PT1076662E - Proteínas transportadoras de poli-epítopos - Google Patents

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DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE POLI-EPÍTOPOS" A presente invenção refere-se a proteínas transportadoras poli-epítopo. Quando conjugadas a polissacáridos capsulares, estas proteínas transportadoras são úteis como componentes de vacinas capazes de desencadear uma resposta imune dependente das células T. Em particular, as proteínas da presente invenção podem ser utilizadas para conferir protecção contra a infecção por bactérias encapsuladas em crianças com idades compreendidas entre os 3 meses e cerca de 2 anos.

As bactérias encapsuladas, tais como Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis e Streptococcus pneumoniae constituem uma causa significativa de morbilidade e mortalidade em recém-nascidos e bebés em todo o mundo (Tunkel & Scheld, 1993). Nos países em desenvolvimento, cerca de um milhão de crianças morrem todos os anos só de pneumonia. Além disso, mesmo nos países desenvolvidos, o crescimento do fenómeno de resistência aos antibióticos significa que existe uma maior necessidade de melhorar as vacinas existentes. A cápsula polissacarídica de H. ínfluenzae, N. meningitidis e S. pneumoniae representa um dos principais factores de virulência, importante na colonização nasofaríngea e invasão sistémica de bactérias encapsuladas (Moxon & Kroll, 1 1990). Consequentemente, muita da pesquisa dedicada a descobrir imunogénios protectores tem-se focalizado nos polissacáridos capsulares. A descoberta de que estes polissacáridos têm capacidade de desencadear a formação de anticorpos protectores conduziu ao desenvolvimento de um conjunto de vacinas que têm sido eficazes a proteger os adultos da doença (Andreoni et al. 1993; Goldblatt et al. 1992) . O problema das vacinas polissacaridicas capsulares desenvolvidas até à data é o facto de sofrerem de uma incapacidade inerente de proteger da doença crianças com menos de dois anos de idade (Holmes & Granoff 1992) . Esta é uma desvantagem significativa quando se considera que esta população de crianças se encontra em maior risco de infecção. Acredita-se que a incapacidade de bloquear a infecção deriva do tipo de imunorreacção independente das células T (TI, T-independente) , que é a única resposta de anticorpos utilizada pelo corpo contra os antigénios polissacaridicos. Este tipo de resposta não envolve moléculas de restrição MHC Classe II na apresentação às células T: consequentemente, a intervenção das células T é impedida. Apesar de a resposta TI funcionar bem nos adultos, está inactiva nas crianças muito jovens devido a uma combinação de factores, tais como a imaturidade funcional das células B, inactivação da sinalização mediada pelos receptores das células B e anergia celular B em resposta à estimulação antigénica.

Para ultrapassar esta dificuldade, estão actualmente a ser investigadas duas abordagens particulares às vacinas. A primeira centra-se no desenvolvimento de vacinas anti-idiotipo que contêm péptidos que imitam os idiotipos hidratos de carbono (McNamara 1984; Agadjanyan, 1997). A segunda abordagem envolve vacinas conjugadas que são concebidas para transformar 2 antigénios polissacarídicos T-independentes (TI) em antigénios T-dependentes (TD) por ligação covalente do polissacárido a um polipéptido transportador.

As vacinas conjugadas contra H influenzae tipo B (Hib) representam um exemplo pioneiro par ao desenvolvimento de outras vacinas contra infecções por bactérias encapsuladas. De facto, a meningite e outras infecções causadas por Hib diminuíram drasticamente em países onde se conseguiu uma vacinação generalizada com o conjugado Hib (Robins, 1996). A eliminação total do agente patogénico poderá ser possível, mas tal depende de diversos factores, incluindo o melhoramento das vacinas existentes (Liptak, 1997).

Os toxóides do tétano e da difteria, que são antigénios de vacinas pediátricas muito disseminadas, foram seleccionados como proteínas transportadoras com o objectivo de tirar vantagem de uma população já imunizada no momento da injecção da vacina conjugada. A vacinação prévia com vacinas pediátricas contra difteria-tétano (DT) ou difteria-tétano-pertussis (DTP) significa que a imunização com o transportador pode agora ser explorada de modo a aumentar a resposta imune aos conjugados polissacarídicos.

Um conjunto de vacinas deste tipo foram produzidas com sucesso e têm sido eficazes na redução do número de mortes provocadas por estes agentes patogénicos. Os transportadores utilizados nestas vacinas são antigénios de grandes dimensões, como o toxóide do tétano, o mutante não-tóxico da toxina da difteria CRM197 e o complexo de proteína da membrana externa (OMPC) do grupo B de N. meningitidis. Contudo, no futuro, pensa-se que, à medida que aumenta o número de vacinas conjugadas que contêm as mesmas proteínas transportadoras, a 3 supressão de respostas imunes devido a anticorpos pré-existentes poderá tornar-se um problema.

Muita pesquisa está agora a ser orientada para o desenvolvimento de moléculas transportadoras melhoradas, que contenham péptidos transportadores que contenham epítopos de células T-CD4 adjuvantes (Th), mas que não possuam as funções supressoras das células T (Ts) (Etlinger el al. 1990). Os péptidos que retenham apenas funções adjuvantes (epítopos CD4+) são as mais adequadas como transportadores, uma vez que o seu efeito é suficiente para induzir a ajuda das células T mas o transportador é suficientemente pequeno para limitar ou evitar completamente a produção de anticorpos anti-transportador.

Diversas publicações demonstram a capacidade que os péptidos deste tipo têm para conferir ajuda das células T a haptenos quando ligadas por ligações covalentes aos mesmos (Etlinger, 1990; Valmori 1992; Sadd 1992; Kumar 1992; Kaliyaperumal, 1995; De Velasco, 1995 e Bixler 1989) . Contudo, até à data, estas publicações não resultaram no desenvolvimento de vacinas eficazes. Permanece, por isso, uma grande necessidade de desenvolver estratégias de vacinação novas e melhoradas, que sejam eficazes no combate a doenças causadas por bactérias encapsuladas em bebés e crianças j ovens.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, disponibiliza-se uma proteína transportadora que compreende 10 a 20 epítopos das células T-CD4+. De preferência, a proteína transportadora é conjugada com um polissacárido. Estes compostos são úteis como 4 compostos imunogénicos que podem, por seu lado, ser úteis como componentes de vacinas protectoras contra doenças causadas por bactérias patogénicas.

Uma proteína transportadora é uma entidade polipeptídica antigénica que induz a formação de anticorpos dirigidos contra um antigénio que se encontra conjugado à dita proteína, pelo sistema imunitário de um organismo no qual o conjugado transportador-antigénio é introduzido. A necessidade de utilizar proteínas transportadoras resulta do facto de, apesar de muitos epítopos curtos conferirem protecção, a sua imunogenicidade ser fraca. Isto anula a utilidade destes epítopos na geração de vacinas novas e eficazes. Ao conjugar uma proteína transportadora imunogénica a uma molécula não-imunogénica, é possível conferir a elevada imunogenicidade da proteína transportadora à moléculas conjugada. As moléculas conjugadas deste tipo estimulam a geração de uma resposta imune contra a porção não-imunogénica das moléculas conjugadas, pelo que têm sido eficazmente utilizadas em vacinas que protegem contra agentes patogénicos contra os quais não seria possível gerar imunidade protectora de outro modo.

Por isso, proteínas altamente imunogénicas (como o toxóide do tétano) têm sido historicamente utilizadas como transportadores para induzir uma resposta celular Th que ajuda as células B na produção de anticorpos dirigidos contra epítopos não-imunogénicos. Contudo, a eficácia global ainda não foi conseguida através desta abordagem, uma vez que as resposta dos anticorpos a um hapteno (o epítopo) acoplado a uma proteína transportadora pode ser inibido caso o hospedeiro que recebe a vacina tenha sido previamente imunizado com a proteína transportadora não modificada. Este fenómeno é 5 denominado supressão específica ao epítopo e já foi estudada numa série de sistemas hapteno-transportador. 0 acoplamento de polissacáridos bacterianos a proteínas transportadoras demonstrou melhorar a imunogenicidade do polissacárido e resulta em antigénios com características inovadoras. Além disso, o acoplamento de um polissacárido timo-independente (TI) a uma proteína torna o polissacárido timo-dependente (TD).

Um epítopo de célula T-CD4+ é um epítopo péptido que estimula a actividade das células T que são MHC Classe II restritas. Este subconjunto de células T inclui células Th. Muitos epítopos CD4 + são bem conhecidos pelos técnicos especializados na área e demonstrou-se que estes conferem ajuda das células T aos haptenos quando estão ligados covalentemente aos mesmos (Etlinger et al, 1990; Valmori 1992; Sadd 1992; Kumar 1992; Kaliyaperumal, 1995).

Os epítopos T-CD4+ usados nas proteínas transportadoras da presente invenção compreendem idealmente péptidos que são o mais curtos possível. O epítopo reterá assim as suas características a um grau suficientemente elevado para induzir a ajuda das células T, sendo contudo suficientemente pequeno de modo a minimizar a produção excessiva de anticorpos anti-transportador. Isto é preferível, uma vez que se pensa que a supressão de respostas imunes por anticorpos pré-existentes aos epítopos transportadores poderá tornar-se um problema nu futuro, à medida que o número de vacinas congregadas contendo proteínas transportadoras comuns continuar a crescer. Além disso, o uso de péptidos curtos como epítopos transportadores permite a selecção racional de epítopos Th adequados, ao mesmo tempo que evita trechos de sequências que contenham epítopos 6 supressores das células B ou T que sejam prejudiciais para a função da proteína ao desencadear uma resposta imune TI.

Proteínas adequadas, a partir das quais podem ser seleccionados epítopos CD4 + , incluem a toxina do tétano (TT), a proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum, o antigénio de superfície da hepatite B, a proteína do nucleocapsídeo (core) da hepatite B. Proteína matricial de H. influenzae. Hemaglutinina de H. influenzae, toxóide da difteria, mutante do toxóide da difteria CRM197, complexo de proteína da membrana externa (OMPC) do grupo B de N. meningitidis, a toxina pneumocócica pneumolisina e proteínas de choque térmico de Mycobacterium bovis e M leprae. O epítopo 408-427 da HSP70 de M. leprae não se encontra na sequência homóloga humana correspondente (Adams et al., 1997 Infect Immun, 65: 1061-70); uma vez que uma possível limitação no uso de motivos HSP em formulações de vacina é a possibilidade de induzir respostas autoimunes devido à elevada homologia entre os Hasps microbianos e humanos, este epítopo é particularmente preferido. Outros epítopos péptidos transportadores adequados serão bem conhecidos daqueles com conhecimento na área. Os epítopos das células T-CD4+ seleccionados a partir destes antigénios são reconhecidos pelas células T-CD4+ humanas.

