PT101042B

PT101042B - Sistema de vectores de expressao miogenicos

Info

Publication number: PT101042B
Application number: PT101042A
Authority: PT
Inventors: Robert J Schwartz; Franco J Demayo; Bert W O'malley
Original assignee: Baylor College Medicine
Priority date: 1991-11-06
Filing date: 1992-11-06
Publication date: 1999-11-30
Also published as: US5756264A; AU3124693A; EP0635060A1; PT101042A; EP0635060A4; CA2122617A1; WO1993009236A1; AU660751B2; JPH07500967A; US5298422A

Description

Domínio da Invenção

A presente invenção refere-se, em geral, a vectores de expressão para utilização na expressão de polipéptidos em células miogénicas. Mais particularmente, a invenção refere-se a vectores que contêm o promotor do gene de alfa-actina do esqueleto e a correspondente região 3' transcrita mas não traduzida do gene e do ADN não codificante contíguo que contem a região terminal de transcrição natural do gene.

Técnica Anterior

A actina é uma proteína contraível encontrada na maior parte dos tipos de células. As proteínas de actina são representadas por isoformas semelhantes mas não idênticas que, nos vertebrados de sangue quente, são codificadas por famílias multigenéticas. A actina é expressa duma maneira gradualmente dependente do tempo e do tecido específico, em que os tecidos dos músculos adultos expressam exclusivamente o gene da alfa-actina do esqueleto como isoforma da actina predominante. A sequência do ácido nucleico do gene da alfa-actina do esqueleto foi caracterizada nas galinhas, nas ratazanas, nas cobaias e nos seres humanos. Fornwald et al. , Nucleic Acids Res., Vol. 10, pag. 3861-3876 (1982); French et al., Gene,

Vol. 88, pag. 173-180 (1990); Zak et al., Nature, Vol. 298, pag. 857-859 (1982); Hu et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 6, pag. 15-25 (1986) e Minty e Kedes, Mol. Cell. Biol., Vol. 6, pag. 2125-2136 (1986).

Uma vez caracterizado e sequenciado o gene, pode ser traçado para determinar as suas porções que codificam e não descodificam as proteínas. Iniciam-se transcrições de RNA a partir de um sítio de partida da região do promotor no tampão de RNA mensageiro e continua-se através da região que codifica as proteínas para a região que não codifica envolvida com a terminação da transcrição. 0 processamento de pós-transcrição das transcrições de RAN remove os intrões não codificantes para formar uma sequência de codificação contínua. Além disso, existe um desbaste progressivo da transcrição de RNA em relação aos sinais de poliadenilação, descobertos na porção não traduzida 3' que não codifica do RNA mensageiro processado. Os níveis de biossíntese do RNA mensageiro e de acumulação são determinados por partes da porção não-expressada do gene. Por exemplo, o promotor que faz parte da porção não expressada do gene, está envolvido na determinação da expressão do gene. Ele regula quando e como o gene expresso é transcrito. A acumulação de transcrições de RNA, contudo, pode estar relacionada com a estabilidade intrínseca desse RNA num tipo de células em particular. Esta estabilidade intrínseca está dependente de sequências dentro do mRNA que proporciona a estabilização. Deste modo, a capacidade para expressar um produto de gene em particular constitui um balanço entre a taxa de transcrição e a estabilidade de transcrição do mRNA.

A expressão da família do gene de actina é específica dos tecidos. A proteína de alfa-actina do esqueleto é expressada principalmente nos tecidos do músculo cardíaco e do músculo do esqueleto. As experiências de transfecção transitória indicaram que as regiões dentro da região do promotor 200 bp são suficientes para a expressão restrita de tecidos em mioblastos primários. Bergsma et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 6, pag. 2462-2475 (1986) e Chow e Schwartz, Mol. Cell. Biol., Vol. 10, pag. 528-538 (1990). Além disso, a região do promotor abriga elementos cis-actuantes conservados para iniciarem correctamente transcrições de alfa-actina do esqueleto a partir da acetil-transferase de cloranfenicol (CAT) do gene informador das bactérias em mioblastos de diferenciação. Grichniz et al., Nucleic Acids Res., Vol. 14, pag. 1683-1701 (1986). As cobaias transgénicas com um promotor de alfa-actina do esqueleto integrado revelaram uma expressão preferencial do gene CAT em tecidos miogénicos, Petropulous et al., Mol. Cell. Biol., Vol. 9, pag. 3785-3792 (1989). Sabe-se também que a actividade CAT é detectável logo aos 10 dias no embrião da cobaia, quando se está a formar primeiro o coração embriónico. Além disso, a actividade do CAT pode ser induzida no músculo do esqueleto do recém-nascido. Deste modo, o promotor da actina do esqueleto pode ligar a actividade de transcrição nos sistemas dos mamíferos, para proporcionar a expressão restrita dos músculos. Contudo,

quando as medições são feitas para comparar os níveis de RNA mensageiro do CAT com os do RNA mensageiro da alfa-actina do esqueleto, endógeno (que no músculo adulto foi encontrado em níveis mais de mil vezes superiores aos do embrião), o RNA mensageiro de CAT não pode ser detectado pelas técnicas de manchamento de RNA conhecidas. Estes resultados experimentais mostraram que, mesmo que pequenas quantidades da proteína de CAT se tenham acumulado no músculo do esqueleto, o RNA mensageiro de CAT nunca se acumulou até aos níveis de transcrições de RNA do gene da actina do esqueleto, endógeno.

As tentativas actuais para optimizar os vectores de transcrição dos genes têm sido dirigidas no sentido de aumentar a actividade de transcrição do sistema de vector. Por exemplo, observações no sistema do gene de beta globina humano indicaram que a expressão em cobaias transgénicas nunca foi tão elevada como a expressão do gene da beta globina na cobaia endógena. Grosveld e os seus colaboradores Cell, Vol. 51, pag. 975-985 (1987). Determinou-se que os sítios que circundam o local da globina contêm um número de sítios hipersensívos de ADNse que são denominados região de controlo dominante. Estas regiões parecem actuar como aumentadores específicos dos tecidos. Quando alguns destes sítios foram clonados num gene minilocus proporcionou uma expressão específica de tecido eritróide em animais transgénicos. As sequências reguladoras semelhantes às regiões de controlo dominantes foram descritas para o CD2 humano. Greaves et al., Cell, Vol. 56., pag. 979-986 (1988). É sabido que o promotor

da actina do esqueleto das aves ê tão activo quanto o promotor SV40, que é um padrão para níveis de expressão elevados. Bergsma et al., (1986). Deste modo, o promotor da actina do esqueleto não é a causa dos baixos níveis de acumulação de RNA mensageiro. Deste modo, o promotor de actina é, por si próprio, insuficiente para conduzir a expressão dos outros produtos genéticos para se acumularem, em níveis que são comparáveis ao do mRNA da alfa-actina do esqueleto intacto.

A taxa de interrupção metabólica das moléculas de mRNA é um factor importante na regulação da expressão genética. As taxas de declínio das espécies de mRNA individuais podem afectar fortemente os níveis de estado constantes destas espécies no citoplasma. Consequentemente, a extensão de expressão de um dado gene, conforme medido pela taxa da síntese da proteína correspondente dependerá, em larga medida, do grau de estabilidade do mRNA derivado deste gene. Mostrou-se anteriormente que o RNA mensageiro do músculo do esqueleto estava distribuído em duas populações no que diz respeito à sua estabilidade. Medford et al., J. Biol. Chem., Vol. 258, pag. 11063-11073 (1983). Uma população de mRNA tinha uma média de vida inferior a 4 horas e a outra população tinha uma média de vida de 17 a mais de 54 horas.

A comparação das regiões não traduzidas no mRNA de alfa do esqueleto, de alfa cardíaco e da beta-actina dos vertebrados revelou regiões de sequências homólogas elevadas dentro da porção não traduzida 3' de cada um destes mRNA isofórmicos de actina e que esta homologia é maior entre as isoformas alfa-cardíacas e de actina do esqueleto do que entre o mRNA da isoforma de alfa-actina estriada e beta-actina. Mayer et al., Nucl. Acids Res., Vol. 12, pag. 1087-1100 (1984); Ponte et al., Nucl. Acids Res., Vol. 12, pag. 1687-1696 (1984); Chang et al. , Nucl. Acids Res., Vol. 13, pag. 1223-1237 (1985). Comparativamente, outros genes de vertebrados, tais como os que codificam a insulina e a prolactina, partilham regiões de codificação comuns, mas usualmente contêm regiões não traduzidas 3' divergentes. A preservação das regiões não traduzidas 3' do gene da alfa-actina do esqueleto em espécies de animais que vão desde os pássaros aos seres humanos, sugere que eles possuem papéis biológicos importantes. Na presente invenção, a incorporação da região 3' não traduzida específica miogénica nos vectores de ADN recombinante para a expressão de polipéptidos em tecidos musculares foi considerada como sendo altamente vantajosa, uma vez que aumentou o teor de mRNA de polipéptidos no músculo, aumentando a sua estabilidade.

Resumo da Invenção

Um objecto da presente invenção consiste num sistema de vectores de expressão miogénica capaz de expressar qualquer sequência de ácido nucleico específica em tecido miogénico.

Um objecto adicional da presente invenção consiste num sistema de vectores de expressão miogénica regulável.

Um outro objecto da presente invenção consiste num método para o tratamento da atrofia muscular em seres humanos

idosos.

Um outro método da presente invenção consiste num método para o tratamento da atrofia muscular provocada por lesões da espinal medula ou doenças musculares.

