PT1480669E

PT1480669E - Utilização da variante de splicing do factor de crescimento semelhante a insulina i, mgf, para a prevenção de danos no miocárdio

Info

Publication number: PT1480669E
Application number: PT37373784T
Authority: PT
Inventors: Geoffrey Goldspink; Paul Goldspink
Original assignee: Univ London; Univ Illinois
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2003-02-06
Publication date: 2013-05-22
Also published as: GB0202906D0; US20080039390A1; US20180271942A1; DK1480669T3; US9919031B2; ES2432082T3; JP2005516997A; WO2003066082A1; US20130210723A1; EP1480669B1; AU2003244511A1; EP1480669A1; US20050048028A1

Description

ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Utilização da variante de splicing do factor de crescimento semelhante a insulina I, MGF, para a prevenção de danos no miocárdio"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de polipéptidos derivados da sequência da variante de splicing de IGF-I, MGF, e de polinucleótidos que codificam esses polipéptidos, na prevenção de danos no miocárdio após um ataque cardiaco. ANTERIORIDADE DA INVENÇÃO Doença isquémica cardíaca A isquemia ocorre quando uma artéria que fornece sanque oxigenado a um músculo ou outro órgão fica obstruída. Isto diminui a capacidade do órgão afectado funcionar e pode envolver morte celular na área em que o fornecimento de sangue é reduzido. A doença isquémica cardíaca é uma importante causa de morte. Mesmo nos pacientes que sobrevivem a um ataque cardíaco, as perspectivas de um estilo de vida activo são severamente reduzidas devido à perda de músculo cardíaco. O músculo cardiaco, como o músculo esquelético e o sistema nervoso central, é um tecido pós-mitótico. Como não há virtualmente substituição de células ao longo da via, tem que haver um mecanismo de reparação local contínuo eficaz. Os danos locais físicos e por radicais livres ocorrem mesmo em tecidos saudáveis e têm que ser reparados; de outro modo a célula sofre morte celular que resulta num défice funcional permanente.

No coração, a isquemia pode resultar de uma obstrução das artérias coronárias. Isto faz com que os cardiomiócitos em certas áreas fiquem privados de sangue, e portanto de oxigénio. Começam então a morrer. Isto significa um esforço mecânico acrescido para os miocardiócitos sobreviventes na área que sofre os danos, o que leva também a morte celular. Assim, a morte celular ocorre tanto em resultado da privação 2 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ de oxigénio como em resultado de esforço mecânico indevido. A região de morte celular, ou necrose, é conhecida como um enfarte.

A variante de splicing de IGF-I, MGF

Os polipéptidos de IGF-I de mamífero têm várias isoformas, que surgem em resultado de splicing alternativo do ARNm. No geral, existem dois tipos de isoformas, isoformas do tipo hepático e do tipo não hepático. As isoformas do tipo hepático podem ser expressas no fígado ou em outros locais mas, se expressas em outros locais, são equivalentes às que são expressas no fígado. Têm uma acção sistémica e são as principais isoformas nos mamíferos. As isoformas do tipo não hepático são menos comuns e crê-se que algumas têm uma acção autócrina/parácrina. A isoforma MGF da invenção é deste último tipo. A terminologia para as variantes de splicing de IGF-I é baseada nas isoformas hepáticas (Chew et ai, 1995) e não evoluiu completamente para ter em conta as que são produzidas por tecidos não hepáticos. Estas últimas são controladas em alguma extensão por um promotor diferente (promotor 1) das isoformas hepáticas de IGF-I, que respondem a hormonas e estão sob o controlo do promotor 2.

No músculo esquelético humano, clonámos o ADNc de três variantes de splicing de IGF-I. Com referência à Figura 1, os exões 1 e 2 são exões de comando alternativos com locais de início da transcrição distintos que sofrem splicing diferencial no exão 3 comum. Os exões 3 e 4 codificam para o péptido de IGF-I maduro (domínios B, C, A e D) assim como para os primeiros 16 aminoácidos do domínio E. Os exões 5 e 6 codificam, cada um, uma parte alternativa de um péptido de extensão distinto, o dominio E. Este é seguido pelos codões de terminação do precursor de IGF-I, regiões não traduzidas a 3' e locais de sinalização de adição de poli(A).

No músculo esquelético, o ARNm de uma das três variantes de splicing de IGF-I do músculo foi apenas detectável em músculo exercitado e/ou em danificado (estirado e/ou electricamente estimulado), e a sua expressão está relacionada com o nível de actividade do músculo. Denominámo-la Factor de Crescimento Mecânico (MGF, do inglês Mechano Growth Factor). 0 3 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ ARNm de MGF não é detectado em músculo esquelético distrófico mesmo quando este é sujeito a estiramento. O MGF (Figura 1; Yang et al, 1996; McKoy et al, 1999) possui os exões 4, 5 e 6 enquanto o IGF-I do tipo hepático expresso no músculo possui os exões 4 e 6. As outras duas variantes de splicing encontradas no músculo humano têm sequências similares ao tipo hepático sistémico do IGF-I. Notavelmente, o MGF humano possui uma inserção de 49 pares de bases (dominio E) que altera o seu quadro de leitura na extremidade carboxi. Já identificámos o MGF para o tratamento de desordens do músculo esquelético, nomeadamente distrofia muscular (W097/33997; Patente US 6,221,842; Yang et al, 1996; McKoy et al, 1999), para o tratamento de desordens neurológicas (WOOl/136483) e para reparação de nervos (WOOl/85781).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O papel de L.IGF-I e MGF no músculo cardíaco A farmacologia da regulação local da expressão de genes, incluindo as vias de sinalização através das quais as células respondem a estímulos mecânicos, representa uma nova e importante área de estudo. Factores mecânicos (tanto extrínsecos como intrínsecos) estão envolvidos no "ligar" da expressão génica e na regulação de processos de transcrição e de tradução nos miócitos cardíacos. Alterações em estímulos mecânicos podem provocar crescimento aumentado do músculo cardíaco (hipertrofia cardíaca) , que é inicialmente uma resposta adaptativa ao aumento do débito cardíaco. Contudo, sob certas condições, pode ocorrer uma transição para hipertrofia patológica em que há um aumento da massa do miocárdio mas uma diminuição do desempenho cardíaco. As células dos ventrículos revertem para expressão das isoformas embrionárias dos genes contrácteis, o que resulta numa utilização mais rápida da energia. Para ainda mais exacerbar o problema, outras formas de lesão do miocárdio que podem ocorrer com frequência resultam em morte celular (apoptose) de miócitos resultando na perda de miócitos em funcionamento. Os miócitos saudáveis remanescentes geralmente aumentam de tamanho de modo a manter o débito cardíaco. Isto novamente 4 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ conduz a um estado hipertrófico e pode também desenvolver-se até ao ponto em que se torna uma condição patológica.

Existem evidências da importância do IGF-I do tipo hepático (L.IGF-I), sistémico, como regulador do crescimento do miocárdio e um protector contra a morte celular do miocárdio. Foi reportada uma melhoria significativa na função cardíaca após administração de hormona do crescimento (GH) em modelos animais de cardiomiopatia e em ensaios clínicos (Thuesen et al, 1998; Fazioet al, 1996) . A hormona do crescimento induz a expressão dos factores de crescimento semelhantes a insulina sistémicos através da sua acção sobre o fígado. Buerke et al (1995) reportaram que a administração de L.IGF-I recombinante após isquemia transiente do miocárdio em ratos reduziu a morte celular e a membrana celular foi reduzida como indicado por depuração de CK. Utilizando o anticorpo para IGF-I genérico, Matthews et al (1999) mostraram que o L.IGF-I foi supra-regulado na região do enfarte. A administração de hormona do crescimento e IGF-I do tipo hepático recombinante em ensaios clínicos também mostrou ter efeitos benéficos sobre o débito cardíaco em casos cardíacos terminais (Gluckman, W092/11865). Contudo, todos estes trabalhos envolveram explicitamente IGF-I recombinante do tipo hepático ou sistémico, ou não reconheceram a existência de múltiplas isoformas de IGF-I. Nenhum deles identificou a isoforma MGF.

Evidências relativas ao MGF no músculo cardíaco, em oposição a L.IGF-I, foram até ao presente muito pouco desenvolvidas. Utilizando RT-PCR, Skarli et al (1998) verificaram que o MGF era expresso em músculo cardíaco de coelho, 24 horas após um breve pinçamento da aorta enquanto apenas L.IGF estava presente no coração em repouso e concluíram que o transcrito de MGF foi traduzido e produzido pelo músculo cardíaco em resposta a sinais mecânicos. Juntamente com distrofia muscular e outras desordens do músculo esquelético, W097/3397 (Patente US 6,221,842) também menciona a possibilidade de prevenção de desordens cardíacas, doenças em que a promoção da síntese de proteínas no músculo cardíaco é um tratamento benéfico, cardiomiopatias, insuficiência cardíaca aguda ou insulto agudo incluindo miocardite ou enfarte do miocárdio, e melhoria do débito 5 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ cardíaco por aumento do coração/volume; mas não proporciona verificações experimentais que liguem o MGF ao músculo cardíaco, em oposição ao esquelético.

Aqui, mostramos que o MGF é fortemente expresso na área enfartada após isquemia no coração de rato e de ovelha. Ao contrário da situação do L.IGF-I, também mostrámos que a expressão do MGF coincide com o estágio de recuperação imediata após sobrecarga mecânica e isquemia transiente. A expressão de MGF é portanto mais rápida do que a expressão de L-IGF-I. Também mostrámos que a expressão de MGF é induzida em miócitos cardíacos que sofrem apoptose, que a transfecção estável da linha celular do tipo cardíaco H9C2 com MGF previne a apoptose e obtivemos evidências de que o MGF induz um fenótipo hipertrófico em miócitos in vitro.

Adicionalmente, mostrámos que a expressão prolongada de MGF em miócitos cardíacos está associada à supressão de proteínas de filamentos grossos de miofilamentos mas não de proteínas de filamentos finos. Isto actua para desdiferenciar o miócito. Concluímos que a expressão de MGF resulta na remodelação da região enfartada, i.e. que desdiferenciando o miócito, o MGF facilita o processo de reparação.

Verificámos que o domínio E (parte do exão 4) é importante no músculo cardíaco para a reparação local de tecido, embora isto não pareça envolver activação de células estaminais pois não se crê que o músculo cardíaco possua células estaminais. Os nossos dados sugerem portanto não apenas que a inserção do domínio E no MGF altera o quadro de leitura da extremidade C-terminal do péptido relativamente ao de L.IGF-I como também que o domínio E pode ter uma função separada na reparação celular de cardiomiócitos.

As nossas verificações aqui mostram que o MGF é activado em resposta a danos no tecido cardíaco e possui uma função de reparação no coração isquémico e/ou sobrecarregado. Por sua vez, isto mostra que, em adição a utilidades anteriormente notadas, pode ser utilizado para proteger contra danos de apoptose no miocárdio em resposta a isquemia/sobrecarga. A este respeito, existem dois aspectos do processo de reparação cardíaca, nomeadamente a prevenção de apoptose e a hipertrofia 6 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ dos cardiomiócitos sobreviventes nas regiões danificadas para compensar a perda de células de músculo cardíaco. A rápida administração de um polipéptido de MGF após um ataque cardíaco é particularmente desejável, e um tratamento a mais longo prazo pode também ser efectuado, especialmente por entrega de um polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF para manter os níveis de MGF no músculo cardiaco após a administração inicial do polipéptido.