Descobriu-se que o número de epítopos de célula T presentes na proteína transportadora tem uma influência significativa a conferir ajuda das células T às moléculas oligossacarídicas que lhes estão conjugadas. A proteína transportadora poli-epítopo deve conter 10 a 20 epítopos de célula T-CD4+. De preferência, a proteína transportadora poli-epítopo contém 10, 11 ou 19 epítopos de célula T-CD4+ degenerados. 7 0 uso de uma série de epitopos universais na proteína transportadora demonstrou reduzir o problema de restrição genética da resposta imune gerada contra antigénios péptidos.

Adicionalmente aos epitopos CD4+, as proteínas transportadoras da presente invenção podem compreender outros péptidos ou fragmentos de proteínas, tais como os epitopos de citocinas imunomoduladoras, tal como a interleucina-2 (IL-2) ou o factor de estimulação de colónias de macrófagos granulócitos (GM-CSF). Os péptidos promíscuos (Panina-Bordignon et al 1989), os péptidos denominados "universais" (Kumar et al., 1992), péptidos cluster (Ahlers et al., 1993) ou péptidos que contêm simultaneamente epitopos de células T e de células B (Lett et al, 1994) também podem ser usados para recrutar diversos sistemas efectores do sistema imunitário, conforme necessário. A proteína transportadora poli-epítopo pode ser produzida por quaisquer meios adequados, como será aparente para alguém com conhecimento na área. Dois métodos preferidos para a construção de proteínas transportadoras de acordo com a invenção são a síntese directa e a produção de proteína recombinante. De preferência, as proteínas transportadoras poli-epítopo da presente invenção são produzidas por meios recombinantes, através da expressão de uma molécula de ácidos nucleicos codificadora. A expressão recombinante tem a vantagem de a produção da proteína transportadora ser barata, segura, fácil e não envolver o uso de compostos tóxicos que necessitem de ser removidos posteriormente.

Quando são expressadas na forma recombinante, as proteínas transportadoras da presente invenção são geradas por expressão de um ácido nucleico codificador numa célula hospedeira. Pode utilizar-se qualquer célula hospedeira, dependendo dos requisitos individuais de um sistema de vacinação especifico. De preferência, utilizam-se hospedeiros bacterianos para a produção de proteínas recombinantes, devido à facilidade com que as bactérias podem ser manipuladas e cultivadas. A bactéria hospedeira preferida é Escherichia coli.

De preferência, no caso de serem produzidas por técnicas recombinantes, as proteínas transportadoras são expressas a partir de plasmídeos que contêm uma inserção de ácidos nucleicos sintética. Inserções deste tipo podem ser concebidas por emparelhamento de duplexes de oligonucleótidos que codificam epítopos de células T-CD4+. As extremidades 5' e 3' das moléculas de ligação sintéticas podem ser desenhadas de modo a emparelharem entre si. Esta técnica permite o emparelhamento dos oligonucleótidos por uma ordem aleatória, resultando numa mistura de mini-genes potencialmente diferentes que compreendem qualquer uma de um conjunto de combinações de epítopos possíveis. Esta mistura é então clonada para qualquer vector de expressão adequado e o processo de selecção para expressar clones é então realizado. Esta estratégia garante que só são seleccionados os clones que produzem uma proteína transportadora que não seja prejudicial para a saúde da célula na qual vai ser expressada. Em contrapartida, a selecção arbitrária da ordem dos epítopos demonstrou ser menos bem sucedida.

As extremidades dos linkers codificadores dos epítopos podem ser desenhadas de modo a introduzir dois codões entre os epítopos individuais durante o emparelhamento. Os resíduos aminoácidos como a glicina ou a lisina são exemplos de resíduos adequados para serem usados como espaçadores. Em particular, o uso de resíduos lisina em espaçadores permite a conjugação subsequente da proteína transportadora ao 9 polissacárido capsular. Adicionalmente, o sítio de inserção no plasmídeo de expressão no qual o ácido nucleico que codifica a proteína transportadora é clonado pode permitir a ligação do transportador poli-epítopo a um tag, tal como o péptido "sinalizador" ou poli-histidina. Isto facilita a purificação subsequente da proteína recombinante. 0 ácido nucleico que codifica a proteína transportadora poli-epítopo pode ser clonada com controlo de um promotor induzível, permitindo assim a regulação precisa da expressão da proteína transportadora. Sistemas indutíveis adequados serão bem conhecidos daqueles com conhecimento na área e incluem o sistema bem conhecido lac (Sambrook et al. 1989) .

Os métodos de expressão recombinante das proteínas transportadoras de acordo com a invenção serão bem conhecidos daqueles com conhecimentos na área, mas serão brevemente discutidos aqui em prol da clareza.

Os sistemas de expressão com células de mamífero são conhecidos na área. Um promotor mamífero é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase de mamífero e iniciar a transcrição a jusante (downstream) (3') de uma sequência codificadora (por ex. gene estrutural) em mRNA. Um promotor terá uma região iniciadora de transcrição, que se localiza geralmente próxima da extremidade 5' da sequência codificadora, e um motivo TATA (TATA box), geralmente localizado 25-30 pares de bases (bp) a montante (upstream) do ponto de iniciação da transcrição. Pensa-se que a TATA box comanda a RNA polimerase II a iniciar a síntese de RNA no ponto correcto. Um promotor de mamífero também conterá um elemento promotor a montante, geralmente localizado entre 100 a 200 pares de bases (bp) a montante da TATA box. Um elemento promotor a montante determina a velocidade a que a transcrição 10 é iniciada e pode actuar em qualquer uma das orientações [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in

Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed.].

Os genes virais de mamífero são frequentemente altamente expressados e apresentam uma gama de hospedeiros alargada; por isso, as sequências que codificam genes virais de mamífero apresentam-se como sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem o promotor precoce SV40, o promotor LTR do vírus do tumor mamário murino (MMTV), o promotor principal tardio do adenovírus (Ad MLP) e o promotor do vírus de herpes simplex. Além disso, as sequências derivadas de genes não virais, tal como o gene da metalotioneína de murino, também mostram ser sequências promotoras úteis. A expressão pode ser constitutiva ou regulada (induzível). Dependendo do promotor, pode ser induzida com glucocorticóides em células que respondem a hormonas. A presença de um elemento estimulador (enhancer), combinada com os elementos promotores acima descritos, aumentará geralmente os níveis de expressão. Um estimulador é uma sequência de DNA reguladora que pode estimular a transcrição até 1000 vezes quando ligado a promotores homólogos ou heterólogos, com a síntese a começar no ponto iniciador do RNA normal. Os estimuladores também apresentam actividade quando estão localizados a montante (upstream) ou a jusante (downstream) no ponto de iniciação da transcrição, com uma orientação normal ou invertida, ou a uma distância superior a 1000 nucleótidos do promotor [Maniatis et al. (1987) Science 236:1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2a ed.]. Os elementos estimuladores derivados de vírus podem ser particularmente úteis, pois têm geralmente uma gama de hospedeiros mais alargada. Exemplos 11 incluem o estimulador do gene precoce SV40 [Dijkema et al (1985) EMBO J. 4:761] e o intensificador/promotores derivados da sequência de repetição terminal longa (LTR) do virus de sarcoma de Rous [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sei. 79:6777] e do citomegalovirus humano [Boshart et al. (1985) Cell 41:521]. Adicionalmente, alguns estimuladores podem ser regulados e ficam activos apenas na presença de um indutor, como uma hormona ou um ião metálico [Sassone-Corsi & Borelli (1986) Trends Genet. 2:215; Maniatis et al. (1987) Science 236:1237].

Um molécula de DNA pode ser expressa intracelularmente em células de mamífero. Uma sequência promotora pode ser ligada directamente à molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na parte N-terminal da proteína recombinante será sempre metionina, que é codificada pelo codâo de iniciação ATG. Se desejado, a porção N-terminal pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Em alternativa, as proteínas exógenas podem ser segregadas da célula para o meio de crescimento através da criação de moléculas de DNA quiméricas que codifiquem uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência líder que assegura a secreção da proteína exógena em células de mamíferos. De preferência, existem locais de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene exógeno que pode ser clivado in vivo ou in vitro. 0 fragmento da sequência líder codifica geralmente um péptido sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a secreção da proteína da célula. 0 líder tripartido do adenovírus é um exemplo de uma sequência líder que assegura a secreção de uma proteína exógena em células de mamíferos. 12

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição e de poliadenilação reconhecidas por células de mamíferos são regiões reguladoras localizadas na posição 3' em relação ao codão stop da tradução e, por isso, flanqueiam a sequência codificadora em conjunto com os elementos promotores. A extremidade 3' do mRNA maduro é formada por clivagem pós-transcrição especifica ao sitio e poliadenilação [Birnstiel et al. (1985) Cell 41:349; Proudfoot & Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames e D.M. Glover): Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sei. 14:105]. Estas sequências orientam a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo DNA. Exemplos de sinais de terminação da transcrição/poliadenilação incluem os derivados do SV40 [Sambrook et al (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].

Alguns genes podem ser expressados com mais eficiência quando estão presentes intrões (também denominados sequências intervenientes). Alguns cDNAs, contudo, foram expressados de forma eficiente a partir de vectores que não apresentam sinais de splicing (também denominados sítios doadores e aceitadores de splicing) [ver e.g., Gothing e Sambrook (1981) Nature 293:620]. Os intrões são sequências não codificadoras intervenientes no interior de uma sequência codificadora que contém sítios doadores e aceitadores de splice. São removidos por um processo chamado "splicing", seguido da poliadenilação da transcrição primária [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52:441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20:671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55:1119; Krainer e Maniatis (1988) "RNA splicing." In Transcription and splicing (ed. B.D. Hames e D.M. Glover)]. 13

Geralmente, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, um sinal de poliadenilação e uma sequência terminadora da transcrição são agrupados na construção de expressão. Se desejado, também se pode incluir estimuladores, intrões com sítios dadores e aceitadores de splicing funcional e sequências líder numa construção de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como as células de mamífero ou bactérias. Os sistemas de replicação dos mamíferos incluem os derivados de vírus animais, que precisam de factores que actuam em trans para a replicação. Por exemplo, os plasmídeos que contêm os sistemas de replicação dos papovavírus, como o SV40 [Gluzman (1981) Cell 23:175] ou o poliomavírus, replicam-se com um elevado número de cópias na presença do antigénio T virai apropriado. Exemplos adicionais de replicões mamíferos incluem os derivados de papilomavírus bovino e de vírus de Epstein-Barr. Adicionalmente, o replicão pode ter dois sistemas de replicação, o que permite manter-se, por exemplo, nas células de mamíferos para expressão e num anfitrião procariótico para clonagem e amplificação. Exemplos de vectores vaivém mamífero-bactéria incluem o pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9:946] e pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074] . O processo de transformação utilizado depende do hospedeiro a ser transformado. Os métodos de introdução de polinucleótidos heterólogos em células de mamíferos são conhecidos da arte e incluem a transfecção mediada por dextrano, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, electroporação, 14 encapsulação dos polinucleótidos em liposomas e microinjecção directa de DNA nos núcleos.

