PT1140149E

PT1140149E - Utilização da hormona do crescimento humana para aumentar o número de células circulantes cd34+, destinada a reconstituição dos sistemas hematopoiético e imunitário na sequência de terapias mieloablativas ou antiblásticas, por meio de transplante, re

Info

Publication number: PT1140149E
Application number: PT99965579T
Authority: PT
Inventors: Alessandro Massimo Gianni
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-30
Publication date: 2007-01-31
Also published as: DE69933581T2; BR9916726A; CY1107603T1; AU2004203355A1; ES2275359T3; SI1140149T1; AU772222B2; IL143994A; EP1016413A1; EP1140149A1; DE69933581D1; AU2004203355B2; EP1779865A1; JP4808316B2; US20060029581A1; CA2354194A1; WO2000040260A1; JP2002534393A; EP1140149B1; DK1140149T3

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DA HORMONA DO CRESCIMENTO HUMANA PARA AUMENTAR O NÚMERO DE CÉLULAS CIRCULANTES CD34+, DESTINADA À RECONSTITUIÇÃO DOS SISTEMAS HEMATOPOIÉTICO E IMUNITÁRIO NA SEQUÊNCIA DE TERAPIAS MIELOABLATIVAS OU ANTIBLÁSTICAS, POR MEIO DE TRANSPLANTE, RE-PERFUSÃO OU ENXERTO" O transplante de medula óssea (TMO) é um procedimento clínico em que as células hematopoiéticas pluripontentes obtidas a partir da medula óssea são transplantados para um paciente. 0 TMO é o tratamento de eleição em várias perturbações hematológicas, incluindo malignidades, imunodeficiências combinadas graves (Severe Combined Immunodeficiencies, SCID), anomalias hematopoiéticas congénitas ou determinadas geneticamente, anemia, aplasia anémica, leucemia e osteoporose (Fischer et al., 1998). Nos últimos dez anos a utilização do TMO cresceu de menos de 5000 para mais de 40000 anualmente (Waters et al., 1998).

Em estado de equilíbrio dinâmico, a maioria das células indiferenciadas e progenitoras hematopoiéticas residem na medula óssea e só um pequeno número destas células são detectáveis no sangue periférico. No entanto, células indiferenciadas adicionais podem ser mobilizadas para o sangue periférico por meio de tratamento com agentes mielossupressores e/ou certos factores de crescimento hematopoiéticos (Van Hoef, 1998). Os estudos têm demonstrado que as células indiferenciadas do sangue periférico (CISP) introduzidas por perfusão num hospedeiro apresentam um maior potencial de enxerto em comparação com as células indiferenciadas e progenitoras derivadas da medula óssea (Gianni et al., 1989/ Larsson et al., 1998). 2

Assim, são actualmente utilizados as CISP mobilizadas por quimioterapia, factores de crescimento hematopoiéticos ou a combinação destas modalidades tanto em cenários de transplante autólogo como não-autólogo (Van Hoef, 1998; Anderlini e Korbling, 1997). No caso de transplante não-autólogo, os doadores das células indiferenciadas são indivíduos normais e o procedimento para a mobilização das células indiferenciadas para a corrente sanguínea tem de ser conseguida com o mínimo desconforto. Neste caso, é preferida a mobilização das células indiferenciadas com factores de crescimento hematopoiéticos do que o tratamento com medicamentos antiblásticos (por exemplo ciclofosfamida). Vários factores de crescimento, tais como G-CSF, EPO e CSF têm vindo a ser estudados como agentes mobilizantes e são actualmente utilizados para aumentar o número de CISP antes da leucaferese (Henry, 1997; Weaver e Testa, 1998). Os tratamentos destinados a simular a hematopoiese total podem ser muito interessantes para mobilizar um grande conjunto de células das células progenitoras e indiferenciadas. Uma mobilização aumentada das células indiferenciadas é extremamente valiosa no contexto do transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas por meio da redução do número de leucaferese necessárias para recolher uma quantidade suficiente de células indiferenciadas hematopoiéticas para transplante. A primeira parte da presente invenção apresenta um novo agente mobilizante, utilizado para aumentar o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo num indivíduo. 0 novo agente mobilizante da presente invenção é hormona do crescimento e em especial Hormona do Crescimento Humana 3 (hHG) ou um dos seus derivados ou qualquer factor que induza a libertação da hormona do crescimento.

Excepto quando especificado em contrário, o termo «GH» significa Hormona do Crescimento ou um dos seus derivados no âmbito da presente invenção.

Constatou-se agora que, por meio da administração da hormona do crescimento e especialmente da Hormona do Crescimento Humano (hGH) ou um dos seus derivados ou qualquer factor indutor da libertação da hormona do crescimento, obtém-se uma mobilização das células capazes da regeneração da hematopoiese in vivo no sangue periférico. Por conseguinte, a hormona do crescimento e em especial a Hormona Do Crescimento Humana ou um dos seus derivados ou qualquer factor indutor da libertação da hormona do crescimento, administrada isoladamente ou em combinação com outros factores, representa um novo método ou utilização para mobilizar células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo no sangue periférico. A hormona do crescimento humano (hGH), também conhecida como somatotropina, é uma hormona proteína produzida e segregada pelas células somatotrópicas da pituitária anterior. A hGH desempenha um papel chave no crescimento somático através dos seus efeitos no metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lípidos. Para além dos seus efeitos no crescimento somático, a hGH tem demonstrado estimular célula sanguíneas in vitro (Derfalvi et al., 1998; Merchav et al., 1988), aumentar as contagens de eritrócitos e de hemoglobina (Valerio et al., 1997; Vihervuori et al ., 1996), reforçar a proliferação e produção Ig em linhas de células do plasma (Kimata and 4

Yoshida, 1994) e estimular as contagens de células CD8+ e, em menor escala, as contagens de células CD4+ (Geffner, 1997) .

As utilizações da presente invenção que utilizam o agente mobilizante da presente invenção têm várias vantagens: - Há um pequeno número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese. Este número é considerado insuficiente para proporcionar uma dose de enxerto de células por meio de aférese única ou múltipla, num espaço de tempo razoável. Os métodos e utilizações da presente invenção resolvem este problema por meio de uma periferização temporária das ditas células e subconjuntos para o sangue em circulação que é largamente utilizada para aumentar significativamente no sangue o produto de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, minimizando assim o número de aféreses necessárias para atingir uma dose de enxerto. - Outras vantagens dos métodos e utilizações da presente invenção incluem a possibilidade de: a) contornar a necessidade de anestesia geral, b) recolha, mesmo se os ossos ilíacos estiverem danificados devido a radioterapia anterior ou infiltrados com células malignas, c) atingir restauração das funções hematopoiéticas sustentadas mais rapidamente do que com MO derivada de células progenitoras, d) atingir a restauração das funções hematopoiéticas sustentadas mais rapidamente e com maior eficácia do que sem um pré-tratamento, incluindo um método ou uma utilização da presente invenção. 5

Em geral, as utilizações da presente invenção são eficazes e seguras para mobilizar as células sanguíneas periféricas capazes de regenerar a hematopoiese in vivo.

As utilizações da presente invenção não são tóxicas tendo em vista os parâmetros de toxicidade que são, por exemplo, crescimento de tumores, sintomas clínicos e instrumentais ou ensaios laboratoriais da função cardíaca, hepática e renal. - A maior mobilização das células circulantes, capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, obtida com as utilizações da presente invenção é extremamente valiosa no contexto do transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas por meio da redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma porção suficiente de células hematopoiéticas para transplante.

As utilizações da presente invenção conduzem a uma redução do volume de sangue necessário para ser processado durante o procedimento de aférese ou leucaferese, de forma a obter-se o número alvo especificado de células. As vantagens de processar um reduzido volume de sangue residem no menor espaço de tempo que o paciente gasta na máquina separadora de células, na redução da toxicidade do procedimento, particularmente em termos do volume de anticoagulante a que o paciente teria de ser exposto durante o procedimento, na redução do tempo de máquina e operador. - Além disso, o transplante de uma população de células sanguíneas, enriquecida com células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, população essa que é obtida a partir 6 do sangue periférico pelos métodos ou utilizações da presente invenção, tem o efeito de intensificar a reconstituição dos sistemas hematopoiéticos e imunológicos na sequência de terapias mieloablativas ou antiblásticas. A presente invenção está de acordo com as reivindicações. A presente descrição apresenta um método de preparação de uma população de células circulantes, capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, incluindo: a) administração a um dador de uma composição que inclui hormona do crescimento ou um dos seus derivados, numa quantidade suficiente para aumentar no dador mencionado o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. b) isolamento de uma população de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue periférico do dito dador.

Este método produz assim uma população de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, sendo esta população destinada ao transplante para o mesmo ou diferentes indivíduos.

Assim, a presente descrição apresenta um método de preparação de uma população de células sanguíneas enriquecidas com células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, incluindo: a) administração a um dador de uma composição que inclui hormona do crescimento ou um dos seus derivados, numa quantidade suficiente para aumentar no dador mencionado o 7 número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. b) isolamento de uma população de células enriquecidas com células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue periférico do dito dador. A presente descrição apresenta também um método de isolamento de um maior número de células circulantes, capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir de um dador, incluindo: a) administração a um dador de uma composição incluindo a hormona do crescimento ou um dos seus derivados, isoladamente ou em combinação com outros factores de crescimento hematopoiéticos, ao sujeito numa quantidade suficiente para induzir a mobilização das células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo no sangue periférico, b) isolamento de uma população de células enriquecidas com células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue periférico do dito dador. A presente descrição apresenta também um método de preparação de uma população de células circulantes, capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, incluindo: a) administração a um dador de uma composição que inclui hormona do crescimento ou um dos seus derivados, numa quantidade suficiente para induzir no dador mencionado a mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, b) isolamento de uma população de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue periférico do dito dador ou isolamento de uma população de células sanguíneas enriquecidas com células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue periférico do dito dador. A fase b) [isto é «isolamento de uma população de (células sanguíneas enriquecidas com) células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue periférico do dito dador»] dos métodos ou utilizações da presente invenção pode corresponder à operação de remoção de sangue periférico do dador, no qual o número de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo foi aumentado por meio da administração da hormona do crescimento ou um dos seus derivados, isoladamente ou em combinação com outros factores.

Uma quantidade suficiente para aumentar o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, uma quantidade suficiente para induzir a mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou uma quantidade suficiente para induzir a mobilização de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo para o sangue periférico pode ser administrada durante um ou vários dias. A operação de remoção do sangue periférico a partir do dador pode corresponder a leucaferese. A leucaferese é um procedimento, em que os leucócitos são removidos do sangue recolhido e o restante sangue é retransfundido para o dador.

As células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, presentes na população isolada de células sanguíneas pode ser purificado em maior profundidade, de forma a aumentar a concentração das células mencionadas. A purificação pode 9 ser feita por meio de selecção positiva das células positivas CD34. A presente descrição apresenta também um método de preparação de um dador de células circulantes, células essas capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, incluindo a administração ao dador mencionado de uma composição incluindo a hormona do crescimento ou um dos seus derivados, numa quantidade suficiente para aumentar o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo no dador mencionado. A presente descrição apresenta também um método para aumentar o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo num dador por meio de administração ao dador mencionado de uma composição incluindo a hormona do crescimento ou um dos seus derivados. 0 termo "aumentado" ou "aumentar" e o termo "enriquecido" significam em geral, no contexto da presente invenção, que o parâmetro "aumentado" ou "enriquecido" (número) tem um valor que está acima do valor padrão para este parâmetro. 0 valor padrão do parâmetro é medido num corpo ou numa amostra de um corpo que não recebeu qualquer agente mobilizante de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. 0 valor padrão do número de células CD34+ por microlitro de sangue é, por exemplo 3,8 (+ ou - 3,2) célula por microlitro de sangue periférico (Anderlini et al., 1997) .

