PL99037B1

PL99037B1 - Sposob wytwarzania polsyntetycznych cefalosporyn

Info

Publication number: PL99037B1
Application number: PL19431672A
Authority: PL
Priority date: 1972-04-26
Filing date: 1972-04-26
Publication date: 1978-06-30

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia pólsyntetycznych cefalosporyn. Okreslenie „ce- falosporyny naturalne" oznacza w niniejszym ojpi- ®ie cefaiosporyny wytwarzane metoda biologiczna w obecnosci pdpowiednich prekursorów.Sposób wedlug wynalazku stosuje sie np. do wytwarzania kwasu 7-aminocefalospoiranowegp i otrzymywania nastepnie z iniego, równie? za po¬ moca enzyrnów, nowych cefalosporyn pólsyntetycz¬ nych odpornych na dzialanie P-laktamazy i po¬ siadajacych szeroki zakres dzialania.Znane jest zastosowanie kwasu 7-aminocefalo- slporanowego jako surowca do produkcji cefalo¬ sporyn pólsyntetycznych. Sposób otrzymywania kwasu 7-amiinocefalosporanowego na drodze bez¬ posredniej fermentacji bez prekursorów jest skom¬ plikowany i malo wydajny. Metody chemiczne wy¬ magaja specjalnej technologii ze wzgledu na nie- trwalosc surowców wyjsciowych i produktu kon¬ cowego powodujaca ich rozklad i znaczne straty.W znanej metodzie enzymatycznej uzywa sie ko¬ mórki odpowiednich mikroorganizmów wytwarza¬ jacych acylaze penicylinowa. Poniewaz komórki te moga byc uzyte tylko jednorazowo i to w sto- slunkowO' wysokim stezeniu niezbednym dla skró¬ cenia czasu hydrolizy, trzeba ciagle przygotowy¬ wac nowe ich poLrcje.Ekstrakcja produktu hydrolizy, to znaczy kwa¬ su 7-aminocafalosporanowego z mieszaniny reak¬ cyjnej jest skomplikowanym problemem. Otrzy- muje sie przy tym kwas wymagajacy powtórnej krystalizacji i^ czesto zawierajacy material bial¬ kowy, który o ile nie zostanie usuniety, np. por przez enzymatyczny rozklad przy uzyciu enzymów proteolitycznych, wywoluje odczyny alergiczne po podaniu otrzymanych z niego cefalosiporyn. Po- diraza to oczywiscie produkcje i kompMkuje tech¬ nologie wytwarzania.Stwierdzono, ze preparaty enzymatyczne osa¬ dzone na wlóknistej zywicy zachowuja swoja ak¬ tywnosc w ciagu dlugiego okresu uzywania. W czasie prób utrzymywaly one prawie nie zmniej¬ szona aktywnosc w ciagu 12 miesiecy uzywania.Sposób enzymatycznego wytwarzania pólsynte¬ tycznych cefalosporyn wedlug wynalazku polega na tym, ze naturalna cefaloisporyne w roztworze wodnym, o stezeniu 1—6fy* (waga/objetosc), korzy¬ stnie 2—3l8/o, poddaje sie enzymatycznej hydroli¬ zie pod wplywem preparatu enzymatycznego osa¬ dzonego na zywicy o strukturze wlóknistej przy wartosci pH okolo 8 w temperaturze do 60°C, korzystnie 37—40°C, otrzymany produkt hydroli¬ zy wydziela sie i w postaci roztworu wodnego o stezeniu powyzej l°/o, korzystnie 1—3°/« wprowadza do stTefy syntezy, w której poddaje sie go enzy¬ matycznej kondenslacji z odpowiednim kwasem karboksylowym lub jego pochodna korzystnie ami¬ dem lub N-acylopochodna glicyny. Synteze pro¬ wadzi sie utrzymujac pH okolo 6, w temperaturze dio 60°C, korzystnie 37—40°C. 99 0373 Wybór kwasu zalezy od tego jaka cefalosporyne pólsyntetyczna chce sie otrzymac. Anion kwasu karboksylowego musi zawierac grupe zgodna z ro¬ dzajem otrzymywanej cefalosporyny. Preparat en¬ zymatyczny umieszczony w strefie reakcji osadzo¬ ny jest na wlóknistej zywicy, przy czym stosuje sie enzym albo znajdujacy sie w surowym eks¬ trakcie otrzymanym z komórek grzybów, promie¬ niowców lub bakterii albo