PL91696B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych pirazolowych o wlasci¬ wosciach przeciwbakteryjnych, przeciwgrzybowych i przeciwpierwotniakowych.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie po¬ chodne pirazolowe o wzorze 1, w którym R ozna¬ cza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla albo hydroksyalkilowa o 1—3 atomach wegla, R1 ozna¬ cza grupe NH2, R2 oznacza grupe cyjanowa.Przeprowadzono duza liczbe badan nad znale¬ zieniem srodków do zwalczania infekcji u drobiu, swin i bydla, spowodowanych bakteriami i pier¬ wotniakami. Tak wiec przedmiotem szerokich ba¬ dan od wielu lat byly zwiazki i sposoby zwalcza¬ nia Escherichia coli, Pasteurella multocida, Sal¬ monella typhimurium oraz kokcydioza u kurczat, jak równiez Treponema hyodysenteriae u swin.W belgijskim opisie patentowym nr 751 453 opi¬ sano podstawione zwiazki 5-nitrofuranowe i 5-ami- no-4-cyjano-l-metylo-3-(5-nitro-2-furylo)-pirazolu, sposoby wytwarzania tych zwiazków oraz leki za¬ wierajace podstawione nitrofurany jako skladnik czynny. Podaje sie ,ze ziwiazkd wykazuja wlasci¬ wosci przeciwbakteryjne, przeciwczerwiowe i prze- orwpierwotniakowe, jak równiez dzialanie jako srodki kokcydiostatyczne, przeciwswidrowcowe i srodki przeciwmalaryczne.Takze i w belgijskim opisie patentowym nr 782 851 opisuje sie 2-(5-nitTO-2-imidazolilo)-pirymidy- ny oraz sposoby ich otrzymywania. Podaje sie, ze ii zwiazki te sa czynne jako srodki przeciwrzesistko- we bakteriobójcze i przeciwgrzybiczne, jak rów¬ niez sa uzyteczne przy leczeniu infekcji pochwo¬ wych.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 452 034 znane sa podstawione 2- -(l,3,4-tiadiazolil-2)-4-|(5)-nitroimidazole oraz ich otrzymywanie. Podaje sie, ze zwiazki te sa uzy¬ teczne jako srodki przeciwbakteryjne i amebobój- cze, przeciwrzesistkowe oraz kokcydiostatyczne.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 682 942 znane sa sposoby wytwarza¬ nia 2-(2-amino-l,3,4-tiadiazolilo-5)-l-podstawionych -nitroimidazoli. Sadzi sie, ze produkty te sa uzy¬ teczne do zwalczania infekcji bakteryjnych, pa¬ sozytniczych i pierwotniakowych u drobiu i zwie¬ rzat, i ze sa skuteczne przeciw infekcjom u dro¬ biu i zwierzat, spowodowanym przez Tirichomonas vaginalis i Salmonella gallinaruni, jak opisano przez Berkelhammera i wspólpacowników w opi¬ sie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 452 035.Podstawione w polozeniu 2 przez pierscieniowe uklady heterocykliczne 5-nitroimidazole ujawnia Rufer i wspólpracownicy, Progr. Antimikrob. Anti- -cancer Chemother., Proc. Int. Congr. Chemother., 6-y 1969 (publikowany 1970), 1, 145—8. (Univ. Park Press: Baltimore, Maryland); Chem. Abstr. 74, 141632 z (1971). Autorzy ci podaja, ze zwiazki te sa czynne przeciw Trichomonas vaginallis in vitro, 91 69691 « 3 2 opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 682 953, znane sa podstawione 3-(5- -nitro-2-furylo) pirazole i ich farmaceutycznie przy¬ datne sole addycyjne z kwasami oraz zawierajace te zwiazki kompozycje farmaceutyczne i paszowe, a jak równiez na sposoby leczenia infekcji bakteryj¬ nych u ssaków oraz sposoby ochrony materialu or¬ ganicznego przed atakiem bakterii przy zastoso¬ waniu zastrzezonych zwiazków. Twierdzi sie, ze zwiazki te wykazuja czynnosc przeciwbakteryjna, 10 przeciwczerwiowa, przeciwpierwotniakowa, kokcy- diostatyczna, przeciwswidrowcowa oraz przeciw- malaryczna.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 682 956 znane jest, ze 5-amino-4-kar- i« bonyio-3-(5-nitro-2-furylo) pirazole wykazuja czyn¬ nosc przeciwbakteryjna. Zwiazki stosuje sie w taki sam sposób jak opisano w opisie patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki nr 3 682 953.