Um objecto da presente invenção consiste num método para impedir ou tratar doenças cardiovasculares arterioscleróticas.

Um método adicional da presente invenção consiste na introdução de um sistema de vectores de expressão miogénica para a substituição de genes.

Um	outro	objecto	da	presente invenção	consiste	num
método	para a	produção	de	uma vacina em seres humanos	ou
animais	•
Um	outro	objecto	da	presente invenção	consiste	num

método para o tratamento de perturbações do crescimento.

Deste modo, na realização dos objectos anteriormente expostos, proporciona-se, de acordo com um dos aspectos da presente invenção, um sistema de vectores de expressão miogénica (MVS) para a expressão de uma sequência de ácido nucleico em tecido miogénico, que compreende um promotor; uma cassete cuja extremidade 5' está ligada à extremidade 3' do promotor, em que a cassete contem uma sequência de ácido nucleico que se destina a ser expressada; uma região não traduzida 3'específica miogénica (3' UTR) e uma região não codificante (NCR) contígua à extremidade 3' da UTR 3', em que a NCR contem um sinal de fim de transcrição, em que a extremidade 5' da UTR 3' está ligada à extremidade 3' da cassete.

Formas de realização específicas dos MVS (sistemas de vectores de expressão miogénica) da presente invenção podem ainda incluir uma sequência líder a seguir à região do promotor. Formas de realização adicionais dos MVS (sistemas de vectores de expressão miogénica) incluem um primeiro intrão, um ATG de iniciação e um sítio de clonação Ncol inserido entre a área da região líder do promotor e a área da cassete. Formas de realização específicas da cassete incluem um sítio EcoRl na extremidade 3'. A UTR 3' pode ter um sítio EcoRV na sua extremidade 5'.

Qualquer promotor poderá servir, muito embora na forma de realização preferida seja um promotor miogénico seleccionado a partir de um grupo que consiste no promotor do gene de alfa-actina do esqueleto, um promotor 1 da cadeia leve da primeira miosina, um promotor da cadeia pesada da miosina, um promotor da tropinina T, um reforçador/promotor da creatinina quinase dos músculos, um promotor de citomegalovírus, um promotor RSV e LTR do vírus do Sarcoma de Rous. Na forma de realização preferida, é usado o promotor de alfa-actina do esqueleto.

De forma semelhante, o UTR 3' e o NCR são seleccionados de quaisquer genes específicos miogénicos. Na forma de realização preferida, são usadas as regiões UTR e NCR 3' do gene da alfa-actina do esqueleto.

As formas de realização específicas também incluem a adição de elementos de regulação do promotor para regular a expressão de qualquer sequência de ácido nucleico específica

no tecido miogénico. Na forma de realização preferida, é usada a Vitamina D para regular a expressão.

A cassete pode conter uma variedade de sequências de ácido nucleico que expressam um polipéptido. Estas podem incluir hormonas, factores do crescimento, enzimas, apolipoproteinas, factores de coagulação, proteínas de revestimento do vírus da SIDA, proteínas do componente de vírus, proteínas superficiais de vírus, proteínas superficiais de bactérias, proteínas superficiais de células de parasitas, supressores de tumores e transcriptase inversa de vírus.

Para as formas de realização específicas, a cassete contem a sequência de ácido nucleico para o factor I de crescimento semelhante à insulina, para o factor II de crescimento semelhante à insulina, para a proteína de ligação do factor de crescimento de insulina, para o factor de libertação da hormona do crescimento, para a apolipoproteína A-I ou uma proteína capaz de provocar uma resposta de anti-corpos.

MVS (sistema de vectores de expressão miogénica) é usado para tratar a atrofia muscular em seres humanos idosos, a atrofia muscular provocada por lesões da espinal medula ou doenças neuro-musculares, a esclerose lateral amiotrófica e a doença do crescimento. É também útil no tratamento da prevenção das doenças cardio-vasculares arterioscleróticas, substituição dos genes e na produção de vacinas.

Outros objectivos, características e vantagens serão evidentes a partir da descrição seguinte das formas de realização presentemente preferidas da invenção, que são dadas com o fim de descrição, quando consideradas conjuntamente com os desenhos anexos.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 representa um desenho esquemático do gene de alfa-actina do esqueleto da galinha que inclui a localização de sítios de restrição únicos.

A Figura 2 ilustra o domínio de transcrição do gene de alfa-actina do esqueleto das aves e a região não codificante contígua em que termina a transcrição.

A Figura 3 é uma representação esquemática de um sistema de vectores de expressão miogénica.

A Figura 4 é um diagrama esquemático de genes híbridos da alfa-actina do esqueleto/factor I do crescimento semelhante à insulina.

A Figura 5 ilustra o aumento da actividade dos vectores híbridos de IGF-I miogénicos que contêm a região não traduzida 3' da alfa-actina do esqueleto e a região não codificante contígua pela acumulação de RNA de IGF-I em mioblastos C£C|2 estavelmente transfectados.

A Figura 6 mostra a acumulação de RNA de IGF-I em linhas de cobaias transgénicas geradas com o vector de expressão miogénica SK202IGF-I-3'SV.

A Figura 7 mostra a acumulação de RNA de IGF-I em linhas de cobaias transgénicas geradas com o vector de expressão miogénica SK202IGF-I-3'SK.

A Figura 8 é uma representação esquemática de um MVS regulável usando um receptor de Vitamina D.

A Figura 9 é uma representação esquemática de um MVS regulável usando um receptor quimérico.

A Figura 10 ilustra a estabilidade dos RNAs de IGF-I com UTRS 3' diferentes.

Os desenhos não são necessariamente a esta escala. Algumas características da invenção podem ser exageradas na escala ou mostradas em forma esquemática tendo em conta a clarificação e exactidão.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Será evidente para um perito na matéria que podem ser feitas várias substituições e modificações à invenção aqui descrita, sem sair do âmbito e do espírito da invenção.

O termo promotor, tal como aqui é usado, refere-se a um sítio de reconhecimento numa fita de ADN à qual se liga a RNA polimerase. O promotor é usualmente um fragmento de ADN de cerca de 100 a 200 bp na corrente ascendente de ADN de flanqueamento 5' do local da cobertura ou do sítio de partida da iniciação da transcrição. O promotor forma um complexo de iniciação com a RNA polimerase para iniciar e conduzir a actividade de transcrição. 0 complexo pode ser modificado activando sequências denominadas aumentadores ou inibindo sequências denominadas silenciadores. Usualmente, sequências ou elementos reguladores específicos são encaixados numa posição adjacente ou dentro das regiões de ADN de

codificação de proteínas. Os elementos, localizados numa posição adjacente ao gene, são denominados elementos de actuação cis. Estes sinais são reconhecidos por outras biomoléculas difusíveis em trans para potenciarem a actividade de transcrição. Estas biomoléculas são denominadas factores de actuação trans. A presença de factores de actuação trans e de elementos de actuação cis mostrou contribuir para o padrão de expressão em tempo e desenvolvimento de um gene. Pensa-se usualmente que os elementos de actuação cis são aqueles que regulam a transcrição e se encontram dentro das regiões do promotor e outras sequências de flanqueamento do ADN a montante.

termo líder, tal como aqui é usado, refere-se a uma sequência de ADN na extremidade 5' de um gene de estrutura, que é transcrito juntamente com o gene. 0 líder resulta usualmente na proteína que tem uma extensão de péptido do terminal N, por vezes denominada uma sequência pro. Para as proteínas destinadas, quer para a secreção no meio extra-celular ou numa membrana, esta sequência de sinal, que é em grande parte hidrofóbica, dirige a proteína para dentro do rectículo endoplásmico a partir do qual é descarregada para o destino apropriado.

termo intrão, tal como aqui é usado, refere-se a uma secção de ADN que ocorre no meio de um gene que não codifica um amino ácido no produto do gene. 0 RNA precursor do intrão | é cortado e, por isso, não é nem transcrito no mRNA nem traduzido para dentro da proteína.

termo cassete refere-se à sequência da presente invenção que contem a sequência de ácido nucleico que vai ser expressada. A cassete é semelhante, no seu conceito, a uma fita de cassete. Cada cassete terá a sua própria sequência. Deste modo, permutando a cassete, o vector irá expressar uma sequência diferente. Devido aos sítios de restrição nas extremidades 5' e 3', a cassete pode ser facilmente inserida, removida ou substituída por outra cassete.

termo região não traduzida 3'ou UTR 3' refere-se à sequência na extremidade 3' de um gene de estrutura que é usualmente transcrito com o gene. Esta região UTR 3' contem, em geral, a sequência poli A. Embora a UTR 3' seja transcrita a partir do ADN, é cortada antes da tradução para dentro da proteína. Na presente invenção, é preferido ter uma UTR 3' específica miogénica. Isto permite a estabilidade específica nos tecidos miogénicos.

termo Região Não-Codificante ou NCR refere-se à região contígua à região UTR 3' do gene da estrutura. A região NCR contem um sinal de terminação da transcrição.

A UTR 3' e a NCR são um aspecto essencial da presente invenção, porque proporcionam um nível mais elevado de acumulação de mRNA através do aumento da estabilidade do mRNA em células miogénicas, mais do que em células não miogénicas. Assim, este aumento de estabilidade do mRNA conduz ao aumento dos níveis de produção de proteínas.