wydzielony z tycli zró- dtel.Enzymy wykorzystywane w tym przypadku wy¬ twarzane s$ przez grzyby lub promieniowce (As¬ pergillus, Penicillium, Botrytis cinerea, Fusarium, Mucor, Alternaria, Streptomyces i podobne) i te sa specyficzne dla rozszczepiania cefalosporyny fenoksymetylowej lub przez bakterie (E. Coli, B.Megaterium, Aerobacter Aerogenes, Alcaligenes faecalis i inne podobne), specyficzne dla rozszcze¬ piania cefalosiporyny benzylowej.Do polimerów na których mozna osadzac enzym naleza: polimery estrów i azotanów celulozy, po- liolefiny, polimery i- kopolimery otrzymywane z akrylonitrylu, akrylanów, metakrylanów, estrów winylowych, chlorku winylu, chlorku winylidenu, styrenu oraz poliamidy, poliwinylobutyral i po¬ dobne. Wlóknisty preparat enzymatyczny otrzy¬ muje sie z lepkiej masy, skladajacej sie z enzymu i latwo tworzacego wlókna polimeru.Nierozpuszczalny preparat enzymatyczny otrzy¬ muje sie w sposób opisany w patencie wloskim nr 838 462. Wedlug tego patentu wlóknista zywica z osadzonym enzymem przygotowywana jest z roz¬ tworu polimeru zdolnego do wytwarzania struktu¬ ry wlóknistej, w którym zdyspergowany jest pre¬ parat enzymatyczny. Z uzyskanej w taki sposób emrnsji mozna na 'mokro lub sucho otrzymywac wlókna posiadajace wewnatrz bardzo male pory, W których osadzony jest enzym osloniety bardzo cienka membrana zapobiegajaca ucieczce enzymu do srodowiska reakcji ale z drugiej strony po¬ zwalajaca na oddzialywanie katalityczne.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie rów¬ niez kwas 7-aminocefalosporanowy, przy czym ce- faloclporyne poddaje sie dzialaniu hydirolityczne- mu preparatu enzymatycznego, przygotowanego w sposób opisany powyzej, a nastepnie z mieszani¬ ny reakcyjnej wydziela sie kwas 7-aminocefalo¬ sporanowy.Podczas hydrolizy prowadzacej do otrzymywa¬ nia kwasu 7-aminocefalosporanowego* stosuje sie roztwory soli odpowiedniej cefalosporyny o ste¬ zeniu od 1 do 6*/o (waga na objetosc), korzystnie 2—#/•. Kwas 7-aminocefalosporanowy lub jego sól poddaje sie za pomoca preparatu enzymatyczne¬ go, reakcji kondensacji z kwasem karboksylowym amidem lujb N-acylopochodna glicyny przy czym wymieniony produkt hydlrolizy cefalosporyny wpro¬ wadza sie do strefy syntezy w stezeniu korzystnie 1—&I* (waga na objetosc), a w strefie syntezy utrzymuje sie wartosc pH wynoszaca okolo 6.W celu wytworzenia kwasu 7jaminoceftolospo- ranowego do strefy hydrolizy wprowadza sie sól potasowa kwasu 7-<2-fenyloacetamido) - cefalospo- ranowego* a w celu otrzymania kwasu 7-aminode- 1037 4 zoksyacetylofalosporanowego do strefy hydrolizy wprowadza sie sól potasowa kwasu 7K2-fenyloace- tamido)dezoksyacetylofalosporanowego, natomiast w celu otrzymania kwasu 7-(2-D-a-am:nofenylo- acetamido)cefalosporanowego do strefy kondensa¬ cji wprowadza sie mieszanine soli potasowej kwa¬ su 7-aminocefalosporanowego i chlorowodorku estru metylowego D-a-fenyloglicyny.Przedluzona aktywnosc nierozpuszczalnych pre- io paratów enzymatycznych upraszcza proces, a tak¬ ze obniza koszt przygotowywania enzymu w kosz¬ tach ogólnych procesu do wysokosci nie majacej praktycznie zadnego znaczenia. Sposób bedacy przedmiotem wynalazku pozwala z jednej strony na enzymatyczne rozszczepianie antybiotyków z grupy cefalosporyn naturalnych, z drugiej zas na otrzymywanie w prowadzonym w analogiczny spo¬ sób procesie pochodnych cefalosporyn.Zywica z osadzonym