；Cu-Kα1辐射；标准测量条件：透射；40kV和40mA管功率；弯曲锗单色仪；0.02°2θ步长(step size)，48s步进时间，1.5-50.5°2θ扫描范围；检测器模式：步进扫描；1°2θ检测器步长(detector step)；标准样品制备：将10至20mg样品置于两片醋酸酯类箔(acetate foil)之间；样品架：Stoe透射样品架；在测量过程中旋转样品。所有样品的制备和测量均在环境空气气氛中进行。
TG-FTIR
用偶联至Bruker FTIR Spectrometer Vector 22的Netzsch Thermo-Microbalance TG 209(具有针孔的样品盘，N2气氛，加热速率10K/min)进行热重测量。
DVS
DVS测量通常使用来自ProUmid(以前称为“Projekt Messtechnik“),August-Nagel-Str.23,89079Ulm(Germany)的SPS11-100n“Sorptions Prüfsystem”进行。
拉曼光谱
FT-拉曼光谱是在Bruker MultiRAM FT-Raman或Bruker RFS 100FT-Raman系统上使用在1064nm工作的近红外Nd:YAG激光器和液氮冷却的锗检测器记录的。在3500至-50cm-1的范围内，累计进行了64次分辨率为2cm-1的扫描；但是，由于过滤器截止效应，仅评估100cm-1以上的数据。名义激光功率通常为100或300mW。
实施例1：在无播种(seeding)的情况下5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐晶型A的制备
将2.00克5-甲基-(6S)-四氢叶酸(测定：95.6％w/w)在20.0ml水中的悬浮液加热至70℃，并添加2.13克L-异亮氨酸乙酯盐酸盐。悬浮液中的温度为65℃，并以30％(w/w)浓缩水溶液的形式添加氢氧化钠。总共添加0.95g的30％氢氧化钠溶液。氢氧化钠的添加导致基本上澄清的溶液，其逐渐变成浓缩的悬浮液。将悬浮液用20.0ml水稀释，并关闭加热器，以允许混合物在约两个小时内冷却至环境温度。具有悬浮液的反应器在半小时内在冰/水浴中进一步冷却至约10℃，然后用多孔玻璃过滤器过滤并用5ml冷水洗涤。将固体产物在真空干燥器中于35℃干燥约20小时，并通过粉末X射线衍射检查，并鉴定为5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A。晶型A的粉末X射线衍射图谱如图1所示，并显示如表1所示的2θ角处的峰。HPLC分析显示纯度为98.65％面积。
表1:晶型A的2θ角、d间距和定性强度。Vs＝非常强的强度，s＝强的强度，m＝中等的强度，w＝弱的强度，vw＝非常弱的强度。应该注意的是，由于优选的取向效应，强度值可以显著变化。
Figure BDA0002855526510000101
Figure BDA0002855526510000111
Figure BDA0002855526510000121
实施例2：在播种的情况下5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐晶型A的制备
在氮气氛下向15g的5-甲基-(6S)-四氢叶酸(测定：95.4％w/w，6S-非对映异构体：97.74％)中添加225g水。通过添加氢氧化钠水溶液(30％w/w)将pH调节至6.5。将混合物加热至66℃，并进一步添加氢氧化钠水溶液(30％w/w)以保持pH在6.5。在66℃下添加15.2gL-异亮氨酸乙酯盐酸盐在75g水中的溶液。在66℃下用5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A播种后，将混合物在66℃下搅拌16小时。将混合物冷却至1℃，同时通过添加1摩尔盐酸水溶液将pH调节至5.7。在1℃下搅拌1小时后，通过抽滤分离结晶材料，并用预冷至1℃的44g水洗涤。将该材料在36℃下真空干燥22小时，以得到14.6g的5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐，这对应于75％的理论产率(经测定校正的)。(分离的产物的分析数据：纯度：98.9％面积，测定：对应于1:1盐的73.95％w/w 5-甲基-(6S)-四氢叶酸，干燥失重(残留水)：1.2％w/w，(6S)-非对映异构体：99.8％。TG-FTIR分析表明，所得到的固体产物基本上不含水，因为在150℃下的质量损失不超过约0.2％。H-NMR光谱分析表明，5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为约1:1。图1所示的粉末X射线衍射图对应于晶型A。
实施例3：5-甲基-(6S)-四氢叶酸的盐和L异亮氨酸乙酯盐晶型A的制备
将1.92g的5-甲基-(6S)-四氢叶酸(4mmol)溶解在8.0ml的1N NaOH中。将该溶液加热至80℃。将1.28g L-异亮氨酸乙酯盐酸盐(～6.5mmol)溶解在6.0ml水中，并添加到具有5-甲基-(6S)-四氢叶酸的溶液中。在约15分钟内将溶液冷却至60℃，并用根据实施例1获得的约10至20mg的5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A播种。pH的测试通常显示7的pH，然后滴加2.0ml 1N HCl。形成悬浮液，并将混合物以每小时15℃的速率冷却至5℃。在5℃下搅拌约30分钟后，将悬浮液过滤并将固体产物在40℃下真空干燥24小时。样品的粉末X射线衍射表明，获得了5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A。
实施例4：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐晶型B的制备