A região não traduzida 3' do gene da alfa-actina do

esqueleto da galinha começa no nucleótido 2060 e se estende até ao 2331. À região não traduzida 3' completa e o ADN não codificante contíguo estendem-se num adicional de 2,0 Kb. Este fragmento 2,3 Kb pode ser ligado, imediatamente a seguir ao codão de terminação da tradução natural, a uma cópia da sequência de ADN que codifica um polipéptido desejado que se destina a ser expressado.

termo miogénico ou específico miogénico refere-se ao tecido muscular. 0 tecido muscular pode ser tecido in vivo, tecido in vitro ou culturas de células de tecido in vitro capazes de se diferenciarem no tecido muscular. As células miogénicas incluem as células do esqueleto, do coração e dos músculos lisos. Estes vectores são transfectados em células miogénicas em cultura e são injectados no tecido múscular intacto. Estes vectores, que contêm a construção, são injectados em oócitos de mamíferos e podem ser estavelmente incorporados no genoma para gerar animais transgénicos, em que o vector expressa polipéptidos em células miogénicas.

termo sítio de restrição refere-se a um sítio de clivagem específico da sequência de endonucleases de restrição.

termo vector refere-se a alguns meios através dos quais os fragmentos de ADN podem ser introduzidos num organismo hospedeiro ou num tecido hospedeiro. Existem vários tipos de vectores incluindo plasmídios, bacteriofages e cosmídios.

termo quantidade efectiva significa que é injectado MVS suficiente no tecido miogénico ou na cultura, para produzir os níveis adequados do polipéptido. Um perito na matéria reconhece que este nível real dependerá do uso do MVS. Os níveis serão diferentes no tratamento, na produção de vacinas ou na vacinação.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, existe um sistema de vectores de expressão miogénica (MVS) para a expressão de uma sequência de ácido nucleico em tecido miogénico, que compreende um promotor; uma cassete cuja extremidade 5' está ligada à extremidade 3' do promotor; uma UTR 3'miogénica específica e uma NCR contígua à extremidade 3' da UTR 3'.

Este sistema básico pode ser aumentado de várias maneiras, incluindo a adição de uma sequência líder entre o promotor e a cassete.

De acordo com uma forma de realização preferida, os MVS para a expressão de uma sequência de ácido nucleico em tecido miogénico compreende uma unidade funcional que expressa a sequência de ácido nucleico. A unidade funcional compreende elementos, todos eles sequencialmente ligados entre si, de 5' a 3'. Os elementos, por ordem de ligação, incluem um promotor, uma sequência líder de mRNA 5', um primeiro intrão e ATG de iniciação e um sítio de clonação Ncol, uma cassete que tem um sítio EcoRI na sua extremidade 3', uma UTR 3' específica miogénica em que a extremidade 5' da UTR 3'tem um sítio EcoRV e uma NCR que é contígua à extremidade 3' da UTR 3'.

Podem ser usados vários promotores no MVS. Alguns exemplos incluem um promotor do gene de alfa-actina do esqueleto, um promotor 1 da cadeia leve da primeira miosina, um promotor da cadeia pesada de miosina, um promotor de tropinina T, um promotor da creatinina quinase dos músculos, um promotor do citomegalovirus, um promotor de RSV e o LTR do vírus Sarcoma de Rous. De acordo com a forma de realização preferida, é usado um promotor específico miogénico, tal como o promotor do gene da alfa-actina do esqueleto.

A UTR 3' e a NCR podem ser seleccionadas de qualquer grupo de genes miogénicos específicos. Exemplos de genes neste grupo são o gene da alfa-actina do esqueleto, o gene 1 da cadeia leve da miosina rápida, o gene da cadeia pesada da miosina, o gene da tropinina T, genes de sub-unidades de receptores de acetil colina e o gene da creatinina quinase dos músculos. De acordo com a forma de realização preferida, a UTR 3' e a NCR são provenientes do gene da alfa-actina do esqueleto.

Formas de realização alternativas da presente invenção incluem a adição de um sistema regulador para a regulação da expressão da sequência de ácido nucleico.

Pode ser usado qualquer um de vários sistemas reguladores. De acordo com a forma de realização preferida, foram usados dois sistemas reguladores diferentes.

Uma forma de realização de um MVS regulado (veja-se Figura 7) para a expressão de uma sequência de ácido nucleico específica em tecido miogénico, compreende uma primeira

unidade funcional e uma segunda unidade funcional. Â primeira unidade funcional e a segunda unidade funcional podem estar no mesmo vector ou em dois vectores separados. Em qualquer dos casos ambas as unidades funcionais devem ser introduzidas no tecido miogénico.

À primeira unidade funcional é composta pelos elementos seguintes, todos eles sequencialmente ligados de 5' a 3': um promotor específico miogénico, uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor, uma UTR 3' específica miogénica e uma NCR específica miogénica.

A segunda unidade funcional é composta pelos elementos seguintes, sequencialmente ligados 5' a 3': um elemento de resposta correspondente ao receptor, um promotor de timidina quinase, uma cassete contendo a sequência de ácido nucleico específica de interesse, uma UTR 3' específica miogénica e uma NCR específica miogénica contígua.

Neste MVS regulável, é preferível que a primeira unidade funcional expresse continuamente o receptor. É preferível usar um receptor que não seja encontrado em níveis muito elevados no tecido miogénico, quando o agente que é específico do receptor, é introduzido no sistema. 0 receptor forma uma interacção com o elemento de resposta e o agente específico. Esta interacção de ligação leva a que o promotor de timidina quinase expresse a sequência de ácido nucleico específica. Regulando a quantidade de agente que está presente, regula-se a actividade do MVS.

Neste sistema regulável, o elemento de resposta e o

receptor são usualmente complementares e podem ser seleccionados de vários grupos receptores. Por exemplo, pode ser usada qualquer vitamina, esteróide, tiróide, orfano, hormona, ácido retinóico e tiroxina. De acordo com a forma de realização preferida, são usados o receptor de Vitamina D e o elemento de resposta de Vitamina D. Neste caso, a ingestão de Vitamina D, por exemplo bebendo leite, provoca o aumento do nível de Vitamina D no sangue. Esta liga-se ao receptor que está a ser gerado no tecido miogénico e o complexo liga-se ao elemento receptor provocando a expressão do gene de interesse. Deste modo, o MVS pode ser regulado pela ingestão de alimentos.

Um método alternativo para regular o MVS é mostrado na Figura 9. Nesta forma de realização, pelo menos um dos elementos de resposta do soro na região do promotor de alfa-actina é feito num sítio de ligação do receptor. Então, é construído um transfactor quimérico em que o domínio de ligação do ADN normal do factor de resposta do soro é substituído pelo domínio de ligação do ADN do receptor. 0 domínio de transactivação do factor de resposta do soro não é alterado. Deste modo, quando se encontra presente um agente ou um ligante específico do receptor, ele liga-se ao receptor no domínio de ligação permitindo que o factor de transactivação da resposta do soro active a transcrição. Deste modo, a regulação pode ser controlada, controlando-se a quantidade do agente. 0 domínio de ligação do ADN, que é substituído no factor de resposta do soro normal, é usual20 mente seleccionado das seguintes famílias de domínios de ligação de receptores: as vitaminas, esteróides, tiróides, orfanos, hormonas, ácido retinóico e tiroxina. Na forma de realização preferida, é usado o receptor de Vitamina D.

A cassete pode conter a sequência de ácido nucleico de interesse e incluir qualquer sequência de ácido nucleico que se destina a ser expressada no tecido miogénico ou na cultura de tecidos. Esta sequência de ácido nucleico pode exigir qualquer variedade de polipéptidos. 0 polipéptido pode ser qualquer polipéptido desejado, incluindo, mas não se limitando, às proteínas conhecidas. Por exemplo, a sequência pode codificar uma hormona, um factor de crescimento, uma enzima, uma apolipoproteína, um supressor de tumores, um anti-gene de tumores, uma proteína de vírus, um factor de coagulação e quaisquer proteínas associadas com o vírus da SIDA, quaisquer outras proteínas de vírus, incluindo as proteínas de revestimento da superfície de vírus, as proteínas superficiais de bactérias, as proteínas superficiais de células de parasitas, a transcriptase inversa de vírus e qualquer gene que necessite de ser substituído por substituição de genes.

Nas formas de realização específicas do MVS, a cassete inclui o ácido nucleico para o factor I do crescimento semelhante à insulina, ou o factor II semelhante à insulina ou a proteína de ligação do crescimento da insulina. Esta forma de realização específica pode ser usada para tratar a atrofia muscular em seres humanos idosos, a atrofia muscular provocada por lesões da espinal medula ou doenças neuro-musculares.

Um exemplo específico do último caso é a esclerose amiotrófica lateral.

Uma outra forma de realização específica consiste num MVS em que a cassete contem a sequência de ácido nucleico que codifica o factor de libertação da hormona do crescimento. Este sistema de MVS pode ser usado para tratar a atrofia muscular em seres humanos idosos.

Uma outra forma de realização da presente invenção inclui um MVS em que a cassete inclui a sequência de ácido nucleico para a apolipoproteína A-I. Este MVS pode ser usado para a prevenção ou o tratamento da doença cardiovascular arteriosclerótica.

Nos casos em que a cassete do MVS contem uma sequência que codifica uma proteína de vírus, de bactérias ou de parasitas, o MVS pode ser usado para preparar uma vacina. Neste caso, o processo para preparar uma vacina em humanos ou animais, compreendendo a operação de se injectar uma quantidade efectiva do MVS no músculo do esqueleto ou na cultura de tecidos. Neste vector de MVS a cassete contem uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido capaz de desencadear uma resposta de anticorpos. Este processo será um método seguro e eficaz para a criação de vacinas. A vacina pode ser gerada em cultura de tecido ou in vivo, em seres humanos ou animais. Exemplos de sequências de ácido nucleico que podem desencadear uma resposta de anticorpos incluem as das proteínas de vírus, das proteínas de bactérias e das proteínas de parasitas. Um exemplo de um caso específico é o das proteínas da SIDA.