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych 2o Ameryki nr 3 716 555 znane sa pochodne 3-(5-nitro- -2-furylo) pirazolu i to, ze zwiazki te posiadaja wlasciwosci przeciwbakteryjne.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 719 759, znane sa srodki przeciw- M pierwotniakowe zawierajace nitroimidazole. Opi¬ sane nitroimidazole obejmuja 1-podstawione 2- -arylo-5-nitroimidazole, w których aryl oznacza podstawiony lub niepodstawiony fenyl lub naftyl, a podstawnik w polozeniu 1 oznacza nizsza grupe s0 alkilowa. Podaje sie, ze zwiazki te sa skuteczne przeciw infekcjom spowodowanym przez pierwot¬ niaki, taikhn jak hi&tomonioza, zakazenie rzesist- kiem, amebiaza i swidrowica, jak równiez przeciw robakom, takim jak szczepy Heterakis i Ascarid, oraz bakteriom, takim jak szczep Salmonella, Streptococcus i Escherichia coli oraz przeciw or¬ ganizmom czynnym przy zapaleniu pluc i opluc¬ nej.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 399 211 znane sa sposoby wytwarza¬ nia zwiazków stosowanych w srodkach przeciw- pierwotniakowych opisanych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 719 759., Zwiazki opisane uprzednio i wyzej wymienione róznia sie znacznie budowa od zwiazków wytwa¬ rzanych sposobem wedlug wynalazku.Sposób wedlug wynalazku polega na reakcji zwiazku o wzorze 2, w którym R ma wyzej podane znaczenie z malononitrylem w obecnosci akcepto¬ ra kwasowego.W podstawnikach we wzorze 1 grupa alkilowa o 1—3 atomach wegla oznacza nasycony rodnik weglowodorowy o lancuchu prostym lub rozgale¬ zionym, tak jak metylowy, etylowy, n-propylowy, } izopropylowy.Grupa hydroksyalkilowa o 1—3 atomach wegla oznacza grupe hydroksymetylowa |3-hydroksyety- lowa oraz Y-hydroksypropylowa.W sposobie wedlug wynalazku jako odpowiednie srodki wiazace kwasy stosuje sie aminy organicz- 60 ne, takie jak metyloamina, etyloamina, trój etylo- amina i tym podobne.Nowe zwiazki o ogólnym wzorze 1, wytwarza •sie latwo wychodzac z dostepnego w handlu 2- --. -metylo-5-niiro-imidazolu. Zwiazek ten poddaje w 4 sie reakcji z odpowiednim srodkiem alkilujacym, takim jak siarczan dwumetyilu, w odpowiednim rozpuszczalniku, na przyklad benzenie, uzyskujac zwiazek zidentyfikowany jako l,2-dwumetylo-5- -nitroimidazol. Ten ostatni zwiazek poddaje sie nastepnie reakcji z benzaldehydem w obecnosci zasady, na przyklad etanolanu sodowego w bez¬ wodnym etanolu, otrzymujac l-metylo-5-nitro-2- styryloimidazol.Nastepny etap syntezy nowych zwiazków we¬ dlug wynalazku polega na utlenianiu wiazania styrylowego w l-metylo-5-nitro-2-styryloimidazolu.Mozna tego dokonac przy pomocy szeregu utle¬ niaczy nadajacych sie do utlenienia tego typu wiazania do grupy aldehydowej (formylowej).Utlenianie przeprowadza sie przez potraktowa¬ nie l-metylo-5-nitro-2-styryloimidazolu, zawieszo¬ nego w odpowiednim rozpuszczalniku, ozonem w temperaturze w przyblizeniu pokojowej. Do od¬ powiednich rozpuszczalników nalezy metanol, mie¬ szanina metanolowo-wodna albo mieszanina me¬ tanolu, chlorku metylenu i wody, i tym podobne.Utlenienie zwiazku styrylowego mozna prowadzic równiez sposobem podanym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 472 864. Zba¬ dano uklad utleniajacy skladajacy sie z nadjodanu metalu alkalicznego i cz-terotlenku osmu w odpo¬ wiednim srodowisku wodnym, zwlaszcza w wodzie i 1,2-dwumetoksyetanie, w temperaturze okolo 20— °C, w czasie okolo 10—20 godzin. . 