Deste modo, a invenção proporciona: um polipéptido de Factor de Crescimento Mecânico (MGF) ou um polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF, para utilização na prevenção ou limitação de danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco, por prevenção ou limitação da apoptose no miocárdio; um produto compreendendo um polipéptido de MGF e um polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF, para utilização simultânea, separada ou sequencial na prevenção de danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco; e utilização de um polipéptido de Factor de Crescimento Mecânico (MGF) ou de um polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF no fabrico de um medicamento para a prevenção ou limitação de danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco, por prevenção ou limitação da apoptose no miocárdio.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Splicing alternativo do gene de IGF-I

Esta Figura mostra a sequência de exões das variantes de splicing de IGF-I expressas em músculo esquelético humano. Duas delas possuem sequências similares aos IGF-I sistémicos produzidos pelo fígado. O transcrito de MGF humano possui uma inserção de 49 bases (52 bases no rato e no coelho) no domínio E que altera o quadro de leitura, e portanto a extremidade C-terminal do péptido difere da das outras variantes de splicing. É também mostrada a expressão do IGF-I sistémico (A) e do MGF (B) no coração de ovelha isquémico. No caso do MGF a expressão é mais rápida e é observada quando o intervalo entre 7 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ a indução do enfarte e a colheita das amostras cardíacas é relativamente muito curto como em E3 em B.

Figura 2: Indução de expressão de MGF em corações com constrição aórtica

Grupos de ratinhos (3) receberam constrição durante 7 dias após os quais a expressão de MGF foi avaliada utilizando RT-PCR em tempo real quantitativa no ARN total extraído do coração. A. Resultados da reacção RT-PCR em géis de agarose para MGF e IGF. B. Quantificação da expressão génica após RT-PCR em tempo real, de MGF, IGF, ANF e Bax.

Figura 3: Indução dos genes marcadores hipertróficos com

sobre-expressão de MGF

Nas culturas primárias de miócitos cardíacos transfectados com o plasmídeo de MGF (NT-GFP) houve um aumento significativo na expressão de ANF e de bMHC comparativamente com as outras condições. Estes dados mostram que a expressão de MGF é suficiente para induzir um fenótipo hipertrófico in vitro.

Figura 4: Indução da expressão de MGF em resposta a MPA em miócitos cardíacos

Culturas primárias de miócitos cardíacos foram cultivadas em meios isento de soro durante 24 horas antes da adição de PMA (200 nM). Após 30 min, extraiu-se o ARN total e avaliou-se a expressão do gene de MGF utilizando RT-PCR em tempo real. A. A expressão de MGF é significativamente aumentada após tratamento com PMA, enquanto a expressão de IGF não se altera. B. Uma repetição da experiência inicial mas no terceiro grupo foi adicionado PMA às culturas sem troca dos meios. A expressão de MGF é aumentada em maior extensão do que quando é adicionado PMA com meios frescos.

Figura 5: Expressão de MGF em miócitos cardíacos sob condições apoptóticas

Cultivaram-se miócitos cardíacos em meios isentos de soro durante 24 horas antes da adição de sorbitol 0,3M. Extraiu-se o ARN total após 4 horas e 24 horas de tratamentos. A. A análise da expressão génica foi realizada utilizando RT-PCR em tempo real para MGF, IGF, o marcador anti-apoptose Bcl2 e o 8 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ marcador de apoptose Bax. B. Extraiu-se o ADN das mesmas células e submeteu-se a electroforese para determinar a extensão da fragmentação. A fragmentação do ADN pode ser observada (seta), nas células tratadas com sorbitol durante 24 horas indicando que tinha ocorrido apoptose nesses miócitos.

Figura 6: Indução de apoptose na linha de células cardiacas transfectadas com MGF e L.IGF Células foram estavelmente transfectadas com ADNc que codifica MGF e L.IGF-I e foram seleccionadas por resistência a antibiótico utilizando técnicas padrão. Uma vez identificados os clones, estes foram isolados e expandidos na forma de linhas de células separadas. Células de controlo, que não tinham sido transfectadas, mais clones estáveis de MGF e L.IGF-I, foram plaqueados e tratados durante 24 horas com Sorbitol 0,3M. Após o tratamento, extraiu-se o ADN e submeteu-se a electroforese (agarose a 1%) para determinar se tinha ocorrido fragmentação do ADN. As Pistas 1 e 5 são marcadores de ADN (100 pb e lkB respectivamente) . A Pista 2 são células H9C2 de controlo após 24 horas com sorbitol. A Pista 3 são células H9C2 transfectadas com MGF após 24 horas com sorbitol. A Pista 4 são células H9C2 transfectadas com IGF após 24 horas com sorbitol. Pode-se ver claramente que ocorre fragmentação de ADN nas células de controlo que estão a sofrer apoptose, enquanto as células que sobre-expressam os genes de MGF ou de L.IGF-I não sofrem apoptose.

Figura 7: Sequência de ADNc e de aminoácidos de MGF humano, mostrando a sua estrutura de exões.

Figura S: Sequência de ADNc e de aminoácidos de MGF de rato, mostrando a sua estrutura de exões.

Figura 9: Sequência de ADNc e de aminoácidos de MGF de coelho, mostrando a sua estrutura de exões.

Figura 10: Sequência de ADNc e de aminoácidos de L.IGF-I humano, mostrando a sua estrutura de exões.

Figura 11: Sequência de ADNc e de aminoácidos de L-IGF-I de rato, mostrando a sua estrutura de exões. 9 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Figura 12: Sequência de ADNc e de aminoácidos de L-IGF-I de coelho, mostrando a sua estrutura de exões.

Figura 13: Alinhamento de sequências, ilustrando a estrutura de exões de MGF e L-IGF-I humanos, de rato e de coelho, e salientando as similaridades e as diferenças.

Figura 14: Miócitos cardíacos infectados com vírus de MGF e de IGF durante 24h. A. Localização de MGF no núcleo. B. Presença de L-IGF no núcleo mas também em todo o citoplasma.

Figura 15: Miócitos cardíacos infectados com vírus de MGF e de IGF e contrastados com DAPI

Topo esquerdo. Vírus de IGF-GFP. Topo direito. 0 mesmo com coloração com DAPI. Fundo esquerdo. Vírus de MGF-GFP. Fundo direito. 0 mesmo com coloração com DAPI.

Figura 16: Miócitos cardíacos infectados durante 48 h com o vírus que expressa MGF e GFP de controlo

As células foram contrastadas com faloidina e DAPI para visualizar os miofilamentos. A. Miócito de controlo mais coloração com DAPI. B. Miócito infectado com vírus de GFP. C. Miócito infectado com vírus de MGF mais coloração com DAPI. D. Miócito infectado com vírus de MGF.

Figura 17: Análise da expressão de filamentos grossos e finos com RT-PCR após 48h de infecção com vírus de MGF em miócitos cardíacos

Três painéis superiores: proteínas de filamentos grossos. Três painéis inferiores: proteínas de filamentos finos.

Figura 18: Análise quantitativa da expressão de cxMHC em miócitos cardíacos após 48h de infecção com vírus de MGF. 10 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Figura 19: Percentagem média de área de fibra muscular danificada em regeneração em relação à secção do músculo completo em dois modelos de danos A. Percentagem de área danificada/regenerada relativamente à massa muscular. B. Percentagem de área corada com MyHC embrionária. Linha com pontos de losangos: bupivacaína; linha com pontos de guadrados: estiramento/estimulação.

Figura 20: Niveis de ARNm das isoformas MGF e IGF-IEa em dois modelos de danos musculares A. niveis de ARNm de MGF em picogramas por micrograma de ARN total. B. niveis de ARNm de IGF-IEa em picogramas por micrograma de ARN total. Linha com pontos de losangos: bupivacaína; linha com pontos de quadrados estiramento/estimulação. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipéptidos e polinucleótidos de MGF Polipéptidos Anterioridade 0 MGF representa o factor de crescimento mecânico (cf. McKoy et al, 1999). Como discutido acima, o MGF é uma variante de splicing alternativo de IGF-I. 0 IGF-1 do tipo hepático (L.IGF-I) compreende aminoácidos codificados pelos exões 4 e 6 enquanto o MGF compreende aminoácidos codificados pelos exões 4, 5 e 6. 0 MGF também possui um quadro de leitura alterado no seu terminal carboxi em resultado de uma inserção de 49 (humano) ou 52 (rato, coelho) pb no exão 5, e é menor porque não é glicosilado. Chew et al (1995) e Yang et al (1996) não utilizaram o termo MGF, mas sim IGF-I Ec, para definir a variante de splicing 4-5-6. A isoforma muscular que possui o domínio Ec é hoje conhecida por MGF (cf McKoy et al, 1999; WOOl/136483; WOOl/85781).

Propriedades estruturais de polipéptidos de MGF da invenção

Aqui, um polipéptido de MGF é entendido como sendo qualquer polipéptido de IGF-I possuindo a estrutura de exões 4-5-6 ou derivado de um polipéptido de IGF-I com a estrutura de exões 4-5-6 e uma ou mais das propriedades funcionais do 11 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ MGF aqui descritas ou já identificadas pelos inventores, e.g. como em W097/33997 e/ou WOOl/136483 e/ou WOOl/85781. A estrutura de exões de MGF no ser humano, no rato e no coelho está ilustrada na Figuras 7, 8 e 9 (SEQ ID NO: 1/2, 3/4 e 5/6). Para comparação, a estrutura de exões de L.IGF-I humano, de rato e de coelho é apresentada nas Figuras 10, 11 e 12 (SEQ ID NO: 9/10, 11/12 e 13/14), e é feita uma comparação entre MGF e L.IGF-I na Figura 13.

Preferivelmente, os polipéptidos de MGF da invenção terão o quadro de leitura que, no MGF nativo, é gerado pela inserção de 49/52 pb acima mencionada. Preferivelmente, os polipéptidos de MGF da invenção não estarão glicosilados. Contudo, podem estar glicosilados ou parcialmente glicosilados em algumas concretizações. Parcialmente glicosilado significa até 10, 20, 30, 50, 70, 80, 90, 95 ou 99% da glicosilação do L.IGF-I, e.g. contendo alguns, mas não todos, os locais de glicosilação do L.IGF-I. O padrão de glicosilação pode ser o mesmo que o de L.IGF-I em termos do tipo e localização de açúcares ou pode ser diferente.

Preferivelmente, os polipéptidos de MGF da invenção compreendem sequências codificadas pelos exões 3, 4, 5 e 6 ou sequências equivalentes. Opcionalmente, podem incluir os exões 1 e/ou 2, ou também sequências equivalentes. Contudo, podem também ser mais curtos, e.g. compreendendo apenas sequências codificadas pelos exões 5 e 6 ou pelos exões 4, 5 e 6.