As linhas de células disponíveis como anfitriões são conhecidas da arte e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC), incluindo, sem se limitar a, células de ovários de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebé (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular (por ex. Hep G2) e uma série de outras linhas celulares. 0 polinucleótido que codifica a proteína também pode ser inserido num vector de expressão de insecto adequado e ser funcionalmente ligado aos elementos de controlo nesse vector. A construção do vector utiliza técnicas que são conhecidas da arte. De um modo geral, os componentes do sistema de expressão incluem um vector de transferência, geralmente um plasmídeo bacteriano, que contém um fragmento do genoma do baculovírus e também um sítio de restrição conveniente para inserção do gene ou genes heterólogos a expressar; um baculovírus do tipo selvagem com uma sequência homóloga à do fragmento específico do baculovírus no vector de transferência (isto permite a recombinação homóloga do gene heterólogo no genoma do baculovírus); e células hospedeiras de insecto apropriadas e meio de crescimento.

Depois de inserir a sequência de DNA que codifica a proteína no vector de transferência, o vector e o genoma virai de tipo selvagem são transfectados para uma célula hospedeira de insecto, onde o vector e o genoma virai são recombinados. 0 vírus recombinante empacotado é expresso e as placas recombinantes são identificadas e purificadas. Os materiais e métodos para os sistemas de expressão de baculovírus/células 15 de insecto estão disponíveis comercialmente sob a forma de kit, inter alia, Invitrogen, San Diego CA (kit "MaxBac"). Estas técnicas são geralmente conhecidas para os especialistas da arte e estão extensamente descritas em Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987) (a partir de agora referido como "Summers and Smith").

Antes de introduzir a sequência de DNA que codifica a proteína no genoma do baculovírus, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, um líder (se desejado), a sequência codificadora em questão e a sequência de terminação da transcrição, são geralmente reunidos numa construção intermédia de translocação (vector de transferência) . Esta construção pode conter um único gene e elementos reguladores funcionalmente ligados; múltiplos genes, cada um com o respectivo conjunto de elementos reguladores funcionalmente ligados; ou múltiplos genes regulados pelo mesmo conjunto de elementos reguladores. As construções intermédias de translocação são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como uma bactéria. 0 replicão terá um sistema de replicação, o que lhe permite manter-se num hospedeiro adequado para clonagem e amplificação.

Actualmente, o vector de transferência mais comum utilizado para introduzir genes estranhos no AcNPV é o pAc373. Foram concebidos muitos outros vectores conhecidos dos peritos na arte. Estes incluem, por exemplo, o pVL985 (que altera o codão inicial da polihedrina de ATG para ATT e que introduz um sítio de clonagem BamHI 32 pares de bases a jusante do ATT) ver Luckow and Summers, Virology (1989) 17:31. 16

Geralmente, o plasmídeo também contém o sinal de poliadenilação da poliedrina (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42:177) e um gene procariótico de resistência à ampicilina (amp) e origem de replicação para selecção e propagação em E. coli.

Os vectores de transferência de Baculovirus contêm geralmente um promotor de baculovirus. Um promotor de baculovirus é qualquer sequência de DNA capaz de ligar uma RNA polimerase de baculovirus e iniciar a transcrição a jusante (5' a 3') de uma sequência codificadora (por ex. um gene estrutural) em mRNA. Um promotor conterá uma região iniciadora da transcrição que se encontra geralmente numa posição próxima da extremidade 5' da sequência codificadora. Esta região iniciadora da transcrição inclui geralmente um sitio de ligação da RNA polimerase e um sitio de iniciação da transcrição. Um vector de transferência de baculovirus também pode conter um segundo dominio chamado estimulador (enhancer), que, quando está presente, se encontra geralmente numa posição distai em relação ao gene estrutural. A expressão pode ser regulada ou constitutiva.

Os genes estruturais, abundantemente transcritos tardiamente num ciclo de infecção virai, fornecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem sequências derivadas do gene que codifica a proteína do poliedro virai. Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression." in: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler); EPO Publ. N.°s 127 839 e 155 476; e o gene que codifica a proteína plO, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69:765. O DNA que codifica sequências sinalizadoras adequadas pode ser derivado de genes de proteínas segregadas de insecto 17 ou baculovírus, tal como o gene da poliedrina do baculovírus (Carbonell et al. (1988) Gene, 73:409). Em alternativa, como os sinais das modificações pós-tradução das células de mamíferos (como a clivagem do péptido sinalizador, clivagem proteolítica e fosforilação) parecem ser reconhecidos pelas células de insectos, e os sinais necessários para a secreção e acumulação nuclear também parecem ser conservados entre as células de invertebrados e de vertebrados, os líderes de origens que não sejam insectos, tal como os derivados de genes codificadores do interferão α humano, Maeda et al., (1985),

Nature 315:592; péptido libertador de gastrina humano, Lebacq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8:3129; IL-2 humano, Smith et al., (1985) Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 82:8404; IL-3 de ratinho, (Miyajima et al., (1987) Gene 58:273; e glucocerebrosidase humana, Martin et al. (1988) DNA, 7:99, também podem ser usados para conseguir secreção em insectos.

Um polipéptido ou poliproteína recombinante pode ser expressado intracelularmente ou, se for expressado com as sequências reguladoras adequadas, pode ser segregado. Uma boa expressão intracelular de proteínas exógenas não fundidas requer geralmente genes heterólogos que têm idealmente uma sequência líder curta contendo os sinais iniciadores da tradução adequados precedendo um sinal inicial ATG. Se desejado, a metionina na porção N-terminal pode ser clivada da proteína madura por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Como alternativa, as poliproteínas ou proteínas recombinantes que não sejam segregadas naturalmente podem ser segregadas da célula de insecto através da criação de moléculas de DNA quimérico que codificam uma proteína de fusão composta de um fragmento com uma sequência líder que assegura 18 a secreção da proteína exógena em insectos. 0 fragmento da sequência líder codifica geralmente um péptido sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a translocação da proteína para dentro do retículo endoplasmático.

Depois da inserção da sequência de DNA e/ou do gene que codifica o produto de expressão precursor da proteína, uma célula de insecto anfitriã é co-transformada com o DNA heterólogo do vector de transferência e o DNA genómico do baculovírus de tipo selvagem - geralmente por co-transfecção. A sequência promotora e de terminação da transcrição da construção conterá, geralmente, uma secção com 2-5kb do genoma do baculovírus. Os métodos de introdução de DNA heterólogo no sítio desejado no baculovírus são conhecidos da arte. (Ver Summers and Smith supra; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3:2156; e Luckow and Summers (1989)). Por exemplo, a inserção pode dar-se num gene como o gene da poliedrina, por recombinação homóloga de duplo crossover; a inserção também pode dar-se num sítio da enzima de restrição modificado para fazer parte do gene de baculovírus desejado. Miller et al., (1989), Bioessays 4:91. Quando é clonada em vez do gene da poliedrina no vector de expressão, a sequência de DNA é flanqueada de ambos os lados, 5' e 3', por sequências específicas da poliedrina e fica localizada a jusante do promotor da poliedrina. 0 vector de expressão de baculovírus recém-formado é depois empacotado num baculovírus recombinante infeccioso. A recombinação homóloga ocorre a frequências baixas (entre cerca de 1% e cerca de 5%); assim, a maioria do vírus produzido após a co-transfecção continua a ser um vírus do tipo selvagem. Por isso, é necessário um método para identificar os vírus recombinantes. Uma vantagem do sistema de expressão é um 19 rastreio visual que permite distinguir os virus recombinantes. A proteina da poliedrina, que é produzida pelos virus nativos, é produzida a niveis muito elevados nos núcleos das células infectadas nas fases tardias após infecção virai. A proteina da poliedrina acumulada forma corpos oclusivos que também contêm partículas incrustadas. Estes corpos oclusivos, com dimensões que podem atingir os 15 ym, são altamente refractários, o que lhes dá um aspecto brilhante e luminoso que é fácil de visualizar à luz do microscópio. As células infectadas com virus recombinantes não têm estes corpos oclusivos. Para distinguir virus recombinantes de virus do tipo selvagem, o sobrenadante da transfecção é cultivado para obtenção de placas sobre uma monocamada de células de insecto através de técnicas conhecidas dos peritos na arte.

Nomeadamente, as placas são analisadas à luz do microscópio para detecção da presença (indicativa de virus do tipo selvagem) ou ausência (indicativa do vírus recombinante) de corpos oclusivos. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. eds) em 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and

Smith, supra; Miller et al. (1989).

Os vectores de expressão de baculovírus recombinante foram desenvolvidos para infectar diversos tipos de células de insecto. Por exemplo, foram desenvolvidos baculovírus para, entre outros: Aedes aegypti, Autographa californica. Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni (PCT Pub. No. WO 89/04 6699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56:153: Wright (1986) Nature 321:718: Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3:2156; e consultar na generalidade, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25:225).

As células e meios de cultura de células estão disponíveis comercialmente quer para expressão directa quer 20 para expressão por fusão de polipéptidos heterólogos num sistema de expressão/baculovírus; a tecnologia de cultura celular é conhecida para a generalidade dos especialistas na arte. Ver, por ex. Summers and Smith supra.

As células de insecto modificadas podem ser cultivadas num meio nutriente apropriado, que permita uma manutenção estável dos plasmideos presentes no insecto hospedeiro modificado. Quando o gene do produto de expressão é de controlo induzivel, o hospedeiro pode ser cultivado a elevada densidade e a expressão induzida. Em alternativa, quando a expressão é constitutiva, o produto será expresso continuamente no meio e o meio nutriente terá de ser circulado continuamente, para remover o produto desejado e acrescentar os nutrientes consumidos. 0 produto pode ser purificado por técnicas como a cromatografia, por ex. HPLC, cromatografia de afinidade, cromatografia de permuta iónica, etc.; electroforese; centrifugação de gradiente de densidade; extracção por solventes, ou similares. 0 produto pode ser ainda mais purificado, conforme apropriado e necessário, de modo a remover substancialmente qualquer proteína de insecto que também seja segregada para o meio ou que resulte da lise das células de insecto, de modo a obter-se um produto que está pelo menos substancialmente isento de resíduos do hospedeiro, e.g. proteínas, lípidos e polissacáridos. A fim de se obter a expressão da proteína, as células hospedeiras recombinantes derivadas dos transformantes são incubadas sob condições que permitam a expressão da sequência codificadora da proteína recombinante. Estas condições variam, dependendo da célula hospedeira seleccionada. Contudo, as condições são facilmente verificáveis para alguém com conhecimentos gerais na arte, com base nos conhecimentos actuais na arte. 21

As técnicas de expressão bacteriana são conhecidas na área. Um promotor bacteriano é qualquer sequência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição a jusante (downstream) (3") de uma sequência codificadora (por ex. gene estrutural) em mRNA. Um promotor conterá uma região iniciadora da transcrição que se encontra geralmente numa posição próxima da extremidade 5' da sequência codificadora. Esta região iniciadora da transcrição inclui geralmente um sitio de ligação da RNA polimerase e um sitio de iniciação da transcrição. Um promotor bacteriano também pode ter um segundo domínio chamado operador, no qual pode haver sobreposição com um sítio de ligação da RNA polimerase adjacente no qual a síntese do RNA começa. 0 operador permite a transcrição (induzível) regulada negativa, uma vez que uma proteína repressora do gene pode ligar-se ao operador e, assim, inibir a transcrição de um gene específico. A expressão constitutiva pode ocorrer na ausência de elementos reguladores negativos, como o operador. Adicionalmente, a regulação positiva pode ser conseguida por uma sequência que liga uma proteína activadora do gene, que, quando está presente, se encontra geralmente em posição proximal (5') relativamente à sequência que liga a RNA polimerase. Um exemplo de uma proteína activadora de um gene é a proteína activadora do catabolito (CAP), que ajuda a iniciar a transcrição do operão lac em Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18:173]. A expressão regulada pode, por isso, ser positiva ou negativa, aumentando ou diminuindo a transcrição.