Uma outra forma de realização específica da presente invenção consiste num método de tratamento da doença do crescimento que compreende a operação de se injectar uma quantidade efectiva de um MVS no músculo do esqueleto, em que a sequência de ácido nucleico na cassete contem a sequência da hormona do crescimento.

Uma outra aplicação da presente invenção reside num método para a substituição de genes. Nesta forma de realização, é injectada uma quantidade efectiva do MVS no músculo do esqueleto e a cassete contem qualquer sequência que codifica um gene defeituoso. Por exemplo, podem ser inseridos na cassete os genes da glicogene fosforilase, alfa-1-antitripsina e distrofina. Os indivíduos com as doenças correspondentes à doença de acumulação de glicogene, da deficiência de alfa-l-antitripsina ou do efisomo pulmonar e da Distrofia Muscular de Duchenne, produzirão assim uma quantidade suficiente do polipéptido normal. A proteína expressada pode espalhar-se sistemicamente pelo corpo do animal através da corrente sanguínea bem como permanecer na musculatura injectada. 0 polipéptido pode ser colhido e purificado conforme se desejar.

Quaisquer dos MVS aqui discutidos podem ainda ser modificados para aumentar a absorção pelas células. Este aumento compreende a adição de um revestimento. 0 revestimento inclui um complexo de iniciação do ADN e histonas. 0 complexo de iniciação compreende um factor de resposta do soro (SRF), um factor de iniciação da transcrição (TIF) e um factor de trans-regulação (TRF). 0 SRF é ligado ao elemento de resposta do soro dentro da região do promotor do MVS. 0 TIF e o TRF interactuam então com o SRF e a caixa TATA dentro do promotor para formar um complexo de ADN estável. As histonas ligam-se não especificamente ao ADN restante no MVS.

Os exemplos seguintes são dados como ilustração e não pretendem limitar a invenção de qualquer forma.

Exemplo 1

Isolamento do Gene de Alfa Actina do Esqueleto da Galinha fragmento EcoRl 25 Kb do ADN genómico da galinha isolado a partir de um vector de lambda Charon 4A, contem o gene de alfa-actina 6,2 Kb do esqueleto no único sitio Hind III de pBR322, conforme mostrado na Figura 1. Chang et al., Mol. Cell. Biol, Vol. 4: 2498-2508 (1984). Foram usados desenrolamentos de transcrição nuclear para traçar o domínio de transcrição do gene da alfa-actina do esqueleto (Figura 2). As amostras de ADN que incluíam porções das regiões não codificantes 5', do promotor, de codificação, e das regiões não codificantes 3' contíguas, foram clonadas nos vectores M13 que proporcionavam amostras de sentido e anti-sentido. Foram usados núcleos isolados de fibroblastes, mioblastes e de células de músculos de embriões de 19 dias nos ensaios de transcrição in vitro para ampliar as transcrições de RNA com nucleótidos radioactivos marcados. O RNA marcado hibridizado em amostras de ADN pintadas mostrou que a transcrição termina

aproximadamente 1 Kb a jusante do sítio de adição da poli A do gene de alfa-actina do esqueleto. Isto é dentro de um fragmento PvuII 800 bp entre os nucleótidos +2800 e +3600 a partir do início da transcrição.

A região 3' não traduzida (3' UTR) e a região não codificante contígua (NCR) podem ser isoladas por digestão de endonucleases de restrição do gene de actina 6,2 Kb com cortador cego Nael, que corta 30 bp a montante do codão de terminação da tradução TAA. 0 HindIII liberta a maior parte da porção 3' do gene de actina a partir do vector pBR322 (Figura 3). A UTR 3' e a NCR foram usadas para preparar construções de ADN. 0 promotor de alfa-actina do esqueleto e as sequências de flanqueamento de ADN (pelo menos 411 núcleotidos a partir do sítio do topo de mRNA) e as sequências de ADN que se estendem através do líder não codificante 5' do esqueleto, o primeiro intrão e até à iniciação da tradução de ATG, convertido num sítio de clonação Ncol a +196, foi libertado a partir de um ADN de fita dupla M13 pela digestão de Xbal e Ncol, carregado de Klenow e depois ligado ao Xbal e aos sítios cegos Smal do pBluescript II KS (Stratagene). O sítio Ncol é regenerado por meio desta operação de clonação. A UTR 3' e a NCR no fragmento 2,3 Kb Nael/HindIII foram direccionalmente clonadas num sítio EcoRv cego e no sítio HindIII adjacente do pBuescript II do vector da cassete KS. São destruídos os sítios EcoRV e Nael. 0 sítio Ncol restaurado foi usado para inserir as sequências de cADN que codificam polipéptidos. Foi construído um outro vector de clonação por i

meio da inserção do promotor de alfa-actina do esqueleto a partir do -411 a -11 adjacentes à UTR 3' e NCR. Este vector miogénico elimina o primeiro intrão e a sequência líder 5' de actina do esqueleto. Estes dois vectores foram usados na preparação de construções de ADN para testar a eficácia da UTR 3' e NCR.

Exemplo 2

Construção de um MVS Contendo o IGF-I Humano

Ligaram-se construções contendo o promotor de actina do esqueleto a cADN de IGF-I humano por meio de técnicas conhecidas de ADN recombinante. Maniatis, Fritsch and Sambrook, Molecular Cloning. Um manual de laboratório. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982. Mostram-se na Figura 3 exemplos de uma estrutura de MVS generalizada. Mostra-se na Figura 4 IGF-I a construção específica do IGF-I. A construção foi feita de forma a que o sítio de adição SV40 poli A e o t-intrão pequeno ficassem ligados à região não traduzida 3' do cADN do IGF-I. Foram adicionadas as sequências SV40 para aumentar a estabilidade das transcrições RNA de IGF-I nucleares. Uma vez que o t-intrão SV40 podia não ser completamente apropriado na expressão do IGF-I nas células dos músculos, foram feitos outros cinco vectores. 0 vector Ncol SK733 contem aproximadamente 411 nucleótidos do promotor de alfa-actina do esqueleto, o sítio de tampa natural, o líder não traduzido 5 ' e o primeiro intrão. Foi construído um sítio Ncol para criar um único sítio de

clonação da inserção para a cassete que contem o cADN de IGF-I, em que o ATG de iniciação foi também convertido num sítio Ncol. A construção SK733IGF-I utiliza o seu próprio sítio poli A. Ligou-se um fragmento Nael/HindIII que incorporava a região 3' não traduzida de alfa-actina do esqueleto, o sítio de adição poli A, e as sequências de terminação, ao SK202, SK733 Ncol, IGF-I e ao SK733IGF-I em que o sítio poli A IGF-I foi anulado e substituído pelo da alfa-actina do esqueleto. Desta forma, as transcrições de RNA de IGF-I que continham a região não traduzida 3' de alfa-actina do esqueleto ficam estabilizadas e acumulam-se em células dos músculos do esqueleto. Além disso, proporcionando-se ADN não codificante 3' contíguo, o IGF-I é tamponado contra as sequências genómicas exteriores, ficando assim mais protegido dos efeitos da posição, quando integrado no genoma. Além disso, proporcionando-se sequências de terminação naturais, as sequências de regulação adicionais que marcam o domínio de transcrição da alfa-actina do esqueleto aumentam a especificidade do tecido, o tempo de desenvolvimento e a actividade de transcrição.

Exemplo 3

Actividade das Construções de MVS

Para determinar a eficácia do promotor de actina/genes híbridos do gene de IGF-I em células miogénicas de cobaia, estudou-se o MVS usando estes genes na estrutura dos mioblastes C₂C^₂ ^mamíf^erosz criando-se uma população de mioblastes C₂C₁₂ estáveis, transfectados. Os níveis de

expressão do IGF-I alterados foram directamente avaliados nestas linhas de células de mioblastes estáveis. Cada construção de IGF-I (Figura 4) foi co-transfectada com o vector seleccionável do fármaco EMSV-Higromicina nas células da cobaia. Depois de duas semanas de selecção, seleccionou-se uma população de mioblastes estáveis. Uma população de mioblastes de C2C-^2 estavelmente transfectada apenas com EMSV-Higromicina serviu como controlo. A inspecção visual dos mioblastes transfectados revelou várias penetrações no papel do IGF-I na diferenciação da células musculares, que não seria óbvio nas cobaias transgénicas. Em geral, todas as linhas de células miogénicas contendo os genes de IGF-I levaram a que os mioblastes no meio de crescimento (soro de feto de vitelo a 10%) se replicassem mais extensamente do que os controlos. Mudando-se o meio de cultura para soro de cavalo a 2%, inicia-se o processo de diferenciação. No processo, os mioblastes C₂C₁₂ ^de controlo fundem-se para formar miotubos multinucleados durante um período de quatro dias. Na mesma densidade de células por prato de cultura, os mioblastes contendo SK733IGF-I,

SK202IGF-I-SK, SK733IGF-I-SK1 e o SK733IGF-I-SK2 fundiram-se, pelo menos dois a três dias mais cedo do que os mioblastes de controlo de C2C12 ou EMSV-Higromicina.

