CS224610B2 - Způsob výroby polosyntetického penicilinu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby polosyntetických penicilinů acylézou 6-aminepenicillanové kyseliny vhodnými aminokyselinami nebo jejich amidy v přítomnosti penicillinacylázy.

Způsobem podle vynálezu lze získat nové polosyntetické peniciliny, stélé vůči beta-laktaméze s širším spektrem účinku.

Způsob podle vynálezu je založen na použití enzymatických přípravků, které jsou uložením ve vlákně učiněny nerozpustnými. Tím se dosáhne značného zlepšení vlastností konečného produktu a významného zjednodušení operací a v důsledku toho i snížení ceny.

Enzymatické přípravky uložená do vláknité struktury si udržují svou účinnost po velmi dlouhou dobu. Vzorky tohoto typu si při opakujících se pracovních cyklech udržely svou účinnost po 12 měsíců takřka nezměněnou.

Prodloužené účinnost struktur podle vynálezu mé vedle zřejmých výhod navíc výhodu ve zjednodušení způsobu, přičemž vliv ceny enzymatického katalyzátoru na výslednou cenu produktu je velmi malý nebo takřka zanedbatelný.

Předmětem vynálezu je způsob výroby polosyntetického penicilinu acylací kyseliny 6-aminopenicilanové ve vodném roztoku o koncentraci 1 až 3 % hmotnost/objem při pH v oblasti 6 vhodnou aminokyselinou nebo jejím amidem v přítomnosti penicilinacylázy, vyznačující se tím, že se použije penicilinacylázy uložené ve vláknech z triacetátu celulózy.

Vlákno obsahující enzym, vyrobené zvlákňováním, se před použitím promyje, aby se odstranily z vnějšku adsorbované nečistoty a po promytí se ho použije na katalýzu reakce.

Vzhledem k tomu, Se protein nemůže difundovat do okolního prostředí, získá se'vysoce čistý produkt, který krom® jiného neobsahuje bílkovinné nečistoty, tak nebezpečné v důsledku alergických reakcí. Katalyzátoru, který je úpravou podle vynálezu zbaven rozpustnosti, se může použít diskontinuélné. Katalyzátor se uvede do styku s reakční smésí a po skončení jeho působení se od reakční směsi oddělí a uvede do styku s novou šarží'čerstvé směsi.

Stejného katalyzátoru se může rovněž použít při kontinuálním způsobu v koloně. Roztok penicilinu v koloně, vhodně pufrovaný, se vede kolonou obsahující vlákno s enzymem. Vhodným nastavením rychlosti toku a množstvím vlákna je možno získat vytékající směs s nejvyššim stupněm konverze.

Enzymatický katalyzátor se připravuje způsobem popsaným v italském patentu ě. 836 462. Podle tohoto patentu se vlékna s uloženým enzymem mohou vyrobit zvlákněním roztoků vléknotvorných polymerů, ve kterých jsou dispergovány enzymatické přípravky ve velmi malých kapičkéch o velikosti řédově stejné, jako jsou kapičky emulze.

Emulze se mohou zvlékňovat za sucha nebo za mokra. Získané vlákno obsahuje uvnitř drobné dutiny, ve kterých jsou uloženy enzymy. Enzymy jsou odděleny od okolí velmi tenkou membránou, které zabraňuje uniknuti enzymů a jejich dispergaci v reakční směsi, ale umožňuje jejich katalytické působení.

V případě způsobu podle vynálezu se používá jako vléknotvorného polymeru triacetátu celulózy.

Jako enzymatického materiálu se může použít surového extraktu získaného z buněk nebo plísní nebo aotinomycetes (Aspergillus, Penioillium, Botrytis cinerea, Fusarium, Mueor, Alternaria, Streptomyces atd.) nebo surového extraktu z buněk bakterií (E. coli, B. Megaterium, Aerobacter aerogenes, Alcaligenes faecalis atd.).

Syntéza se může provádět při teplotě od 15 do 60 °C, přednostně od 37 do 40 °C.

Jako peniciliny vhodné pro syntézu je možno uvést peniciliny, které mají větěí terapeutické použití, jako například

6-(alfa-fenoxypropi onami do)pěni cilin,

6-(alfa-fenoxybutyrami do)penicilín,

6- (2,6-dimetoxybenzoami do)pěni cilin,

6-(5-metyl-3-fenyl-4-isoxazolkarboxyamido)penicilín, „6— (5 6-(5-metyl-3-o-chlorfenyl-4-isoxazolkarboxyamido)penicilín,

5-tj)(-)-alfa-aminofenylacetamidojpenicilin atd.