Os polipéptidos de MGF da invenção podem ter a sua origem em qualquer espécie que possua o IGF-I com splicing 4-5-6. Assim, um polipéptido de MGF da invenção pode ter a sequência de MGF humano ou representar uma forma truncada de MGF humano. Estes polipéptidos de MGF humano são geralmente preferidos. Os polipéptidos de MGF possuindo a sequência de um MGF animal podem também ser utilizados, e.g. MGF de rato, coelho, ratinho, vaca, ovelha, cabra, galinha, cão, gato. Preferivelmente, a espécie de origem do polipéptido de MGF utilizado será correspondente à espécie do indivíduo a tratar. Em particular, prefere-se utilizar polipéptidos de MGF humano para tratar pacientes humanos. 12 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

As sequências de exões 3, 4, 5 e 6 de MGF humano (IGF-I-Ec) (SEQ ID NO: 1/2, Figura 7), MGF de rato (SEQ ID NO: 3/4, Figura 8) e MGF de coelho (IGF-I Eb) (SEQ ID NO: 5/6, Figura 9) são apresentadas adiante, juntamente com as suas correspondentes sequências de ADNc. As SEQ ID NO: 1, 3 e 5 são os ADNc; as SEQ ID NO: 2, 4 e 6 são os polipéptidos. Para comparação, as sequências de exões 3, 4 e 6 de IGF-I do tipo hepático (L.IGF-I) humano (SEQ ID NO: 9/10, Figura 10), de rato (SEQ ID NO: 11/12, Figura 11) e de coelho (SEQ ID NO: 13/14, Figura 12) estão também apresentadas (veja-se a Figura 13 em particular para comparação) . Os polipéptidos possuindo as sequências de SEQ ID NO: 2, 4 e 6 podem ser utilizadas em concretizações preferidas da invenção.

Propriedades funcionais de polipéptidos de MGF da invenção

Aqui, os polipéptidos de MGF podem ter as propriedades funcionais identificadas pelos Inventores em W097/33997. Em particular, podem ter a capacidade de induzir o crescimento de tecido de músculo esquelético. Similarmente, como aqui discutido, podem ter a capacidade de supra-regular a síntese de proteínas necessárias para a reparação do músculo esquelético e/ou para activar células satélite (estaminais) no músculo esquelético. Alternativa ou adicionalmente, os polipéptidos de MGF da invenção podem ter as propriedades neurológicas previamente identificadas pelos Inventores em WOOl/136483. Assim, podem ter a capacidade de efectuar o resgate de neurónios motores. Em particular, podem ser capazes de reduzir a perda de neurónios motores após avulsão de nervos até 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 ou 100% num indivíduo tratado, em comparação com uma situação equivalente num indivíduo não tratado. Prefere-se a redução da perda de neurónios motores em 70% ou mais, ou 80% ou mais (i.e. até 30% ou menos ou 20% ou menos) . O grau do resgate pode ser calculado utilizando qualquer técnica adequada, e.g. uma técnica conhecida tal como estereologia. Como teste específico, podem-se utilizar as técnicas utilizadas em WOOl/136483, que assentam na medição do resgate de neurónios motores em resposta a avulsão de nervos faciais nos ratos.

Mais preferivelmente, um polipéptido de MGF da invenção terá a capacidade de prevenir ou limitar danos no miocárdio após isquemia ou sobrecarga mecânica através da prevenção da 13 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ morte celular, ou apoptose, das células musculares do miocárdio. Preferivelmente, um polipéptido de MGF da invenção terá a capacidade de prevenir completamente a apoptose na área do músculo cardíaco na qual é aplicado. Contudo, a apoptose pode também ser apenas parcialmente prevenida, i.e. ser limitada. Os danos são limitados se for conseguida qualquer redução dos danos em comparação com a que ocorreria sem um tratamento da invenção, e.g. se os danos são reduzidos em 1% ou mais, 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 50% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais, 98% ou mais, ou 99% ou mais, como medido pelo número ou proporção de células que morrem, ou pela dimensão da área de músculo que perde a função, ou pela capacidade global do coração bombear sangue.

Em particular, a redução de danos pode ser estimada in vivo por determinação do débito cardíaco, da fracção de ejecção, etc. utilizando métodos minimamente invasivos. Marcadores tais como creatina-quinase e troponina T no soro podem também ser testados. Estes são os parâmetros utilizados em situações clínicas para determinar a extensão dos danos no músculo cardíaco após lesão. A capacidade de prevenir a apoptose pode ser medida por qualquer técnica adequada. Por exemplo, com referência ao Exemplo 4 e às Figuras 3 e 6, ela pode ser medida pela capacidade de prevenir a apoptose numa célula do músculo cardíaco ou numa linha celular do tipo cardíaco, como indicado pela fragmentação do ADN. Isto pode ser determinado, em particular, numa linha celular do tipo cardíaco tal como H9C2 estavelmente transfectada com um vector que expressa o polipéptido de MGF. A capacidade de prevenir a apoptose, como indicado pela fragmentação do ADN, pode ser testada por tratamento das células com sorbitol ou outro agente que coloque as células sob stress osmótico durante até, e.g. 1, 2, 4, 6, 12, 24 ou 48 horas, preferivelmente 12 a 24 horas, mais preferivelmente 24 horas, e investigação se pode ser observado o padrão de fragmentação associado à apoptose. Um polipéptido de MGF da invenção expresso desta maneira irá tipicamente reduzir, preferivelmente eliminar, a fragmentação do ADN sob estas condições, em comparação com uma condição não transfectada ou simuladamente transfectada (vector mas sem a 14 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ sequência de codificação do MGF) após 6, 12 ou 24 horas de tratamento com sorbitol. A ausência de expressão, ou baixa expressão, de genes que actuam como marcadores para apoptose pode também actuar como uma indicação de prevenção de apoptose. Um marcador adequado é o gene Bax. Similarmente, a expressão aumentada de marcadores anti-apoptóticos em células transfectadas com MGF sob condições apoptóticas pode ser tomada como um sinal de que o polipéptido da invenção está a prevenir a apoptose. Um gene marcador anti-apoptótico adequado é o Bcl2. A capacidade de prevenir a apoptose pode também ser medida por referência à capacidade de um polipéptido de MGF prevenir uma redução no número de células em miócitos in vitro. Por exemplo, as células podem ser transfectadas com um vector que codifica o polipéptido de MGF, de maneira a este ser sobre-expresso. Depois, as contagens de células nas culturas transfectadas com MGF e de controlo podem ser comparadas ao longo do tempo sob condições apoptóticas. Preferivelmente, as células irão morrer menos rapidamente nas culturas transfectadas com MGF, deixando uma maior proporção do número original de células nestas culturas após, e.g. 24, 48 ou 72 horas. Por exemplo, até 5% ou mais, 10% ou mais, 20% ou mais ou 50% ou mais células podem permanecer nas culturas transf ectadas com MGF após 24, 48 ou 72 horas do que nas culturas de controlo.

Outra propriedade preferida dos polipéptidos de MGF da invenção é a capacidade de induzir um fenótipo hipertrófico em células do músculo cardíaco. Em particular, isto pode ser testado por determinação da capacidade de induzir um fenótipo hipertrófico em culturas primárias de miócitos cardíacos in vitro. Por exemplo, estas culturas podem ser transfectadas com um vector, e.g. um plasmídeo, que codifica o polipéptido de MGF de modo que o polipéptido da invenção é sobre-expresso, e é determinada a capacidade de induzir o fenótipo hipertrófico. Um método preferido para esta determinação consiste em testar um aumento na expressão de ANF (Factor Natriurético Auricular) e/ou bMHC (Cadeia Pesada da Miosina Beta) . O ANF é um gene marcador embrionário que é supra-regulado em condições 15 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ hipertróficas. Ο bMHC é uma importante proteína contráctil no músculo.

Os polipéptidos de MGF possuindo a sequência dos MGF de ocorrência natural são preferidos. Contudo, podem também ser utilizadas variantes de MGF possuindo as mesmas estrutura básica de exões 4-5-6 e propriedades.

Sequência de polinucleótidos da invenção

Os polipéptidos da invenção podem ser codificados por polinucleótidos como descrito adiante.

Em particular, um polipéptido da invenção pode compreender: (a) a sequência de MGF Humano (SEQ ID NO: 2), MGF de Rato (SEQ ID NO:4) ou MGF de Coelho (SEQ ID NO:6); (b) uma sequência possuindo 80% ou mais de identidade de aminoácidos com uma sequência de (a) ; ou (c) uma sequência compreendendo os aminoácidos codificados pelos exões 5 e 6, exões 4, 5 e 6, ou exões ou 3, 4, 5 e 6, do ADN de MGF humano, de rato ou de coelho de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5.

Variantes alélicas

Uma variante alélica será uma variante que ocorre naturalmente e que funcionará de uma maneira substancialmente similar à proteína de SEQ ID NO: 2, 4 ou 6 como definido acima. Similarmente, um homólogo de espécie da proteína será a proteína equivalente que ocorre naturalmente em outra espécie. Este homólogo pode ocorrer em qualquer espécie, preferivelmente uma espécie de mamífero, por exemplo uma espécie bovina, equina, ovina, felina ou canina; tal como vaca, cavalo, ovelha ou cabra, gato ou cão; ou numa espécie de roedor outra que não o rato (SEQ ID NO: 4) ou o coelho (SEQ ID NO: 6), ou numa espécie de primata outra que não o ser humano (SEQ ID NO: 2) . Os MGF que não de mamífero, por exemplo MGF piscícolas ou avícolas, e.g. MGF de galinha, são também MGF da invenção. Dentro de uma qualquer espécie, pode existir um homólogo na forma de várias variantes alélicas, e estas serão todas consideradas homólogas da proteína de SEQ ID NO: 2, 4 ou 6. 16 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

As variantes alélicas e homólogos de espécie podem ser obtidos por métodos conhecidos na especialidade, e.g. por sondagem de uma fonte de células adequada com uma sonda derivada de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. Os clones obtidos podem ser manipulados por técnicas convencionais para gerar um polipéptido da invenção que pode ser produzido por técnicas recombinantes ou sintéticas conhecidas per se.

Homólogos

Um polipéptido da invenção é preferivelmente pelo menos 70% homólogo da proteina de SEQ ID NO: 2, 4 ou 6, mais preferivelmente pelo menos 80 ou 90% e, mais preferivelmente ainda, pelo menos 95, 97 ou 99% homólogo ao longo de uma região de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 30, por exemplo pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais aminoácidos contíguos. Os métodos de medição da homologia de proteínas são bem conhecidos na especialidade e será entendido pelos peritos na especialidade que no presente contexto, a homologia é calculada com base na identidade de aminoácidos (por vezes referida como "homologia dura").

Os graus de homologia podem ser medidos por métodos bem conhecidos, como aqui descrito para sequências polinucleotidicas. A sequência dos polipéptidos de SEQ ID NOs. 2, 4 e 6 e das variantes alélicas e homólogos de espécie pode ser modificada para proporcionar outros polipéptidos da invenção.

Substituições

Podem ser feitas substituições de aminoácido, por exemplo de 1, 2 ou 3 a 10, 20 ou 30 substituições. Por exemplo, um total de até 1, 2, 5, 10 ou 20 aminoácidos pode ser substituído ao longo de um comprimento de 50, 100 ou 200 aminoácidos nos polipéptidos. Por exemplo, até 20 aminoácidos substituídos ao longo de qualquer comprimento de 50 aminoácidos. O polipéptido modificado geralmente retém uma ou mais das propriedades funcionais do MGF, como aqui definido. Podem ser feitas substituições conservativas, por exemplo de acordo com a tabela que se segue. Os aminoácidos no 17 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ mesmo bloco na segunda coluna e preferivelmente na mesma linha na terceira coluna podem ser substituídos uns pelos outros.