1 rinetylo-5-nitroimidazolo-2-karboksyaldehyd, uzyskany jednym z dwóch wyzej wymienionych sposobów, jest podstawowym glównym materialem wyjsciowym stosowanym w sposobie wedlug wy¬ nalazku do wytwarzania nowych zwiazków.Nastepny etap wytwarzania nowych zwiazków polega na reakcji l-metylo-5-nitroimidazolo-2- -karboksyaldehydu, otrzymanego powyzej, z pod¬ stawiona hydrazyna o wzorze H2N-NHR, w którym R oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla lub hydroksyalkilowa o 1—3 atomach wegla. Re¬ akcje prowadzi sie w odpowiednim rozpuszczal¬ niku, takim jak chloroform, w temperaturze wrze¬ nia pod chlodnica zwrotna, uzyskujac alkilo-hy- drazon lub hydroksyalkilohydrazon l-metylo-5- nitroimidazolo-2-ka'rboksyaldehydu. Do odpowied¬ nich podstawionych hydrazyn stosowanych w tej reakcji nalezy metylohydrazyna, etylohydrazyna, n-propylohydrazyna, izopropylohydrazyna, 2-hydro- ksyetylohydrazyna, i tym podobne. Warunki re¬ akcji sa takie same dla wszystkich hydrazyn. Za¬ tem na przyklad, jesli metylohydrazyne poddaje sie reakcji l-metylo-5-nitroimidazolo-2-karboksy- aldehydem w chloroformie, to otrzymuje sie mety- lohydrazon 1 -metylo-5-nitroimidazolo-2-karboksy- aldehydu.Utworzone w ten sposób hydrazony poddaje sie reakcji z N-bromosukcynimidem w przyblizeniu w temperaturze pokojowej w odpowiednim roz¬ puszczalniku, takim jak chloroform, otrzymujac l-metylo-5-nitroimidazolo-2-karbonylo-bromoalkilo- lub hydroksyalkilohydrazony. Reakcja z N-bromo¬ sukcynimidem nadaje sie do jakiegokolwiek pod¬ stawionego hydrazonu i prowadzi do bromopodsta- wionych hydrazonów. Na przyklad, jesli metylo- hydrazon l-metylo-5-nitroimidazolo-2-kairboksyal-5 dehydu poddaje sie reakcji z N-bromosukcynimi- dem w temperaturze pokojowej w chloroformie, to otrzymuje sie l-metylo-5-nitroirnidazolo-2-karbo- nylobromometylohydrazon.Podstawiony bromem hydrazon jest nietrwaly 5 i posiada wlasciwosci parzace i lzawiace. Z tego powodu wykorzystuje sie go bez wydzielania lub dokladniejszego oczyszczania. Z podstawionego bromem hydrazonu wytwarza sie zawiesine w od¬ powiednim rozpuszczalniku, na przyklad bezwod- 10 nym metanolu i dodaje malonitryl. Nastepnie do tak utworzonej mieszaniny dodaje sie trójetyio- amine rozpuszczona w bezwodnym metanolu, przy czym mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w tem¬ peraturze okolo 10—20°C przy pomocy odpowied- 15 niego srodka chlodzacego. Reakcja ta jest nieznacz¬ nie egzotermiczna i aby utrzymac zadana tempe¬ rature potrzebne jest chlodzenie. W miare postepu reakcji poczatkowo zólta zawiesina rozpuszcza sie i w czasie okolo 1—2 godziny zostaje zastapiona 20 przez inna zawiesine. Staly material w tej drugiej zawiesinie jest zadanym produktem, który odsacza sie, przemywa metanolem, a nastepnie woda i su¬ szy.Jesli na przyklad stosuje sie l-metylo-5-nitroimi- 25 dazolo-2-karbonylo-bromometylohydrazon, to na podstawie analizy elementarnej i widma NMR sta¬ ly material identyfikuje sie jako 5-aminorl-metylo- -3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo(pirazolo-4-karbo- nitryl. Homologiczne 5-amino-l-(alkilo lub hydro- 30 ksyalkilo)-3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazo- lo-4-karbonitryle mozna zsyntezowac z odpowied¬ nich bromopodstawionych alkilo- lub hydroksyal- kilohydrazonów postepujac w taki sam sposób, jak przy reakcji z malonitrylem. 