在室温下，向6.0ml水和452mg 5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A的混合物添加6.0ml的L-异亮氨酸乙酯盐酸盐在水中的0.5M溶液和2.0ml乙醇。通过添加0.250ml的1N NaOH将pH调节至pH～6-7，然后将混合物加热至75℃。浅黄色悬浮液的温度在75℃下保持30分钟。然后将混合物在约三小时内冷却至25℃。在约4小时期间继续在25℃下搅拌，并通过离心过滤回收被称为PP555-P40a的固体样品，并通过PXRD在未干燥的情况下检查。固体产物被鉴定为5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型B。
表2：晶型B的2θ角、d间距和定性强度。Vs＝非常强的强度，s＝强的强度，m＝中等的强度，w＝弱的强度，vw＝非常弱的强度。应该注意的是，由于优选的取向效应，强度值可以显著变化。
Figure BDA0002855526510000131
Figure BDA0002855526510000141
Figure BDA0002855526510000151
实施例5：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐晶型C的制备
向81mg无定形5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐(通过将溶液在4:1的水-二噁烷中冷冻干燥产生)添加1.0ml 2:1(体积比)的乙醇-水并将混合物在室温搅拌两天。然后将悬浮液过滤并将固体进行粉末X射线衍射。粉末X射线衍射显示获得了结晶形式，称为晶型C。1H-NMR光谱分析显示5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为约2.8:1。
表3：晶型C的2θ角、d间距和定性强度。Vs＝非常强的强度，s＝强的强度，m＝中等的强度，w＝弱的强度，vw＝非常弱的强度。应该注意的是，由于优选的取向效应，强度值可以显著变化。
Figure BDA0002855526510000152
Figure BDA0002855526510000161
Figure BDA0002855526510000171
实施例6：从由(6S)-四氢叶酸苯磺酸盐原位形成的5-甲基-(6S)-四氢叶酸制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐
向20g[6S]-四氢叶酸苯磺酸盐(根据EP 0 495 204制备，四氢叶酸测定：72.2％w/w，(6S)-非对映异构体：95.9％)和50g水的混合物在20-30℃在搅拌下添加9.9mL氢氧化钠水溶液(30％w/w氢氧化钠)。然后添加0.83mL的1摩尔氢氧化钠水溶液，并将混合物冷却至0-5℃。在0-5℃下，添加3.13mL的甲醛水溶液(浓度：36.9％w/w)，并且在搅拌1小时后，添加0.31mL的氢氧化钠水溶液(30％w/w的氢氧化钠)，然后添加14g水、1.7g氢氧化钠水溶液(30％w/w氢氧化钠)和3.07g硼氢化钠的混合物。将混合物加热至约63℃并搅拌90分钟。冷却至环境温度后，添加7.9mL的盐酸水溶液(37％w/w)，随后添加4.1mL的氢氧化钠水溶液(30％w/w氢氧化钠)。添加少量的四硼酸钠，并将混合物冷却至0-5℃并搅拌约22小时。通过过滤(抽吸)除去固体，并用5g水洗涤。在环境温度下在搅拌下向滤液中添加15.86克L-异亮氨酸乙酯盐酸盐和30克水的混合物。将该混合物加热至约66℃，并添加少量的结晶5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙基酯盐晶型A用于播种。在约66℃下，添加27.1mL的1摩尔盐酸水溶液。形成悬浮液。在约90分钟内，将混合物冷却至约20℃，同时进一步添加33.2mL的1摩尔盐酸水溶液。通过过滤(抽吸)分离结晶产物，并用在冰浴中预冷却的84mL水洗涤。将产物在室温下真空(10mbar)干燥约60小时，以得到17.2克的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐晶型A(5-甲基-(-6S)-四氢叶酸测定：74.0％w/w，纯度：98.6％面积，(6S)-非对映异构体：99.5％)，这对应于88.1％的测定校正的化学产率。
实施例7：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的制备
在环境温度下在搅拌下向1670g水添加250g 5-甲基-(6S)-四氢叶酸(测定：96.2％w/w)和256.1g L-异亮氨酸乙酯盐酸盐。添加500g水，并通过添加134.6mL氢氧化钠水溶液(30％w/w氢氧化钠)将pH调节至pH＝7.3。在搅拌下将混合物加热至约66℃，并添加少量的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的的盐晶型A用于播种。在66℃下，在约30分钟内添加385mL的1摩尔的盐酸水溶液。在约90分钟内，将混合物冷却至约20℃，同时进一步添加365mL的1摩尔盐酸水溶液。通过过滤(抽吸)分离结晶产物，并用在冰浴中预冷却的733g水洗涤。将产物在约40℃在真空(10毫巴)干燥约60小时，以得到300.8克的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐晶型A(5-甲基-(6S)-四氢叶酸测定：74.3％w/w，纯度：98.7％面积)，这对应于92.9％的测定校正的化学产率。
实施例8：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的制备