ALIFÁTICO Não polar GAP I L V Polar não carregado C S T M N Q Polar carregado D E K R AROMÁTICO H F W Y

Fragmentos

Os polipéptidos da invenção também incluem fragmentos dos polipéptidos de comprimento completo acima mencionados e suas variantes, incluindo fragmentos da sequência estabelecida em SEQ ID NOs. 2, 4 e 6.

Os fragmentos adequados terão geralmente um tamanho de pelo menos cerca de 20, e.g. pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos. Os fragmentos polipeptídicos dos polipéptidos de SEQ ID NOs. 2, 4 e 6 e suas variantes alélicas e de espécie podem conter uma ou mais (e.g. 2, 3, 5, 5 a 10 ou mais) substituições, deleções ou inserções, incluindo substituições conservativas. Cada substituição, inserção ou deleção pode ser de qualquer comprimento, e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 5 a 10 ou 10 a 20 aminoácidos de comprimento.

Em particular, os fragmentos da invenção podem compreender os aminoácidos codificados pelos exões 5 e 6 ou 4, 5 e 6 do ADN humano, de rato ou de coelho de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. O primeiro aminoácido do exão 4, Asn, é parcialmente codificado pelo exão 3 (1 nucleótido) e parcialmente pelo exão 4 (2 nucleótidos). Prefere-se que o referido primeiro aminoácido esteja presente num fragmento da invenção.

Sequências quiméricas

Podem ser utilizados polipéptidos de MGF codificados por sequências polinucleotidicas quiméricas da invenção (veja-se adiante). 18 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Isolamento, purificação e modificação

Os polipéptidos da invenção podem estar numa forma substancialmente isolada. Entender-se-á que o polipéptido pode ser misturado com transportadores ou diluentes que não vão interferir com a finalidade pretendida do polipéptido e ainda assim ser considerado substancialmente isolado. Um polipéptido da invenção pode também estar numa forma substancialmente purificada, caso em que irá geralmente compreender o polipéptido numa preparação em que mais do que 70%, e.g. mais do que 80, 90, 95, 98 ou 99% do polipéptido na preparação é um polipéptido da invenção.

Os polipéptidos da invenção podem ser proporcionados numa forma tal que estejam fora do seu ambiente celular natural. Assim, podem estar substancialmente isolados ou purificados, como discutido acima, ou numa célula onde não ocorrem na natureza, e.g. uma célula ou outra espécie vegetal, animais, leveduras ou bactérias.

Os polipéptidos da invenção podem ser modificados, por exemplo, pela adição de resíduos de Histidina ou de um marcador T7 para auxiliar na sua identificação ou purificação ou pela adição de uma sequência de sinal para promover a sua secreção pela célula.

Um polipéptido da invenção pode ser marcado com um marcador de revelação. O marcador de revelação pode ser qualquer marcador adequado que permita que o polipéptido seja detectado. Os marcadores adequados incluem radioisótopos, e.g., 125I, 35S, enzimas, anticorpos, polinucleótidos e ligantes tais como biotina.

Os polipéptidos da invenção podem ser quimicamente modificados, e.g. modificados pós-tradução. Por exemplo, podem compreender resíduos de aminoácido modificados. Podem também ser glicosilados (veja-se acima), embora o MGF não seja naturalmente glicosilado. Estes polipéptidos modificados serão entendidos como sendo polipéptidos da invenção.

Os efeitos de modificações na sequência do MGF podem ser testados através de qualquer método adequado. Por exemplo, as 19 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ propriedades de ligação e/ou a estabilidade de MGF variantes podem ser testadas por comparação in vitro ou in vivo com as do MGF não modificado.

Polinucleótidos

Os polinucleótidos da invenção codificam polipéptidos da invenção.

Os polinucleótidos preferidos da invenção compreendem uma sequência de codificação que codifica um polipéptido possuindo uma ou mais das propriedades funcionais do MGF, como aqui definido, sequência de codificação essa que é seleccionada de entre: (a) a sequência de codificação de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5; (b) a sequência de codificação dos exões 5 e 6, 4, 5 e 6 ou exões 3, 4, 5 e 6 de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 (c) uma sequência capaz de hibridar selectivamente com uma sequência de (a) ou (b), ou com uma sequência complementar de uma sequência de (a) ou (b); (d) uma sequência possuindo 70% ou mais de homologia com uma sequência de (a) ou (b); (e) uma sequência que é um fragmento da sequência de qualquer uma de (a) a (d) ; e (f) uma sequência que difere da de qualquer uma de (a) a (d) mas que, devido á degenerescência do código genético, codifica o mesmo polipéptido.

Assim, a invenção proporciona polinucleótidos compreendendo a sequência de codificação mostrada em qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 e suas variantes com sequências relacionadas. Os polinucleótidos da invenção podem ser utilizados para preparar vectores da invenção. SEQ ID NOs. 1, 3 e 5

Os polinucleótidos preferidos da invenção compreendem sequências de codificação como mostrado em SEQ ID NOs. 1, 3 e 5. 20 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Sequências hibridáveis

Um polinucleótido da invenção pode hibridar selectivamente com a sequência de codificação de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 a um nível significativamente acima do valor de fundo. A hibridação de fundo pode ocorrer, por exemplo, devido a outros ADNc presentes numa biblioteca de ADNc. 0 nivel de sinal gerado pela interacção entre um polinucleótido da invenção e a sequência de codificação de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11 é tipicamente pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 100 vezes, tão intenso quanto o das interacções entre outros polinucleótidos e a sequência de codificação de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. A intensidade da interacção pode ser medida, por exemplo, por radiomarcação da sonda, e.g. com 32P. A hibridação selectiva é tipicamente conseguida utilizando condições de médio a elevado rigor (por exemplo cloreto de sódio 0,03M e citrato de sódio 0,03M, de cerca de 50°C a cerca de 60°C, por exemplo 45 a 50, 50 a 55 ou 55 a 60°C, e.g. a 50 ou 60°C.

Contudo, esta hibridação pode ser realizada sob quaisquer condições adequadas conhecidas na especialidade (veja-se Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Por exemplo, se for necessário elevado rigor, as condições adequadas incluem SSC 0,2x a cerca de 60°C, por exemplo 40 a 50°C, 50 a 60°C ou 60 a 70°C, e.g. a 50 ou 60°C. Se for requerido menor rigor, as condições adequadas incluem SSC 2x a cerca de 60°C, por exemplo 40 a 50°C, 50 a 60°C ou 60 a 70°C, e.g. a 50 ou 60 °C. O rigor tipicamente ocorre numa gama de cerca de Tm-5°C (5°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) das duas sequências que hibridam uma com a outra formando um dúplex) a cerca de 20°C a 25°C abaixo da Tm. Assim, de acordo com a invenção, uma sequência hibridável pode ser uma que híbrida com SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 a uma temperatura de Tm a Tm-25°C, e.g. Tm a Tm-5°C, Tm-5 a Tm-10°C, Tm-10 a Tm-20°C ou Tm-20 a Tm-25°C.

Sequências homólogas

Uma sequência polinucleotídica da invenção, compreenderá uma sequência de codificação pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80 ou 90%, e mais preferivelmente pelo menos 95, 98 21 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ ou 99%, homóloga à sequência de codificação de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5.

Esta homologia aplicar-se-á preferivelmente ao longo de uma região de pelo menos 20, preferivelmente pelo menos 50, por exemplo 100 a 500 ou mais, nucleótidos contíguos. São bem conhecidos na especialidade métodos para a medição da homologia de ácidos nucleicos e polipéptidos. Estes métodos podem ser aplicados à medição da homologia tanto para polipéptidos como para ácidos nucleicos da invenção. Por exemplo, o pacote UWGCG proporciona o programa BESTFIT que pode ser utilizado para calcular a homologia (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, p.387-395).

Similarmente, os algoritmos PILEUP e BLAST podem ser utilizados para alinhar sequências (por exemplo como descrito em Altschul, S.F., 1993, J. Mol. Evol. 30:290-300; Altschul, S.F. et ai., 1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). São possíveis muitas configurações diferentes para estes programas. De acordo com a invenção, podem ser utilizadas as configurações padrão.

Com mais detalhes, o algoritmo BLAST é adequado para a determinação da similaridade de sequências e está descrito em Altschul et ai. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. O software para a realização das análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi/nlm.hih-gov/). Este algoritmo envolve, primeiro, a identificação de pares de sequências com classificação alta (HSP) através da identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência interrogada que correspondem ou satisfazem uma classificação limiar considerada positiva T quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento numa sequência da base de dados. T é referido como o limiar de classificação de palavras na vizinhança (Altschul et al., supra). Estes sucessos de palavras na vizinhança iniciais actuam como sementes para a iniciação de buscas para encontrar HSP que as contenham. Os sucessos de palavras são estendidos em ambos os sentidos ao longo de cada sequência tão longe quanto a classificação 22 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ cumulativa do alinhamento possa ser aumentada. As extensões para os sucessos de palavras em cada sentido são paradas quando: a classificação cumulativa do alinhamento cai o equivalente à quantidade X a partir do seu valor máximo atingido; a classificação cumulativa cai para zero ou menos, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos com resíduos com classificação negativa; ou é atingida a extremidade de uma das sequências. Os parâmetros do algoritmo BLAST, W, T e X, determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLAST utiliza como valores padrão um comprimento de palavra (W) de 11, a matriz de classificação BLOSUM62 (veja-se Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915-10919) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as cadeias. O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências; veja-se e.g. Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Sei. USA 90:5873-5787. Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade a que uma correspondência entre duas sequência de nucleótidos ou de aminoácidos pode ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a um gene fundido ou um ADNc se a menor probabilidade soma em comparação do ácido nucleico de teste com um ácido nucleico fundido for inferior a cerca de 1, preferivelmente inferior a cerca de 0,1, mais preferivelmente inferior a cerca de 0,01, e o mais preferivelmente inferior a cerca de 0,001.

Fragmentos

Também estão incluídas no âmbito da invenção sequências que são fragmentos das sequências de (a) a (d) acima mas que codificam polipéptidos de MGF possuindo as propriedades acima discutidas.

Em particular, os fragmentos podem compreender os exões 5 e 6 ou 4, 5 e 6 ou os exões 3, 4, 5 e 6 do ADN de MGF humano, de rato ou de coelho de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. O primeiro aminoácido do exão 4, Asn, é parcialmente codificado pelo exão 3 e parcialmente pelo exão 4. Prefere-se 23 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ que as bases codificantes necessárias do exão 3 estejam presentes para codificar o referido primeiro aminoácido, Asn.

Sequências degeneradas

Estão também incluídas no âmbito da invenção sequências que diferem das sequências de (a) a (e) mas que, devido à degenerescência do código genético, codificam os mesmos polipéptidos protectores. Por exemplo, a invenção proporciona variantes degeneradas das sequências de SEQ ID NOs. 1, 3 e 5 que também codificam os polipéptidos de SEQ ID NOs. 2, 4 e 6.

Sequências complementares

Em adição, a invenção proporciona polinucleótidos possuindo sequências complementares de quaisquer das sequências acima mencionadas.