As sequências que codificam as enzimas de vias metabólicas mostram ser sequências promotoras particularmente úteis. Os exemplos incluem sequências promotoras derivadas de enzimas da metabolização do açúcar, como a galactose, lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198:1056] e maltose. Outros 22 exemplos incluem as sequências promotoras derivadas das enzimas biossintéticas, como o triptofano (trp) [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8:4057; Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9:731; Patente dos EUA No. 4,738,921; Publicações EPO Nos. 036 776 e 121 775] . Os sistemas promotores g-laotamase (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (ed. I. Gresser)], bacteriófago lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128] e T5 [Patente dos EUA No. 4,689,406] também oferecem sequências promotoras úteis.

Adicionalmente, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores bacterianos. Por exemplo, pode-se juntar as sequências activadoras da transcrição de um promotor bacteriano ou bacteriófago às sequências do operão de outro promotor bacteriano ou bacteriófago, criando um promotor híbrido sintético [patente dos EUA 4,551,433]. Por exemplo, o promotor tac é um promotor híbrido trp-lac composto pelas sequências promotora trp e operão lac que é regulado pelo repressor lac [Amann et al. (1983) Gene 25:167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. 80:21]. Além disso, um promotor bacteriano pode incluir promotores que ocorrem na natureza de origem não bacteriana, que têm a capacidade de ligar a RNA polimerase bacteriana e iniciar a transcrição. Também é possível acoplar um promotor de origem não bacteriana que ocorre naturalmente com uma RNA polimerase para produzir níveis elevados de expressão de alguns genes em procariotas. O sistema bacteriófago T7 RNA polimerase/promotor é um exemplo de um sistema promotor acoplado [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1074]. Adicionalmente, um promotor híbrido também pode ser composto por um promotor 23 bacteriófago e uma região operador de E. coli (Publicação EPO No. 267 851) .

Em adição a uma sequência promotora funcional, um sitio de ligação do ribossoma eficiente também é útil na expressão de genes estranhos em procariotas. Na E. coli, o sitio de ligação do ribossoma é denominado sequência de Shine-Dalgarno (SD) e inclui um codão iniciador (ATG) e uma sequência com 3-9 nucleótidos de comprimento localizada 3-11 nucleótidos a montante do codão iniciador [Shine et al. (1975) Nature 254:34]. Pensa-se que a sequência SD promove a ligação do mRNA ao ribossoma através do emparelhamento de bases entre a sequência SD e a extremidade 3' do 16S rRNA da E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger)]. Para expressar genes eucarióticos e genes procarióticos com sítios de ligação ao ribossoma fracos [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual] .

Uma molécula de DNA pode ser expressada intracelularmente. Uma sequência promotora pode ser ligada directamente à molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na parte N-terminal será sempre uma metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina N-terminal pode ser clivada da proteína por incubação in vitro com brometo de cianogénio ou por incubação in vivo ou in vitro com uma peptidase da metionina N-terminal bacteriana (Publicação EPO 219 237) .

As proteínas de fusão oferecem uma alternativa à expressão directa. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica a porção N-terminal de uma proteína bacteriana 24 endógena ou de outra proteína estável é fundida com a extremidade 5' das sequências codificadoras heterólogas. Ao ser expressada, esta construção fornecerá uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da célula lambda do bacteriófago pode ser ligada na extremidade 5' de um gene exógeno e expressada na bactéria. A proteína de fusão resultante retém, de preferência, um sítio para uma enzima de processamento (factor Xa) clive a proteína do bacteriófago do gene exógeno [Nagai et al. (1984) Nature 309:810]. As proteínas de fusão também podem ser produzidas a partir de sequências dos genes lacZ [Jia et al. (1987) Gene 60:197], trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5:93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135:11] e Chey [Publ. EPO No. 324 647] . A sequência de DNA na junção das duas sequências de aminoácidos podem ou não codificar um sítio de clivagem. Outro exemplo é uma proteína de fusão de ubiquitina. Uma proteína de fusão deste género é feita com a região da ubiquitina que, de preferência, retém um sítio para uma enzima de processamento (por ex. a protease processadora específica da ubiquitina) clivar a ubiquitina da proteína exógena. Este método permite isolar uma proteína nativa exógena [Miller et al. (1989) Bio/ Technology 7:698].

Em alternativa, as proteínas exógenas podem ser segregadas da célula através da criação de moléculas de DNA quiméricas que codifiquem uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência de um péptido sinalizador que assegura a secreção da proteína exógena em bactérias [patente dos EUA 4,336,336]. O fragmento da sequência sinalizadora codifica geralmente um péptido sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a secreção da proteína da célula. A proteína é segregada para o meio de crescimento (bactérias gram-positivas) ou para o espaço periplasmático, 25 localizado entre a membrana interna e externa da célula (bactérias gram-negativas). De preferência, existem locais de processamento que podem ser clivado in vivo ou in vitro codificados entre o fragmento do péptido sinalizador e o gene exógeno. É possível derivar DNA que codifica sequências sinalizadoras adequadas a partir de genes para proteínas bacterianas segregadas, como é o caso do gene da proteína da membrana externa de E. coli (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3:2437] e a sequência sinalizadora da fosfatase alcalina de E. coli (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7212]. Como exemplo adicional, refere-se que a sequência sinalizadora do gene da alfa-amilase de diversas estirpes de bacilos pode ser utilizada para segregar proteínas heterólogas de B. subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Nail. Acad. Sei. USA 79:5582; Publ. EPO No. 244 042].

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas pelas bactérias são regiões reguladoras localizadas em posição 3' em relação ao codão stop e, por isso, flanqueiam a sequência codificadora em conjunto com o promotor. Estas sequências orientam a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo DNA. As sequências de terminação da transcrição incluem frequentemente sequências de DNA com cerca de 50 nucleótidos capazes de formar estruturas em haste e ansa que ajudam a terminar a transcrição. Os exemplos incluem sequências de terminação da transcrição derivadas de genes com fortes promotores, tal como o gene trp em E. coli bem como outros genes biossintéticos.

Geralmente, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, uma sequência sinalizadora (se desejado), a 26 sequência codificadora de interesse e uma sequência de terminação da transcrição são agrupados em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicão, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmideos) capaz de se manter estável um anfitrião como uma bactéria. 0 replicão terá um sistema de replicação, o que lhe permite manter-se num hospedeiro procariótico para expressão ou para clonagem e amplificação. Adicionalmente, um replicão pode ser um plasmideo com elevado ou reduzido número de cópias. Um plasmideo de alto número de cópias terá geralmente um número de cópias entre cerca de 5 e cerca de 200, e geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro que contém um plasmideo com alto número de cópias conterá de preferência pelo menos cerca de 10, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 plasmideos. Pode-se seleccionar um vector com um alto ou baixo número de cópias, dependendo do efeito do vector e da proteína exógena no hospedeiro.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas no genoma bacteriano com um vector de integração. Os vectores de integração contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga ao cromossoma bacteriano que permite ao vector integrar. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma bacteriano. Por exemplo, os vectores de integração construídos com DNA de diversas estirpes de bacilos integram-se no cromossoma do bacilo (Publ. EPO No. 127 328). Os vectores de integração também podem ser constituídos por sequências de bacteriófago ou transposão.

Geralmente, as construções de expressão extra- cromossómicas e de integração podem conter marcadores seleccionáveis que permitem a selecção das estirpes de 27 bactérias que foram transformadas. Os marcadores seleccionáveis podem ser expressados no hospedeiro bacteriano e podem incluir genes que tornam as bactérias resistentes a medicamentos como a ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamicina (neomicina) e tetraciclina [Davies et al. (1978), Annu. Rev. Microbiol. 32:469]. Os marcadores seleccionáveis também podem incluir genes biossintéticos, tal como os das vias biossintéticas da histidina, triptofano e leucina.

Em alternativa, alguns dos componentes acima descritos podem ser agrupados em vectores de transformação. Os vectores de transformação são geralmente constituídos por um marcador seleccionável que é mantido num replicão ou é desenvolvido até um vector de integração, conforme acima descrito.

Os vectores de expressão e de transformação, sejam eles replicões extra-cromossómicos ou vectores de integração, foram desenvolvidos para a transformação em várias bactérias. Por exemplo, os vectores de expressão foram desenvolvidos para, inter alia, as seguintes bactérias: Bacillus subtilis [Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; Publ. EPO Nos. 036 259 e 063 953; Publ. PCT No. WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292:128; Amann et al. (1985) Gene 40:183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189:113; Publ. EPO Nos. 036 776, 136 829 e 136 907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655], Streptomyces lividans [Patente dos EUA No. 4,745,056].

Os métodos de introdução de DNA exógeno em bactérias anfitriãs são bem conhecidos da arte e incluem geralmente a transformação de bactérias tratadas com CaCl2 ou com outros agentes, como catiões divalentes e DMSO. O DNA também pode ser 28 introduzido em células bacterianas por electroporação. Os processos de transformação variam geralmente com a espécie de bactéria a ser transformada. Ver, por ex. [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Paiva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5582; Publ. EPO Nos. 036 259 e 063 953; Publ. PCT No. WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85:856; Wang et al. (1990) J.

Bacteriol. 172:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sei. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids

Res. 16:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids. In Genetic Engineering: Actas do International

Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer e S. Nicosia) ; Mandei et al. (1970) J. Mol. Biol. 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 170:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus] , [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti e R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32: 1295;

Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412,

Streptococcus] .

Os sistemas de expressão em leveduras também são conhecidos daqueles com conhecimentos gerais na área. Um promotor de levedura é qualquer sequência de DNA capaz de ligar a RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição a jusante (downstream) (3') de uma sequência codificadora (por ex. gene estrutural) em mRNA. Um promotor conterá uma região iniciadora da transcrição que se encontra geralmente numa 29 posição próxima da extremidade 5' da sequência codificadora. Esta região iniciadora da transcrição inclui geralmente um sitio de ligação da RNA polimerase (a "TATA Box") e um sitio de iniciação da transcrição. Um promotor de levedura também pode conter um segundo domínio chamado uma sequência activadora upstream (UAS) , que, quando está presente, se encontra geralmente numa posição distai em relação ao gene estrutural. A UAS permite a expressão regulada (induzível). A expressão constitutiva ocorre na ausência de uma UAS. A expressão regulada pode ser positiva ou negativa, desse modo aumentando ou diminuindo a transcrição.