As células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo são células CD34+. 10 A frequência de células CD34+ no sangue pode ser medida por meio de medições FACScan (Siena et al., 1989 & 1991). O número aumentado de células CD34+ no sangue periférico do dador ou o nivel de enriquecimento de células CD34+ na preparação isolada de células sanguíneas pode ser mais de 10, 25, 34 ou 80 células CD34+ por microlitro de sangue periférico. O número aumentado de células CD34+ no sangue periférico do dador ou o nível de enriquecimento de células CD34+ na preparação isolada de células sanguíneas pode ser pelo menos 2xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do receptor ou pelo menos 4xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do receptor ou pelo menos 8xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do receptor. O número aumentado de células CD34+ no sangue periférico do dador ou o nível de enriquecimento de células CD34+ na preparação isolada de células sanguíneas pode ser mais de 2x106, 4xl06, 5xl06, 6xl06, 8xl06 ou 15xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador.

Existe uma correlação entre o número de células CD34+ necessárias para o transplante e actividade GM-CFC correspondente que pode ser medida (Weaver et al., 1998). Por conseguinte, o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou o nível de enriquecimento de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo na preparação isolada de células sanguíneas pode corresponder a pelo menos lxlO5 GM-CFC por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor. O número de células CD34+ no sangue correlaciona-se bem com 11 CFU-GM (Siena et al., 1991). CFU-GM é a unidade de formação da colónia, granulócitos e macrófagos. Por conseguinte, o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou o nivel de enriquecimento de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo na preparação isolada de células sanguíneas pode corresponder a pelo menos 500 CFU-GM por mililitro de sangue periférico.

Por conseguinte, o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou o nivel de enriquecimento de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo na preparação isolada de células sanguíneas pode corresponder a um nível aumentado de CFU-C, CFU-Meg ou BFU-E. CFU-C é a unidade de formação da colónia, cultura; CFU-Meg é a unidade de formação da colónia, megacariócito e BFU-E é a unidade de formação burst, eritróide. O número de células CD34+ no sangue correlaciona-se bem com a contagem de glóbulos brancos. Por conseguinte, o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou o nível de enriquecimento de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo na preparação isolada de células sanguíneas pode corresponder a pelo menos 1000 glóbulos brancos por microlitro de sangue periférico.

As células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo podem ser células CD34+/CD33+ e/ou células CD34+/CD38- e/ou células CD34+/Thy-I e/ou células CD39+/Thy-L/CD38- e/ou células CD33- e/ou células indiferenciadas da medula óssea e/ou células progenitoras 12 e/ou células iniciadoras de cultura a longo prazo (long-term culture initiating cells - LTC-IC) e/ou células que concretizam o potencial de auto-renovação e/ou células que concretizam caracteristicas pluripotenciais e/ou células que iniciam uma cultura de medula óssea a longo prazo e/ou células que podem gerar linhagens de células múltiplas. As linhagens de células podem ser células sanguíneas totalmente diferenciadas.

As células CD34+/CD38- e células CD34+/Thy-I e células CD34+/Thy-I/CD38- são enumeradas por exemplo em Anderlini et al (ver referências). As células CD34+/CD33 e células CD33+ são enumeraras por exemplo em Siena et al., 1991 (ver referências). As células iniciadoras de cultura a longo prazo (LTC-IC) são enumeraras por exemplo em Heather et al. (ver referências). As células que concretizam o potencial de auto-renovação e/ou células que concretizam as caracteristicas pluripotenciais e/ou células que iniciam uma cultura de medula óssea a longo prazo são enumeradas por exemplo em Anderlini et al (ver referências). A presente invenção refere-se especificamente à utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento que aumente, num paciente, o número de células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, sendo as células mencionadas destinadas a serem utilizadas para tratar, por retransfusão, transplante ou enxerto, o mesmo paciente para a reconstituição do sistema hematopoiético e imunitário na sequência de terapias mieloablativas ou antiblásticas.

Numa outra forma de concretização, a presente invenção refere-se a utilização da hormona do crescimento humana ou 13 um dos seus derivados para aumentar, num dador saudável, o número de células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, disponíveis e destinadas a leucaferese e retransfusão, transplante ou enxerto num receptor necessitado dessas células.

As utilizações seguintes são também presentemente descritas: - utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para aumentar ou expandir o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. - utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para periferizar células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. - utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento ou composição destinado a aumentar ou expandir o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. - utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento ou uma composição destinado a periferizar células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que as células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo são células CD34+. - utilização de acordo com a utilização anterior em que o número aumentado de células CD34+ é mais do que 10, 25, 34 ou 80 células CD34+ por microlitro de sangue periférico. - utilização de acordo com qualquer umas das utilizações anteriores em que o número aumentado de células CD34+ é pelo menos 2xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do receptor ou pelo menos 4xl06 células CD34+ por 14 quilograma de peso corporal do receptor ou pelo menos 8xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do receptor. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o número aumentado de células CD34+ é pelo menos 2xl06, 4xl06, 5xl06, 8xl06 ou 15xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo corresponde a pelo menos lxlO5 GM-CFC por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo corresponde a pelo menos 500 GM-CFC por mililitro de sangue periférico. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo corresponde a um nivel aumentado de CFU-C, CFU-Meg ou BFU-E. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o número aumentado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo corresponde substancialmente a uma contagem de glóbulos brancos de pelo menos 1000 células por microlitro de sangue periférico. Utilização de qualquer das utilizações anteriores em que as células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo são células CD34+/CD33+ e/ou células CD34+/CD38- e/ou células CD34+/Thy-I e/ou células CD39+/Thy-L/CD38- e/ou células CD33- e/ou células indiferenciadas e/ou células progenitoras e/ou células iniciadoras de cultura a longo prazo (LTC-IC) e/ou células que concretizam o potencial de auto-renovação e/ou células que concretizam características pluripotenciais e/ou 15 células que iniciam uma cultura de medula óssea a longo prazo.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o medicamento ou composição inclui ainda um ou vários composto(s) escolhidos de entre os seguintes grupos de compostos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que o grupo das citoquinas inclui IL-1, IL-3, GCSF, GM-CSF ou SCF, o grupo das quimioquinas inclui ΜΙΡ-Ια ou trombopoietina (TPO), o grupo de anticorpos monoclonais inclui anticorpos anti-VLA-4.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o medicamento ou composição inclui

Hormona do Crescimento e G-CSF.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que GH e G-CSF deve ser administrados em separado e/ou simultaneamente.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que a hormona do Crescimento deve ser administrada numa quantidade de cerca de 33 pg por quilograma de peso corporal.

Utilização de acordo com qualquer uma das duas utilizações anteriores, em que a o G-CSF deve ser administrado numa quantidade de cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg por quilograma. Utilização de acordo com qualquer uma das duas 16 utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita por via intravenosa ou subcutânea.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita por via parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica ou bocal.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração é diária ou três vezes por dia.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração da hormona do crescimento deve ser feita três vezes ao dia e a administração de G-CSF é feita diariamente.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita por um período de 5 dias ou por um período de 10 dias até à leucaferese ou até à recuperação total.

Utilização de acordo com qualquer uma das duas utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita até à leucaferese ou até à recuperação total. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a hormona do crescimento é hormona do crescimento recombinante. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a hormona do crescimento é hormona do crescimento humana. 17 A presente descrição apresenta também um método de preparação de uma população de células circulantes, capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, incluindo: a) administração a um dador de uma composição que inclui hormona do crescimento ou um dos seus derivados, numa quantidade suficiente para reduzir o volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especifico de células em circulação capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. b) processamento ou isolamento do volume de sangue reduzido mencionado e opcionalmente c) isolamento de uma população de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do dito volume isolado A fase b) ou c) [isolamento de uma população de células circulantes, capazes de regenerar a hematopoiese in vivo a partir do sangue isolado mencionado] dos métodos ou utilizações descritos presentemente, podem corresponder à operação de remoção de sangue periférico do dador, no qual o número de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo foi aumentado por meio da administração da hormona do crescimento ou um dos seus derivados, isoladamente ou em combinação com outros factores.

Uma quantidade suficiente para reduzir o volume de sangue necessário para ser processado de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo pode ser administrada numa ou várias doses ao longo de um ou vários dias. A operação de remoção do sangue periférico a partir do dador pode corresponder a leucaferese. A leucaferese é um 18 procedimento, em que os leucócitos são removidos do sangue recolhido e o restante sangue é retransfundido para o dador.

As células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, presentes na população isolada de células sanguíneas pode ser purificado em maior profundidade, de forma a aumentar a concentração das células mencionadas. A purificação pode ser feita por meio de selecção positiva das células positivas CD34. A presente descrição apresenta também um método de preparação de um dador de células circulantes, células essas que são capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, incluindo a administração ao dito dador de uma composição contendo hormona do crescimento ou um dos seus derivados numa quantidade suficiente para reduzir o volume de sangue necessário para processamento, de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo e/ou reduzir o número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficiente de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo para transplante.

Uma quantidade suficiente para reduzir o volume de sangue necessário para processamento, de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo e/ou reduzir o número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficiente de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo para transplante pode ser administrada numa ou várias doses ao longo de um ou vários dias. 19 0 volume de sangue necessário para processamento pode ser o volume de sangue necessário para processamento durante o procedimento de aférese ou leucaferese. A presente descrição apresenta também um método para reduzir o volume de sangue necessário para processamento, de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo num dador e/ou reduzir o número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficiente de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo para transplante por meio da administração de uma composição com a hormona do crescimento ou um dos seus derivados ao dito dador. 0 termo "reduzido" significa geralmente, na perspectiva da presente invenção, que o parâmetro "reduzido" (volume) tem um valor que é inferior ao valor padrão deste parâmetro. 0 número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo é de pelo menos 2xl04 LTC-IC por kg de peso corporal do dador ou do receptor, cerca de ou mais que 2xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor, cerca de ou mais que 4xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor ou cerca de ou mais que 8xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor. 0 volume necessário de sangue pode encontrar-se entre cerca de 30 a cerca de 900 mililitros. As utilizações seguintes são também presentemente descritas: - utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para reduzir o volume de sangue necessário para processamento, de forma a obter o número alvo especificado 20 de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. - utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento ou uma composição para reduzir o volume de sangue necessário para processamento, de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. - utilização de acordo com a utilização anterior, em que o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo é de cerca de ou mais que pelo menos 2xl04 LTC-IC por kg de peso corporal do dador ou do receptor, cerca de ou mais que 2xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor, cerca de ou mais que 4xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor ou cerca de ou mais que 8xl06 células CD34+ por quilograma de peso corporal do dador ou do receptor. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que o volume de sangue necessário se encontra entre cerca de 30 a cerca de 900 mililitros.

Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o medicamento ou composição inclui ainda um ou vários composto(s) escolhidos de entre os seguintes grupos de compostos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que o grupo das citoquinas inclui IL-1, IL-3, GCSF, GM-CSF ou SCF, o grupo das quimioquinas inclui ΜΙΡ-Ια ou trombopoietina (TPO), o grupo de anticorpos monoclonais inclui anticorpos anti-VLA-4. 21 - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que o medicamento ou composição inclui

Hormona do Crescimento e G-CSF. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que GH e G-CSF deve ser administrados em separado e/ou simultaneamente. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que a Hormona do Crescimento deve ser administrada numa quantidade de cerca de 33 pg por quiloqrama de peso corporal.

Utilização de acordo com qualquer uma das duas utilizações anteriores, em que a o G-CSF deve ser administrada numa quantidade de cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg por quilograma.

Utilização de acordo com qualquer uma das duas utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita por via intravenosa ou subcutânea. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita por via parentérica, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica ou bocal. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração é diária ou três vezes por dia. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração da hormona do crescimento deve ser feita três vezes ao dia e a administração de G-CSF é feita diariamente. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita por um período de 5 dias ou por um período de 10 dias até à leucaferese ou até à recuperação total. 22

Utilização de acordo com qualquer uma das duas utilizações anteriores, em que a administração deve ser feita até à leucaferese ou até à recuperação total. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que a administração(ões) deve(m) ser feita após quimioterapia, radioterapia, terapia mielossupressora, transplante de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou transplante de medula óssea. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores em que a administração(ões) começa(m) 7 dias depois do inicio do tratamento por quimioterapia ou cerca de 2 dias depois do fim do tratamento por quimioterapia. - utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a hormona do crescimento é hormona do crescimento recombinante. - Utilização de acordo com qualquer uma das utilizações anteriores, em que a hormona do crescimento é hormona do crescimento humana.

Na presente aplicação: - 0 termo "circulante" pode ser substituído pelo termo "sangue" ou "sangue periférico". 0 termo "preparação" na expressão "método de preparação" pode ser substituído por "pré-tratamento" ou por "preparação para extracção de sangue ou leucaferese". - Um "dador", tal como citado nos métodos ou utilizações da presente invenção pode ser um ser humano ou um animal. Um indivíduo saudável ou doente (paciente). 0 animal mencionado é de preferência um mamífero e pode ser escolhido de entre animais domésticos tais como cães, gatos, etc. ou animais tais como cavalos, gado, ovelhas. - 0 termo "hematopoiese" pode significar a formação de células sanguíneas. 23 - 0 termo "Hormona do Crescimento" engloba a hormona do crescimento humana (hGH) e todas as proteínas homólogas da hormona do crescimento humana de espécies diferentes e todos os homólogos das hormonas do crescimento humanas em espécies diferentes da espécie humana. As espécies diferentes da espécie humana podem ser de qualquer tipo de animal doméstico ou cavalo por exemplo.

Numa forma de concretização preferida, a hormona do crescimento é a hormona do crescimento humana. A hormona do crescimento humano (hGH), também conhecida como somatotropina, é uma hormona proteina produzida e segregada pelas células somatotrópicas da pituitária anterior. A hGH desempenha um papel chave no crescimento somático através dos seus efeitos no metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lipidos. A hormona do crescimento humana é uma única cadeia de polipeptideos de 101 aminoácidos, com duas ligações dissulfureto, uma entre Cys-53 e Cys-165, formando uma grande volta na molécula e a outra entre Cys-182 e Cys-189, formando uma pequena volta perto do terminal C. O termo "derivado" na expressão "derivados da hormona do crescimento" significa, no contexto da presente invenção, moléculas que diferem estruturalmente de GH nas que conservam a função de GH, no que respeita ao seu efeito directo ou indirecto no metabolismo das proteínas, hidratos de carbono e lipidos (isto é "mobilização da periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficiente de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo 24 especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo") . Os derivados da hormona do crescimento humana (hGH) incluídos na presente invenção incluem derivados naturais, variantes de produtos metabólicos, produtos da degradação principalmente de derivados biossintéticos hGH e modificados de hGH, produzidos por meio de métodos de engenharia genética. Qualquer derivado de hGH pode ser utilizado para atingir o objectivo da presente invenção desde que mantenha a actividade biológica da hGH da perspectiva da presente invenção.

Exemplos de derivados são variantes de splice, oligómeros, agregados, produtos de cisão proteolíticos, variantes com substituições, inserções ou eliminações de um ou mais aminoácidos, etc.

Metionilo hGH é um exemplo de derivado de hGH que é produzido por meio de tecnologia de ADN recombinante. Este composto é actualmente um derivado de hGH com um resíduo metionina adicional no seu terminal N (Goeddel et al.r 1979) .

Outro exemplo de derivado de hGH é uma variante que ocorre naturalmente de hGH chamada 20-K-hGH, que tem sido descrita como ocorrendo na pituitária, bem como na corrente sanguínea (Lewis et al, 1978; Lewis et al, 1980) . Este composto, ao qual falta os 15 resíduos aminoácido de Glu-32 a Gln-46, vem de um splicing alternativo do ácido ribonucleico mensageiro (DeNoto et al., 1981). Outro exemplo de derivado de hGH é acetilado no terminal-N (Lewis et al., 1979). 25 A hormona do crescimento humana pode ainda ser uma forma oligomérica monomérica, dimérica ou de maior peso molecular ou uma mistura destas formas. A hormona do crescimento humana pode ser encontrada em formas agregadas tanto na pituitária como na circulação (Stolar et al., 1984; Stolar and Baumann, 1986). A forma dimérica de hGH pode assumir vários tipos:

Um dimero dissulfureto ligado por meio de ligações dissulfureto intercadeia (Lewis et al., 1977),

Um dimero covalente irreversível que é detectado em dodecilsulfato de sódio géis de poliacrilamida e que não é um dimero dissulfureto (Bewley and Li, 1975) e

Um dimero não covalente que é facilmente dissociado numa hGH monomérica por meio de tratamento com agentes que rompem as interacções hidrófobas em proteínas (Becker et al., 1987), - Um complexo dimérico com Zn2+ (Cunningham et al., 1991). Análise de Scatchard tem revelado que dois iões ZN2+ associam-se pelo dimero hGH de uma forma cooperativa e constatou-se que este complexo dimérico ZN2+-hGH é mais estável à desnaturação do que o hGH monomérico (Cunningham et al., 1991) . Vários derivados de hGH têm origem nas modificações proteoliticas da molécula. A principal via para o metabolismo da hGH envolve a proteólise. A região de hGH em torno dos residuos 130 a 150 é extremamente susceptivel à proteólise e têm sido descritos vários derivados de hGH com incorrecções ou eliminações nesta região (Thorlacius-Ussing, 1987). Esta região encontra-se na volta grande da hGH e uma cisão da ligação peptídeo aí tem como resultado a degeneração das duas cadeias que estão ligadas pela ligação dissulfureto em Cys 53 e Cys 165. Muitas destas formas em 26 duas cadeias são descritas como tendo maior actividade biológica (Singh et al., 1974).

Muitos derivados da hormona do crescimento humana têm sido gerados artificialmente através do uso de enzimas. As enzimas tripsina e subtilisina, bem como outras têm sido utilizadas para modificar a hGH em vários pontos ao longo da molécula (Lewis et al., 1977). Um destes derivados, chamada proteina anabólica de cadeia dupla (2-CAP) foi formada por meio de proteólise controlada de hGH utilizando tripsina.

Outro exemplo de derivado de hGH é o hGH desamidado. Os resíduos asparagina e glutamina em proteínas são susceptíveis de reacções de desamidação nas condições apropriadas. Um exemplo de hGH desamidada é a hGH da pituitária que tem revelado sofrer este tipo de reacção, tendo como resultado a conversão de Asn-152 em ácido aspártico e também, em menor escala, a conversão de Gln-137 em ácido glutâmico (Lewis et al., 1981) . Outro exemplo de hGH desamidada é a hGH biossintética, que se sabe degradar sob certas condições de armazenagem, tendo como resultado a desamidação numa asparagina diferente (Asn-149). Este é o principal sítio de desamidação mas é também observada a desamidação em Asn-152 (Becker et al., 1988). A desamidação em Gln-137 não foi descrita em hGH biossintética. 1988). A oxidação em Met-170 tem

Outro exemplo de derivado de hGH é a hGH sulfóxida. Os resíduos metionina em proteínas são susceptíveis desoxidação, principalmente para o sulfóxido. Tanto a hGH da pituitária como sintética sofrem sulfoxidações em Met-14 e Met-125 (Becker et al., 27 também sido descrita em hGH da pituitária mas não na biossintética.

Outro exemplo de derivado de hGH são formas truncadas de hGH que foram produzidas, seja por meio de acções de enzimas ou por meio de métodos de engenharia genética. 2-CAP gerado pelas acções controladas da tripsina retira-se-lhe os primeiros oito resíduos no terminal N da hGH. Outras versões truncadas de hGH têm sido produzidas por meio de modificação do gene antes da expressão num hospedeiro adequado. Os primeiros 13 resíduos foram removidos para se obter um derivado com propriedades biológicas distintivas em que a cadeia de polipeptídeos não está cindida (Gertler et al., 1986). hGH e seus derivados podem ser produzidos por meio de tecnologia de ADN recombinante, que permite a produção de um fornecimento ilimitado de hGH por vários sistemas diferentes. A purificação de hGH ou seus derivados do a partir do meio de cultura é facilitada pelas baixas quantidades de proteínas contaminantes presentes. De facto, demonstrou-se que hGH pode ser purificada à escala laboratorial numa única fase de purificação, numa coluna de HPLC de fase inversa. O hGH recombinante é geralmente vendido em frascos contendo hGH mais excipientes adicionais p.ex. glicina e manitol, sob forma liofilizada. É fornecido junto um frasco com diluente, permitindo ao paciente reconstituir o produto na concentração desejada antes da administração da dose.

Em geral, não foram observadas diferenças significativas nas actividades farmacocinéticas ou biológicas da sequência 28 hGH recombinante natural, N metionil-hGH recombinante ou material derivado da pituitária em seres humanos (Moore et al., 1988 ; Jorgensen et al. , 1988). A hormona do crescimento humana, tal como utilizada na presente invenção pode incluir derivados funcionais, tal como indicado anteriormente, bem como outros tipos de derivados, fragmentos, variantes, análogos ou derivados químicos. Um derivado funcional retém pelo menos uma porção da sequência de aminoácidos de hGH que permite a sua utilidade de acordo com a presente invenção, nomeadamente a mobilização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo por exemplo.

No sentido da presente invenção, um "derivado" pode significar:

Um "fragmento" da hormona do crescimento humana, de acordo com a presente invenção refere-se a qualquer subconjunto da molécula, isto é um peptideo mais curto.

Uma "variante" da hormona do crescimento humana, de acordo com a presente invenção refere-se a uma molécula que é substancialmente semelhante seja ao peptideo inteiro como a um seu fragmento. Os peptideos variantes pode ser convenientemente preparados por meio de sintese química directa do peptideo variante, recorrendo a métodos bem conhecidos na técnica.

Em alternativa, as variantes de aminoácidos de hGH podem ser preparadas por meio de mutações no cADN que codifica os derivados de hGH sintetizados. Estas variantes incluem eliminações, inserções ou substituição de resíduos dentro da sequência de aminoácidos. Qualquer combinação de eliminações, inserções e substituições pode também ser 29 feita, desde que a construção final possua a actividade desejada.