Sequências quiméricas

Podem também ser utilizadas sequências quiméricas compreendendo exões de mais do que uma espécie. Por exemplo, um ou mais dos exões 3 a 6 podem ser derivados do ser humano e um ou mais de entre rato e/ou de coelho.

Outras propriedades

As sequências nucleicas da invenção podem ser de qualquer comprimento desde que codifiquem um polipéptido da invenção. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser um fragmento contíguo da sequência de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 ou uma sequência que está relacionada com esta de alguma das maneiras acima descritas. Alternativamente, os ácidos nucleicos da invenção podem compreender sequências de ADN que não são contíguas na sequência de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. Estas sequências podem ser fragmentos da sequência de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 ou sequências de ácido nucleico que estão relacionadas com estes fragmentos de alguma das maneiras descritas acima. As sequências de ácido nucleico da invenção preferivelmente compreenderão pelo menos 50 bases ou pares de bases, por exemplo 50 a 100, 100 a 500, 500 a 1000 ou 1000 a 2000 bases ou pares de bases.

Qualquer combinação dos graus acima mencionados de homologia e dimensões mínimas pode ser utilizada para 24 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ polinucleótidos definidos da invenção, sendo preferidas as combinações mais rigorosas (e.g. maior homologia ao longo de comprimentos mais longos e/ou hibridação sob condições mais rigorosas). Assim, por exemplo, um polinucleótido que é pelo menos 90% homólogo ao longo de 100 nucleótidos forma um aspecto da invenção, tal como um polinucleótido que é pelo menos 95% homólogo ao longo de 100 ou 200 nucleótidos.

Os polinucleótidos da invenção podem compreender ADN ou ARN. Podem também ser polinucleótidos que incluem no seu interior nucleótidos sintéticos ou modificados. São conhecidos na especialidade vários diferentes tipos de modificação de polinucleótidos. As modificações podem, por exemplo, aumentar a resistência a nucleases e/ou aumentar a capacidade para entrar nas células. Por exemplo, podem ser utilizados oligonucleótido-fosforotioatos. Outros análogos de desoxinucleótidos incluem metilfosfonatos, fosforamidatos, fosforoditioatos, N3'P5'-fosforamidatos e oligorribonucleótido-fosforotioatos e seus análogos 2 '-0-alquil- e 2'-O-metil-ribonucleótido-metilfosfonatos. Uma outra possível modificação é a adição de cadeias acridina ou polilisina nas extremidades 3' e/ou 5' da molécula.

Alternativamente, podem ser utilizados oligonucleótidos de esqueleto misto (MBO, Mixed Backbone Oligonucleotide) . Os MBO contêm segmentos de oligodesoxinucleótido-fosfotioatos e segmentos apropriadamente colocados de oligodesoxi- ou oligo-ribonucleótidos modificados. Os MBO possuem segmentos de ligações fosforotioato e outros segmentos de outros oligonucleótidos modificados, tais como metilfosfonato, que é não iónico e muito resistente a nucleases ou 2 '-0-alquiloligorribonucleótidos. Para os fins da presente invenção, deve entender-se que os polinucleótidos aqui descritos podem ser modificados por qualquer método disponível na especialidade. Estas modificações podem ser realizadas para aumentar a actividade in vivo ou o tempo de vida dos polinucleótidos da invenção. Os polinucleótidos da invenção podem ser utilizados para produzir um iniciador, e.g. um iniciador de PCR, um iniciador para uma reacção de amplificação alternativa, uma sonda, e.g. marcada com um marcador de revelação por meios convencionais utilizando marcadores radioactivos ou não radioactivos, ou os 25 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ polinucleótidos podem ser clonados em vectores. Estes iniciadores, sondas e outros fragmentos terão preferivelmente pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 ou 20, por exemplo pelo menos 25, 30 ou 40 nucleótidos de comprimento. Estes serão úteis na identificação de espécies homólogas e variantes alélicas como discutido acima.

Os polinucleótidos tais como polinucleótidos de ADN e iniciadores de acordo com a invenção podem ser produzidos de forma recombinante, sintética ou por qualquer meio disponível aos peritos na especialidade. Podem também ser clonados por técnicas padrão. Os polinucleótidos são tipicamente proporcionados em formas isoladas e/ou purificadas.

Em geral, os iniciadores serão produzidos por meios sintéticos, envolvendo um fabrico por passos da sequência de ácido nucleico desejada, um nucleótido de cada vez. As técnicas para o conseguir utilizando técnicas automáticas estão prontamente disponíveis na especialidade.

Clones genómicos correspondentes aos ADNc de SEQ ID NOs. 1, 3 e 5 contendo, por exemplo intrões e regiões promotoras, são também aspectos da invenção e podem também ser produzidos utilizando meios recombinantes, por exemplo utilizando técnicas de clonagem por PCR (reacção em cadeia pela polimerase). O padrão de exões 4-5-6 do MGF é característico de polinucleótidos da invenção. Qualquer método adequado pode ser utilizado para assegurar que este padrão seja reflectido na sequência de codificação, e desse modo no polipéptido codificado. Por exemplo, podem ser utilizadas sequências de ADNc sem intrões e sinais de splicing e incluindo as sequências de codificação dos exões 4, 5 e 6. Alternativamente, pode ser utilizado ADN genómico se este vier a ser correctamente rearranjado (por splicing) na situação em questão.

Embora em geral as técnicas aqui mencionadas sejam bem conhecidas na especialidade, pode ser feita referência em particular a Sambrook et al (1959), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 26 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Os polinucleótidos que não são 100% homólogos às sequências da presente invenção mas caiem dentro do âmbito da invenção, como descrito acima, pode ser obtidos de várias maneiras, por exemplo por sondagem de bibliotecas de ADN genómico ou de ADNc de outras espécies de plantas com sondas derivadas da SEQ ID NO: 1, 3 ou 5. Podem ser preparadas sondas degeneradas por meios conhecidos na especialidade para ter em conta a possibilidade de variação degenerada entre as sequências de ADN de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 e as sequências que estão a ser sondadas sob condições de rigor médio a elevado (por exemplo cloreto de sódio 0,03M e citrato de sódio 0,03M a de cerca de 50°C a cerca de 60°C), ou outras condições adequadas (e.g. como descrito acima).

Podem também ser obtidas variantes alélicas e homólogos de espécie utilizando PCR degenerada que irá utilizar iniciadores desenhados para ter como alvo sequências dentro das variantes e homólogos que codificam sequências de aminoácidos provavelmente conservadas. As sequências provavelmente conservadas podem ser previstas a partir do alinhamento da sequências de aminoácidos da invenção (SEQ ID NO: 2, 4 ou 6) com cada uma das outras e/ou com as de quaisquer sequências homólogas conhecidas na especialidade. Os iniciadores conterão uma ou mais posições degeneradas e serão utilizados em condições de rigor inferior ao das utilizadas para a clonagem de sequências com iniciadores de sequência simples contra sequências conhecidas.

Alternativamente, estes polinucleótidos podem ser obtidos por mutagénese dirigida ao local de sequências de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5 ou suas variantes alélicas. Isto pode ser útil quando, por exemplo, são necessárias alterações de codões silenciosas nas sequências para optimizar as preferências de codões para uma célula hospedeira particular em que as sequências polinucleotídicas estão a ser expressas. Outras sequências podem ser desejadas de modo a introduzir locais de reconhecimento para enzimas de restrição, ou para alterar as propriedades ou a função dos polipéptidos codificados pelos polinucleótidos. 27 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ A invenção proporciona ainda polinucleótidos em cadeia dupla compreendendo um polinucleótido da invenção e o seu complementar.

Os polinucleótidos, sondas ou iniciadores da invenção podem ser portadores de um marcador de revelação. Os marcadores adequados incluem radioisotopos tais como P ou 35S, marcadores enzimáticos, ou outros marcadores proteinicos tais como biotina. Estes marcadores podem ser adicionados a polinucleótidos, sondas ou iniciadores da invenção e podem ser detectados utilizando técnicas conhecidas per se.

Tratamentos da invenção Isquemia e sobrecarga mecânica

Constitui um objecto da invenção prevenir ou limitar os danos no miocárdio em resposta a um ataque cardiaco através da prevenção ou limitação de apoptose no miocárdio utilizando um polipéptido ou um polinucleótido de MGF da invenção, ou ambos. Um ataque cardiaco pode envolver isquemia ou sobrecarga mecânica. A isquemia ocorre quando uma artéria fornecedora de sangue oxigenado a um músculo ou a outro órgão fica obstruída. Isto diminui a capacidade do órgão afectado funcionar e pode envolver morte celular na área onde o fornecimento de sangue é reduzido. No coração, a isquemia pode resultar de uma obstrução das artérias coronárias. Isto faz com que os cardiomiócitos em determinadas áreas fiquem privados de sangue, e portanto de oxigénio. Começam então a morrer. Isto significa um esforço mecânico acrescido sobre os miocardiócitos sobreviventes na área que fica fisicamente danificada, a menos que estes sofram hipertrofia e adaptação. Assim, a morte celular ocorre tanto em resultado da privação de oxigénio como em resultado de esforço mecânico indevido. A região de morte celular, ou necrose, é conhecida como um enfarte. Sobrecarga significa estiramento da parte ofendida do miocárdio pelo retorno venoso, assim como a força contráctil aumentada requerida por um número reduzido de cardiomiócitos. Se as células do músculo cardíaco estão sobre-estiradas, isso resulta nos filamentos de actina e miosina serem puxados para o ponto em que já não se sobrepõem e os sarcómeros (as unidades geradoras de força) sofrem ruptura. 28 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Entrega de polipéptidos de MGF a indivíduos O polipéptido de MGF é administrado em resposta a um ataque cardiaco.

Os polipéptidos de MGF podem ser entregues a indivíduos necessitados desse tratamento por qualquer método adequado. Geralmente, os polipéptidos de MGF serão entregues por via intravenosa pois este é um método seguro e fiável de entrega. Sob circunstâncias clínicas apropriadas (e.g. em unidades cardíacas especializadas) a entrega directa no coração pode também ser possível, e.g. utilizando um denominado sistema de injecção "sem agulha" (e.g. proporcionado por Powderject) para entregar o polipéptido no coração

Desejavelmente, o polipéptido de MGF será administrado tão rapidamente quanto possível após o ataque cardíaco, por exemplo logo que seja diagnosticado um ataque cardíaco resultante de isquemia. Preferivelmente, será administrado em 5, 10, 15, 30 ou 60 minutes, ou em 2 ou 5 horas. O tratamento de longo prazo pode também ser efectuado por re-administração do polipéptido, mas prefere-se a entrega de um polinucleótido que codifica MGF para esse propósito (veja-se adiante).

Os tratamentos da invenção serão particularmente eficazes para auxiliar sofredores de ataques de coração a ter uma boa recuperação; e voltarem a um estilo de vida activo, normal.

Produção de polipéptidos de MGF

Os polipéptidos de MGF podem ser produzidos de qualquer maneira adequada. Em algumas concretizações podem ser extraídos de tecidos animais. Contudo, prefere-se que sejam produzidos de forma recombinante. Isto pode ser realizado utilizando técnicas conhecidas.