Uma levedura é um organismo fermentador com uma via metabólica activa, pelo que as sequências codificadoras de enzimas na via metabólica oferecem sequências promotoras particularmente úteis. Exemplos incluem a álcool desidrogenase (ADH) (Publ. EP 284 044), enolase, glucocinase, glucose-6-fosfato isomerase, gliceraldeído-3-fosfate-desidrogenase (GAP ou GAPDH), hexocinase, fosfofructocinase, 3-fosfoglicerato mutase e piruvato cinase (PyK) (Publ. EPO 329 203). O gene PH05 de levedura, que codifica a fosfatase ácida, também oferece sequências promotoras úteis [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:1].

Adicionalmente, os promotores sintéticos que não ocorrem na natureza também funcionam como promotores de leveduras. Por exemplo, é possível juntar as sequências UAS de um promotor de levedura com a região activadora da transcrição de outro promotor de levedura, criando um promotor sintético híbrido. Exemplos de promotores híbridos deste género incluem a sequência reguladora ADH ligada à região de activação da transcrição GAP (patentes dos EUA n.°s 4,876,197 e 4,880,734). Outros exemplos de promotores híbridos incluem os promotores que consistem das sequências reguladoras dos genes ADH2, GAL4, 30 GAL10 ou PH05 combinadas com a região de activação transcricional de um gene da enzima glicolitica como a GAP ou PyK (Publ. EPO 164 556). Além disso, um promotor de levedura pode incluir promotores que ocorrem na natureza de origem não levedura, que têm a capacidade de ligar a RNA polimerase de levedura e iniciar a transcrição. Exemplos de promotores deste tipo incluem, inter alia, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283:835; Hollenberg et al. (1981) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96:119; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medicai, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis e A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11:163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2:109;].

Uma molécula de DNA pode ser expressada intracelularmente na levedura. Uma sequência promotora pode ser ligada directamente à molécula de DNA, em cujo caso o primeiro aminoácido na parte N-terminal da proteina recombinante será sempre metionina, que é codificada pelo codão de iniciação ATG. Se desejado, a metionina na porção N-terminal pode ser clivada da proteina por incubação in vitro com brometo de cianogénio.

Proteínas de fusão oferecem uma alternativa aos sistemas de expressão em leveduras, bem como a sistemas de expressão em mamíferos, baculovírus e bactérias. Geralmente, uma sequência de DNA que codifica a porção N-terminal de uma proteína endógena de levedura ou de outra proteína estável é fundida com a extremidade 5' das sequências codificadoras heterólogas. Ao ser expressada, esta construção fornecerá uma fusão das duas sequências de aminoácidos. Por exemplo, o gene da superóxido dismutase (SOD) de levedura ou humana pode ser 31 ligado na extremidade 5' de um gene exógeno e expressado na levedura. A sequência de DNA na junção das duas sequências de aminoácidos podem ou não codificar um sitio de clivagem. Ver, por ex., a Publ. EPO 196 056. Outro exemplo é uma proteína de fusão ubiquitina. Uma proteína de fusão deste género é feita com a região da ubiquitina que, de preferência, retém um sítio para uma enzima de processamento (por ex. a protease processadora específica da ubiquitina) clivar a ubiquitina da proteína exógena. Assim, através deste método é possível isolar uma proteína exógena nativa (e.g. WO88/024066) .

Em alternativa, as proteínas exógenas podem ser segregadas da célula para o meio de crescimento através da criação de moléculas de DNA quiméricas que codifiquem uma proteína de fusão constituída por um fragmento de sequência líder que assegura a secreção da proteína exógena em leveduras. De preferência, existem locais de processamento codificados entre o fragmento líder e o gene exógeno que pode ser clivado in vivo ou in vitro. O fragmento da sequência líder codifica geralmente um péptido sinalizador constituído por aminoácidos hidrofóbicos que controlam a secreção da proteína da célula. É possível derivar DNA que codifica sequências sinalizadoras adequadas a partir de genes de proteínas de levedura segregadas, tal como o gene da invertase de levedura (Publ. EPO No. 012 873; Publ. JPO No. 62,096, 086) e o gene do factor A (Patente dos EUA No. 4,588,684). Em alternativa, existem líderes de origem não levedura, como um líder interferão, que também asseguram a secreção nas leveduras (Publ. EPO 060 057) .

Uma classe preferida de líderes de secreção são os que utilizam um fragmento do gene do factor alfa da levedura, que 32 contém ambas, uma sequência sinalizadora "pre" e uma região "pro". Os tipos de fragmento de factor alfa que podem ser utilizados incluem o lider do factor alfa pre-pro completo (cerca de 83 residuos aminoácido) bem como lideres truncados do factor alfa (geralmente cerca de 25 a cerca de 50 residuos aminoácido) (patentes dos EUA Nos. 4,546,083 e 4,870,008; Publ. EPO No. 324 274). Outros lideres que utilizam um fragmento lider do factor alfa que assegura a secreção incluem os lideres híbridos do factor alfa construídos com uma sequência pre de uma primeira levedura e uma região pro de um factor alfa de uma segunda levedura. (Ver por ex., Publ. PCT No. WO 89/02463.)

Geralmente, as sequências de terminação da transcrição reconhecidas por leveduras são regiões reguladoras localizadas em posição 3' em relação ao codão stop e, por isso, flanqueiam a sequência codificadora em conjunto com o promotor. Estas sequências orientam a transcrição de um mRNA que pode ser traduzido no polipéptido codificado pelo DNA. Exemplos da sequência de terminação da transcrição e outras sequências de terminação reconhecidas por leveduras, como as que codificam enzimas glicolíticas.

Geralmente, os componentes acima descritos, incluindo um promotor, um líder (se desejado), a sequência codificadora de interesse e uma sequência de terminação da transcrição são agrupados em construções de expressão. As construções de expressão são frequentemente mantidas num replicâo, tal como um elemento extra-cromossómico (por ex. plasmídeos) capaz de se manter estável um anfitrião como uma levedura ou bactéria. O replicâo pode ter dois sistemas de replicação, o que permite manter-se, por exemplo, em leveduras para expressão e num anfitrião procariótico para clonagem e amplificação. Exemplos de vectores vaivém levedura-bactéria incluem o YEp24 [Botstein 33 et al. (1979) Gene 8:17-24], pCI/I [Brake et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei USA 81:4642-4646] e Yapl7 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158:157], Adicionalmente, um replicão pode ser um plasmideo com elevado ou reduzido número de cópias. Um plasmideo com elevado número de cópias terá geralmente um número de cópias que varia entre cerca de 5 e cerca de 200, geralmente entre cerca de 10 e cerca de 150. Um hospedeiro com um plasmideo com elevado número de cópias terá, de preferência, pelo menos cerca de 10, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 20. Pode ser seleccionado um vector com elevado ou reduzido número de cópias, dependendo do efeito do vector e da proteina exógena no hospedeiro. Ver, por ex. Brake et al., supra.

Alternativamente, as construções de expressão podem ser integradas no genoma da levedura com um vector de integração. Os vectores de integração contêm geralmente pelo menos uma sequência homóloga a um cromossoma da levedura que permite ao vector integrar e, de preferência, contêm duas sequências homólogas a flanquear a construção de expressão. As integrações parecem resultar de recombinações entre o DNA homólogo no vector e o cromossoma da levedura [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101:228-245]. Um vector de integração pode ser direccionado para um locus especifico na levedura através de uma selecção da sequência homóloga apropriada para inclusão no vector. Ver Orr-Weaver et al., supra. Uma ou mais construções de expressão podem integrar, possivelmente afectando os níveis de proteína recombinante produzidos [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:6750]. As sequências cromossómicas incluídas no vector podem ocorrer como o único segmento no vector, o que resulta na integração do vector completo, ou como dois segmentos homólogos a segmentos adjacentes no cromossoma e que 34 flanqueiam a construção de expressão no vector, o que pode resultar na integração estável de apenas a construção de expressão.

Geralmente, as construções de expressão extra-cromossómicas e de integração podem conter marcadores seleccionáveis que permitem a selecção das estirpes de leveduras que foram transformadas. Marcadores seleccionáveis podem incluir genes biossintéticos que podem ser expressados no hospedeiro levedura, como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 e ALG7, e o gene de resistência G418, que confere às leveduras resistência à tunicamicina e G418, respectivamente. Adicionalmente, um marcador seleccionável adequado também pode dar à levedura a capacidade de crescer na presença de compostos tóxicos, como metais. Por exemplo, a presença de CUPl permite à levedura crescer na presença de iões de cobre [Butt et ai. (1987) Microbiol, Rev. 51:351].

Em alternativa, alguns dos componentes acima descritos podem ser agrupados em vectores de transformação. Os vectores de transformação são geralmente constituídos por um marcador seleccionável que é mantido num replicão ou é desenvolvido até um vector de integração, conforme acima descrito.

Os vectores de expressão e de transformação, sejam eles replicões extra-cromossómicos ou vectores de integração, foram desenvolvidos para a transformação em várias leveduras. Por exemplo, os vectores de expressão foram desenvolvidos para, inter alia, as seguintes leveduras: Candida albicans [Kurtz, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142], Candida maltosa [Kunze, et al. (1985)J. Basic Microbiol. 25:141]. Hansenula polymorpha [Gleeson, et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302], Kluyveromyces fragilis [Das, et al. (1984) J. Bacteriol. 35 158:1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135], Pichia guillerimondii [Kunze et al. (1985)J. Basic Microbiol. 25:141], Pichia pastoris [Cregg, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Patentes dos EUA Nos. 4,837,148 and 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163], Schízosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706] e Yarrowia lipolytica [Davidow, et al. (1985) Curr. Genet. 10:380471 Gaillardin, et al. (1985) Curr. Genet. 10:49].

Os métodos de introdução de DNA exógeno em anfitriães levedura são bem conhecidos da arte e geralmente incluem a transformação de esferoplastos ou de células de levedura intactas tratadas com catiões alcalinos. Os processos de transformação variam geralmente com a espécie de levedura a ser transformada. Ver, por ex. [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunze et al. (1985)J. Basic Microbiol. 25:141; Candida]; [Gleeson et al. (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8:135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985)J. Basic

Microbiol. 25:141; Patentes dos EUA Nos. 4,837,148 e 4,929, 555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 75:1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153:163 Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Nature 300:706: Schízosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10:39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10:49; Yarrowia]. Métodos para o isolamento e purificação de proteínas recombinantes serão bem conhecidos dos peritos da arte e 36 encontram-se resumidos, por exemplo em Sambrook et al (1989) . Particularmente em bactérias como a E. coli, a proteína recombinante formará corpos de inclusão no interior da célula bacteriana, facilitando por isso a sua preparação. Se for produzida em corpos de inclusão, a proteína transportadora pode ter de ser renaturada para a sua conformação natural. Métodos de renaturação de proteínas para o estado enrolado natural são bem conhecidos da arte.