A Figura 5 mostra a acumulação de estado estável do mRNA de IGF-I em mioblastes C2C^2* Foram isoladas quantidades iguais de RNA de células total a partir de mioblastes ^C2^C12 estavelmente transfectados cultivados em meios de cultura (G)

ou em meio de diferenciação (D). 0 RNA foi electroforeticamente separado em geles de agarose desnaturantes, transferido para filtros de nylon e ensaiado com cADN de IGF-I humano de comprimento total uniformemente marcado com P , de acordo com técnicas de hibridização conhecidas. A intensidade do sinal autoradiogrâfico na chapa de raio X proporciona uma medida relativa de acumulação de mRNA, um índice geral da actividade de transcrição combinada e a estabilidade de mRNA do sistema de vectores de expressão miogénica, 0 mRNA de IGF-I no vector, SK202IGF-I-3' SVa não se acumulou nos miotubos acima dos níveis dos mioblastes. Esta é uma actividade de expressão típica. 0 vector SK733IGF-I contem a região não traduzida 3' de IGF-I. 0 mRNA de IGF-I deste vector acumulou-se em miotubos, mas em níveis substancialmente inferiores aos do SK202IGF-I-SK ou SK733IGF-I-SK2. Estes últimos dois vectores contêm a UTR 3' da actina do esqueleto e as regiões não codificantes contíguas. Deste modo, a diferença principal nestes vectores é a UTR 3', o aumento da estabilização das transcrições de mRNA devido às quantidades de UTR 3' do esqueleto em cerca de 100 vezes a diferença no teor de mRNA.

Exemplo 4

Medição dos Níveis Segregados de IGF-I a partir de MVS

Cultivaram-se culturas de miotubos diferenciadas em meios mínimos (DMEM e albumina de soro de boi a 0,05% de grau RIA) a fim de medir a quantidade de IGF-I sintetizado e segregado no meio. 0 SK733IGF-I-SK2 é a construção mais

eficaz para expressar o IGF-I nas células dos músculos. 0 IGF-I foi ensaiado por meio de ensaios radioimunológicos de meios de cultura de tecidos e por meio de coloração de células com imunoperoxidase. Descobrimos um aumento dos níveis de IGF-I durante a fusão de várias das nossas culturas de músculos. A comparação dos níveis de diferentes MVS é mostrada na Tabela 1. Nas culturas de controlo, o nível de IGF-I estava na média de 0,2-0,5 ng/ml. Comparativamente, o vector SK733IGF-I-SK2 tem níveis de IGF-I pelo menos cem vezes superiores.

papel da UTR 3' da alfa-actina do esqueleto na estabilidade do mRNA foi examinado na população estável de células miogénicas

transfectadas.

Foi adicionado um bloquedor da transcrição, actinomicina D (8 ug/ml) para diferenciar as culturas miogénicas na posição do miotubo e as amostras com tempo marcado foram removidas para análise de manchamento blotting de RNA, para determinar as quantidades relativas mRNA de IGF-I. Verificou-se que as transcrições que continham a UTR 3' de IGF-I humano natural se viravam rapidamente com um tempo médio inferior a 1 hora. Estes resultados são consistentes com o curto tempo médio dos factores do crescimento. As transcrições de IGF-I que continham os sinais UTR 3' SV40 e os sinais de adição poli A revelaram um tempo médio de vida de cerca de 4 horas. Em contraste, as transcrições de

IGF-I que continham a UTR 3' da alfa-actina do esqueleto mostraram um elevado nível de estabilidade, com um tempo médio de vida superior a 18 horas. Estes resultados apoiam a reivindicação de que o elevado nível de mRNÀ de IGF-I que se acumula nos mioblastes ¢2^2 transfectados de SK733IGF-I-SK2 é devido, em parte, à estabilização diferencial de mRNA que contem a UTR 3' de alfa-actina do esqueleto contígua.

Tabela I

Níveis de IGF-I em Mioblastes

Estavelmente Transfectados

Construção

IGF-I (ng/ml de meio/4 dias)

SK202IGF-I-3'SVa

4,4

SK733IGF-I

3,8

SK733IGF-I-SK2

79,0

C₂C₁₂ de controlo

0,5

De forma semelhante, a coloração com imunoperoxidase de culturas miogénicas revelou um aumento de produção de IGF-I imunológico reactivo em mioblastes estáveis transfectados mas não nos mioblastes de EMSV-Higromicina de controlo transfec-

contra as regiões A e D em diluições de 1: 1000. Todas as linhas transfectadas, incluindo a SK202IGF-I foram positivamente manchadas com imunoperoxidase. Deste modo, é claro que níveis cada vez maiores de IGF-I estão a ser sintetizados e exportados dos mioblastes estáveis.

Exemplo 5

Inserção de MVS em Cobaias Transgénicas

Geraram-se cobaias transgénicas portadoras de SK202IGF-I-3'SVa ou SK202IGF-I-SK por meio da injecção de oócitos padrão (Brinster, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Vol. 82: 4438-4442 (1958) e instruiram-se para demonstrar a transmissão estável de transgenes para gerações subsequentes. Os transgénicos foram identificados pela reacção em cadeia de polimerase ou pela análise de manchamento com ADN genómico de Southern a partir do ADN do corte da cauda. Os transgenes foram testados relativamente à expressão específica dos músculos do vector de IGF-I transferido pelo manchamento com RNA do RNA total isolado a partir de vários tecidos, tal como se mostra nas Figuras 6 e 7. Foram geradas linhas de cobaias transgénicas independentes 5484, 5496, 5832, 5834 com SK202IGF-I-3'SVa, contendo o intrão 3' SV40 e a sequência de adição poli A. Verificou-se que as cobaias destas estirpes possuem uma fraca expressão, principalmente no tecido do coração, mas descobriram-se níveis muito baixos nos tecidos do músculo do esqueleto e nos tecidos não miogénicos, tais como os do rim e do cérebro (Figura 6). Geraram-se linhas de cobaias transgénicas independentes 3357, 3359 com SK733IGF-I-3'SK2. Verificou-se que as cobaias destas estirpes possuem níveis de expressão elevados de IGF-I (Figura 7). Estes níveis são comparáveis à actividade do gene da alfa-actina das cobaias endógenas. Estes níveis de SK733IGF-I-3'SK2 mostram uma acumulação de mRNA de IGF-I,

pelo menos, 100-1000 vezes superior em comparação com os níveis produzidos pelo vector SK202IGF-I-3'SVa. A adição da UTR 3' da alfa-actina do esqueleto e das regiões não codificantes contíguas permitiu um aumento preferencial de RNA de IGF-I no músculo do esqueleto, mais do que no do cardíaco. Deste modo, a UTR 3' e a NCR da actina do esqueleto desempenham um importante papel no aumento da expressão dos genes específicos dos músculos.

Analisaram-se homogenados dos tecidos dos músculos por meio de ensaio rádio-imunológico para determinar os níveis relativos de produção de IGF-I. Os homogenados foram cromatografados com ácidos para separar as do IGF-I das proteínas de ligação de IGF , depois as fracções de cromotografia com ácidos contendo o IGF-I foram colocadas em piscinas, liofilizadas, reconstituídas e testadas por meio do protocolo de Liu, F, Powell, D. R., Styne, D. M. and Hintz, R. L. (191) J. Clin. Endocrin. Metab., 72: 905-911. O anti-soro de IGF-I foi proporcionado pelo National Hormone and Pituitary Program. Na Tabela II, detectámos um aumento de dez vezes no teor de IGF-I no músculo SK 7333 IGF-I SK transgénico em comparação com os controlos. Deste modo, existe uma boa correspondência entre o aumento do teor de mRNA de IGF-I com um aumento de magnitude do IGF-I expresso em tecido dos músculos de cobaias transgénicas.

Teor de IGF-I nos Músculos em Cobaias Transgénicas IGF-I (100 ng/100 ug de proteínas dos músculos)

Controlo 11,5

SK 733 IGF-I-3' SK2 105,5 linha 3357 de cobaias

Exemplo 6

Expressão de MVS em Músculos Intactos

Pode injectar-se ADN de plasmídio intacto numa solução de sacarose estéril a 20% (peso/volume) em músculos de aves ou de mamíferos completamente desenvolvidos. A seguir a uma única injecção, o ADN do vector fica estável durante, pelo menos, 30 dias como um ADN circular extra-cromossómico não integrado no núcleo dos músculos, sendo transcritivamente activo. Wolf et al., Science, 247: 1465-1468 (1990). Contudo, mais de 99% do ADN injectado degrada-se nos músculos, de acordo com o protocolo de Wolff (Wolff et al., BioTechniques, Vol. 11: 4374-485, 1991). Este protocolo pode ser melhorado, aumentando a absorção de ADN de plasmídio nos músculos e reduzindo a degradação do vector. 0 processo da presente invenção utiliza ADN de MVS revestido com os factores de regulação de transcrição relevantes, o factor de resposta do soro humano e com outras proteínas nucleares associadas com os seres humanos, tais como as histonas e os factores de iniciação da transcrição, para aumentar a absorção e a estabilidade. As proteínas de regulação protegem o ADN contra as nucleases doe músculos e facilitam a absorção do ADN revestido com proteínas no núcleo miogénico.

MVS forma um complexo de proteínas/ADN pela ligação específica à sequência do factor de resposta do soro com o núcleo interno CC(A/T)₆GG do elemento de resposta do soro e através da adição de histonas. A interacção com o núcleo interno do promotor facilita a expressão restrita do tipo das células miogénicas do gene da alfa-actina do esqueleto. 0 factor de resposta do soro, o factor de iniciação da transcrição, o factor de transregulação e as histonas são adicionadas ao MVS por meio de uma reacção de ligação in vitro, para formar um complexo de proteínas/ADN reconstituído.