Utilização de polinucleótidos de MGF em adição a polipéptidos de MGF

Em situações em que se pretendem ambas as entregas, de curto prazo e de longo prazo, um polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF da invenção pode ser entregue assim como o polipéptido de MGF. O polinucleótido que codifica o polipéptido de MGF pode ser entregue simultaneamente com o 29 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ polipéptido ou separadamente. Pode ser entregue na mesma formulação farmacêutica ou numa diferente e pela mesma via de administração ou por uma diferente. 0 MGF tem uma semivida curta e a expressão in vivo do MGF facilita a localização e evita a necessidade de injecção repetida para efectuar uma terapia de longo prazo. A administração intramuscular é preferida para polinucleótidos da invenção, especialmente plasmideos e outros ácidos nucleicos nus.

Vectores para entrega de polinucleótidos

Os polinucleótidos da invenção podem ser entregues de qualquer maneira adequada. Em particular, serão geralmente entregues por via de um vector. Qualquer vector adequado pode ser utilizado. 0 polinucleótido pode ser entregue numa forma "nua" (e.g. num vector plasmídico), opcionalmente associado a um agente para auxiliar a sua penetração, como se discute adiante. Alternativamente, o vector pode ser um que encapsule o ácido nucleico, e.g. um vírus. 0 vector pode, por exemplo, ser um vector plasmídico ou cosmídico, ou outro tipo de vector. O vector pode ser um vector virai, tal como um vector compreendendo um vírus susceptível de infectar as células do indivíduo beneficiário. Assim, o vector pode ser, ou pode ser derivado de, qualquer vírus adequado, por exemplo um vector de alfavírus, adenovírus, vírus adeno-associado, baculovírus, vírus vaccinia, vírus de herpes, vírus de herpes simplex, retrovírus (e.g. lentivírus), ou um baculovírus. Um vírus vector estará incapacitado, no sentido de que não será tipicamente capaz de replicar ou causar efeitos patológicos da mesma maneira que um vírus intacto. Estará tipicamente atenuado, por exemplo, defectivo para replicação.

Especialmente quando é entregue numa forma "nua", e.g. na forma de um plasmídeo, o polinucleótido pode estar associado a um agente para auxiliar na penetração nas células. Os exemplos incluem agentes catiónicos (e.g. lípidos catiónicos), polilisina, lípidos, e agentes precipitantes (e.g. um sal de cálcio). Estes agentes auxiliam geralmente a passagem do polinucleótido através da membrana celular. 0 polinucleótido pode estar na forma de lipossomas ou de partículas, por 30 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ exemplo em associação com qualquer dos agentes de penetração acima mencionados. O polinucleótido pode estar em associação com um agente que faz com que o polinucleótido adopte uma forma mais compacta, tal como uma histona. O polinucleótido pode estar em associação com espermidina.

Similarmente, podem ser utilizados lipossomas para auxiliar o transporte de polinucleótidos da invenção para as células. O polinucleótido pode estar associado a um transportador que pode ser utilizado para entregar o polinucleótido na célula, ou mesmo no núcleo, utilizando técnicas biolisticas. Um tal transportador pode ser uma partícula metálica, tal como uma partícula de ouro ou de tungsténio. O polinucleótido é tipicamente susceptível de ser expresso numa célula do beneficiário. Assim, o polinucleótido tipicamente também compreende sequências de controlo que estão operativamente ligadas à sequência de codificação do MGF da invenção, sendo as referidas sequências de controlo capazes de expressar a sequência de codificação nas células do beneficiário, por exemplo após integração do polinucleótido no genoma da célula.

As sequências de controlo tipicamente compreendem um promotor (geralmente a 5' da sequência de codificação) e/ou uma sequência terminadora e/ou de iniciação da tradução (e.g. GCCACCATGG (SEQ ID NO: 7) ou GCCCCCATGG (SEQ ID NO: 8)) e/ou um codão de paragem da tradução (e.g. TAA, TAG ou TGA) e/ou um sinal de poliadenilação e/ou uma ou mais sequências potenciadoras e/ou um local de pausa de ARN. As sequências de controlo podem melhorar a transcrição ou a tradução do polinucleótido. As sequências de controlo podem ser especificas do tecido de modo a que o polinucleótido seja expresso apenas em determinados tecidos, ou podem ser as sequências de controlo de um gene expresso constitutivamente. Os promotores e potenciadores específicos do músculo são particularmente preferidos. As sequências de controlo são tipicamente as de qualquer dos eucariotas aqui mencionados ou de um vírus que infecta um eucariota, e.g. da espécie do beneficiário, tal como um vírus humano para um beneficiário 31 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ humano. Ο polinucleótido pode compreender uma origem de replicação. O promotor pode ser, por exemplo, (em particular para expressão em células de mamifero) um promotor do gene da metalotioneina, o promotor do antigénio T grande de SV40, promotor de CMV ou promotor adenoviral.

No que se refere à expressão especifica de tecidos, são particularmente preferidos elementos de controlo específicos do músculo, tais como promotores e potenciadores específicos do músculo, especialmente quando o ácido nucleico vai ser entregue intramuscularmente, e.g. na forma de plasmídeo. Estes elementos podem ser derivados de, por exemplo, genes de miosina. Por exemplo, podem ser utilizados promotores da cadeia leve ou da cadeia pesada da miosina, assim como potenciadores da cadeia leve ou da cadeia pesada da miosina. Vários potenciadores e promotores da miosina foram identificados até à data de ambos os genes, da cadeia leve da miosina e da cadeia pesada da miosina. Preferivelmente, o potenciador e/ou o promotor da miosina utilizados têm origem em vertebrados, mais preferivelmente origem avícola, piscícola ou mamífera.

Prefere-se um potenciador da cadeia leve da miosina. Um potenciador da cadeia leve 1/3 da miosina de rato (Donoghue et ai. (1988) Genes Dev. 2:1779-1790; Neville et al. (1996) Dev.

Genetics 19:157-162) é especialmente preferido. 0 potenciador está operativamente ligado ao promotor. O potenciador pode estar a montante ou a jusante do promotor. O potenciador pode ser utilizado em qualquer orientação.

Prefere-se um promotor da cadeia pesada da miosina. Um promotor da cadeia pesada da miosina particularmente preferido é um promotor da cadeia pesada da miosina β cardíaca de coelho truncado, em particular até, e incluindo, 789 pares de bases a montante do local de início da transcrição. Outro promotor da cadeia pesada da miosina conhecido é o promotor FG2 de carpa, em particular até, e incluindo, 901 pares de bases a montante do local de início da transcrição (Gauvry et al. (1996) Eur. J. Biochem. 236:887-894). Outros detalhes de promotores da 32 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ cadeia pesada da miosina derivados de genes da cadeia pesada da miosina de rato, de coelho, humanos, porcinos e de pinto, são apresentados em Gauvry et al. (1996) e suas referências. Todos estes promotores podem ser utilizados na presente invenção.

Contudo, quaisquer elementos reguladores adequados podem ser utilizados, e os mencionados acima são meramente exemplificativos.

Neste contexto, e se for apropriado para a condição global do paciente, a introdução do MGF da invenção pode ser ligada a actividade física. Como os músculos respondem ao exercício e a miosina é a proteína mais abundante no músculo, os elementos reguladores promotor/potenciador da miosina significam que a expressão do ADNc será supra-regulada por uma actividade muscular aumentada.

Os vectores plasmídicos e vectores virais incapacitados são concretizações preferidas. Os vectores plasmídicos são particularmente preferidos, especialmente para administração intramuscular, com o objectivo de assegurar a expressão local no músculo. 0 vector pode ser desenhado para uma integração estável no genoma das células do beneficiário. Alternativamente, pode ser desenhado para ser não integrativo. Na introdução estável o polinucleótido fica integrado no genoma da célula (i.e. fica contíguo ao genoma). Assim, o polinucleótido pode também compreender uma sequência que melhora a integração do polinucleótido tal como os locais loxP do sistema de recombinação Cre do bacteriófago Pl, locais FRT do sistema de recombinação FLP de levedura ou sequências de repetição terminais de vírus adeno-associados (AAV). A integração pode ser melhorada por outros factores que estão presentes, tais como Cre derivado do bacteriófago Pl, recombinase FLP derivada de levedura, proteínas Rep de AAV, recombinases Cre ou FLP ou proteínas Rec bacterianas. Numa concretização, o polinucleótido da invenção é capaz de expressar esse factor. O polinucleótido pode ser um que se integre aleatoriamente (tal como de uma maneira não específica da 33 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ sequência) em qualquer posição no genoma ou um que se integre preferencialmente em locais particulares do genoma. Geralmente estarão presentes no genoma, após a integração, a totalidade da sequência de codificação do polinucleótido e as sequências de controlo.

Composições e formulações farmacêuticas

Os polipéptidos e os polinucleótidos da invenção são preferivelmente entregues na forma de uma formulação farmacêutica compreendendo um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis. Pode ser utilizada qualquer formulação farmacêutica adequada.

Por exemplo, as formulações adequadas podem incluir soluções para injecção estéreis, aquosas e não aquosas, que podem conter antioxidantes, tampões, bacterióstatos, antibióticos bactericidas e solutos que tornam a formulação isotónica com os fluidos corporais do beneficiário pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multi-dosagem. Por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas numa condição congelada ou criodessecada (liofilizada) que requer apenas a adição do transportador liquido estéril, por exemplo água para injecções, imediatamente antes da utilização.

Deverá entender-se que em adição aos ingredientes mencionados particularmente acima, as formulações da presente invenção podem incluir outros agentes convencionais na especialidade tendo em conta o tipo de formulação em questão. São preferidas soluções estéreis, isentas de pirogénios, aquosas e não aquosas.

Dosagens

As proteínas, polinucleótidos e vectores da invenção podem ser entregues em qualquer dosagem adequada, e utilizando qualquer regime de dosagem adequado. Os peritos na especialidade entenderão que a quantidade e o regime de dosagem podem ser adaptados para assegurar o tratamento óptimo da condição particular a tratar, dependendo de numerosos 34 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ factores. Alguns destes factores podem ser a idade, o sexo e a condição clínica do indivíduo a tratar. A dosagem utilizada para a entrega de ácidos nucleicos por vectores irá depender de muitos factores, incluindo a eficiência com que os vectores entregam os ácidos nucleicos nas células, e a eficiência com que os ácidos nucleicos são expressos nas células.

Para a entrega de ácidos nucleicos nus (e.g. plasmídeos ou outros vectores não virais nus), as doses típicas são de 0,1 a 5000pg, por exemplo 10 a lOOOpg, tal como 10 a 100yg, 100 a 500pg e 500 a 2000pg por dose.

Como orientação, os vectores virais podem ser entregues em doses de 104 a 1014 ufc ou ufp/ml, por exemplo 104 a 106, 106 a ΙΟ8, 108 a ΙΟ10, 1010 a 1012 ou 1012 a 1014 ufc ou ufp/ml. Doses na região de 105 a 109 ufc ou ufp/ml são preferidas. O termo ufp (unidades formadoras de placas) aplica-se a determinados vírus, incluindo adenovírus, e corresponde à infecciosidade de uma solução do vírus, e é determinada por infecção de uma cultura celular apropriada, e medição, geralmente após 48 horas, do número de placas fágicas de células infectadas. O termo ufc (unidades formadoras de colónias) aplica-se a outros vírus, incluindo retrovírus, e é determinado por meios conhecidos na especialidade, geralmente após 14 dias de incubação, com um marcador seleccionável. As técnicas para a determinação do título ufc ou ufp de uma solução virai são bem conhecidas na especialidade. Para retrovírus, dosagens na região de 105 a 106 ufc/ml são particularmente preferidas.