Espécies nas quais as proteínas transportadoras da presente invenção podem ser imunogénicas e, assim, eficazes no desencadear de uma resposta imune, incluem todos os mamíferos, especialmente os humanos. Na maioria dos casos, será preferível que as proteínas transportadoras da presente invenção apresentem actividade no desencadear de uma resposta imune em seres humanos. A população humana com maior necessidade de protecção de doenças causadas por bactérias encapsuladas é constituída pelas crianças entre aproximadamente os 3 meses e os 2 anos de idade. É durante esse período que as crianças geralmente não recebem protecção do leite materno e ainda não possuem um sistema imunitário suficientemente bem desenvolvido para gerar uma resposta imune contra antigénios polissacarídicos.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, também são providenciadas moléculas de ácidos nucleicos que codificam proteínas transportadoras de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Conforme será aparente ao perito da arte, essas moléculas de ácidos nucleicos serão desenhadas utilizando o código genético de modo a codificar o epítopo desejado.

Adicionalmente, a fim de adaptar de forma precisa as propriedades exactas das proteínas transportadoras codificadas, o técnico especializado apreciará que podem ser 37 feitas alterações ao nível dos nucleótidos de sequências de epítopos conhecidos, por adição, substituição, deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos. A mutagénese sítio-dirigida (SDM) é o método preferido utilizado para gerar proteínas transportadoras mutadas de acordo com a presente invenção. Existem diversas técnicas de SDM conhecidas do técnico especializado, incluindo mutagénese oligonucleótido-dirigida por PCR conforme apresentada, por exemplo, por Sambrook et al., (1989) ou utilizando kits disponíveis comercialmente. A maioria das proteínas transportadoras produzidas por estas técnicas de mutagénese serão menos eficazes que as proteínas de tipo selvagem. Contudo, pode acontecer que numa minoria dos casos essas alterações produzam moléculas com uma função de proteína transportadora melhorada, conforme desejado, tal como maior imunogenicidade em determinado organismo.

As moléculas de ácidos nucleicos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender DNA, RNA ou cDNA e podem compreender adicionalmente análogos de nucleótidos na sequência codificadora. De preferência, as moléculas de ácidos nucleicos compreenderão DNA.

Outro aspecto da presente invenção providencia uma célula hospedeira que contém um ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora. Outro aspecto ainda providencia um método que compreende a introdução de um ácido nucleico codificador numa célula hospedeira ou organismo hospedeiro. A introdução de ácidos nucleicos pode recorrer a qualquer técnica disponível. Em células eucariotas, técnicas adequadas podem incluir a transfecção com fosfato de cálcio, DNA-dextrano, electroporação, transfecção mediada por lipossoma ou 38 transdução utilizando um retrovirus ou outros virus como o virus vaccinia. Em células bacterianas, técnicas adequadas podem incluir a transformação por cloreto de cálcio, electroporação ou transfecção utilizando bacteriófagos. A introdução do ácido nucleico pode ser seguida de provocar ou permitir a expressão do ácido nucleico, por exemplo fazendo uma cultura de células hospedeiras em condições que permitem a expressão do gene.

Numa forma de concretização, o ácido nucleico é integrado no genoma da célula hospedeira. A integração pode ser promovida pela inclusão de sequências que promovem a recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padronizadas (ver Sambrook et al., 1989).

De acordo com outra forma de concretização, disponibiliza-se uma proteína transportadora que compreende 10 a 20 epítopos da célula T-CD4+, conjugada a um polissacárido. Por polissacárido toma-se qualquer polímero linear o ramificado constituído por resíduos monossacarídicos, geralmente ligados por ligações glocosídicas, o que inclui os oligossacáridos. De preferência, o polissacárido conterá entre 2 e 50 unidades monossacarídicas, mais preferivelmente entre 6 e 30 unidades monossacarídicas. O componente polissacarídico pode ser baseado em ou derivado de componentes polissacarídicos da cápsula polissacarídica de muitos agentes patogénicos bacterianos Gram positivos e Gram negativos, tal como H. influenzae, N. meningitidis e S. pneumoníae. Esta cápsula representa um dos principais factores de virulência importante na colonização nasofaríngea e invasão sistémica. Outras bactérias a partir das quais se pode conjugar componentes polissacarídicos a proteínas transportadoras da presente invenção incluem 39

Staphylococcus aureus, Klebsiella, Pseudomonas, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa e Shigella dysenteriae. Componentes polissacarídicos adequados a serem usados de acordo com este aspecto da presente invenção incluem o oligossacárido Hib, o lipopolissacárido de Pseudomonas aeruginosa (Seid e Sadoff, 1981), lipopolissacáridos de Salmonella (Konadu et al., 1996) e o polissacárido 0-específico de Shigella dysenteriae (Chu et al, 1991). Outros componentes polissacarídicos adequados a serem usados de acordo com a presente invenção serão bem conhecidos dos especialistas da arte.

Fragmentos de polissacáridos capsulares bacterianos podem ser produzidos por qualquer método adequado, tal como hidrólise ácida ou irradiação ultrassónica (Szn et al, 1986). Outros métodos de preparação dos componentes polissacarídicos serão conhecidos dos peritos na arte. 0 componente polissacarídico da vacina conjugada deve ser preferivelmente acoplado à proteína transportadora por uma ligação covalente. Um método especialmente preferido de acoplar o polissacárido e a proteína é por aminação redutiva. Outros métodos incluem: activação do polissacárido com brometo de cianogénio seguida de reacção com di-hidrazida de ácido adípico (espaçador) e conjugação com grupos carbóxido da proteína transportadora usando carbodiimidas solúveis (Shneerson et al, 1986); funcionalização da proteína transportadora com di-hidrazida de ácido adípico seguida do acoplamento com polissacáridos activados com brometo de cianogénio (Dick et al, 1989); modificação química de ambos, a proteína transportadora e o polissacárido, seguida do respectivo acoplamento (Marburg et al, 1986; Marburg et al, 1987 e 1989) . Nalguns casos, polissacáridos contendo grupos carbonilo, tais como os polissacáridos meningocócicos do grupo 40

C, podem ser conjugados directamente a proteínas utilizando carbodiimidas solúveis. Os polissacáridos também podem ser activados utilizando agentes alternativos, como CDAP (tetrafluorborato de l-ciano-4-dimetilaminopirridínio), e depois conjugadas directamente à proteína transportadora (Konadu et al, 1996). Os polissacáridos ou oligossacáridos tratados com periodato podem ser conjugados a proteínas por meio de aminação redutiva (Jennings e Lugowsky, 1982; Anderson, 1983; Insel, 1986). Alternativamente, oligossacáridos obtidos por hidrólise ácida podem ser derivatizados quimicamente através da introdução nos grupos da extremidade redutora de um espaçador hidrocarboneto com um grupo terminal éter activo; este oligossacárido activado pode ser conjugado à proteína transportadora seleccionada (Costantino et al, 1992). A molécula polissacarídica pode ser acoplada à proteína transportadora por uma molécula espaçadora, tal como ácido adípico. Essa molécula espaçadora pode ser usada para facilitar o acoplamento da proteína ao polissacárido. Após a reacção de acoplamento ter sido realizada, o conjugado pode ser purificado por diafiltração ou outros métodos conhecidos para remover proteína não reagida ou componentes polissacarídicos.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é providenciado um método para a produção de uma proteína transportadora de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, compreendendo os passos seguintes: (a) construir moléculas de oligonucleótidos que codifiquem epítopos peptídicos; (b) anelar as moléculas de oligonucleótidos de modo a formar duplexes; 41 (c) introduzir os duplexes oligonucleótidos num vector de expressão de modo a codificar uma proteína de fusão; (d) introduzir o vector de expressão numa célula hospedeira bacteriana para permitir a expressão da proteína de fusão; (e) isolar a proteína de fusão produzida de uma cultura da dita bactéria.

Opcionalmente, este método pode compreender adicionalmente a conjugação da proteína transportadora a uma molécula polissacarídica.

De preferência, a célula hospedeira bacteriana utilizada neste método é uma célula hospedeira da bactéria E. coli.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é disponibilizada uma composição compreendendo uma proteína transportadora que contém 10 a 20 epítopos da célula T-CD4+ conjugados a um polissacárido, em conjunção com um excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma composição deste tipo pode ser racionalmente desenhada de modo a providenciar protecção contra doenças causadas por bactérias patogénicas tais como H. influenzae, S. pneumaniae, N. meningitidis, Staphylococcus aureus, Klebsiella, Pseudomonas e S. typhi e, de acordo com isso, pode ser usada como vacina. As vacinas de acordo com a invenção podem ser profilácticas (ou seja, para prevenir a infecção) ou terapêuticas (ou seja, para tratar a doença após infecção) .

Por excipiente farmaceuticamente aceitável entende-se qualquer composto que não induz por si próprio a produção de anticorpos prejudiciais para o indivíduo que recebe a composição. O excipiente deve ser adequado à administração oral, subcutânea, intramuscular, tópica ou intravenosa. Compostos adequados são, tipicamente, macromoléculas grandes 42 que são metabolizadas lentamente, como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, co-polímeros de aminoácidos, agregados lipídicos (como gotículas de óleo ou lipossomas) e partículas de vírus inactivados. Estes tipos de compostos são bem conhecidos na arte. Adicionalmente, estes compostos podem funcionar como agentes imunoestimulantes ("adjuvantes") . Além disso, o antigénio pode ser conjugado a um toxóide bacteriano.

Adjuvantes preferidos para melhorar a eficácia da composição incluem, sem se limitar a: (1) sais de alumínio (alum), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos tais como péptidos de muramil ou componentes da parede celular bacteriana), tais como, por exemplo (a) MF59™ (WO 90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween™ 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente com várias quantidades de MTP-PE, apesar de este não ser necessário) formulado em partículas submicrónicas usando um microfluidificador (b) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero L121 plurónico-bloqueado e thr-MDP quer microfluidificado numa emulsão submicrónica ou passada por vórtex para gerar uma emulsão de tamanho de partículas grande, e (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), contendo 2% de esqualeno, 0,2% de Tween 80 e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo constituído por monofosforil lípido A (MPL) , dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox™); (3) podem ser usados adjuvantes saponina, tal como Stimulon™, ou partículas geradas a partir destes, tais como ISCOM (complexos imunoestimulantes); (4) adjuvantes de Freund completo e incompleto (CFA & IFA); (5) citocinas, tais como interleucinas (eg. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, 43 etc.), interferões (eg. IFNy), factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose de tumor, etc; e (6) outras substâncias que funcionam como agentes imunoestimulantes para melhorar a eficácia da composição. Alúmen e MF59™ são preferidos.