Ao nivel genético, estas variantes são vulgarmente preparadas por meio de mutagénese dirigida ao sitio (tal como exemplificado por (Adelman et al., 1983)) de nucleótidos no ADN que codifica a molécula do peptídeo, produzindo assim o ADN que codifica a variante e em seguida exprimindo o ADN em cultura celular recombinante. As variantes apresentam tipicamente a mesma actividade biológica que o peptideo não variante. - Um "análogo" da hormona do crescimento humana, de acordo com a presente invenção refere-se a uma molécula não natural que é substancialmente semelhante seja à molécula inteira como a um seu fragmento activo. - Um "derivado químico" da hormona do crescimento humana, de acordo com a presente invenção, contém fracções químicas adicionais que normalmente não fazem parte da sequência de aminoácidos do derivado da hormona do crescimento humana. Modificações covalentes da sequência de aminoácidos são incluídas no âmbito da presente invenção. Estas modificações podem ser introduzidas na hormona do crescimento humana por meio de reacção de resíduos de aminoácidos do peptídeo específicos com um agente de derivatização orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas em resíduos terminais. podem ser

Os tipos de substituições que podem ser feitas na hormona do crescimento humana, de acordo com a presente invenção podem basear-se nas análises das frequências das alterações de aminoácidos entre uma proteína homóloga de espécies diferentes. Com base nestas análises, 30 presentemente definidas substituições conservadoras como trocas dentro de um dos cinco grupos seguintes: I: resíduos pequenos, alifáticos, não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly II: resíduos polares, com carga negativa e suas amidas: Asp. Asn, Glu, Gin III: resíduos polares com carga positiva: His, Arg, Lys IV: resíduos grandes, alifáticos não polares: Met, Leu, Ile, Vai, Cys V: resíduos grandes aromáticos: Phe, Try, Trp

Dentro dos grupos anteriores, as seguintes substituições são consideradas como sendo "muito conservadoras":

Asp/Glu His/Arg/Lys Phe/Tyr/Trp Met/Leu/Ile/Vai

As substituições semi-conservadoras são definidas como sendo trocas entre dois grupos (I) - (IV) acima dos quais estão limitadas ao supergrupo (A), incluindo (I), (II) e (III) acima ou o supergrupo (B) incluindo (IV) e (V) acima. As substituições não se limitam aos aminoácidos codificados geneticamente ou mesmo aos aminoácidos naturais. Quando o epítopo é preparado por meio de síntese do peptídeo, o aminoácido desejado pode ser utilizado directamente. Em alternativa, um aminoácido codificado geneticamente pode ser modificado fazendo-o reagir com um agente de derivatização orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou resíduos terminais.

Normalmente, os resíduos de cisterna são feitos reagir com alfa-haloacetatos (e aminas correspondentes) , tais como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para se obter derivados de carboximetilo ou carboxiamidometilo. Os 31 resíduos de cisteína são também derivatizados por meio de reacção com bromotrifluoroacetona, acido alfa-bromo-beta-(5-imidazoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfureto de 3-nitro-2-piridilo, disulfureto de metil-2-piridilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol. OS resíduos de histidilo são derivatizados por meio de reacção com dietilprocarbonato a pH 5,5 a 7,0 porque este agente é relativamente específico da cadeia lateral histidilo. Brometo de parabromofenacilo é também útil, a reacção é realizada de preferência em cacodilato de sódio 0,1 M a pH 6,0.

Lisinilo e resíduos terminais amino são feitos reagir com os anidridos de ácido succínico ou outro ácido carboxílico. A derivatização com estes agentes tem o efeito de inverter a carga dos resíduos lisinilo. Outros reagentes adequados para a derivatização de resíduos contendo alfa-aminoácidos incluem imidoésteres tais como picolinimidato de metilo, fosfato de pirodoxal, pirodoxal, cloroboro-hidreto, ácido trinitrobenzenosulfónico, O-metilisoureia, 2,4-pentanediona e reacção catalisada com transaminase com glioxilato.

Os resíduos de arginilo são modificados por meio de reacção com um ou vários reagentes convencionais, entre os quais fenilglioxal, 2,3-butanediona e ninidrina. A derivatização dos resíduos de arginina exige que a reacção seja realizada em condições alcalinas devido ao elevado pKa do grupo funcional guanina. Além disso, os reagentes podem reagir com os grupos da lisina bem como o grupo arginina epsilon-amino. 32 A modificação especifica dos resíduos de tirosilo per se tem sido estudada extensivamente, com particular interesse na introdução de rótulos espectrais em resíduos tirosilo por meio de reacção com compostos diazónio aromáticos ou tetranitrometano. Mais vulgarmente, são utilizados N-acetilimidazóis e tetranitrometano para formar espécies 0-acetilo tirosilo e derivados e-nitro respectivamente.

Os grupos laterais carboxilo (aspartilo ou glutamilo) so modificados selectivamente por meio de reacção com carbodiimidas (R'NC-N-R') tal como l-ciclo-hexil-3-[2-morfolinil-(4-etil)] carbodiimida ou l-etil-3-(4-azonia-4,4-diemtilpentil)carbodiimida. Além disso, os resíduos aspartatilo e glutamilo são convertidos em resíduos asparaginilo e glutaminilo por meio de reacção com iões de amónio.

Os resíduos glutaminilo asparaginilo são frequentemente desamidados nos resíduos glutamilo e aspartilo correspondentes. Em alternativa, estes resíduos são desamidados sob condições ligeiramente ácidas. Qualquer das formas destes resíduos é abrangida pela presente invenção. Enquanto que a presente invenção pode ser executada com derivados da hormona do crescimento humana recombinante, feitos por meio da tecnologia de ADN recombinante, por exemplo em células procariotas ou eucariotas, estes derivados podem também ser feitos por meio de métodos de síntese de proteínas convencionais, que são bem conhecidos dos especialistas na técnica. A hormona do crescimento pode ser uma proteína ou um peptídeo. 33 A hormona do crescimento pode ser de preferência uma hormona do crescimento recombinante. A determinação das quantidades de hormona do crescimento ou de um dos seus derivados, destinados a serem administrados numa utilização da presente invenção descrita anteriormente é abrangida pela especialidade na técnica. A dosagem tipica da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados terá inicio a cerca de 1 micrograma por quilograma do peso do paciente, por dia e a dose será escalada até se atingir o efeito desejado (mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, aumento do número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo). A dosagem da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados destinados a ser administrado depende da idade, sexo, saúde e peso do dador, tipo de tratamento anterior e simultâneo, se houver, frequência do tratamento e natureza do efeito desejado. A hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser vantajosamente administrado numa quantidade entre 20 e 50 pg por quilograma de peso corporal, mais particularmente entre 30 e 40 pg por quilograma de peso corporal. 34

Uma dosagem preferida da hormona do crescimento ou um dos seus derivados destinado a ser administrado situa-se cerca dos 33 pg por quilograma de peso corporal. A hormona do crescimento ou os seus derivados podem ser administrados isoladamente ou em conjunto ou associação com outros factores. A hormona do crescimento ou os seus derivados podem vantajosamente encontrar-se numa composição que inclui ainda um ou vários composto(s) escolhidos de entre os compostos que fazem parte dos seguintes grupos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais. A hormona do crescimento ou os seus derivados e um ou vários composto(s) escolhidos de entre os compostos dos seguintes grupos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais destinados a serem administrados simultaneamente ou em momentos diferentes e/ou no mesmo sítio ou em sitio (s) diferente(s) e/ou na mesma composição ou medicamento ou em composições ou medicamentos diferentes. 0 grupo das citoquinas pode incluir IL-1, IL-3, GCSF, GM-CSF ou SCF. 0 grupo das quimioquinas pode incluir ΜΙΡ-Ια ou trombopoietina (TPO). 0 grupo dos anticorpos monoclonais pode incluir anticorpos anti-VLA-4.

De preferência, a hormona do crescimento ou os seus derivados encontra-se numa composição que inclui factor estimulante de colónia de granulócitos (G-CSF). 35

De preferência, a hormona do crescimento ou os seus derivados estão associados a G-CSF.

Hormonas do crescimento ou seus derivados e G-CSF podem ser administrados simultaneamente ou em momentos diferentes e/ou no mesmo sitio ou em sítio (s) diferente (s) e/ou na mesma composição ou medicamento ou em composições ou medicamentos diferentes. A hormona do crescimento ou seus derivados e G-CSF podem ser vantajosamente administrados em separado. G-CSF pode ser vantajosamente administrado numa quantidade entre 3 e 15 pg por quilograma de peso corporal, mais particularmente entre 4 e 12 pg por quilograma de peso corporal.

Uma dosagem preferida de G-CSF para administração situa-se cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal.

Numa forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados será administrada numa quantidade entre 20 e 50 pg por quilograma de peso corporal, mais particularmente entre 30 e 40 pg por quilograma de peso corporal e G-CSF é administrado numa quantidade entre 3 e 15 pg por quilograma de peso corporal, mais particularmente entre 4 e 12 pg por quilograma de peso corporal.

Numa forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados será administrada numa quantidade de 33 pg por quilograma de peso corporal e G-CSF será administrado numa quantidade de cerca de 5 pg ou cerca de 10 pg por quilograma de peso corporal. 36

De acordo com a presente invenção, a expressão "administração numa quantidade suficiente para aumentar o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou reduzir o volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo" pode significar uma ou várias administrações, um ou vários momentos por dia e durante um ou vários dias para que uma acumulada seja suficiente para aumentar o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou reduzir o volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo.

As composições farmacêuticas ou composições que são utilizadas de acordo com a presente invenção, numa forma farmaceuticamente aceitável, são opcionalmente combinadas com um veiculo aceitável.

Estas composições podem ser administradas por qualquer meio que atinja os objectivos propostos. Estas composições utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser administradas isoladamente ou em conjunto com outras terapêuticas orientadas para uma doença ou orientadas para outros sintomas destas.

As composições utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser administradas pelas vias intravenosa ou subcutânea.

Após a administração intravenosa, a eliminação de hGH é descrita por cinética de primeiro ordem, com uma semivida 37 no soro de 12 a 30 minutos tanto em animais como em seres humanos (Moore et al., 1988; Hendricks et al., 1985). Tradicionalmente, a injecção intramuscular tem sido o método de eleição como via preferida de aplicação. Em seres humanos, a absorção de hGH exógeno parece ser mais rápido a partir de sítios intramusculares, com um tempo até à concentração máxima de duas a três horas, em comparação com quatro a seis horas depois da administração subcutânea. A fase de desaparecimento do soro tem sido relatada como sendo entre 12 a 20 horas para a administração intramuscular e 20 a 24 horas depois da administração subcutânea (AlbertssonWikland et al., 1986; Jorgensen et al., 1987).a

As composições utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser administradas por vias parentéricas, tais como as vias subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou transdérmica ou por vias mucosas, tais como a via bucal ou oral. A composição que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada por vias parentéricas, tais como as vias subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou transdérmica ou por vias mucosas, tais como a via bucal ou oral.

De preferência, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados deve ser administrada por via subcutânea. A dose ou quantidade total necessária para cada utilização da presente invenção pode ser administrada em doses múltiplas ou dose única. 38 A composição que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada diariamente ou três vezes ao dia.

De preferência, a composição que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada três vezes ao dia.

De preferência, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada diariamente ou três vezes ao dia. Numa forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada três vezes ao dia.