Um método de terapia genética pós-natal envolve a injecção de vectores miogénicos em músculos adultos com o fim expresso de exprimir um polipéptido particular. 0 vector miogénico SK733IGF-I-SK2 foi injectado a cerca de 100 ug/100 μΐ no músculo gastrocnémio da cobaia BALB/C hipofisectomizada. Removeu-se todo o músculo no espaço de 1 a 4 semanas a seguir à injecção e testou-se relativamente ao teor de mRNA de IGF-I em comparação com o membro contra-lateral não injectado. Em comparação com os controlos, os membros injectados com tubos deveriam aumentar os níveis de mRNA de IGF-I devido à expressão do MVS.

A injecção de 20 yg de ADN de plasmídio SK73IGF-I-SK2 no músculo vastolateralis da cobaia Little provocou um aumento médio de 60% nos níveis de IGF-I em comparação com os controlos, injectados apenas com o vector de plasmídio pSK-3'SK, conforme testado pelo ensaio rádio-imunológico com IGF-I. Dois animais injectados com o vector SK7331IGF-I-SK2 duplicaram os níveis de IGF-I, conforme se mostra na Tabela III.

Tabela III

Transferência Genética Somática para o Músculo do Esqueleto do Ratinho

Ratinho # Plasmídio Músculo (20 ug de ADN) IGF-I (ng/100 ug de proteínas)

776	pSK-3'SK	4,2
777	pSK-3'SK	4,2
778	pSK-3'SK	4,5
779	pSK-3'SK	3,9
780	pSK-3'SK	3,9
781	pSK-3'SK	4,2
782	PSK733IGFSK2	4,5
783	PSK733IGFSK2	6,3
784	PSK733IGFSK2	8,2
785	PSK733IGFSK2	6,9
786	PSK733IGFSK2	8,4
787	PSK733IGFSK2	7,0

Exemplo 7

Tratamento com a Hormona do Crescimento

A hormona do crescimento é produzida e segregada a partir da pituitária anterior e estimula o crescimento linear nas crianças na fase de pré-puberdade. A secreção da hormona do crescimento é regulada por uma hormona do hipotálamo de estimulação (hormona de libertação da hormona do crescimento) e uma hormona do hipotálamo de inibição (somatostatina). A hormona do crescimento actua no figado e noutros tecidos para estimular a produção do factor I do crescimento semelhante à insulina. Este factor é responsável pelos efeitos de estimulação do crescimento da hormona do crescimento. Além disso, este factor serve como um indicador da secreção em geral da hormona do crescimento. A concentração de IGF-I no soro aumenta em resposta à hormona do crescimento administrada por via endógena e hexógena. Estas concentrações são baixas nos casos de deficiência na hormona do crescimento. A injecção de um MVS contendo a sequência de IGF-I (por exemplo, SK 733 IGF-I SK2) pode ser usada para tratar as perturbações do crescimento. A injecção do MVS é uma via barata, de longa duração, para aumentar a concentração sistémica no sangue de IGF-I em pacientes com deficiência da hormona do crescimento.

Exemplo 8

Tratamento da Atrofia Muscular Devido à Idade

Os níveis da hormona do crescimento diminuem com o aumento da idade. Os níveis nos homens e mulheres saudáveis acima dos 55 anos são aproximadamente um terço menores do que os níveis em homens e mulheres dos 18 aos 33 anos. 0 declínio na hormona do crescimento e na produção de IGF-I está em correlação com a diminuição da massa muscular, denominada atrofia muscular senil e no aumento da adiposidade que ocorre nos indivíduos saudáveis. Administrando-se hormona do crescimento três vezes por semana a pessoas saudáveis de 61 a 81 anos de idade, que tinham níveis no soro inferiores aos de homensjovens saudáveis, aumentou-se os níveis de IGF-I no soro para a média encontrada em adultos jovens saudáveis. Este aumento do nível levou ao aumento e fortalecimento da massa muscular e à redução da gordura no corpo.

São usados sítios de clonação convenientes nos Sistemas de Vectores Miogénicos para construir vectores de MVS contendo a sequência de cADN da hormona do crescimento humano e/ou a hormona de libertação (secreção) da hormona do crescimento humano. A expressão de um gene da hormona do crescimento conduzida pelo MVS a seguir às injecções intramusculares é outra forma de aumentar os níveis no soro de IGF-I. A expressão de MVS da hormona de libertação do factor de crescimento (GHRH) pode ser mais vantajosa do que a expressão de qualquer das transcrições dos vectores de IGF-I ou da hormona do crescimento. Uma vez que a GHRH é reduzida nas pessoas de idade avançada, parece ser responsável pela falta da secreção de GH, mais do que pela capacidade da pituitária anterior de sintetizar a hormona do crescimento, pelo que o aumento da

expressão de GHRH do músculo deveria aumentar os níveis de GHRH no sistema sanguíneo sistémico e aumentar a secreção diurna natural do padrão de GH a partir da pituitária anterior. Desta forma, o GHRH pode actuar como segregador (secretogogue) natural, permitindo a secreção elevada ou a libertação de GH do hipotálamo das pessoas de idade avançada.

Deste modo, a aplicação de sistemas de vectores miogénicos para expressar os factores de crescimento semelhantes à insulina, através da injecção do vector SK 733 IGF-I Sk2 nos músculos adultos de pessoas de idade avançada é uma via barata, de longa duração, para aumentar a concentração sistémica no sangue de IGF-I em indivíduos de idade avançada.

Exemplo 9

Atrofias nos Músculos Humanos Provocadas por Lesões da Espinal Medula, por Atrofiamento dos Nervos e por Doenças Neuromusculares

Os factores do crescimento semelhantes à insulina são um dos factores chave que potenciam o desenvolvimento muscular e o crescimento muscular. Os mioblastes segregam naturalmente IGF-I/IGF-II bem como as suas proteínas de ligação cognadas durante o começo da fusão. Este processo coincide com o aparecimento dos produtos genéticos específicos dos músculos. Nos dos músculos diferenciados nas extremidades, os sinais propagados de hipertrofia provocada pela tensão passiva provoca a expressão de genes de IGF. Muitas das acções dos

IGFs nos músculos resultam das interacções com o receptor de IGF-I. 0 receptor ê uma proteína quinase específica de tirosina activada por um ligando. Os factores do crescimento semelhantes à insulina são também agentes neurotróficos conhecidos que mantêm sinapses musculares neurónicas, a integridade dos neurões e a vida das células neurónicas em condições neuro-degenerativas. Foi possível aumentar o crescimento muscular em condições de crescimento de outra forma difíceis, em culturas miogénicas e em cobaias transgénicas, injectando-se um MVS contendo uma sequência de IGF-I. As injecções directas no músculo adulto permitem a transferência directa de construções genéticas promotoras do crescimento no músculo, proporcionando, deste modo, uma terapia genética pós-natal. Uma vez que os genes que conduzem o MVS são relativamente insensíveis ao estado de enervamento do músculo, proporcionam uma aplicação directa e bastante ampla para remediar certos tipos de atrofias musculares humanas causadas por lesões da espinal medula e por doenças neuro-musculares. Estas doenças incluem as atrofias musculares da espinal medula e a esclerose lateral amiotrófica (ALS). Neste tratamento, o produto do MVS actua como um agente neurotrófico segregado a partir do músculo injectado e como agente hipertrófico para manter a integridade muscular.

Exemplo 10

Doenças Cardiovasculares Arterioscleróticas

A doença cardiovascular arteriosclerótica é uma das

principais causas de mortalidade nos Estados Unidos e no mundo. A placa arteriosclerótica, a lesão básica que está por detrás da arteriosclerose, contem ésteres de colesterol que são derivados dos lípidos da circulação. Estes lípidos de circulação são essenciais para o desenvolvimento da arteriosclerose. A concentração no plasma de lipoproteinas de densidade elevada (HDL) está inversamente relacionada com a tendência para o desenvolvimento da arteriosclerose. No estado nascente, o HDL é segregado na forma de partículas discoidais. Estas partículas consistem numa camada dupla de fosfolípidos, sobre os quais são embutidas as apolipoproteínas (apoA-I, ApoII e E). 0 HDL captura os ésteres de colesterol pela acção de uma enzima, a lecitina-colesterol-aciltransferase. 0 HDL é segregado a partir do fígado, do intestino delgado e, possivelmente, de outros tecidos.

A cADN de APO A-I está em 878 bp e codifica os amino ácidos 267, incluindo os propropéptidos dos amino ácidos 24. Aumentando-se os níveis de circulação de HDL pode-se influenciar ou inverter o transporte de colesterol e, deste modo, reduzir a tendência para a formação de placas arterioscleróticas. A inserção das sequências que codificam o APO A-I humanos no MVS serve como um vector de expressão para aumentar a expressão do APO A-I a seguir à injecção de ADN de plasmídio no músculo do esqueleto. 0 gene híbrido APO A-I do MVS é eficaz para uma expressão de longa duração, para a biosíntese e para a secreção de HDL num sitio ectópico e,

deste modo, aumenta o teor de HDL segregável total no plasma sanguíneo.

Exemplo 11

Sistemas de Vectores de Expressão Miogénica Reguláveis de Vitamina D

A primeira série de vectores de expressão miogénica desenhados com os promotores de actina do esqueleto e as regiões não traduzidas 3' proporciona elevados níveis de actividade de transcrição não regulada. Em certas circunstâncias, torna-se desejável controlar a actividade de transcrição do vector e ligar e desligar a transcrição do gene através da introdução sistémica de um simples indutor ou ligando. Ê também importante que a regulação do vector de expressão miogénica seja controlada por produtos indutores naturais que não sejam considerados nem tóxicos para o homem nem sejam imunogénicos. Mostram-se nas Figuras 8 e 9 dois sistemas reguladores diferentes de Vitamina D.