在环境温度下在搅拌下向反应容器中的250.5kg水添加31.0kg 5-甲基-(6S)-四氢叶酸(测定：96.8％w/w，6S-非对映异构体：98.3％)和32.0kg L异亮氨酸乙酯盐酸盐。添加16.5kg水，并通过添加18.6kg氢氧化钠水溶液(30％w/w氢氧化钠)将pH调节至pH＝7.3。在搅拌下将混合物加热至约66℃，并通过过滤除去固体。经由反应容器用20.3kg水洗涤过滤器。将滤液和洗涤液(washing)在结晶容器中合并，并加热至约65℃。添加37.5克的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯晶型A用于播种。在约65℃下在30分钟内添加64.5kg的1M盐酸水溶液。在90分钟内将混合物冷却至20℃，并通过添加1.5kg的1M盐酸水溶液将pH调节至pH＝5.4。将混合物在约20℃下搅拌1小时，并通过离心分离结晶产物。用预冷至约3℃的45kg水洗涤产物。然后将产物在50℃真空干燥17小时，以得到23.63kg 5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯晶型A(5-甲基四氢叶酸测定77.2％w/w，6S非对映异构体：99.5％)，这对应于60.8％的测定校正的产率。此实施例的产率没有代表性，因为在离心过程中由于技术缺陷损失了部分结晶产物。
实施例9：吸湿性和水含量(DVS实验)
测量5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐样品的水含量，发现水含量为12.4％。根据实施例1或2制备的5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A的样品的TG-FTIR分析显示该样品基本上不含水。
5-甲基-(6S)-四氢叶酸钙盐的样品和根据实施例1或2制备的5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A的样品(各约20mg)通过动态水蒸气吸附分析(DVS)在0至75％r.h的相对湿度范围内进行检测。DVS测量使用来自ProUmid(以前称为“ProjektMesstechnik“),August-Nagel-Str.23,89079Ulm(Germany)的SPS11-100n“Sorptions Prüfsystem”进行。如下进行测量：将样品放在微量天平顶部的铝或铂金支架上，并允许在50％RH下平衡，随后开始预先限定的湿度程序：
(1)在50％相对湿度(RH)下五个小时，然后
(2)以每小时5％的速率扫描到50→0％RH
(3)将恒定RH保持在0％持续5小时
(4)以每小时5％的速率将RH提高到75％
(5)将恒定RH保持在75％持续5小时
(6)以每小时5％的速率扫描到50％RH
将5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A的结果与钙盐的结果进行比较，显示5-甲基-(6S)-四氢叶酸L-异亮氨酸乙酯盐晶型A的水含量在测试范围内变化小于0.8％，而5-甲基-(6S)-四氢叶酸的钙盐的水含量变化超过6％。结果在图5中形象地说明。
实施例10：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的稳定性
为了比较本发明化合物5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的长期稳定性与根据EP 1 044 975 B1制备的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐的长期稳定性，已经在各种温度和湿度下产生了各自的稳定性数据。
(a)5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在25℃/60％rh下的稳定性
根据文献程序(EP 1 044 975 B1)制得的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐和5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐晶型A储存在25℃/60％rh下。通过HPLC以周期性间隔测量样品中残留的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的含量。结果示于表4a和图6中。还将剩余的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的含量与制备时的初始值进行比较(相对％)。结果示于表4b。另外，主要的降解产物4α-羟基-5-甲基-THF的吡嗪并-s-三嗪衍生物(MeFox)的含量通过HPLC以周期性间隔测量，并公开为绝对值(％w/w)。结果显示在表5和图7中。
表4a：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在25℃/60％rh下的长期稳定性(％w/w)
Figure BDA0002855526510000201
Figure BDA0002855526510000211
表4b：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在25℃/60％rh下的长期稳定性(相对％)。
Figure BDA0002855526510000212
表5：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在25℃/60％rh下的长期稳定性(主要降解产物[MeFox])
Figure BDA0002855526510000213
(b)5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在40℃/75％rh下的稳定性
根据文献程序(EP 1 044 975 B1)制得的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐和5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐晶型A储存在40℃/75％rh。通过HPLC以周期性间隔测量样品中残留的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的含量。结果示于表6a和图8中。还将剩余的5-甲基-(6S)-四氢叶酸的含量与制备时的初始值进行比较(相对％)。结果示于表6b中。另外，主要的降解产物4α-羟基-5-甲基-THF的吡嗪并-s-三嗪衍生物(MeFox)的含量通过HPLC以周期性间隔测量，并公开为绝对值(％w/w)。结果显示在表7和图9中。