enzymem, po zakonczeniu procesu koagulacji i nadaniu jej struktury wlók¬ nistej, przemywana jest w celu usuniecia zaad- sorbowanych zanieczyszczen bialkowych, które moglyby przedostac sie do srodowiska i moze by£ uzywany do katalizowania reakcji. Otrzymuje sie w ten sposób produkt o wysokiej czystosci pozba¬ wiony calkowicie zanieczyszczen bialkowych stwa¬ rzajacych niebezpieczenstwo wywolywania odczy¬ nów alergicznych.Nierozpuszczalny preparat enzymatyczny moze byc uzywany w sposób periodyczny, wtedly po hydrolizie penicyliny mieszanine reakcyjna usu¬ wa sie i zastepuje swieza porcja. ^m - Te same katalizatory enzymatyczne mozna wy- korzystac w procesie ciaglym stosujac kolumne.W tym przypadku buforowany roztwór cefalospo¬ ryny przepuszcza sie przez kolumne wypelniona preparatem enzymatycznym. Utrzymuje sie przy tym wartosc pH 8 dodajac w sposób automatycz- 40 ny roztwór zasady. Zachowujac odpowiednia szyb¬ kosc przeplywu i stosujac odpowiednia ilosc pre¬ paratu enzymatycznego otrzymuje sie po wyjsciu z kolumny mieszanine o wysokim stopniu hydro¬ lizy. Te same enzymy w srodlowisku kwasnym ka- 45 talizuja acylacje kwasu 7-aminocefalosporanowe¬ go, co umozliwia enzymatyczna synteze nowych cefalosporyn. Mozliwa jest wiec, przy zastosowa¬ niu tej samej jak podczas hydrolizy aparatury, synteza cefalosporyn pólsyntetycznych w miesza- 50 nimie zawierajacej kwas 7-aminocefalosporanowy i odpowiedni kwas karboksylowy lub korzystniej bardziej aktywna jego pochodna, np. amid lub N-acylopochodna glicyny.Przyklad I. 20 g trójoctanu celulozy (Flu- 55 ka) rozpuszczono podczas mieszania w 280 ml chlorku metylenu (C. Erba). Osobno przygotowano roztwór enzymu dodajac 60 g (wilgotny produkt) komórek otrzymanych z fermentacji E. Coli na odpowiedniej pozywce w obecnosci kwasu fenylo- 60 octowego, do 0,01 molarnego buforu fosforanowe¬ go o pH — 7,0. Otrzymany material ogrzewano w ciagu 3 minut w temperaturze 50°C, a nastep¬ nie stracono siarczanem amonu przy pH 5,5 zbie¬ rajac frakcje wytracone przy 25—75a/o nasycenia. 65 Frakcje te rozpuszczono w 0,01 n buforze fosfo-99 037 ranowym o pH 8,0 zawierajacym 30*/© objetoscio¬ wych gliceryny. Otrzymany roztwór enzymu do¬ dano do roztworu trójoctanu celulozy i emulgo¬ wano mieszajac energicznie w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C, a nastepnie otrzymana emulsje wlewano do malego pojemnika i w temperaturze —6°C, cisnieniem azotu wyciskano wlókna, które koagulowano w toluenie w temperaturze pokojo¬ wej. Otrzymane wlókna suszono w ciagu jednej godziny pod zmniejszonym cisnieniem celem usu¬ niecia toluenu. 37 g otrzymanego preparatu umieszczono w ko¬ lumnie szklanej o wymiarach 70X3 cm, zaopa¬ trzonej w plaszcz termostatyczny i przemywano wodla oraz gliceryna do zaniku protein. Nastepnie przepuszczono w obiegu zamknietym 600 ml 2°/o roztworu wodnego1 soli potasowej kwasu 7-(2-fe- nyloacetamido)-cefalosporanowego., Utrzymywano pH 8, dodajac w sposób ciagly 0,5 N roztwór NaOH. Kolumne termostatowano w temperaturze 37°C. Po 5 godzinach uzyskano 98*/o hydrolizy, a otrzymany kwas 7-aminoceralosporanowy izolowa¬ no z mieszaniny reakcyjnej.Przyklad II. Powtarzajac postepowanie z przykladu I przygotowano nierozpuszczalny pre-" parat enzymatyczny ze 100 g grzybni (waga wil¬ gotna) z fermentacji Penicilium chrysogenum. g preparatu umieszczono w kolumnie o wy¬ miarach 70X3 cm. Kolumne termostatowano w