Se uma utilização da presente invenção inclui a administração da hormona do crescimento ou um dos seus derivados e G-CSF, o G-CSP deve de preferência ser administrado uma vez ao dia e/ou subcutaneamente.

Se uma utilização da presente invenção inclui a administração da hormona do crescimento ou um dos seus derivados e G-CSF, a hormona do crescimento e um dos seus derivados devem de preferência ser administrados três vezes ao dia e G-CSF é administrado de preferência diariamente. A composição que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada diariamente com inicio até 20 dias antes da leucaferese. A hormona do crescimento ou de um dos seus derivados será administrada por um periodo de 5 dias ou por um período de 10 dias, até à leucaferese ou até se atingir o efeito desejado (mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, aumento do 39 número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo). A hormona do crescimento ou de um dos seus derivados será administrada por um periodo de 5 dias ou por um periodo de 10 dias, até à leucaferese ou até se atingir o efeito desejado (mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, aumento do número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo).

As utilizações da presente invenção são realizadas vantajosamente depois de quimioterapia, radioterapia, terapia mielossupressora, transplante ou enxerto de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou transplante de medula óssea.

As utilizações da presente invenção são realizada vantajosamente cerca de 7 dias depois do inicio do tratamento por quimioterapia ou cerca de 2 dias depois do fim de um tratamento por quimioterapia. 40

Numa forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou de um dos seus derivados e G-CSF será administrada até à leucaferese, até à mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, aumento do número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. Nesta forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados é administrada de preferência três vezes ao dia e G-CSF é administrada de preferência uma vez ao dia.

As utilizações da presente invenção podem ser combinadas com um tratamento anterior chamado "chemopriming". Os regimes de "chemopriming" que podem ser utilizados são: - doses elevadas de ciclofosfamida (4 g/m2) para pacientes com cancro da mama ou mieloma múltiplo. - ifosfamida, etoposide para pacientes com linfoma não-Hodgkin ou doença de Hodgkin. ciclofosfamida, etoposide, cisplatina (CVP) para pacientes com tumores sólidos (p.ex. cancro da mama).

Para intensificar resposta de indução de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo as utilizações da presente invenção devem começar pouco tempo depois da conclusão do tratamento de "chemopriming" e continuar até se completar a aférese (5 a 12 pg/kg/d). 41 É também notável que em pacientes cuja contagem de células indiferenciadas da medula óssea está significativamente diminuída antes da quimioterapia, um regime adicional de "chemopriming" pode prejudicar mais do que induzir a periferização de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. Os agentes quimioterapêuticos tóxicos para as células indiferenciadas, tais como busulfano, doxorubicina, melfalano, tiotepa e possivelmente fludarabina (e outros) não devem fazer parte de um regime de "chemopriming". Por outro lado, a ciclofosfamida é considerada o medicamento de "chemopriming" ideal, com a menor toxicidade para as células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo apesar de a cardiotoxicidade (dose > 4 g/m2) e a cistite hemorrágica serem efeito secundários extramedulares, limitadores da dose bem conhecidos (Shepperd et ai., 1990). A população de células sanguíneas enriquecidas com células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, obtidas a partir do sangue periférico, pelos métodos e utilizações da presente invenção podem ser retransfundidas, enxertadas ou transplantadas para o mesmo indivíduo, que neste caso é o dador (transplante autólogo) ou para diferentes indivíduos (transplante não autólogo). A população de células sanguíneas enriquecidas com células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, obtidas a partir do sangue periférico pelos métodos e utilizações da presente invenção são vantajosamente transfundidas para um indivíduo, que recebeu previamente uma ou várias terapias de quimioterapia, radioterapia, terapia mielossupressora, mieloablativa ou mielotóxica. 42 A operação ou retransfusão, enxerto ou transplante mencionados fazem parte dos procedimentos ditos de Transplante de Células Indiferenciadas Hematopoiéticas (TCIH). 0 TCIH é um procedimento clinico em que as células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, obtidas da medula óssea ou sangue periférico são transplantadas para um paciente.

Um transplante autólogo é um transplante em que o dador e o receptor são o mesmo individuo, enquanto que um transplante não autólogo é um transplante em que o dador e o receptor são indivíduos diferentes. 0 método da presente invenção engloba tanto o transplante autólogo como o não autólogo.

Noutra parte a presente descrição apresenta também um método ou uma utilização da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados para intensificar o efeito de mobilização ou periferização de G-SCF. A presente descrição apresenta um método ou utilização da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados ou qualquer factor indutor da libertação da hormona do crescimento para intensificar a mobilização de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo com G-CSF, para intensificar o aumento do número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo com G-CSF, para intensificar a redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante com G-CSF e/ou para intensificar a redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo com G-CSF. 43

Assim, a administração da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados e G-CSF intensifica ou aumenta sinergisticamente a mobilização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, intensifica ou aumenta sinergisticamente o número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, reduz o número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante e/ou reduz o volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo no que se refere ao(s) efeito(s) obtidos por meio da administração de G-CSF isoladamente ou sem a hormona do crescimento ou um dos seus derivados ou qualquer factor indutor da libertação da hormona do crescimento. A administração da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados e G-CSF permite usar dosagens menores de G-CSF do que se o G-CSF fosse utilizado isoladamente ou sem a hormona do crescimento ou um dos seus derivados ou qualquer factor indutor da libertação da hormona do crescimento. A administração de hormonas do crescimento ou um dos seus derivados e G-CSF pode ser executada simultaneamente ou em momentos diferentes e/ou no mesmo sitio ou em sitio (s) diferente(s) e/ou na mesma composição ou medicamento ou em composições ou medicamentos diferentes.

Numa segunda parte, a presente descrição apresenta novas utilizações para intensificar a reconstituição hematopoiética. A presente descrição apresenta um agente capaz de promover, intensificar ou acelerar a regeneração hematopoiética, recuperação ou reconstituição. A presente 44 descrição apresenta novas utilizações para intensificar a reconstituição hematopoiética.

Assim a presente descrição apresenta a utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado a intensificar a reconstituição hematopoiética num ser humano.

Ao longo do pedido de patente, o termo "intensificação" e todos os termos da mesma raiz podem ser substituídos pelo termo "promoção" ou pelo termo "aceleração".

Ao longo do pedido de patente, o termo "reconstituição" e todos os termos da mesma raiz podem ser substituídos pelo termo "recuperação" ou pelo termo "regeneração". A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado a intensificar a reconstituição hematopoiética na sequência de um transplante da medula óssea, num ser humano. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado a intensificar um enxerto da medula óssea ou células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo num ser humano. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado a intensificar a reconstituição hematopoiética na sequência do transplante 45 de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo num ser humano. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado a intensificar a o enxerto de células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo. A hormona do crescimento pode ser vantajosamente uma hormona do crescimento humana. A hormona do crescimento e seus derivados podem corresponder à hormona do crescimento e seus derivados que são enumerados anteriormente neste pedido de patente, associados à primeira parte da invenção. A reconstituição hematopoiética ou enxerto intensificado podem ser detectados por um aumento da contagem de glóbulos brancos periféricos (GB) e/ou contagem de granulócitos e/ou contagem de linfócitos e/ou contagem de plaquetas e/ou contagem de eritrócitos.

Um aumento da contagem de Glóbulos Brancos (GB) e/ou) e/ou contagem de granulócitos e/ou contagem de linfócitos e/ou contagem de plaquetas e/ou contagem de eritrócitos. Pode ser detectada por meio de comparação com a taxa de aumento das ditas contagens num indivíduo que recebeu o mesmo regime de transplantes mas que não recebeu qualquer tratamento de reconstituição hematopoiética. A reconstituição hematopoiética ou enxerto intensificado podem ser detectados por uma redução do período de tempo 46 necessário para recuperar uma contagem de glóbulos brancos periféricos (GB) e/ou contagem de granulócitos e/ou contagem de neutrófilos e/ou contagem de linfócitos e/ou contagem de plaquetas e/ou contagem de eritrócitos normal ou padrão.

Uma contagem de glóbulos brancos periféricos (GB) e/ou contagem de granulócitos e/ou contagem de neutrófilos e/ou contagem de linfócitos e/ou contagem de plaquetas e/ou contagem de eritrócitos normal ou padrão é aquela que é medida num indivíduo saudável ou num indivíduo que não recebeu qualquer terapia mieloablativa, mielotóxica ou mielossupressora, qualquer quimioterapia, qualquer radioterapia ou qualquer transplante.

Uma contagem de neutrófilos normal pode ser de pelo menos 0,5 x 109 células de neutrófilos por litro de sangue periférico. Uma contagem de plaquetas normal pode ser de pelo menos 20 x 109 por litro de sangue periférico.

Uma reconstituição hematopoiética ou enxerto de intensificação podem ser detectados por uma redução da extensão e/ou duração da neutropenia e/ou trombocitopenia e/ou anemia e/ou hemorragias e/ou duração da profilaxia. A reconstituição hematopoiética ou enxerto de intensificação podem ser detectados por uma redução da duração e/ou gravidade da febre e/ou infecções. Uma redução da extensão e/ou duração da neutropenia e/ou trombocitopenia e/ou anemia e/ou hemorragias e/ou duração da profilaxia ou uma redução da duração e/ou gravidade da febre e/ou infecções pode ser comparada com a dita extensão e/ou duração e/ou gravidade medidas num indivíduo que 47 recebeu o mesmo regime de transplante, a mesma quimioterapia, a mesma radioterapia ou a mesma terapia mielossupressora, mieloablativa ou mielotóxica mas que não recebeu qualquer tratamento de reconstituição hematopoiética. A reconstituição hematopoiética ou o enxerto intensificador podem ser detectados por uma recuperação dos granulócitos que é de pelo menos 1000 por microlitro de sangue periférico. A reconstituição hematopoiética ou o enxerto intensificador podem ser detectados por uma recuperação da contagem de plaquetas que é de pelo menos 50.000 por microlitro de sangue periférico. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados ou qualquer factor indutor da libertação da hormona do crescimento para preparar um medicamento destinado ao tratamento de doenças neoplásicas, uma perturbação hematológica, malignidades, imunodeficiências combinadas graves (SCID), anomalias hematopoiéticas congénitas ou determinadas geneticamente, anemia, aplasia anémica, leucemia e osteoporose.

Uma doença neoplásica pode ser o cancro da mama. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado à redução do periodo de aplasia da medula óssea na sequência de transplante, quimioterapia, radioterapia ou terapia mieloablativa, mielossupressora ou mielotóxica, para prevenir ou tratar infecções oportunistas 48 na sequência de um transplante, quimioterapia, radioterapia ou terapia mieloablativa, mielossupressora ou mielotóxica ou para limitar o risco de recorrência do tumor após transplante, quimioterapia, radioterapia ou terapia mieloablativa, mielossupressora ou mielotóxica. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados para preparar um medicamento para prevenção ou tratamento dos efeitos secundários da terapia mieloablativa, mielossupressora ou mielotóxica e/ou radioterapia e/ou quimioterapia e/ou transplante. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento destinado a prevenir ou tratar neutropenia e/ou trombocitopenia. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento para prevenir ou tratar anemia na sequência de radioterapia e/ou quimioterapia e/ou transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas e/ou transplante de células capazes de regenerar a hematopoiese e/ou transplante de medula óssea e/ou terapia mielossupressora ou mielotóxica. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento para prevenir ou tratar neutropenia na sequência de radioterapia e/ou quimioterapia e/ou transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas e/ou transplante de células capazes de regenerar a hematopoiese 49 e/ou transplante de medula óssea e/ou terapia mielossupressora ou mielotóxica. A presente descrição apresenta também a utilização da hormona do crescimento ou um dos seus derivados para preparar um medicamento para prevenir ou tratar trombocitopenia na sequência de radioterapia e/ou quimioterapia e/ou transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas e/ou transplante de células capazes de regenerar a hematopoiese e/ou transplante de medula óssea e/ou terapia mielossupressora ou mielotóxica.