Tal como mencionado acima, os muramilpéptidos incluem, sem se limitarem a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- {1' -2' -dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

As composições imunogénicas (ou seja o antigénio, veiculo farmaceuticamente aceitável e adjuvante) contêm tipicamente diluentes, como água, soro fisiológico, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, podem estar presentes nos veículos substâncias auxiliares, tal como agentes molhantes ou emulsificantes, substâncias tampão do pH e similares.

Tipicamente, as composições imunogénicas são preparadas como injectáveis, quer como soluções quer como suspensões líquidas; também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução e, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injecção. A preparação também pode ser emulsificada ou encapsulada em lipossomas para um efeito adjuvante melhorado, conforme foi discutido acima.

As composições imunogénicas utilizadas como vacinas compreendem uma quantidade imunologicamente eficaz da proteína transportadora, bem como qualquer outro dos componentes acima mencionados, conforme necessário. Por "quantidade imunologicamente eficaz" designa-se que a administração dessa quantidade a um indivíduo, quer como dose individual quer como parte de uma série, é eficaz no tratamento ou prevenção. Esta 44 quantidade varia conforme a saúde e condição física do indivíduo a ser tratado, o grupo taxonómico do indivíduo a ser tratado (por ex. primata não humano, primata, etc.), a capacidade do sistema imunitário do indivíduo para sintetizar anticorpos, o grau de protecção desejado, a formulação da vacina, a avaliação do médico assistente da condição clínica e outros factores relevantes. É expectável que a quantidade caia num intervalo relativamente alargado, que pode ser determinado por ensaios de rotina.

As composições imunogénicas são convencionalmente administradas por via parentérica, ou seja, por injecçâo subcutânea ou intramuscular. Também podem ser administradas sobre as mucosas (por ex. oral ou intranasal) ou sob a forma de formulações pulmonares, supositórios ou aplicações transdérmicas. 0 tratamento pode seguir um esquema de programa de dose individual ou programa de múltiplas doses. A vacina pode ser administrada em conjunto com outros agentes imuno-reguladores.

Como alternativa às vacinas à base de proteínas, pode aplicar-se a vacinação com DNA [e.g. Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283; Donnelly et al. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648]. Em conformidade, em vez de compreenderem um péptido, oligopéptido ou polipéptido, as vacinas da invenção podem compreender um ácido nucleico que codifica esses compostos.

De acordo com outro aspecto da invenção, é providenciado um processo para a formulação de uma composição imunogénica que compreende associar uma proteína transportadora de acordo com o primeiro aspecto da invenção, conjugada a um polissacárido, a um veículo farmaceuticamente aceitável, opcionalmente com um adjuvante. 45

De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é providenciada uma composição de proteína transportadora conjugada a um polissacárido, opcionalmente com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como um adjuvante, para utilização na vacinação de um mamífero. Vários aspectos e concretizações da presente invenção serão de seguida descritos em mais detalhe por via de exemplos, com especial referência às proteínas transportadoras N6 (para fins comparativos) e N10 conjugadas ao polissacárido capsular HIB. Será apreciado que poderão ser introduzidas alterações de detalhe sem se afastar do âmbito da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 é uma representação esquemática da construção da proteína Νβ. A Figura 2 ilustra as construções N6 e N10 e as respectivas sequências de DNA e de aminoácidos. 0 tag histidina, o péptido sinalizador, o sítio de corte Fxa e os epítopos da célula T-CD4+ estão sublinhados. A Figura 3 é uma placa de gel SDS-PAGE revelada por coloração com Coomassie de extractos de proteína total preparados a partir de clones E. coli induzidos a produzir as diferentes proteínas poliepítopo. Pista A: Controlo negativo (células TGl contendo o vector pQE30 sem inserção); pista B: células TGl contendo o plasmídeo pQE30-N10; pista C; células TOPIO contendo o plasmídeo pTrc-NIO; pista D: células TOPIO contendo o plasmídeo pTrc-N6; pista E: Marcadores de baixo peso molecular. A Figura 4 é um immunoblot da placa de gel SDS-PAGE ilustrada na Figura 3. 0 Western blot foi incubado com antisoro de coelho específico para o péptido sinalizador e, em seguida, com um anticorpo anti-coelho igG peroxidado. A imunorreacção foi então revelada com 4-cloro-l-naftol como substrato da peroxidase. A Figura 5 46 é uma placa de gel SDS-PAGE revelada por coloração com Coomassie contendo diferentes amostras obtidas durante o procedimento de purificação da proteína N6. Pista A: material de partida (proteína total das células TOP10 de E. coli induzidas contendo plasmídeo pTrc-N6; pista B: proteínas solúveis (sobrenadante obtido após centrifugação da amostra de proteína total): pista C: proteínas solúveis em ureia 1M (sobrenadante obtido após lavagem das proteínas insolúveis com ureia 1M) ; pista D: corpos de inclusão (pellet obtido após lavagem das proteínas insolúveis com ureia 1M); pista E: proteína N6 obtida a partir da purificação sobre resina NTA Ni2+ usando a técnica de cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC); pista F: marcadores de baixo peso molecular. A Figura 6 é um immunoblot da placa de gel SDS-PAGE ilustrada na Figura 5. 0 Western blot foi incubado com antisoro de coelho específico para o péptido sinalizador e, em seguida, com um anticorpo anti-coelho IgG peroxidado. A imunorreacção foi então revelada com 4-cloro-l-naftol como substrato da peroxidase. A Figura 7 é uma representação esquemática da construção Nll e as respectivas sequências de DNA e proteica. 0 tag hexa-histidina, o péptido sinalizador, o sítio de corte FXa e os epítopos da célula T-CD4+ estão sublinhados. A Figura 8 é uma representação esquemática da construção N19 e as respectivas sequências de DNA e proteica. 0 tag hexa-histidina, o péptido sinalizador, o sítio de corte FXa e os epítopos da célula T-CD4+ estão sublinhados. A Figura 9 é um SDS-Page e coloração por Coomassie das proteínas obtidas do clone ToplO-Trc-Nll de E. coli. Pista A: Extracto total de uma cultura não induzida. Pista B: Extracto total de uma cultura induzida usando IPTG. Pista C: Proteína Nll purificada (solubilização de células inteiras com guanidínio e cromatografia IMAC). Figura 10: A: SDS-Page e coloração pode Coomassie. Análise das fracções obtidas pela cromatografia 47 IMAC realizada para purificar a proteína N19. Pista a: marcadores de peso molecular pré-corados. Pista b: eluído. Pistas c até m: fracções de gradiente mostrando a proteína N19 purificada; as bandas com um peso molecular inferior a N19 e visíveis nas pistas sobrecarregadas f, g & h representam produtos de degradação da proteína N19. B: SDS-Page e coloração pode Coomassie. Análise das fracções obtidas n cromatografia IMAC da proteína N19 conjugada ao polissacárido Hib. Toda a proteína N19 resultou conjugada, a julgar pelo elevado peso molecular do conjugado e pela ausência da proteína N19 não conjugada de 43.000 kDa. C: As mesmas amostras conjugadas utilizadas na imagem B foram sujeitas a Western blot utilizando um anticorpo anti-flag. Aqui também pode ser apreciado que toda a proteína N19 migrou com um peso molecular muito elevado após conjugação ao polissacárido Hib, e que não existe proteína N19 não conjugada a migrar a 43.000 kDa. Figura 11: Resposta proliferativa de dois clones de célula T humana específicos para P30TT (clone GG-22) e P2TT (clone KSIMK-140) após estimulação com os respectivos péptidos sintéticos (controlos) e com proteínas poliepítopo conjugadas ou não conjugadas (cpm: contagens por minuto). Figura 12: Ensaio de proliferação de células mononucleares de sangue periférico (PBMC). PBMC de três dadores saudáveis, RR, EB e MC, imunes ao toxóide do tétano foram estimulados com toxóide do tétano, P2TT, N6, N6-Hib e NlO-Hib. Figura 13: Resultados dos testes de imunogenicidade realizados para comparar o efeito das proteínas transportadoras N10, N19 e CRM-197, e para verificar a presença ou ausência de fenómenos de imunossupressão induzida pelo transportador. Títulos anti-Hib obtidos após imunização de ratinhos CDl inoculados e não inoculados com diferentes conjugados. 48