temperaturze 37°C. Przepuszczono 600 ml 2f°/o roz¬ tworu wodnego soli potasowej kwasu 7-(2-feno- ^ksyacetamido)-cefalosporanowego. Po szesciu go¬ dzinach uzyskano 86f/o hydrolizy, a otrzymamy kwas 7-aminocefalosporanowy izolowano z mie¬ szaniny reakcyjnej.Przyklad III. Powtarzajac postepowanie z przykladu I przez kolumne zawierajaca 37 g pre¬ paratu enzymatycznego przepuszczano 600 ml 2P/» roztworu wodnego soli potasowej kwasu 7-(2-fe- nyloacetamido) - dezoksyacetylocefalosporanowego, utrzymujac pH 8 i temperature 37°C. Po 5 go¬ dzinach osiagnieto calkowita hydrolize, a wydaj¬ nosc kwasu 7 - aminodezoksyacetylocefalosporano- wego wynosila 85°/o.Przyklad IV. Przez kolumne zawierajaca 37 g preparatu enzymatycznego przygotowanego wedlug przykladu I, przepuszczono 500 ml roz¬ tworu zawierajacego 5 g soli potasowej kwasu T-aminocefalosporanowego i 13,1 g chlorowodorku estru metylowego D-a-fenyioglicyny, utrzymujac przy tym pH 6,5 i temperature 37°C. Po 1,5 go¬ dzinie 40% kwasu 7-aminocefalosporanowego ule¬ glo konwersji do kwasu 7-{D-a-aminofenyloace- tamldo)-cefaiosporanowego. 6 PL

Claims

Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania pólsyntetycznych cefalo- sporyn przez enzymatyczna hydrolize i konden- 5 sacje pod wplywem acylazy penicylinowej, zna¬ mienny tym, ze naturalna cefalosporyne w roz¬ tworze wodnym o stezeniu 1—61%, korzystnie 2— 3% (wagowa na objetosc) poddaje sie enzymatycz¬ nej hydrolizie pod wplywem acylazy penicylino- io wej osadzonej na polimerycznym nosniku o struk¬ turze wlóknistej, utrzymujac pH okolo 8, w tem¬ peraturze do 60°C, korzystnie 37—40°C i otrzyma¬ ny prodlukt hydrolizy w roztworze wodnym o stezeniu powyzej l°/oi, korzystnie 1—3% wagowych 15 (waga na objetosc) poddaje sie enzymatycznej kon¬ densacji pod wplywem acylazy penicylinowej osa¬ dzonej na polimerycznym nosniku o strukturze wlóknistej, utrzymujac pH okolo 6, w temperatu¬ rze do 60°C, korzystnie 37—i40°C, z odpowiednim 20 kwasem karboksylowym albo jego pochodna, ko¬ rzystnie amidem albo N-acylopochodna glicyny.
2. Sposób wedlug zastrz, 1, znamienny tym, ze do strefy hydrolizy wprowadza sie buforowany 25 roztwór cefalosporyny.
3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako nosnik stosuje sie polimery estrów lub azo¬ tanów celulozy, poliolefiny, polimery metakryla- nów, estrów winylowych, chlorku winylu, chlorku 30 winylidenu, styrenu, poliamidy i poliwinylobuty- ral.
4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do strefy hydrolizy wprowadza sie sól potasowa 35 kwasu 7-(2-fenyloacetairiido) - cefalosporanowego otrzymujac jako produkt hydrolizy kwas 7-ami¬ nocefalosporanowy.
5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 40 do strefy hydrolizy wprowadza sie sól potasowa kwasu 7-<2-fenoksyacietamido) - cefalosporanowe¬ go otrzymujac gako produkt hydrolizy kwas 7-ami¬ nocefalosporanowy.
6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 45 dio strefy hydrolizy wprowadza sie sól potasowa kwasu 7-(2-fenyloacetamido) - dtezoksyacetylocefa- losporanowego otrzymujac jako produkt hydrolizy kwas 7-aminodezoksyacetylosparanowy. 50
7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do strefy kondensacji wprowadza sie mieszanine soli potasowej kwasu 7-aminocefalosporanowego i chlorowodorku estru metylowego D-a-fenyloglicy- ny otrzymujac jako produkt kwas 7-(2-D- 55 nofenyloacetamido) - cefalosporanowy. PL