À concentração de células do receptor de Vitamina D (VDR) nos músculos pode ser aumentada através do sistema MVS injectando-se um gene VDR de actina do esqueleto, híbrido que ficaria sob controlo do promotor de actina e das sequências de estabilização UTR 3'. Ê construído o alvo SEQ.ID.N²2 para conter multímeros sintetizados do elemento regulador de Vitamina D (VDRE). Este alvo é ligado a um promotor mínimo de timidina quimase do Vírus do Herpes Simplex (HSV). A actividade de transcrição que emana do promotor TK é regulada pela

presença de VDR e coactivada pelo ligando, a Vitamina D. Qualquer sequência de polipéptidos clonada em tandem no promotor HSV, como um cADN, é conduzida do vector alvo quando a Vitamina D é introduzida nas células dos músculos. 0 gene VDR de actina híbrido e o vector alvo são ligados no mesmo plasmídio ou co-injectados em plasmídios separados. São administrados níveis pré-medidos de Vitamina D, bebendo-se um copo de leite ou tomando uma pílula de Vitamina D. Os níveis são usados para activar a transcrição do vector alvo. Tomando o ligando em todos os outros dias, isto fará oscilar a actividade do promotor. A remoção do ligando, Vitamina D, da dieta regula para baixo ou reprime a transcrição do vector alvo.

Exemplo 12

Produção de Vacinas sistema MVS é apropriado para dirigir a expressão de um epítopo de proteínas exógenas nos músculos e, deste modo, para gerar vacinas em seres humanos e animais. São inseridas sequências alvo na cassete de um MVS para expressão de epítopos de proteínas para mediar a imunização protectora. Por exemplo, são usadas as regiões constantes das proteínas do vírus de SIDA, GP 120, GP 160 e GP 41 e para a imunidade GP 24 mediada pelas células, são usadas as proteínas superficiais do vírus da Hepatite A, B e C, do vírus respiratório incluindo o da gripe e dos rotovírus gastrointestinais. 0 MVS é depois injectado no ser humano ou animal.

Todas as patentes e publicações mencionadas na memória são indicadoras dos níveis para os peritos na matéria aos quais a invenção diz respeito. Todas as patentes e publicações são aqui incorporadas por referência na mesma medida em que se cada publicação individual fosse específica e individualmente indicada que era incorporada por referência.

Um perito na matéria verificará facilmente que a presente invenção está bem adaptada para levar a cabo os objectos e obter as finalidades e vantagens mencionadas bem como as inerentes à mesma. Os sistemas de vectores de expressão miogénica juntamente com os métodos, processos de tratamento e vacinações aqui descritas são presentemente representativos das formas de realização preferidas como exemplos e não pretendem constituir limitações ao âmbito da invenção. Alterações à mesma e outros usos serão evidentes para qualquer perito na matéria, desde que estejam dentro do espírito da invenção ou definido pelo âmbito das reivindicações.

LISTA DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL:

(i) REQUERENTE: Schwartz, Robert J.

De Mayo, Franco O'Malley, Bert W.

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Sistemas de Vectores de Expressão Miogénica (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) MORADA: Thomas D. Paul (B) RUA: 1301 McKinney, Suite 5100 (C) CIDADE: Houston (D) ESTADO: Texas (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) ZIP: 77010-3095 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (d) SOFTWARE: Patentln Release #1.0,

Versão #1.25 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO:

(A) MATRÍCULA DE APLICAÇÃO: US

(Β) DATA DO DEPÓSITO:

(C) CLASSIFICAÇÃO:

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O ADVOGADO/AGENTE:

(A) NOME:

Paul, Thonas D.

(B) NÚMERO DO REGISTO:

32.714 (C) NÚMERO DA REFERÊNCIA/PROCESSO: D-5379 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES:

(A) TELEFONE: 713/651-5325 (B) TELEFAX: 713/651-5246 (C) TELEX: 762829 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID N^s 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 275 pares base (B) TIPO:

ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: isolado (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN (iii) HIPOTÉTICO: Não (iv) PREJUDICIAL AOS SENTIDOS: Não

Claims

REIVINDICAÇÕES:

la. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS) para a expressão de uma sequência de ácido nucleico em tecido miogénico, compreendendo um promotor; uma cassete cuja extremidade 5' está ligada à extremidade 3' do promotor contendo uma sequência de ácido nucleico que se pretende seja expressada; uma região 3' não traduzida (3'UTR) específica miogénica e uma região não codificante (NCR) contígua à extremidade 3' da 3' UTR, contendo a referida NCR um sinal de fim de transcrição, caracterizado pelo [ S facto de a extremidade 5 da região 3' UTR ser ligada a extremidade 3' da cassete.
2a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda uma sequência lider 5' mARN inserida entre o promotor e a cassete, caracterizado pelo facto de a extremidade 5 da mencionada sequência lider ser ligada ao promotor e a extremidade 3^V ser ligada à cassete.
3a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), para a expressão de uma sequência de ácido nucleico compreendo uma unidade funcional que expressa a sequência de ácido nucleico, caracterizado pelo facto de a unidade funcional ser constituída por elementos 5' a 3' todos sequencialmente ligados entre si e os referidos elementos incluírem o promotor; uma sequência 5' mARN líder; um primeiro intrão; um sítio de iniciação ATG e de clonação

Ncol; uma cassete que tem um sítio EcoR' na sua extremidade 3' e contêm a sequência de ácido nucleico a ser expressada; uma região não traduzida 3'(3'UTR) específica miogénica e uma região não codificante (NCR) contígua à extremidade 3' da 3' UTR contendo a citada NCR um sinal de fim de transcrição.
4a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o promotor ser miogénico especifico.
5a . Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a sequência lider ser miogénica especifica.
6a . Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o promotor ser escolhido do grupo que consiste em promotor do gene da alfa-activa do esqueleto, promotor 1 da cadeia leve da miosina rapida, promotor da cadeia pesada da miosina, promotor da tropinina T, reforçador/promotor da criatinina quinase dos músculos, sub-unidades receptoras de acetilcolina, promotor de citomegalo vírus, promotor de RSV e LTR de víruis do Sarcoma de Rous.
7a . Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de o promotor do gene da alfa-activa do esqueleto.
8a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de as regiões 3'UTR e NCR serem escolhidas do grupo que consiste em gene da alfa do esqueleto, gene 1 de cadeia leve de miosina rápida, gene de cadeia pesada de miosina, gene de tropinina T e gene de criatinina quinase do músculo.
9a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de as regiões 3UTR e NCR serem do gene de alfa activa de esqueleto.
10a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de compreender ainda um sistema regulador para regular a expressão da sequência de ácido nucleico.
11a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de pelo menos um dos factores de resposta do soro na região promotora ser uma quimera que tem o seu domínio de ligação de ADN substituído por uma sequência de ADN de receptor.
12a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 11, caracterizado pelo facto de de o sítio de ligação do receptor ser escolhido da família de receptores que consiste em vitaminas, esteróides, tiróide, orfano, hormonas, ácido retenóico e tiroxina.
13a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 11, caracterizado pelo facto de o sítio de ligação do receptor ser um receptor de vitamina D.
14a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de a sequência do ácido nucleico expressada codificar um polipéptido.
15a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar o polipéptido escolhido do grupo que consiste em uma hormona, factor de crescimento, enzima, apolipoproteina, factor de coagulação, supressor de tumores, proteína de vírus, proteina superficial de bactérias e proteina superficial de células de parasitas.
16a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar factor I de crescimento, semelhante a insulina, factor II de crescimento semelhante a insulina ou proteína de ligação de factor de crescimento de insulina.
17a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar hormona de libertação da hormona do crescimento.
18a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar apolipoproteína A-I.
19a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar factor I de crescimento semelhante a insulina, factor II de crescimento semelhante a insulina ou proteína de ligação de factor de crescimento da insulina.
20a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar hormona de libertação da hormona de crescimento.
21a. Sistema de vectores de expressão miogénica (MVS), de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico expressada codificar apoliproteina A-I.
22a. Composição farmacêutica apropriada para introduzir um fornecimento contínuo de polipéptido num organismo de um ser humano ou de um animal ou em culturas de tecidos mediante injecção no músculo ligado ao esqueleto, contendo MVS de acordo com as reivindicações 1 ou 3 conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
23a. Composição farmacêutica apropriada para introduzir um fornecimento regulado de polipéptido no organismo dum ser humano ou animal ou cultura de tecidos mediante injecção em músculo do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 10, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
24a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de atrofia muscular em seres humanos idosos mediante injecção no respestivo musculo do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 16, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
25a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de atrofia muscular em seres humanos idosos mediante injecção no respectivo musculo de esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 19, conjuntalente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
26a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de atrofia muscular em seres humanos idosos mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 17, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
27a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de atrofia muscular em seres humanos idosos mediante injecção no respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 20, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
28a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de atrofia muscular provocada por lesões da espinal medula ou doenças neuromusculares em seres humanos mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 16, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
29a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de esclerose amiotrófica lateral em seres humanos mediante injecção no respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 16, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
30a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de atrofia muscular provocada por lesões da espinal medula ou doenças, neuromusculares em seres humanos, mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 19, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
31a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de esclerose amiotrófica lateral em seres humanos, mediante injecção no respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 19, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
32a. Composição farmacêutica apropriada para evitar ou tratar doenças cardiovasculares arterioescleróticas em seres humanos, mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 18, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
33a. Composição farmacêutica apropriada para evitar ou tratar doenças cardiovasculares arterioescleróticas em seres humanos, mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 21, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
34a. Composição farmacêutica apropriada para realizar a substituição de genes de um ser humano ou de um animal, mediante injecção nos respectivos musculos da esqueleto, contendo MVS de acordo com as reivindicações 1 ou 3, em que o ácido nucleico da cassete contém o gene para corrigir o defeito genético, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
35a. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo de a cassete conter uma sequência para codificar o gene pretendido escolhida do grupo que consiste em glicogénio fosforilase, alfa-l-antitripsina e distrofina.
36a. Composição farmacêutica apropriada para realizar a substituição de genes de um ser humano ou de um animal mediante injecção nos respectivos músculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 10, em que o ácido nucleico da cassete contém o gene para corrigir o defeito genético, conjuntamente com um agente veicular farmacologicamente aceitável.
37a. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo facto de a cassete conter uma sequência para codificar o gene pretendido escolhido do grupo que consiste em glicogénio fosforilase, alfa-1antitripsina e distrofina.
38a. Processo para a produção de vacinas, caracterizado pelo facto de compreender a operação que consiste em injectar uma quantidade efectiva de MVS de acordo com as reivindicações 1 ou 3, na massa muscular do esqueleto de um animal em que a sequência do ácido nucleico presente na cassete codifica um polipéptido capaz de desencadear uma resposta de anticorpos.
39a. Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico codificar uma proteína da superfície das células de bactérias, uma proteina de virus e uma proteína de células de parasitas.
40a. Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo facto de o ácido nucleico e a sequência codificarem uma proteína de virus da SIDA.
41a. Processo para a produção de vacinas, caracterizado pelo facto de compreender a operação que consiste em injectar uma quantidade efectiva do MVS de acordo com a reivindicação 10 na massa muscular do esqueleto de um animal em que a sequência do ácido nucleico da cassete codifica um polipéptido capaz de desencadear uma resposta de anticorpos.
42a. Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de sequência do ácido nucleico ser escolhida do grupo que codifica uma proteína da superfície de células de bactérias, uma protéina de virus e uma proteina de células de parasitas.
43a. Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de o ácido nucleico e a sequência codificarem uma proteína de vírus da SIDA.
44a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de doenças do crescimento em um ser humano ou um animal mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com as reivindicações 1 a 3, em que a sequência do acido nucleico da cassete contém a sequência da hormona de crescimento.
45a. Composição farmacêutica apropriada para o tratamento de doenças do crescimento em um ser humano ou um animal mediante injecção nos respectivos musculos do esqueleto, contendo MVS de acordo com a reivindicação 10, em que a sequência do ácido nucleico da cassete contém a sequência da hormona do crescimento.
46a. Sistema de vectores miogénicos regulável (MVS) para a expressão de sequência de ácido nucleico específica em tecido miogénico compreendendo uma primeira unidade funcional, cujos elementos compreendem um promotor miogénico específico; uma sequência de ácido nucleico que codifica um receptor; uma região 3' não traduzida específica miogénica (3' UTR) e uma região não codificante específica miogénica (NCR) em que os elementos da primeira unidade estão ligados em conjunto sequencialmente a partir da extremidade 5' com o promotor, seguidos pela sequência do ácido nucleico receptor, seguida pelas regiões 3' UTR e NCR contígua;