Para retrovírus pseudotipifiçados, dosagens na região de 107 ufc/ml são particularmente preferidas. Para adenovírus, dosagens na região de 109 ufp/ml são particularmente preferidos.

Para a entrega de polipéptidos de MGF da invenção as doses adequadas incluem doses de 1 a 1000pg, de 10 a 100pg, de 100 a 500yg e de 500 a 1000pg. Os horários das dosagens irão também variar de acordo com, por exemplo, a via de administração, a espécie do beneficiário e a condição do beneficiário. Contudo, o polipéptido de MGF será tipicamente 35 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ dado rapidamente após o incidente isquémico, ou de sobrecarga mecânica, como discutido acima. Opcionalmente, doses adicionais podem ser espalhadas ao longo de períodos de, e.g. dias, semanas ou meses. Como discutido acima, contudo, a entrega por meio de polinucleótidos que são expressos in vivo é vantajosa para tratamento de longo prazo porque minimiza a necessidade de injecções no indivíduo.

EXEMPLOS

Para investigar a regulação do MGF no músculo cardíaco utilizámos vários modelos in vivo e in vitro. Para confirmar a função do MGF, sobre-expressámos o gene do MGF em células do músculo cardíaco numa série de "experiências de ganho de função".

Exemplo 1: Indução da expressão de MGF in vivo durante isquemia funcional e sobrecarga

Utilizando PCR com transcritase inversa (RT-PCR) como em Yang et al (1996) e com os mesmos iniciadores oligonucleotídicos específicos, mostrámos que o MGF é fortemente expresso em torno da área enfartada após isquemia no coração de rato e de ovelha (Fig. 1B).

Numa situação isquémica, os cardiomiócitos sobreviventes próximos da região do enfarte ficam funcionalmente sobrecarregados de modo que é difícil dissociar as duas causas de morte celular, i.e. privação de oxigénio no fornecimento de sangue e subsequentemente esforço mecânico acrescido nos miócitos remanescentes depois de alguns terem sido mortos por privação de oxigénio. Colocando uma pequena ligadura em torno da aorta (constrição aórtica; Ding et al.(2000)) há um aumento da quantidade de trabalho que o coração tem que executar para ejectar sangue de modo a manter uma pressão sanguínea constante. Isto é referido como um aumento após carga e é observado em pacientes que sofrem de hipertensão, e oclusão aórtica (acumulação de placa nas paredes da aorta). Como o coração tem que trabalhar mais, a resposta compensatória do músculo é a hipertrofia de modo a corresponder às exigências.

Realizámos esta constrição aórtica em ratinhos para determinar se a expressão de MGF é aumentada neste modelo de 36 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ hipertrofia cardíaca. Na Figura 2, estão apresentados os resultados de grupos de 3 ratinhos com constrições de 7 dias comparativamente com controlos operados simuladamente. A Figura 2 mostra que a expressão de MGF é marcadamente induzida em cardiomiócitos funcionalmente sobrecarregados.

Inversamente, a expressão de IGF-I do tipo hepático não foi encontrada aumentada após a constrição. 0 ANF é um gene marcador embrionário que é supra-regulado em condições hipertróficas. Pode-se observar que a constrição induziu a expressão de ANF indicando hipertrofia cardíaca neste modelo. Também, a expressão do gene Bax é supra-regulada durante a apoptose e em situações patológicas e isto não ocorreu nos ratinhos com oclusão aórtica de 7 dias. Estes dados mostram que a expressão de MGF é aumentada pela sobrecarga funcional e que, ao contrário da situação para o IGF-I do tipo hepático, esta expressão coincide com o estágio de recuperação imediata após sobrecarga. Detectámos alterações similares imediatamente após isquemia transiente no rato e na ovelha e verificou-se que a expressão de MGF é elevada próximo da área do enfarte onde os cardiomiócitos estão sujeitos a sobrecarga mecânica (veja-se abaixo).

Exemplo 2: Sobre-expressão de MGF In vitro em miócitos cardíacos primários

Para adicionalmente confirmar o papel do MGF na compensação cardíaca aumentámos a expressão de MGF em miocardiócitos primários. Isto foi conseguido transfectando um plasmídeo contendo o ADNc do MGF em culturas primárias de miócitos cardíacos preparadas a partir de ratinhos neonatais (Goldspink et al. (1997)). 0 ensaio inicial após a transfecção consistiu em determinar se houve uma alteração no número de células. Os miócitos são células terminalmente diferenciadas que não sofrem divisão celular uma vez comprometidas na linhagem miocítica. Um aumento no número de células (hiperplasia) pode ser devido a aumentos na expressão génica que tinham que ser ensaiados e desse modo sugere que o MGF pode não estar envolvido na hipertrofia cardíaca. Ao contrário da situação no músculo esquelético, não houve aumento no número de células em nenhuma das condições após transfecção. Portanto pode-se 37 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ concluir que ο papel do MGF no miocárdio não é principalmente induzir divisão celular.

Extraiu-se o ARN das células após a transfecção (após 72 horas) e utilizou-se para ensaiar a expressão do marcador hipertrófico embrionário, ANF. Estão mostrados na Figura 2 os dados quantitativos derivados da RT-PCR em tempo real para monitorar o nivel de expressão destes genes marcadores de crescimento/reparação nos miócitos transfectados. Uma expressão aumentada de MGF, sem um correspondente aumento na expressão de L.IGF-I, mostra que é a isoforma MGF que é induzida sob condições apoptóticas.

Exemplo 3: Indução de expressão de MGF em resposta à activação da via de transdução de sinal

De modo a investigar que sinal parece modular a expressão de MGF em miócitos cardíacos, aplicaram-se vários fármacos em culturas de cardiomiócitos. Estes por sua vez activam moléculas de transdução de sinal quer directamente quer indirectamente através de moléculas acopladas a receptores. Um destes fármacos é o miristato-acetato de forbol (PMA), um éster de forbol que activa especificamente a família Proteina-Quinase C das quinases de sinalização de serina/treonina. Como mostrado na Figura 4, uma exposição breve a PMA (200 nM) , origina um aumento significativo na expressão do gene de MGF endógeno. Quando a quantidade de MGF é comparada com a quantidade de IGF do tipo hepático nas condições de controlo, há substancialmente menos nos miócitos cardíacos. Contudo, o nível de MGF é significativamente aumentado em resposta a PMA enquanto o nivel de IGF não se altera (Fig. 5A) . Quando a mesma experiência foi repetida mas o PMA foi adicionado a culturas de miócitos em que o meio não tinha sido alterado durante 24 horas antes da adição do PMA, o

aumento na expressão de MGF é ainda maior do que quando o PMA é adicionado juntamente com meio fresco (Fig. 5B).

Estes dados mostram que o PMA, um activador de proteína-quinase C, induz a expressão do gene de MGF endógeno em miócitos cardíacos. Na condição em que o meio não foi trocado o ambiente é de pH aumentado e nutrientes diminuídos. Em alguns aspectos, isto é um ambiente similar àquele em que um miócito pode existir após um evento isquémico, quando o fluxo 38 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ sanguíneo para uma região do coração é interrompido. Sob estas condições pode-se observar que a expressão de MGF aumenta ainda mais. Isto sugere que o MGF é activado por isquemia e que uma das moléculas de transdução de sinal responsáveis é a proteína-quinase C. A activação da família proteína-quinase C foi implicada na resposta a vários estímulos hipertróficos e patológicos no coração. Estas moléculas de sinalização foram também implicadas no desempenho de um papel em eventos que originam apoptose (morte celular) em miócitos cardíacos.

Estas experiências mostram novamente que o IGF-I e o MGF são factores de crescimento diferentes que possuem diferentes vias de sinalização, e sugerem que é a isoforma MGF cuja expressão é decisiva após isquemia.

Exemplo 4: Indução de expressão de MGF durante a apoptose

Para determinar se o MGF é activado sob condições que originam apoptose, cultivaram-se miócitos cardíacos na presença de sorbitol. Isto coloca as células sob stress osmótico que faz com que intumesçam e eventualmente morram. Inicialmente, cultivaram-se os miócitos em meios definidos sem soro durante 24 horas antes da adição de sorbitol. Após a exposição a sorbitol, extraiu-se o ARN e ensaiou-se a expressão génica com RT-PCR em tempo real. Mostram-se na Figura 5 as alterações na expressão dos genes de MGF e de IGF-I após uma curta exposição (4 horas) a sorbitol. Pode-se observar que a expressão de MGF inicialmente aumenta enquanto a do IGF não se altera. Após uma exposição mais longa ao sorbitol (24 horas), a expressão de MGF é a mesma que o controlo enquanto a do IGF é aumentada. Isto demonstra a diferente cinética do MGF em comparação com o IGF-I, e adicionalmente suporta a ideia de que é a expressão de MGF que é decisiva após isquemia/sobrecarga mecânica. A expressão aumentada do gene Bax também indicou que as células estão a sofrer apoptose, o que foi adicionalmente demonstrado pelo surgimento de fragmentação de ADN nas culturas tratadas com sorbitol após 24 horas.

Para adicionalmente determinar o papel do MGF na prevenção de apoptose, uma linha de células do tipo cardíaco (H9C2) (Kimes et al. (1976), e comercialmente disponível de

American Type Culture Collection, PO Box 1549, Manassas, 39 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ

Virgínia 20108, EUA) foi estavelmente transfectada com ADNc de MGF e de IGF do tipo hepático utilizando um vector pcDNA3.1/NT-GFP (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Califórnia 92008, EUA) e as técnicas de Southern et al. (1982). As linhas de células estavelmente transfectadas mais o controlo não transfectado foram depois tratados com sorbitol durante 24 horas e extraiu-se o ADN para analisar a extensão da fragmentação de ADN, que é um indicador da apoptose. Está mostrada na Figura 6 a análise do ADN após 24 horas de tratamento com sorbitol. Pode-se observar claramente que o ADN extraído das células de controlo (não transfectadas) apresenta o padrão característico de fragmentação associado à apoptose. As células estavelmente transfectadas com o ADNc de MGF e de IGF não apresentam qualquer sinal de fragmentação de ADN indicando que não sofreram apoptose. Esta característica protectora foi anteriormente descrita para o IGF no músculo cardíaco (Yamashita et ai., 2001), mas nunca foi descrita para o MGF.

Estes dados mostram que a variante de splicing do factor de crescimento semelhante a insulina, MGF, é activada em resposta a danos no tecido cardíaco e que tem uma função reparadora. Assim, a sua administração possui um efeito cardioprotector que será benéfico para o coração isquémico/sobrecarregado.

Exemplo 5: Evidência de que péptidos de MGF e de L.IGF-I se acumulam diferentemente nos cardiomiócitos

Isto indica que o receptor de MGF está provavelmente no núcleo enquanto o receptor de IGF-IEa não é nuclear, e também que as acções biológicas das duas variantes de splicing são diferentes.