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma proteína transportadora caracterizada por compreender 10 a 20 epítopos de célula T-CD4+.
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   2. A proteína transportadora, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizada por conter 10, 11 ou 19 epítopos degenerados de célula T-CD4+.
3. 3. Uma proteína transportadora, de acordo com a reivindicação N°.l ou a reivindicação N°.2, caracterizada por os epítopos CD4+ serem derivados de uma bactéria patogénica ou de um vírus.
4. 4; U «. tf >< £- K çh ar V" Uf £-*sn D tfi υ) ω ·< tor 5 õ< α 5« H Ui <í! Ϊ3 5-í ^ 50 t-5 :.5 O H tfi (í n V X H to tf. *-* O X ^ to5 3 £-» «5 «s; m u X f-< to fJ X ÍH tO55 t- ff, u ω i" tfj tf co tf tf O Q U ííi c> a <J x 8 8:;: 8 O tftf to tf )” 88 Η ν’ O feJ8¾ o w Η· ·/; tf ^ H O O a u <. 8 tf U £38 U tfi O \r E-* O S-* a O 05 u < O Oí «c ff! L5 .< Ο Ώ88< to tf > tf *3 0 C48 8 O X O X < ·." υ «4 H 4! tí l“í C5 x33 KS U X33 O fXi U aS3 .-£ .4 « L5 E-t e o « u o; υ w E-* .4 < !-i >h ' *4 O α 04 Í.3 UJ b* v) U§3 8 υ £4 0,5 Η X%$OT% 3 í- ÍK υ w H «0 υ κsseg 13 !> 5^ 41 H .< iS > O z3Ss!y *» 05 U à3 tO88 Γ-t to83^ tf < V· tf X p- Ό b< r*í 42 < & H tf O *4 Cf < tf to s?s X >4 Cj ai a j-o tf n l> ^ x i-.· LP KS84 >*%É «: m 5 3 C oi W ?h Ç'· O O 57 H t4 V 4S IH' W H *4 O U C5 U ti>83 <: 4 D (5 O »8383 O X O cfi O M ^ to83 O 0 aí u & H to. ir^ i4 H tf tf- >1 ® O U iC v> 0j j~5 O > H !4:83 Ο Ό í- W rc ^ C? D 8-1 ·*is u » U £ tf H to < ^ c.) cç H to tf *-í u a ΐ4 O O te U J4.83 £" ¢0 Ç' 4 O 8'-'II «c oi c: S <i 4! < S 88 V :¾83 ;-8 ζ O -J o o o >< 8885tf. £ < 5/ W 5? a ,· , W KS' H l~l ,-4 cj a v-2 < —— < ξ.4 V-. < W O - ^ r:; 55 V> 5? ta ;-‘ >1 < 4. sC i-l < >< Η X 50 4Í O < vD O < a ΰ O U L.4 U 4C ίο to v.; aí u ω i-4 «í w < U tà\ r* >-5 #*‘C ,--·< < ft *2 j4 H ·:? < .w u a. U X < D H .4 53 50 u H ÍC to 33 < a 4-4 o H < r-:.' 3· H X a Ϊ-' ..; >0 Q 5; a 'ς 4 l·* í i tC 5 *A O a c ;,.· a C Ό tf i-' tf .-i r' X V ! ZC. < m O Ui υ •c Μ i4 O X Λ X r -7: sj , .· .t. 0 ,..·; f. < :*' 4, £ * 1 <A X 4 54 a tf >* 6- t- υ £ 83 ÍJ X 83 53 8 1¾ vj c- 8/14 \3 1¾ H M < Ο W gu* P O Pt Η Φ < *—t o <| tf D C iuVí Φ >4 Sí ξ4 4-4 Ο Ο O O < :M ^ Φ (J3 tf ίζ SM U >4 tf bl tf *4 C3 < O O ο g íí í/3 l·* o C4 **ν á Sw iic Λζ Η >4 u tf ο < í V Z3 Ο »4 H ώ tf *4 Ο tf íj *4 Í4 e? d w H >*» $“t ΰύ U Oi fjí 4Ϊ / S ..: w O; <4 tf φ ÍJ t>« O < X O mt f5. O.i J o t? O O ; Í3 D Γ:-’ ÍK :H & ! fW 5jú 0 w < ?* |. U tf m ί ο «' n·: ta 4-4 υ κ < h tf SJ, r*í; :£** í*a «V.J. Ο xik u ÍH Vv jíU rfC ira Ο »4 <i. Pt a < αΓ, M>. ta u Ο ίν 5* 4. tt| H wj υ ο ►í >4 Kt M ***** Ή &!' e> .23 b < 5* m < z < Ρ> \D til u r-l. . 'ί 0 • tf j V ^ tf H U S >4 :-) ta s3 í> o , Ç—1· ££ KC >-! v---t O n: tú υ Jjtí N j-Λ ή*ί b* w H í.0 * : tf Φ f£ 3* o Yjr tf ta u o D ftC £U 0 i? oj ο O f£ S Ο WÍ [ O O íX & sa .-Ά Kv p v4 O E H ac Ce? t- iX ο ω H »*-> ζ / ω s- « ξ-Ί v> <í y υ ÍX pM ÍH ví P O »4 O ia < y> m < t(3 •4 m << * í*4 tfj! >3, >* si! P o *4 α ta < H ui ta i-4 <-£ Q U J ►4 P-* < '3] Í3 ta »-t £C Ό ta pI ta í O1 Sr* Ot O ii' H ω> ta tf <0 O U’í 1 O >4 ta o < £ * vO t υ si H eei < < L- 2Ξ ctr tf C) tf : tf < hj ta ÍD o o P H | ta r> ta O tf «1 ; ^ U3 ; tf ώ Íc3 * s: f u ►WJ V-a' -í p: ptj ta "> i o u í^> υ p! £--4 iii : N O CC. .¾ Kj U P ; O u < < <| < p U j ta b φ{ 4 ρ Í ·>< ! fi" (J ; 0 O : í‘< £J^ u fj O i -1 υ ί ! tf Ííj 1$ *^jí h se! : t-’ X y-í υ ω:| ο ta i Cu o < b< U); 9/14

   4. Uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por os epítopos CD4+ serem derivados da toxina do tétano, da proteína circunsporozoíta de Plasmodium falciparum, do antigénio de superfície da hepatite B, da proteína do nucleocapsídeo (core) da hepatite B, da proteína matricial de influenza, da hemaglutinina de influenza, do toxóide da difteria, do mutante da toxina da difteria CRM 197, do complexo de proteína da membrana externa (OMPC) do grupo B de Neisseria meningitidis, da toxina da tosse convulsa (pertussis) ou da proteína de choque térmico 70.
5. 5. Uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por os epítopos CD4+ serem seleccionados de entre os epítopos CD4+ P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg, MT e hsp70 conforme apresentado no Quadro 1.
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   6. Uma proteína transportadora de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizada por compreender os epítopos CD4+ P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg e MT conforme indicado no Quadro 1. 1
7. 7/14 ο ο ο a ϋ < ί··\ $

   7. Uma proteína transportadora, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizada por compreender os epítopos CD4+ P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT, P2TT, HBVnc, HA, HbsAg, MT e hsp70 conforme indicado no Quadro 1.
8. 8. Uma proteína transportadora, de acordo com a reivindicação N°.l, caracterizada por compreender os epítopos P23TT, P32TT, P21TT, PfT3, P30TT e P2TT, conforme indicado no Quadro 1.
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   9. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizada por os epítopos CD4+ serem epítopos CD4+ humanos.
10. 10 * o φ w w 03 E o o O

    10. Uma proteína transportadora, caracterizada por compreender uma ou mais cópias de: MGGSHHHHHHGMASMDYKDDDDÍEGRKGVSIDKFMFCKAKPKKGLíC FIIKilYTPNNEíDSKGIK.EDNNrrLKLDRCNNKGEKKIAKM.EKASSVTNV V^SKGFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEKGQYIKANSKFIGITBKGGSPHHT AlRQAlLCWGBLMTLAKGSPíCYV'KGNTlKlATKGSFFLLIRlL'nPQSLD KGYSGPLKAEIAQRLEDVKGS ou MGGSHHHHHHGMASAÍDYKDDDDIEGRKGVSIDKFRIFCK,\NPKKGLK FOKJiYTPNNElDSKGIREDMÍTLKXMCNKKGEKKjAKMEKASSVFNV VNSKGFNNFTVSFWLIlVPKVSASHLEKGQYIKANSKFIGrTEKGOSPHHT ALRQaJLCWGELMTLAKGSPKYVKQNUKLATKGSFFLITRÍLTIPQSLD RGYSGPLKAELAQRLEDVKGSVSlDKFRIFCKANPKiíGLKFlIKilYTPNNE IDSKGÍREDF^ITLKlDRCHNKGEKKIAKMEKASSVFFrVWSKGFlNÍNFT VSrYLRVFKVSASHLEKGQYLKANSKFíGITEKGGSPHHTAtRQAILCW GBLMTLAKGSPKYVKQNTLKLATKGSFFLLTRÍLTIPQSLPKGS, 2
11. 11. Uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por estar na sua forma oligomérica.
12. 12/14 a bcdefgh í im kDa "Λ . 10A 477“" 34.6~~> kDa a b c d e 104 — 81-^

    FIG. 10B kDa a b c d e

    12. Uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada por estar conjugada a um polissacárido.

    13. Uma proteína transportadora, de acordo com a reivindicação N°.12, caracterizada por o polissacárido ser um polissacárido de Haemophilus influenzae tipo B.

    14. Uma proteína transportadora, de acordo com a reivindicação N°.12, caracterizada por o polissacárido ser derivado de qualquer um dos seguintes organismos: S. pneumoniae, N. meningitidís, S. aureus, Klebsiella ou S. typhimurium.

    15. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.12-N°.14, caracterizada por o polissacárido ser conjugado à proteína por ligação covalente.

    16. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.12-N°.14, caracterizada por o polissacárido ser conjugado à proteína por aminação redutora.

    17. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.12-N°.16, caracterizada por existirem duas a dez unidades proteicas para cada unidade de polissacárido.

    18. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.l a N°.17, caracterizada por se destinar a ser utilizada como fármaco.

    19. Uso de uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.l a N°.17, caracterizada por ser utilizada como fármaco. 3

    20. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.l a N°.17, caracterizada por se destinar a ser utilizada como vacina ou como componente de uma vacina.

    21. Uso de uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.l a N°.17, caracterizada a ser utilizada como vacina ou componente de vacina.

    22. Uma vacina, caracterizada por compreender uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°. 1 a N°.17.

    23. Uma proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.l a N°.17, caracterizada por se destinar a ser utilizada na vacinação de um mamífero.

    24. A proteína transportadora, de acordo com uma das reivindicações N°.l a N°.17, caracterizada por se destinar a ser utilizada como imunogénio protector no controlo de doenças causadas por bactérias encapsuladas.

    25. Uma molécula de ácido nucleico, caracterizada por codificar uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.10.

    26. A molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação N°.25, caracterizada por compreender DNA.

    27. Um vector de clonagem ou de expressão, caracterizado por compreender uma molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.25-N°.26.

    28. Uma célula hospedeira, caracterizada por ser transformada ou transfectada com o vector, de acordo com a reivindicação N°.27. 4

    29. Um animal transgénico não humano, caracterizado por ter sido transformado por uma molécula de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.25 ou N°.26, ou por um vector, de acordo com a reivindicação N°.27.

    30. Um método para preparar uma proteína transportadora de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l a N°.10, caracterizado por compreender a expressão de um vector, de acordo com a reivindicação N°.27, numa célula hospedeira e a cultivação da referida célula hospedeira em condições em que a referida proteína é expressada, e recuperar a referida proteína assim expressada.

    31. Um método de produção de uma proteína transportadora, de acordo com qualquer uma das reivindicações N°.l-N°.10, caracterizado por compreender os seguintes passos: a) construir moléculas de oligonucleótidos que codifiquem epítopos peptídicos; b) anelar as moléculas de oligonucleótidos de modo a formar duplexes; c) introduzir os duplexes oligonucleótidos num vector de expressão de modo a codificar uma proteína de fusão; d) introduzir o vector de expressão numa célula hospedeira para permitir a expressão da proteína de fusão; e e) isolar a proteína de fusão produzida de uma cultura das ditas células hospedeiras.

    32. O método, de acordo com a reivindicação N°.31, caracteriazado por compreender ainda um passo de conjugação da proteína de fusão a um polissacárido. 5 33. 0 método, de acordo com a reivindicação N°.30, reivindicação N°.31 a célula hospedeira ou reivindicação N°.32, caracterizado por ser uma bactéria E. coli. Lisboa, 2 de Fevereiro de 2011 6 _Γ t w o. 1/14

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13. 13/14 FIG. 11

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    Ο ©ΦΝίΟΙΠ’ίίΏ Μν (rtdo) vniqíwií.híhç] 3α oyôvdVddoONi RESUMO EPÍGRAFE: "PROTEÍNAS TRANSPORTADORAS DE POLI-EPÍTOPOS" A presente invenção refere-se a proteínas transportadoras de poli-epitopos que compreendem, pelo menos, cinco epitopos da célula T-CD4+, para conjugação a polissacáridos capsulares. As proteínas transportadoras são úteis como componentes de vacinas que são capazes de desencadear uma resposta imune dependente das células T. Estas vacinas são particularmente úteis para conferir protecção contra a infecção por bactérias encapsuladas em crianças com idades compreendidas entre os 3 meses e cerca dos 2 anos. ^ Ρ23ΤΤ

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