Výchozí kyselina 6-aminopenicilanové (6-APA) se může získat enzymatickou hydrolýzou přírodních penicilinů, jako například penicilinu O tak, že se vodný roztok penicilinu G o koncentraci 1 až 6 % hmotnost/objem hydrolyzuje při pH v oblasti 8 v přítomnosti penicilinacylázy uložené ve vláknech z triacetátu celulózy.

Přikladl

Příprava immobillzovaného enzymu

Za míchání se v reaktoru rozpustí 20 g triacetátu celulózy ve 280 g metyleňchloridu.

V jiné nádobě se připraví roztok enzymu následujícím způsobem: buňky Escherichia coli (60 g vlhké hmotnosti), získané fermentací na vhodném prostředí v přítomnosti kyseliny fenylootové, se převedou do fpsfétového pufru 0,01 M o pH 7,0. Surový produkt, který se takto získá, se zahřívá tři minuty na 50 °C a pak se sráží síranem amonným až do dosažení pH 5,5. Frakce získané v rozmezí hodnoty 25 až 75 % nasycení se oddělí. Tato frakce se roz3 pustí v 30 ml fosfátového pufru 0,01 M o pH 8, obsahujícího 30 % objemových glycerinu. Získaný enzymatický roztok se přidá k roztoku polymeru. Emulgace obou fází se dosáhne intenzívním třicetiminutovým mícháním při 0 °C.

Emulze se převede do malého zásobníku, udžoVaného při teplotě -6 °C, a pak se pod dusíkem zvlákní. Koagulace vlékna se provádí v toluenu při teplotě místnosti.

Toluen se odstraní několikahodinovým vakuovým suěenía.

Příprava vodného roztoku 6-aminopenicillanové kyseliny

Do skleněné kolony, vybavené termostatovým pléětěm o výšce 70 cm a průměru 3 cm, se umístí 37 g vláken. Vlákna se promyjí vodou a glycerolem až do vymizení bílkovin z promývacích louhů.

Kolonou se nechá cirkulovat 600 ml vodného roztoku 2% (hmotnost/objem) draselné soli penicilinu G. Hodnota pH se udržuje na 8,0 kontinuálním přidáváním 0,5 N NaOH pomocí zařízení k udržování konstantního pH. Kolona se termostatuje na 37 °C. Po 5 hodinách, kdy se rychlost spotřeby hydroxidu sodného sníží na 1/20 původní hodnoty, se reakční směs odtéhe, zchladí na 3 °C, okyselí 2 N HC1 na pH 3,0 (33,5 ml 2 N HC1) a extrahuje dvakrát 200 ml butylaoetátu.

První extrakt obsahuje 298 mg a druhý extrakt 2 mg penicilinu (stanovení pomocí hydroxylaminu). Vzhledem k tomu, že celkové množství nasazeného penicilinu bylo 12 g, je konverze 97 % Chromatograficky se nezjistí žádné rozkladné produkty.

Příprava ampi ci llinu [6-(D-(-)-alfa-aminofenylace táni do)pěni clllinu]

Hodnota pH vodného roztoku 6-APA obsahujícího 8,5 mg/ml 6-APA se nastaví na 6,0 a přidá se D-alfa-aminofenylacetamidohydrobromid (výsledné koncentrace 10 mg/ml).

Vzniklý vodný roztok se nechá cirkulovat stejnou kolonou, termostatovanou na 37 °C, přičemž pH se udržuje na hodnotě asi 6,0. Po 6 až 7 hodinách cirkulace se syntetizuje ampicillin ve výtěžku asi 90 %.

Příklad 2

Postupuje se způsobem popsaným v příkladu 1, pouze s tím rozdílem, že se místo D-alfa-aminofenylaeetamidhydrobromidu použije DL-amidu kyseliny mandlové v koncentraci 12 mg/ml a pH se udržuje na asi 5,5. Po 6 hodinách se získá alfa-hydroxybenzylpenicilin ve výtěž-

Claims (1)

1. ku 90 %.

   pSedmět vynálezu

   Způsob výroby polosyntetického penicilinu acylací kyseliny 6-aminopenicilanové ve vodném roztoku o koncentraci 1 až 3 % hmotnost/objem při pH v oblasti 6 vhodnou aminokyselinou nebo jejím amidem v přítomnosti penicilinázy, vyznačující se tím, že se použije penicilinacylásy uložené ve vláknech z triacetétu celulózy.