As células CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo podem fazer parte de um ou vários dos seguintes grupos de células: Células CD34+, células CD34+CD33+, células CD34+CD38-, células CD34+Thy-I, células CD34+ThyICD38-, células CD33+, células indiferenciadas, células progenitoras, células iniciadoras de cultura a longo prazo (LTC-IC) e/ou células que concretizam o potencial de auto-renovação e/ou células que concretizam caracteristicas pluripotenciais e/ou células que iniciam uma cultura de medula óssea a longo prazo. A determinação das quantidades de hormona do crescimento ou de um dos seus derivados, destinados a serem administrados por um método de utilização da presente invenção descrito anteriormente é abrangida pela especialidade na técnica. A dosagem tipica da hormona do crescimento ou um dos seus derivados terá inicio em cerca de 1 micrograma por quilograma de peso do paciente, por dia e a dose será escalada até se atingir o efeito desejado (recuperação hematopoiética ou enxerto). 50 A dosagem da hormona do crescimento ou de um dos seus derivados destinado a ser administrado depende da idade, sexo, saúde e peso do dador, tipo de tratamento anterior e simultâneo, se houver, frequência do tratamento e natureza do efeito desejado. A hormona do crescimento ou os seus derivados podem ser administrados isoladamente ou em conjunto ou associação com outros factores. A hormona do crescimento ou os seus derivados podem vantajosamente encontrar-se numa composição ou num medicamento que inclui ainda um ou vários composto(s) escolhidos de entre os compostos que fazem parte dos seguintes grupos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais. A hormona do crescimento ou os seus derivados e um ou vários composto(s) escolhidos de entre os compostos dos seguintes grupos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais de destinados a serem administrados simultaneamente ou em momentos diferentes e/ou no mesmo sitio ou em sitio (s) diferente(s) e/ou na mesma composição ou medicamento ou em composições ou medicamentos diferentes. O grupo das citoquinas pode incluir IL-1, IL-3, GCSF, GM-CSF ou SCF. O grupo das quimioquinas pode incluir ΜΙΡ-Ια ou trombopoietina (TPO). O grupo dos anticorpos monoclonais pode incluir anticorpos anti-VLA-4.

De preferência, a hormona do crescimento ou os seus derivados encontra-se numa composição ou num medicamento 51 que inclui factor estimulante de colónia de granulócitos (G-CSF). De preferência, a hormona do crescimento ou os seus derivados estão associados a G-CSF.

Hormonas do crescimento ou seus derivados e G-CSF podem ser administrados simultaneamente ou em momentos diferentes e/ou no mesmo sitio ou em sitio (s) diferente (s) e/ou na mesma composição ou medicamento ou em composições ou medicamentos diferentes. A hormona do crescimento ou seus derivados e G-CSF podem ser vantajosamente administrados em separado. A hormona do crescimento ou os seus derivados e/ou G/CSF devem ser administrados numa quantidade suficiente para intensificar a reconstituição hematopoiética ou enxerto. A administração de uma quantidade suficiente para intensificar a reconstituição hematopoiética ou enxerto pode significar uma ou várias administrações, uma ou várias vezes ao dia e durante um ou vários dias para se atingir uma quantidade acumulada suficiente para intensificar a reconstituição hematopoiética ou enxerto.

As composições farmacêuticas ou medicamentos ou composições que são utilizadas de acordo com a presente invenção, numa forma farmaceuticamente aceitável, são opcionalmente combinadas com um veiculo aceitável.

Estas composições ou medicamentos podem ser administradas por qualquer meio que atinja os objectivos propostos.

Estas composições ou medicamentos utilizados de acordo com a presente invenção podem ser administrados isoladamente ou 52 em conjunto com outras terapêuticas orientadas para uma doença ou orientadas para outros sintomas destas.

As composições ou medicamentos utilizados de acordo com a presente invenção podem ser administrados pelas vias intravenosa ou subcutânea.

As composições ou medicamentos utilizados de acordo com a presente invenção podem ser administrados por vias parentéricas, tais como as vias subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou transdérmica ou por vias mucosas, tais como a via bucal ou oral. A composição ou medicamento que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrado por vias parentéricas, tais como as vias subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou transdérmica ou por vias mucosas, tais como a via bucal ou oral. De preferência, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados deve ser administrada por via subcutânea. A dose ou quantidade total necessária para cada tratamento, método ou utilização da presente invenção pode ser administrada em doses múltiplas ou dose única. A composição ou medicamento que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrado diáriamente ou três vezes ao dia.

De preferência, a composição ou medicamento que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrado três vezes ao dia. 53

Se uma utilização da presente invenção inclui a administração da hormona do crescimento ou um dos seus derivados e G-CSF, o G-CSF deve de preferência ser administrado uma vez ao dia e/ou subcutaneamente.

Se uma utilização da presente invenção inclui a administração da hormona do crescimento ou um dos seus derivados e G-CSF, a hormona do crescimento e um dos seus derivados devem de preferência ser administrados três vezes ao dia e G-CSF é administrado de preferência diariamente. A administração do medicamento pode ser feita ao longo de um periodo de 3 dias, até à leucaferese ou até à recuperação total. A administração do medicamento pode ser feita a partir do dia 1 até ao dia 3 depois do transplante. 0 termo "transplante" engloba o transplante de medula óssea ou transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas. A composição ou medicamento que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrado diariamente, com inicio até 20 dias antes da leucaferese. A composição que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada por um periodo de 5 54 dias ou por um período de 10 dias, até se atingir o efeito desejado (recuperação hematopoiética ou enxerto).

De preferência, a composição que inclui a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser administrada até se atingir o efeito desejado (recuperação hematopoiética ou enxerto).

As utilizações da presente invenção são realizada vantajosamente cerca de 7 dias depois do início do tratamento por quimioterapia ou cerca de 2 dias depois do fim de um tratamento por quimioterapia.

Numa forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados e G-CSF podem ser administrados até à reconstituição hematopoiética ou enxerto. Nesta forma de concretização preferida, a hormona do crescimento ou um dos seus derivados é administrada de preferência três vezes ao dia e G-CSF é administrada de preferência uma vez ao dia. A hormona do crescimento utilizada no medicamento pode vantajosamente ser hormona do crescimento recombinante. A hormona do crescimento utilizada no medicamento pode vantajosamente ser hormona do crescimento humana. 55

Numa terceira parte, a presente invenção apresenta uma combinação de métodos e utilizações da primeira parte da presente invenção (mobilização) com os métodos e utilizações da segunda parte da presente invenção (recuperação).

As utilizações da dita combinação são mobilização e recuperação que podem ser aplicadas em casos de transplante autólogo de células indiferenciadas hematopoiéticas, em que o dador e o receptor são a mesma pessoa ou indivíduo. Assim a hormona do crescimento ou um dos seus derivados pode ser utilizada como agente mobilizante numa primeira etapa de mobilização que é um pré tratamento, com o objectivo de extrair as células sanguíneas e como agente de recuperação hematopoiética numa segunda etapa, na sequência de transplante.

As utilizações combinadas são muito úteis. De facto, o transplante de células mobilizadas pela hormona do crescimento ou um dos seus derivados num paciente tem como resultado uma recuperação hematopoiética mais rápida do que um transplante sem um tratamento prévio de mobilização do dito paciente.

As utilizações da presente invenção podem ser aplicadas em muitas áreas clinicamente importantes, nomeadamente transplante autólogo de medula óssea, transplante alogénico de medula óssea, terapia genética, transplante de células indiferenciadas hematopoiéticas células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, radioterapia, quimioterapia, terapia mielossupressora ou mielotóxica. 56

As utilizações da presente invenção podem ser aplicadas para tratar um paciente que recebeu radioterapia ou quimioterapia, que sofreu um transplante com medula óssea ou células capazes de regenerar a hematopoiese in vivo ou que recebeu terapia mielotóxica ou mieloablativa.

Legenda das figuras:

Figura 1:

Abreviaturas: - GH: Hormona do Crescimento - G-CSF: Factor estimulante de células granulócitos - ND: Não Detectável Figura 2:

Este gráfico descreve o número de células CD34+/pl de sangue obtido num paciente durante 3 ciclos de quimioterapia, após um tratamento de mobilização só com G-CSF (ciclo 1), GH + G-CSF (ciclo 2) e só G-CSF (ciclo 3).

Exemplos

Abreviaturas e notas: BFU-E : unidade de formação burst eritróide CFU-C : unidade de formação de colónia, cultura CFU-GM: unidade de formação da colónia, granulócitos e macrófagos. - CFU-Meg : unidade de formação de colónia, megacariócitos - G-CSF: Factor estimulante de colónia de granulócitos IGF-I : Factor de crescimento de insulina I LTC-IC : célula iniciadora de cultura a longo prazo - HCH: Hormona do Crescimento Humana - RhG-CSF : Factor estimulante da colónia de granulócitos humanos recombinante - RhGH : hormona do crescimento humana recombinante 57

Exemplo 1 Actividade de mobilização de hGH estudada num modelo pré clinico de murino.

Ratinhos BALB/c receberam 10 μΐ por injecções intraperitoneais de rhGH todos os dias ao longo de 10 dias. A actividade total de CFU-C ou BFU-E a circular no sangue periférico no dia 5 e no dia 10, respectivamente é determinada de acordo com as técnicas de cultura in vitro padrão e comparada com: (i) niveis pré tratamento constantes, (ii) contagens de CFU-C e BFU-E absolutas ao dia 3 e dia 5, respectivamente a seguir ao tratamento com rhG-CSF administrados por via intraperitoneal a 10 μΐ todos os dias durante 5 dias consecutivos.

Exemplo 2 Critérios de selecção paras os estudos clínicos de mobilização e recuperação A) Critérios de inclusão: - Consentimento informado por escrito - Idade 18 anos e 60 anos cancro de elevado risco de histologia confirmada (linfoma) a ser submetido a elevadas doses de quimioterapia, de acordo com a directivas actuais INT. B) Critérios de exclusão: - Pacientes com pré tratamentos intensos com quimioterapia, ciclos de quimioterapia e/ou radioterapia. - Insuficiência renal (creatinina > 1,5 N) ou hepática e/ou SGPT > 2,5 N; bilirrubina > 1,5 N) ou doenças graves do SNC ou psiquiátricas.

Doença cardíaca ou do miocárdio clinicamente significativa. Fracção de ejecção do ventrículo esquerdo < 50% em repouso por determinação por ecocardiografia ou < 55% por medição isotópica.