表6a：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在40℃/75％rh下的长期稳定性(％w/w)
Figure BDA0002855526510000221
表6b：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在40℃/75％rh下的长期稳定性(相对％)
Figure BDA0002855526510000222
Figure BDA0002855526510000231
表7：5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶单钠盐在40℃/75％rh下的长期稳定性(主要降解产物[MeFox])
Figure BDA0002855526510000232
具有本发明中公开的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的稳定性数据的表4至表7清楚地显示了：
i)5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的稳定性与5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐相比存在显著差异，和
ii)5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐在很长一段时间比5-甲基-(6S)-四氢叶酸的结晶钙盐稳定得多。
实施例11：5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐的同分异构富集(Isomeric enrichment)
当以5-甲基-(6S)-四氢叶酸开始制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐时，可以获得以下同分异构富集(通过HPLC测量)
Figure BDA0002855526510000241
当以原位制备的5-甲基-(6S)-四氢叶酸苯磺酸盐开始制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐时，可以获得以下同分异构富集(通过HPLC测量)
Figure BDA0002855526510000242

Claims (36)

1.一种5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物，其中5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为1:0.3至1:2.0(以mol/mol计)。
2.权利要求1的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物，其中5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为1:0.5至1:1.5(以mol/mol计)。
3.权利要求1或2的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物，其中5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的摩尔比为1:0.75至1:1.5(以mol/mol计)。
4.前述权利要求中至少一项的结晶盐和/或其水合物和/或溶剂化物，其中5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯的比率为约1:1(以mol/mol计)。
5.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.8、6.9、14.0、17.5和22.2的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型A)。
6.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.8、6.9、14.0、17.5和22.2的峰的至少三个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型A)。
7.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.8、6.9、8.5、12.5、12.9、14.0、14.9、16.2、17.5、17.9、18.9、19.2、22.2、24.4、25.4、25.8、25.9和34.6的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型A)。
8.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐具有基本上如图1所示的PXRD图谱(晶型A)。
9.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于1607、1571、1506、1250和650的峰的至少一个特征峰(以波数cm-1±2cm-1表示)的拉曼光谱(晶型A)。
10.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于2961、2938、1607、1571、1506、1468、1332、1250、1153、922、860和650的峰的至少一个特征峰(以波数cm-1±2cm-1表示)的拉曼光谱(晶型A)。
11.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其特征在于5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐具有基本上如图4所示的拉曼光谱(晶型A)。
12.权利要求1至4中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.3、7.0、14.0、17.7和24.5的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型B)。