De modo a expressar MGF em culturas primárias de miócitos cardíacos, utilizou-se um sistema de expressão génica mediada por adenovírus - o AdEasy Adenoviral Vector Systems (Stratagene) - para expressar ADNc de MGF e de L.IGF em miócitos isolados. As sequências do MGF e do L.IGF estavam em enquadramento com a Proteína Verde Fluorescente (GP5), que está a jusante do promotor de CMV do vector pcDNA3.1/NT-GFP (Invitrogen). A cassete completa foi removida e ligada no vector pShuttle de modo a produzir o vírus. Este vector possui 40 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ as regiões de homologia para a recombinação homóloga com o vector pAdEasy, que é derivado do adenovirus humano do serotipo 5. O virus é tornado deficiente para replicação por deleção dos genes de empacotamento e de imunidade do hospedeiro (El e E3). A construção viral/vector resultante foi utilizada para transfectar células de empacotamento 293 para produzir uma reserva virai primária. A reserva primária foi utilizada para amplificar o virus através de uma série de infecções em células 293 antes da reserva virai final ser purificada por ultracentrifugação com CsCl. 0 titulo virai final foi quantificado através de um método espectrofotométrico, que originou um titulo virai purificado da ordem de 10n-1012 particulas/ml. Estas partículas foram utilizadas para infectar miócitos primários na gama de 108-109 partículas /ml.

Foram feitas várias observações surpreendentes após 24 h de infecção virai em miócitos cardíacos primários. É mostrada na Figura 1 a localização intracelular diferente do vírus de MGF-GPF em comparação com o vírus de IGF-GFP. Como foi feita uma proteína de fusão com a GFP, a visualização das células infectadas com um microscópio de fluorescência demonstrou uma localização nuclear discreta do vírus de MGF-GFP (Figura 14A). Pelo contrário, o vírus de L.IGF-GFP, embora também estando presente no núcleo, foi adicionalmente também expresso em todo o citoplasma da célula (Figura 14B).

Para confirmar que os núcleos dos miócitos estavam a expressar o MGF, células com vírus foram contrastadas com corante (DAPI), que se liga a cromatina no núcleo e pode ser visionado com fluorescência. São mostrados na Figura 15 os resultados da coloração. O padrão de coloração confirma a expressão de MGF no núcleo.

Após o período inicial de infecção, os miócitos foram infectados durante períodos mais longos para determinar os efeitos da sobre-expressão de MGF. As células foram plaqueadas e infectadas com os vírus de MGF e um vírus que expressa GFP como controlo durante 48 h. Após a infecção fixaram-se as células em paraformaldeído e contrastaram-se com faloidina conjugada com Vermelho do Texas (Molecular Probes) para visualizar os miofilamentos e DAPI para visualizar o núcleo. 41 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ São mostrados na Figura 16 os resultados de uma infecção de 48 horas. Nos miócitos de controlo, sem infecção, a presença de miofilamentos estriados pode ser observada com o corante faloidina (Figura 16A). Do mesmo modo, em miócitos infectados com um vírus de controlo que expressa GFP, os miof ilamentos permanecem intactos com base na sua aparência estriada (Figura 16B). Contudo nos miócitos infectados com MGF, não houve formação de estrias nos miofilamentos quando corados com a faloidina sugerindo que as proteínas dos miofilamento foram desmontadas (Figuras 16C e D).

Para adicionalmente explorar a aparente desmontagem das proteínas dos miofilamentos, os níveis de expressão de ARNm de várias das proteínas de miofilamentos foram analisados utilizando RT-PCR. Extraiu-se o ARN total dos miócitos de controlo e dos miócitos infectados durante 48 h com o vírus de MGF. A expressão de várias proteínas de miofilamentos foi observada utilizando RT-PCR convencional. São mostrados na Figura 17 os resultados após electroforese das proteínas de filamentos grossos (cadeias pesada e cadeia leve da miosina) e das proteínas de filamentos finos (actina, tropomiosina e troponina T) . Pode ser claramente observada uma infra-regulação das proteínas de filamentos grossos nas células infectadas com MGF, enquanto as proteínas de filamentos finos não parecem ser afectadas. Utilizaram-se quatro culturas separadas como controlos sem infecção e quatro culturas de separação infectadas com o vírus de MGF.

Foi realizada a análise adicional da supressão da expressão de proteínas de filamentos grossos utilizando RT-PCR quantitativa. Na Figura 18 a expressão da cadeia pesada de miosina α (a isoforma predominante expressa no coração de roedor) está diminuída em mais de 100 vezes nos miócitos infectados com MGF.

Estes dados mostram que a expressão de MGF está localizada no núcleo de miócitos cardíacos enquanto a expressão do IGF está em toda a célula. A expressão prolongada de MGF em miócitos cardíacos está associada à supressão das proteínas de filamentos grossos dos miofilamentos mas não das proteínas de filamentos finos. Isto resulta numa perda da estriação cruzada de miofilamentos no interior dos miócitos 42 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ mas deixa ο citoesqueleto de actina intacto. A infra-regulação selectiva de proteínas específicas do músculo actua essencialmente para desdiferenciar o miócito, o que pode ser um passo necessário para entrar no ciclo celular a partir do seu estado terminalmente diferenciado. Portanto, pode-se observar que a expressão de MGF resulta na remodelação da região enfartada, i.e. que, de acordo com a invenção, o MGF será útil na prevenção ou limitação dos danos no miocárdio em resposta a isquemia ou sobrecarga mecânica do coração.

Exemplo 6: Decurso no tempo da regeneração de danos e expressão de MGF e IGF-IEa após danos no músculo

Este exemplo demonstra que o MGF e o L.IGF-I possuem diferentes cinéticas de expressão. Os danos no músculo foram induzidos por meios mecânicos e por via de um agente miotóxico. Os resultados mostraram claramente que o MGF é produzido pouco após o insulto enquanto o L.IGF-IEa foi expresso vários dias mais tarde.

Os danos no músculo foram induzidos por meios mecânicos, nomeadamente estiramento e estimulação, e injecção do agente miotóxico bupivacaína.

Na Figura 19, é avaliada, em ambos os modelos de danos, a percentagem média da área de fibra muscular de regeneração de danos em relação à totalidade da secção de músculo. Há uma diminuição continuada da área de regeneração de danos após 4 dias após a injecção de bupivacaína e 5 dias após estiramento e estimulação quando o dano máximo estava presente em ambos (Figura 19A) . Foi observado o mesmo padrão com a da cadeia pesada de miosina embrionária com coloração da área de regeneração em ambos os modelos (Figura 19B) . Foi utilizada uma análise de duas vias da variância (ANOVA) para determinar diferenças significativas entre as médias. N = 4 para o modelo de bupivacaína e N=6 para o modelo de estiramento/estimulação para cada ponto de tempo. Compararam-se músculos experimentais com os dos animais não tratados no tempo zero e todas as diferenças foram significativas a P<0,01 até 15 dias após a lesão. 43 ΕΡ 1 480 669/ΡΤ A Figura 20 mostra os resultados da investigação dos níveis de ARNm das isoformas MGF e IGF-IEa nos dois modelos de danos no músculo. 0 MGF apresentou um máximo de expressão logo 1 dia após o estiramento e a estimulação e 4 dias após a injecção de bupivacaína (Figura 20A), enquanto o IGF-IEa do tipo hepático apresentou o máximo de expressão mais tarde, 7 e 11 dias após a lesão (Figura 20B). Utilizou-se uma análise de duas vias da variância (ANOVA) para determinar diferenças significativas entre as médias. N= 6 para o modelo de estiramento/estimulação e N = 4 para o modelo da bupivacaína para cada ponto de tempo. As medições de MGF foram significativas a níveis P<0,01 durante até 5 dias e as de IGF-IEa do tipo hepático durante até 11 dias.

Isto proporciona evidência adicional de que é a isoforma MGF e não a isoforma IGF-IEa que oferece cardioprotecção.

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Lisboa, 2013-05-15

Claims

ΕΡ 1 480 669/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido de Factor de Crescimento Mecânico (MGF, do inglês Mechano Growth Factor) ou polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF para utilização na prevenção ou limitação de danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco, por prevenção ou limitação da apoptose no miocárdio.
2. Polipéptido ou polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido de MGF não é glicosilado.
3. Polipéptido ou polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido polipéptido de MGF possui: (a) a sequência de MGF Humano (SEQ ID NO:2), MGF de Rato (SEQ ID NO:4) ou MGF de Coelho (SEQ ID NO:6); (b) uma sequência possuindo 80% ou mais de identidade de aminoácidos com a sequência de (a); ou (c) uma sequência compreendendo os aminoácidos codificados pelos exões 5 e 6, exões 4, 5 e 6, ou exões ou 3, 4, 5 e 6, do ADN de MGF humano, de rato ou de coelho de SEQ ID NO: 1, 3 ou 5; e em que o referido polipéptido tem a capacidade de prevenir ou limitar danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco por prevenção ou limitação da apoptose no miocárdio.
4. Polipéptido ou polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 3, em que a referida sequência codificada pelos exões 5 e 6 possui a sequência de aminoácidos 87-110 de SEQ ID NO:2, aminoácidos 87-111 de SEQ ID N0:4 ou aminoácidos 87-111 de SEQ ID NO:6.
5. Polipéptido ou polinucleótido para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o referido polipéptido de MGF possui a capacidade de induzir um fenótipo hipertrófico em células do músculo cardíaco.
6. Polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polinucleótido que codifica ΕΡ 1 480 669/ΡΤ 2/3 um polipéptido de MGF codifica um polipéptido de MGF como definido nas reivindicação 3, 4 ou 5.
7. Polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o referido medicamento é formulado para administração intramuscular.
8. Polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 3, 4, 5 ou 6, em que o referido polinucleót ido está contido no interior de um vector.
9. Polinucleótido para utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o vector é um plasmídeo ou um vector virai desarmado.
10. Polipéptido para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o referido polipéptido se destina a administração nas 5 horas que se seguem ao referido ataque cardíaco.
11. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido polipéptido se destina a administração nas 2 horas que se seguem ao referido ataque cardíaco.
12. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que o referido polipéptido se destina a administração nos 60 minutos que se seguem ao referido ataque cardíaco.
13. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 10, 11 ou 12, em que o referido polipéptido se destina a administração nos 30 minutos, 15 minutos, 10 minutos ou 5 minutos que se seguem ao referido ataque cardíaco.
14. Produto compreendendo um polipéptido de MGF e um polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF para utilização simultânea, separada ou sequencial, na prevenção de danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco.
15. Produto de acordo com a reivindicação 14, em que o referido polipéptido é como definido em qualquer uma das ΕΡ 1 480 669/ΡΤ 3/3 reivindicações 1, 2, 3 ou 4 ou ο referido polinucleótido é como definido em qualquer uma das reivindicações 6, 8 ou 9.
16. Produto de acordo com a reivindicação 14 ou 15 em que o referido polipéptido de MGF é para administração antes do referido polinucleótido.
17. Utilização de um polipéptido de Factor de Crescimento Mecânico (MGF, do inglês Mechano Growth Factor) ou polinucleótido que codifica um polipéptido de MGF no fabrico de um medicamento para a prevenção ou limitação de danos no miocárdio em resposta a um ataque cardíaco por prevenção ou limitação da apoptose no miocárdio.
18. Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que o referido polipéptido é como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4 ou o referido polinucleótido é como definido em qualquer uma das reivindicações 6, 8 ou 9, ou em que a referida prevenção ou limitação é conseguida pela administração como definida em qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12 ou 13. Lisboa, 2013-05-15