uma segundo unidade funcional cujos elementos compreendem um elemento de resposta que corresponde ao receptor; a sequência de ácido nucleico específica de interesse; uma região 3' UTR específica miogénica e uma região NCR miogénica contigua em que os elementos da segunda unidade estão ligados em conjunto sequencialmente a partir da extremidade 5' com o elemento de resposta seguido pelo promotor, seguido pela sequência específica seguida pelas regiões 3' UTR e NCR;

em que a primeira unidade expressa o receptor, formando o referido receptor uma interacção entre o elemento de resposta, o receptor e um agente que se liga ao receptor, regulando a mencionada interacção a expressão da sequência de interesse.
47a. Sistema de vectores de expressão miogénio, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de a primeira e a segunda unidades funcionais se encontrarem no mesmo vector.
48a. Sistema de vectores de expressão miogénica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de a primeira e a segunda unidades funcionais se encontrarem em vectores separados.
49a. Sistema de vectores de expressão miogénica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de o receptor ser escolhido da familia de receptores que consistem em vitaminas, esteróides, tiróide, orfano, hormonas, ácido retinóico e tiroxina.
50a. Sistema de vectores de expressão miogénica, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo facto de o receptor ser receptor de vitamina D, o elemento de resposta ser o elemento de resposta de vitamina D e o agente ser vitamina D.
51a. Sistema de vectores de expressão miogénica, de acordo com as reivindicações 1, 3 ou 46, caracterizado pelo facto de compreender ainda um revestimento que inclui um complexo de ADN de iniciação, em que o citado complexo de ADN de iniciação compreende um facto de resposta do soro (SRF), um factor de iniciação de transcrição (TIF) e um factor de iniciação da transcrição (TRF), em que o SRF está ligado ao elemento de resposta do soro dentro do promotor, o TIF e o TRF interactuam com o SRF e a caixa TATA dentro do promotor para formar um complexo estável; e histonas, sendo as referidas histonas ligadas não especificamente ligadas ao restante ADN no mencionado MVS.
52a. Composição farmacêutica para introduzir um polipéptido no organismo dum ser humano ou de um animal ou numa cultura de tecidos, mediante injecção nos músculos do esqueleto, contendo MVS revestido de acordo com a reivindicação 51 conjuntamente com uma substância veicular farmacologicamente aceitável.
53a. Composição farmacêutica para o tratamento de uma doença em seres humanos ou animais por injecção nos respectivos músculos do esqueleto, contendo MVS revestido de acordo com a reivindicação 51, conjuntamente com uma substância veicular farmacologicamente aceitável.
54a. Composição farmacêutica para realizar a substituição de genes em seres humanos ou animais mediante injecção nos respectivos músculos do esqueleto contendo MSV de acordo com a reivindicação 51, em que a cassete contém a sequência genética para corrigir o efeito genético.
55a. Processo para a produção de vacina num animal, caracterizado pelo facto de compreender a operação que consiste em injectar uma quantidade efectiva de MVS revestido de acordo com a reivindicação 51, nos músculos do esqueleto desse animal, em que a cassete inclui a sequência que codifica um polipéptido capaz de desencadear uma resposta de anticorpos.
56a. Composição farmacêutica para o tratamento de atrofia muscular mediante injecção nos músculos do esqueleto, contendo MVS revestido de acordo com a reivindicação 51, conjuntamente com uma substância veicular farmacologicamente aceitável.
57a. Sistema de vector miogénico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de compreender um revestimento que inclui um complexo de ADN de iniciação que compreende um factor de resposta do soro (SRF), factor de iniciação de transcrição (TIF) e factor transregulatório (TRF) em que o SRF está ligado ao elemento de resposta do soro dentro do promotor, o TIF e o TRF interactuam com o SRF e a caixa de TATA dentro do promotor para formar um complexo estável; e histonas, sendo as citadas histonas ligadas não especif icamente gadas com o ADN restante no referido MVS.
58a. Sistema de vector miogénio (MVS) de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de compreender um revestimento que inclui um complexo de ADN de iniciação que compreende um factor de resposta do soro (SRF), um factor de iniciação (TIF) e um factor trans-regulatório (TRF) em que o SRF está ligado ao elemento de resposta do soro dentro do promotor, O TIF e o TRF interactuam com o SRF e a caixa de TATA dentro do promotor para formar um complexo estável; e histonas ligadas não especificamente com o restante ADN no mencionado MVS.
59a. Sistema de vector miogénico (MVS) para a expressão duma sequência de ácido nucleico em tecido miogénico compreendendo um oligonucleótido 5' que inclui um promotor; .

um oligonucleótido 3' que contém uma região 3' não traduzida (3' UTR) e uma região não codificante (NCR) contigua à extremidade 3' da região 3' UTR, contendo a citada região NCR um sinal de acabamento da transcrição; e um ligador que tem uma pluralidade de sítios de endonucleases de restrição, ligando o referido ligador o oligonucleótido 5' com o oligonucleótido 3' e proporcionando, além disso, uma posição para a inserção de uma cassete que contém o ácido nucleico a ser expressado.
60a. Sistema de vector miogénio (MVS) de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo facto de o oligonucleótido incluindo uma sequência lider.
61a. Sistema de vector miogénico (MVS), de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de a sequência de ácido nucleico a ser expressada ser heteróloga em relação às regiões 3' UTR e NCR no MVS.
62a. Processo para a obtenção de células recombinantes, caracterizado pelo facto de se inserir o vector de acordo com as reivindicações 1, 3, 10 ou 59.
63a. Vacina que compreende um vector de acordo com as reivindicações 1, 3, 10 ou 59, caracterizada pelo facto de o ácido nucleico da cassete codificar uma proteína do gene de imunoglobulina.
64a. Composição farmacêutica compreendendo um vector miogénico de acordo com as reivindicações 1, 3, 10 ou 59 e uma substancia veicular farmacologicamente aceitável.
65a. Composição para aumentar a produção de leite em animais produtores de leite, contendo um vector miogénico de acordo com as reivindicações 1, 3, 10 ou 59, em que o ácido nucleico da mencionada cassete codifica hormona de crescimento, conjuntamente com uma substância veicular farmacologicamente aceitável.
66a. Composição para aumentar a produção de carne em animais produtores de carne, contendo um vector miogénico de acordo com as reivindicações 1, 3, 10 ou 59, em que o ácido nucleico da citada cassete codifica hormona de crescimento.