13.权利要求1至4或12中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.3、7.0、14.0、17.7和24.5的峰的至少三个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型B)。
14.权利要求1至4、12或13中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.3、7.0、8.4、13.0、13.2、14.0、14.7、15.9、17.4、17.7、18.1、18.7、20.7、21.2、22.9、24.5和25.4的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型B)。
15.权利要求1至4、11至13或14中至少一项的结晶盐，其特征在于5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐具有基本上如图2所示的PXRD图谱(晶型B)。
16.权利要求1至4中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于7.0、8.8、14.0、17.6、20.2、23.4和26.9的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型C)。
17.权利要求1至4或16中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于7.0、8.8、14.0、17.6、20.2、23.4和26.9的峰的至少三个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型C)。
18.权利要求1至4、16或17中至少一项的结晶盐，其特征在于所述盐是5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐，并且具有含有选自以下位于5.3、7.0、8.8、11.2、13.0、14.0、15.1、15.9、16.8、17.4、17.6、20.2、20.5、20.8、21.2、21.4、23.4、24.5、26.9和32.2的峰的至少一个特征峰(以2θ±0.2°2θ(CuKα辐射)表示)的PXRD图谱(晶型C)。
19.权利要求1至4、16至17或18中至少一项的结晶盐，其特征在于5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的盐具有基本上如图3所示的PXRD图谱(晶型C)。
20.前述权利要求中至少一项的结晶盐，其具有至少99％或更高的化学、立体异构和结晶纯度。
21.用于获得根据权利要求1至20中至少一项的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐的方法，所述方法包括以下步骤：
i)制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸在水中的混合物，并添加L-异亮氨酸乙酯，任选地在合适的溶剂或溶剂混合物中
ii)添加碱，任选地在合适的溶剂或溶剂混合物中，以实现溶解；
iii)加热组合物至至少60℃；
iv)添加合适的酸以将pH调节至4至7的范围；
v)将混合物结晶并冷却至1℃至30℃的温度，任选地在最终温度下搅拌获得的悬浮液；和
vi)分离获得的固体材料，并任选干燥产物。
22.权利要求21的方法，其特征在于步骤ii)中的5-甲基-(6S)-四氢叶酸与L-异亮氨酸乙酯盐酸盐的摩尔比为1:1至1:3。
23.权利要求21和/或22的方法，其特征在于在步骤i)中原位制备5-甲基-(6S)-四氢叶酸在水中的混合物。
24.权利要求21至23的方法，其特征在于在步骤i)中以其盐酸盐的形式使用L-异亮氨酸乙酯。
25.权利要求21至24的方法，其特征在于在步骤ii)中使用氢氧化钠水溶液以使得能够溶解化合物，并且在步骤iv)中使用盐酸水溶液用于pH调节。
26.权利要求21至25中至少一项的方法，其特征在于在步骤ii)中，在添加碱之后，pH在6.5至9.0的范围内。
27.权利要求21至26中至少一项的方法，其特征在于在步骤iii)中添加炭，然后将溶液澄清过滤。
28.权利要求21至27中至少一项的方法，其特征在于所述溶剂是水。
29.权利要求21至28中至少一项的方法，其特征在于在步骤iv)中，通过添加酸而获得的pH值设定为在5.4至6.4的范围内。
30.权利要求21至29中至少一项的方法，其特征在于在步骤iii)、iv)和/或v)中添加晶种。
31.一种药物组合物、食品添加剂和/或制剂，其包含根据权利要求1至20中至少一项的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，和任选的一种或多种可接受的赋形剂。
32.根据权利要求31的药物组合物，其为片剂、胶囊剂、口服液体制剂、散剂、冻干剂、颗粒剂、锭剂、可重构散剂、可注射或可输注的溶液或混悬剂或栓剂的形式。
33.根据权利要求31或32的药物组合物，其进一步包含至少一种另外的治疗剂。
34.根据权利要求31至33的药物组合物，其是口服、肠胃外、肌内、脊柱内、鞘内、牙周、局部或直肠施用的药物组合物。
35.根据权利要求1至20中至少一项的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐用作药物生产成分和/或食品添加剂的用途。
36.根据权利要求1至20中至少一项的5-甲基-(6S)-四氢叶酸和L-异亮氨酸乙酯的结晶盐，其用于治疗同型半胱氨酸降低、贫血、神经管缺陷、心血管疾病、抑郁症、认知障碍、阿尔茨海默氏病和骨质疏松症和/或用于低血浆和/或低红细胞叶酸和/或低脑脊髓液叶酸和/或低外周或中枢神经系统叶酸的饮食管理。
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