Hepatite B ou C ou teste HIV positivo. 58

Exemplo 3 Procedimento de referência do estudo para os estudos clínicos de mobilização e recuperação São estudados vários parâmetros durante os estudos clínicos de mobilização e de recuperação: - História médica completa, exame físico, exame cardíaco, fracção da ejecção ventricular esquerda (FEVE) por multigated scintigraphic scan ou ecografia, raio X torácico

Teste de gravidez (se aplicável)

- teste HBV, HCV e HIV - Contagem total do sangue com diferencial - Contagens absolutas de células CD34+ circulantes e CFU - química do sangue (transaminases, fosfatase no soro, gama GT, LDH, bilirrubina total, BUN, creatinina, glicemia, Na, K, Ca, P, ácido úrico, proteína total, albumina, colesterol, triglicéridos - biopsia da medula óssea bilateral - consentimento informado

Exemplo 4 Parâmetros principais de toxicidade para os estudos clínicos de mobilização e recuperação

Crescimento do tumor (apenas para o estudo de mobilização) - Sintomas clínicos e instrumentais

Ensaios laboratoriais para a função cardíaca, hepática e renal

Exemplo 5 Estudo clínico de mobilização A) Objectivos do estudo clínico de mobilização - Avaliar a actividade de rhGH em: (i) aumentar células CD34+ circulantes e

(ii) expandir o compartimento hematopoiético da medula óssea para permitir uma maior mobilização e subsequente administração de rhG-CSF 59

Para avaliar a segurança e tolerabilidade de rhGH, administrado com rhG-CSF a pacientes com cancro na sequência de quimioterapia (estudo de recuperação hematológica). B) Plano de tratamento Estudo de mobilização com rhGH: - rhGH é administrado desde o dia 1 até ao dia 10 por via intravenosa. A dosagem de rhGH tem inicio a cerca de 1 micrograma por quilograma do peso do paciente, por dia e a dose será escalada até se atingir o efeito desejado (mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, aumento no dados mencionado do número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo). xx pg/kg QD, iv)

Estudo de mobilização com rbGH e rbG-CSF: - Administração de rhGH: rhGH é administrado desde o dia 1 até ao dia 5 por via intravenosa. A dosagem de rhGH tem inicio a cerca de 1 micrograma por quilograma do peso do paciente, por dia e a dose será escalada até se atingir o efeito desejado (mobilização ou periferização das células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, aumento no dados mencionado do número de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, redução do número de leucafereses necessárias para recolher uma quantidade suficientes de células circulantes para transplante, redução do volume de sangue necessário para processamento de forma a obter o número alvo especificado 60 de células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo). - Administração de rhG-CSF (10 pg/kg QD, iv) desde a conclusão da recolha de células CD34 (dose de célula alvo é 8 x 10e6 células CD34+/kg de peso corporal). C) Parâmetros principais da actividade A começar no dia +6 foram avaliados os seguintes parâmetros: - Contagens de células CD34+ absolutas/μΐ (diariamente na periferia e uma vez nas células recolhidas em leucaferese)

Contagens de CFU-GM absolutas/μΐ (diariamente na periferia e uma vez nas células recolhidas em leucaferese) D) Procedimento do estudo - Avaliação diária de células CD34+/pl e CFU-GM no sangue periférico, desde o dia +5 até à leucaferese. - Rendimento total de células CD34+, CFU-GM, BFU-E, CFU IC em células de leucaferese. - Avaliação da toxicidade clinicamente e em examines (ECG, raio X torácico e outros exames conforme as necessidades). - Medição e avaliação de todos os parâmetros do tumor na conclusão do estudo de mobilização

Exemplo 6 Estudo clínico de recuperação A) Objectivos do estudo clinico de recuperação

Para avaliar a capacidade do rhGH, administrado isoladamente ou em combinação para acelerar a recuperação de GB, GV e plaquetas no sangue periférico de pacientes com cancro tratados com elevadas doses de quimioterapia e auto enxerto de células indiferenciadas do sangue periférico.

Para avaliar a segurança e tolerabilidade de rhGH, administrado com rhG-CSF a pacientes com cancro na sequência de quimioterapia. B) Plano de tratamento 61 - Administração de elevadas doses de quimioterapia, seguida de perfusão no dia 0 de uma quantidade óptima (isto é 8xl0e6 de células CD34+/kg de células criopreservadas, recolhidas no estudo de mobilização. - Co-administração (iv) de rgGH e rhG-CSF pg/kg QD, iv) desde o dia 1 até atingir estabilidade (isto é durante três dias consecutivos) recuperação dos granulócitos acima de 1000 μΐ e contagens de plaquetas acima de 50.000 μΐ. C) Parâmetros principais da actividade A começar no dia +0 e até uma recuperação completa e estável serão avaliados os seguintes parâmetros: - Contagens absolutas de granulócitos/μΐ (diário) -Contagens de plaquetas absolutas/μΐ (diário) - Contagens de eritrócitos absolutos/μΐ (diário)

Granulócitos nadir Plaquetas nadir - Extensão e duração da neutropenia - Extensão e duração da trombocitopenia

Extensão e duração das transfusões de apoio hematopoiéticas, transfusões GV)

Duração das profilaxias infecciosas e hemorragias infecciosas D) Procedimento do estudo - Avaliação diária da contagem de GB, GV e plaquetas

Número de transfusões de plaquetas Número de transfusões de GV

Tipo e gravidade da febre e infecção documentada Avaliação clinica e instrumental de toxicidades hematologias

Exemplo 7 Resultados dos estudos de mobilização clinica I - Estudos de mobilização no espaço de 2 ciclos de quimioterapia 62 A) Plano de tratamento

Três pacientes com recaída da doença de Hodgkin receberam os seguintes dois ciclos de tratamento: • Ciclo 1 (ciclo de controlo):

Ifosfamida (agente de quimioterapia) : 3 g/m2 iv (intravenoso) (uma vez ao dia), dia 1 a 4/ - Vinorelbina (agente de quimioterapia) : 25 mg/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 e 5; - G-CSF: 5 pg/kg sc (subcutâneo) (uma vez ao dia) desde o dia 7 até à leucaferese ou até à recuperação de um número suficientes de células CD34+ (cerca de 3 a 8-106 células/kg). • ciclo 2 : - Ifosfamida: 3 g/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 a 4; - Vinorelbina: 25 mg/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 a 5/ - G-CSF: 5 pg/kg sc (uma vez ao dia) desde o dia 7 até à recuperação de um número suficientes de células CD34 + (cerca de 3 a 8-106 células/kg) ou até à leucaferese. rhGH (hormona do crescimento humana recombinante): 33 pg/kg sc (três vezes ao dia) desde 0 dia 7 até à recuperação de um número suficientes de células CD34 + (cerca de 3 a 8-106 células/kg) ou até à leucaferese. B) Resultados

Os resultados são descritos no quadro da figura 1 Não foi observada qualquer toxicidade, excepto hiperglicemia a necessitar administração de insulina.

Em comparação com o controlo (ciclo 1) a adição de rhGH no ciclo 2 teve como resultado: 1) Duplicação ou triplicação da mobilização de células CD34+ na corrente sanguínea 2) Recuperação das células CD34+ de leucaferese ou aumento do número de células CD34+ de leucaferese. 63 0 aumento do número de células sujeitas a leucaferese CD34+, induzidas por GH permite a recolha de todos os três pacientes de uma quantidade de células CD34+ adequada para um transplante autólogo (cerca de 3 a 8-106 células/kg). II - Estudos de mobilização no espaço de 3 ciclos de quimioterapia A) Plano de tratamento

Um paciente com recaida da doença de Hodgkin recebeu os seguintes 3 ciclos de tratamento: • · ciclo 1 :

Ifosfamida (agente de quimioterapia) : 3 g/m2 iv (intravenoso) (uma vez ao dia), dia 1 a 4; - Vinorelbina (agente de quimioterapia) : 25 mg/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 e 5; - G-CSF: 5 pg/kg sc (subcutâneo) (uma vez ao dia) desde o dia 7 até à leucaferese ou até à recuperação de um número suficientes de células CD34+ (cerca de 3 a 8-106 células/kg). • · ciclo 2 : - Ifosfamida: 3 g/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 a 4; - Vinorelbina: 25 mg/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 a 5; - G-CSF: 5 pg/kg sc (uma vez ao dia) desde o dia 7 até à recuperação de um número suficientes de células CD34 + (cerca de 3 a 8 — 106 células/kg) ou até à leucaferese. rhGH (hormona do crescimento humana recombinante): 33 pg/kg sc (três vezes ao dia) desde o dia 7 até à recuperação de um número suficientes de células CD34 + (cerca de 3 a 8-106 células/kg) ou até à leucaferese. • ciclo 3 :

Ifosfamida (agente de quimioterapia) : 3 g/m2 iv (intravenoso) (uma vez ao dia), dia 1 a 4; 64 - Vinorelbina (agente de quimioterapia) : 25 mg/m2 iv (uma vez ao dia), dia 1 e 5; - G-CSF: 5 pg/kg sc (subcutâneo) (uma vez ao dia) desde o dia 7 até à leucaferese ou até à recuperação de um número suficientes de células CD34+ (cerca de 3 a 8-106 células/kg). B) Resultados

Os resultados do tratamento clinico descritos na secção A, acima são ilustrados no gráfico da figura 2. 0 gráfico da figura 2 mostra o intervalo de tempo da mobilização de células CD34+, ao longo de três ciclos de quimioterapia, a começar a cada 21 dias. Cada ponto apresentado no gráfico da figura 2 corresponde à medição do número de células CD34+/pl de sangue encontrado numa amostra de sangue de 1 mililitro. Os resultados mostram que o ciclo 2 (adição de rgGH) é claramente superior aos ciclos 1 e 3. Assim, a mobilização de CD34+ no sangue é intensificada pela adição de rgGH. A intensificação da mobilização de células CD34+ no sangue pela GH é elevada, em especial uma vez que o paciente estudado recebe várias sequências de quimioterapia mielotóxica, e uma vez que cada sequência subsequente impede a extensão da mobilização. 0 declínio dos números de células CD34+ circulantes depois de quimioterapia mielotóxica consecutiva e ciclos de mobilização pode ser observado por comparação do ciclo 1 e ciclo 3. 0 sangue do paciente é sujeito a leucaferese quando o número de células CD34+/pl de sangue medido está no máximo (dia 13 do ciclo 1/ dia 20 do ciclo 2). 65

As células sujeitas a leucaferese são criopreservadas e serão retransfundidas para o paciente depois da terapia mieloablativa.

Bibliografia

Adelman, J.P., Hayflick, J.S., Vasser, M., e Seeburg, P.H. (1983). In vitro deletional mutagenesis for bacterial production of the 20,000- dalton form of human pituitary growth hormone. DNA 2, 183-193.

Albertsson-Wikland, K., Westphal, O., e Westgren, U. (1986). Daily subcutaneous administration of human growth hormone in growth hormone deficient children. Acta Paediatr.Scand. 75, 89-97.

Alexander, W.S. (1998). Cytokines in hematopoiesis. Int.Rev.Immunol. 16, 651-682.

Anderlini, P. e Korbling, M. (1997). The use of mobilized peripheral blood stem cells from normal donors for allografting. Stem.Cells 15, 9-17.

Becker, G.W., Bowsher, R.R., Mackellar, W.C., Poor, M.L., Tackitt, P.M., e Riggin, R.M. (1987). Chemical, physical, and biological characterization of a dimeric form of biosynthetic human growth hormone. Biotechnol.Appl.Biochem. 9, 478-487.

Becker, G.W., Tackitt, P.M., Bromer, W.W., Lefeber, D.S., e Riggin, R.M. (1988). Isolation and characterization of a sulfoxide and a desamido derivative of biosynthetic human growth hormone. Biotechnol.Appl.Biochem. 10, 326-337. Bewley, T.A. e Li, C.H. (1975) . The chemistry of human pituitary growth hormone. Adv.Enzymol.Relat.Areas.Mol.Biol. 42:73-166, 73-166.

Cunningham, B.C., Mulkerrin, M.G., e Wells, J.A. (1991). Dimerization of human growth hormone by zinc. Science 253, 545-548. 66

DeNoto, F.M., Moore, D.D., e Goodman, H.M. (1981). Human growth hormone DNA sequence and mRNA structure : possible alternative splicing. Nucleic.Acids.Res. 9, 3719-3730. Derfalvi, B., Sallai, P., Nemet, K., Szalai, C., Kenesei, E., Tulassay, T., e Falus, A. (1998). [The in vitro effect of recombinant human growth hormone on lymphocyte and granulocyte function in healthy and uremic children]. Orv.Hetil. 139, 1847-1850.

Fischer, A., Haddad, E., Jabado, N., Casanova, J.L., Blanche, S., Le Deist, F., e Cavazzana-Calvo, M. (1998). Stem cell transplantation for immunodeficiency. Springer Semin. Immunopathol. 19, 479-492.

Geffner, M. (1997). Effects of growth hormone and insulin-like growth factor I on T- and B- lymphocytes and immune function. Acta Paediatr.Suppl. 423: 76-9, 76-79.

Gertler, A., Shamay, A., Cohen, N., Ashkenazi, A., Friesen, H.G., Levanon, A., Gorecki, M., Aviv, H., Hadary, D., e Vogel, T. (1986). Inhibition of lactogenic activities of ovine prolactin and human growth hormone (hGH) by a novel form of a modified recombinant hGH. Endocrinology 118, 720-726.

Gianni, A.M., Bregni, M., Siena, S., Villa, S., Sciorelli, G.A., Ravagnani, F., Pellegris, G., e Bonadonna, G. (1989). Rapid and complete hemopoietic reconstitution following combined transplantation of autologous blood and bone marrow cells. A changing role for high dose chemo-radiotherapy ? Hematol.Oncol. 7, 139-148.

Goeddel, D.V., Heyneker, H.L., Hozumi, T., Arentzen, R., Itakura, K., Yansura, D.G., Ross, M.J., Miozzari, G., Crea, R., e Seeburg, P.H. (1979). Direct expression in

Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone. Nature 281, 544-548.

Heather J. et al. Blood 74 ; 1563-1570 (1989). 67

Hendricks, C.M., Eastman, R.C., Takeda, S., Asakawa, K., e Gorden, P. (1985). Plasma clearance of intravenously administered pituitary human growth hormone: gel filtration studies of heterogeneous components. J.Clin.Endocrinol.Metab. 60, 864-867.

Henry, D. (1997). Haematological toxicities associated with dose-intensive chemotherapy, the role for and use of recombinant growth factors. Ann.Oncol. 8 Suppl 3:S7-10, S7- 10 .

Jorgensen, J.O., Flyvbjerg, A., Dinesen, J., Lund, H., Alberti, K.G., Orskov, H., e Christiansen, J.S. (1987). Serum profiles and short-term metabolic effect of pituitary and authentic biosynthetic human growth hormone in man. A double-blind cross-over study. Acta Endocrinol.(Copenh.) 116, 381-386.

Jorgensen, K.D., Monrad, J.D., Brondum, L., e Dinesen, B. (1988). Pharmacokinetics of biosynthetic and pituitary human growth hormones in rats. Pharmacol.Toxicol. 63, 129-134 .

Kimata, H. e Yoshida, A. (1994). Effect of growth hormone and insulin-like growth factor-I on immunoglobulin production by and growth of human B cells. J.Clin.Endocrinol.Metab. 78, 635-641.

Larsson, K., Bjorkstrand, B., e Ljungman, P. (1998). Faster engraftment but no reduction in infectious complications after peripheral blood stem cell transplantation compared to autologous bone marrow transplantation. Support.Care Câncer 6, 378-383.

Lewis, U.J., Peterson, S.M., Bonewald, L.F., Seavey, B.K., e VanderLaan, W.P. (1977) . An interchain disulfide dimer of human growth hormone. J.Biol.Chem. 252, 3697-3702. 68

Lewis, U.J., Singh, R.N., Bonewald, L.F., Lewis, L.J., e VanderLaan, W.P. (1979). Human growth hormone: additional members of the complex. Endocrinology 104, 1256-1265.

Lewis, U.J., Singh, R.N., Bonewald, L.F., e Seavey, B.K. (1981). Altered proteolytic cleavage of human growth hormone as a result of deamidation. J.Biol.Chem. 256, 11645-11650 .

Lewis, U.J., Singh, R.N., VanderLaan, W.P., e Tutwiler, G.F. (1977). Enhancement of the hyperglycemic activity of human growth hormone by enzymic modification. Endocrinology 101, 1587-1603.

Merchav, S., Tatarsky, I., e Hochberg, Z. (1988). Enhancement of erythropoiesis in vitro by human growth hormone is mediated by insulin-like growth factor I. Br.J.Haematol. 70, 267-271.

Moore, J.A., Rudman, C.G., MacLachlan, N.J., Fuller, G.B., Burnett, B., e Frane, J.W. (1988). Equivalent potency and pharmacokinetics of recombinant human growth hormones with or without an N-terminal methionine. Endocrinology 122, 2920-2926.

Siena et al. Blood 74/ 1905-1914 (1989)

Siena et al. Blood 77/ 400-409 (1991)

Singh, R.N., Seavey, B.K., Rice, V.P., Lindsey, T.T., e Lewis, U.J. (1974). Modified forms of human growth hormone with increased biological activities. Endocrinology 94, 883-891.

Stolar, M.W., Amburn, K., e Baumann, G. (1984). Plasma "big" and "big-big" growth hormone (GH) in man : an oligomeric series composed of structurally diverse GH monomers. J.Clin.Endocrinol.Metab. 59, 212-218.

Stolar, M.W. e Baumann, G. (1986) . Big growth hormone forms in human plasma: immunochemical evidence for their pituitary origin. Metabolism 35, 75-77. 69

Thorlacius-Ussing, 0. (1987). Zinc in the anterior pituitary of rat: a histochemical and analytical work. Neuroendocrinology. 45, 233-242.

Tian, Z.G., Woody, M.A., Sun, R., Welniak, L.A., Raziuddin, A., Funakoshi, S., Tsarfaty, G., Longo, D.L., e Murphy, W.J. (1998). Recombinant human growth hormone promotes hematopoietic reconstitution after syngeneic bone marrow transplantation in mice. Stem.Cells 16, 193-199.

To LB, Shepperd KM, Haylock DN et al. Single high doses of cyclophosphamide enable the collection of high numbers of hemopoietic stem cells from the peripheral blood. Exp Hematol (1990) ; 18, 442-447.

Valerio, G., Di Maio, S., Salerno, M., Argenziano, A., Badolato, R., e Tenore, A. (1997). Assessment of red blood cell índices in growth-hormone-treated children. Horm.Res. 47, 62-66.

Van Hoef, M.E. (1998). Haematological recovery after high-dose consolidation chemotherapy with peripheral blood progenitor cell rescue: the effects of the mobilization regimen and post-transplant growth factors. Neth.J.Med. 52, 30-39.

Vihervuori, E., Virtanen, M., Koistinen, H., Koistinen, R., Seppala, M., and Siimes, M.A. (1996). Hemoglobin levei is linked to growth hormone-dependent proteins in short children. Blood 87, 2075-2081.

Waters, T.M., Bennett, C.L., Pajeau, T.S., Sobocinski, K.A., Klein, J.P., Rowlings, P.A., e Horowitz, M.M. (1998). Economic analyses of bone marrow and blood stem cell transplantation for leukemias and lymphoma : what do we know ? Bone Marrow Transplant. 21, 641-650.

Weaver, A. e Testa, N.G. (1998). Stem cell factor leads to reduced blood Processing during apheresis or the use of 70 whole blood aliquots to support dose-intensive chemotherapy. Bone Marrow Transplant. 22, 33-38.

Lisboa, 27 de Dezembro de 2006

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para preparar um medicamento que aumente, num paciente, o número de células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, sendo as células mencionadas destinadas a serem utilizadas para tratar, por retransfusão, transplante ou enxerto no mesmo paciente para a reconstituição do sistema hematopoiético e imunitário na sequência de terapias mieloablativas ou antiblásticas.

2. Utilização da hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados para aumentar, num dador saudável, o número de células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo, disponiveis e destinadas a leucaferese e retransfusão, transplante ou enxerto num receptor necessitado dessas células.

3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento mencionado se destina a ser administrado em separado ou simultaneamente com G-CSF.

4. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que a hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados se destina a ser administrada em separado ou simultaneamente com G-CSF.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, para aumentar ao longo de um periodo de até 20 dias o número de células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo no paciente. 2

6. Utilização de acordo com a reivindicação 2, para aumentar ao longo de um periodo de até 20 dias o número de células circulantes CD34+ capazes de regenerar a hematopoiese in vivo num dador saudável.

7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, em que o medicamento inclui um ou vários outros composto(s) escolhidos de entre os seguintes grupos de compostos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais.

8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 e 6, em que a hormona do crescimento humana ou um dos seus derivados é destinada a ser administrada em separado ou simultaneamente com um ou vários outros composto(s) escolhidos de entre os seguintes grupos de compostos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais.

9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5, em que o medicamento é destinado a ser administrado em separado ou simultaneamente, incluindo um ou vários outros composto(s) escolhidos de entre os seguintes grupos de compostos: factores de crescimento hematopoiéticos, citoquinas, quimioquinas, anticorpos monoclonais.

10. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, em que o grupo das citoquinas inclui IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, factor de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1), G-CSF, GM-CSF ou SCF, o grupo das 3 quimioquinas inclui ΜΙΡ-Ια ou trombopoietina (TPO), o grupo de anticorpos monoclonais inclui anticorpos anti-VLA-4.

11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o outro composto ou medicamento inclui GCSF.

12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, em que a administração do medicamento mencionado é diária ou três vezes por dia.

13. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 4 e 6, em que a administração da hormona do crescimento humana mencionada ou um dos seus derivados é diária ou três vezes por dia.

14. Utilização de acordo com qualquer a reivindicação 3 ou 4, em que a administração da hormona do crescimento deve ser feita três vezes ao dia e a administração de G-CSF é feita diariamente.

15. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5, em que a administração do medicamento mencionado é feita por um período de 3 dias e/ou até à leucaferese.

16. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 e 5 em que a administração do medicamento mencionado começa cerca de 7 dias depois do início do tratamento por quimioterapia ou cerca de 2 dias depois do fim do tratamento por quimioterapia. 4

17. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a hormona do crescimento é hormona do crescimento recombinante.

18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, em que a hormona do crescimento é hormona do crescimento humana.

19. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6 em que as células circulantes capazes de regenerar a hematopoiese in vivo são células CD34+/CD33+ e/ou células CD34+/CD38- e/ou células CD34+/Thy-I e/ou célulasCD34+/Thy-I/CD38-.

20. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o G-CSF deve ser administrado numa quantidade entre 3 e 15 pg/kg de peso corporal, numa quantidade entre 4 a 12 pg/kg de peso corporal ou numa quantidade cerca de 5 ou 10 pg/kg de peso corporal. Lisboa, 27 de Dezembro de 2006