35 Zwiazki objete wzorem 1, wykazywaly in vitro czynnosc przeciw nastepujacej grupie drobnoustro¬ jów, z których wiele jest czynnikiem chorobo¬ twórczym u zwierzat: Escherichia coli, Salmonella dublin, Arizona paracolon, Pseudomonas, Pasteurel- r, la multocida: (wydzielona z wolu), (wydzielona z ptaków), (wydzielona ze swin), Pasteurella hemo- lytica), Streptococcus (zapalenie sutek), Staphylo- coccus (zapalenie sutek), Streptococcus grupy E, Spherophorus necrophorus, Bordetella bronchisep- tica, Erisipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma gal- lisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma hy- opneumoniae, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplas¬ ma hyorhinis, Mycoplasma T-strain (z wolu), Bac¬ teroides fragilis.Ustalono, ze nowe zwiazki o wzorze ogólnym 1, wykazuja takze czynnosci in vivo. Stwierdzono zatem, ze sa one uzyteczne przy kontrolowaniu szeregu infekcji u zwierzat, takich jak Escherichia coli u drobiu, Pasteurella multocida u kurczat, in¬ dyków i myszy, oraz Salmonella typhimurium u " kurczat. Kontrole tych organizmów przeprowadza sie przez podawanie skutecznych dawek zwiazku drobiu lub myszom albo przez zastrzyk, albo do¬ ustnie w karmie. Ustalono, ze zwiazki byly takze skuteczne jako promotory wzrostu, gdy podawano G0 je kurczetom.Stwierdzono takze, ze nowe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazuja aktywnosc in vivo i in vitro przeciw Treponema hyodysen- teriae, która powoduje biegunke u swin. Biegunka 65 S swinska jest zakazna choroba infekcyjna charakte¬ ryzujaca sie sluzowo-krwistym rozwolnieniem.Choroba ta ma duze znaczenie ekonomiczne z po¬ wodu strat jakie ponosi sie wskutek zmniejszone* go przyrostu, gorszego wykorzystania paszy oraz padniec. Wystepowanie choroby jest czeste zarów¬ no w Stanach Zjednoczonych, jak i w tych kra¬ jach gdzie istnieje intensywna hodowla swin.Nowe zwiazki wykazuja ponadto aktywnosc in vitro przeciw szeregowi bakterii beztlenowych, takich jak: Actinomyces bovis 13684, Clostridium inocuum 1373, Clostridium perifingens 81, Clostri- dium ramosum 1313, Clostridium septicum 1128, Clostridium septicum oovine, Eubacterium aerofa- ciens 1235, Peptococcus anaerobius 1428, Papto- streptococcus intermedius 1264, Propionibacterium acnes 44, Propionibacterium acnes 79, Bacteroides fragilis sp. fragilis 1877, Bacteroides fragilis s$. fra¬ gilis 19368, Bacteroides fragilis sp. thetaiotaomioron 1438, Bacteroides fragilis sp. vulga roides fragilis sp. vulgatus 1211, Fusofoacterium symbiosum 1470, Fusobacterium neorophorum 13859, VeiUonella alcalescens 1.Nowe zwiazki otrzymane sposobem wedlug ni¬ niejszego wynalazku posiadaja cenne wlasciwosci przeciwdrobnoustrojowe^ a zwlaszcza wykazuja uzyteczna w weterynarii czynnosc przeciwbakte- ryjna, przeciwgrzybowa i przeciwpierwotniakowa.Zwiazki te sa szczególnie cenne przy leczeniu in¬ fekcji u drobiu, spowodowanych przez Escherichia coli, Pasteurella multocida i Salmonella typhimur¬ ium, a takze sa czynne jako promotory wzrostu u pisklat.Zatem przy leczeniu infekcji u pisklat, spowo¬ dowanej przez Escherichia coli, skuteczne jest po¬ dawanie w karmie zwiazku o wzorze ogólnym 1, patrz wyzej, w ilosci okolo 50—200 g na tone karmy.Infekcje u kurczat i indyków, spowodowane przez Pasteurella multocida, opanowuje sie sku¬ tecznie przez podawanie jednego z nowych zwiaz¬ ków w ilosci okolo 100 g na tone karmy.Takze u kurczat opanowanie infekcji spowodo¬ wanych przez Salmonella typhimurium przeprowa¬ dza sie droga doustnego podawania jednego z no¬ wych zwiazków w ilosci okolo 25—100 g zwiazku na 1 tone karmy. Zatem infekcje u kurczat i in¬ dyków, spowodowane przez Escherichia coli, Pas¬ teurella multocida i Salmonella typhimurium, opa¬ nowuje sie przez doustne podawanie jednego z no¬ wych zwiazków, w ilosci okolo 25—200 g na 1 t$- ne karmy.Opanowanie infekcji u kurczat, spowodowanych przez Salmonella typhimurium, mozna przeprowa¬ dzic przez podskórne podawanie nowych zwiazków, w dawkach okolo 3—60 mg na kilogram wagi ciala.Infekcje u mysz, spowodowane przez Pasteurel¬ la multocida, opanowac mozna przez dootrzewno¬ we wstrzykiwanie zwiazku w ilosci 2,5 mg na ki¬ logram ciala zwierzecia. Infekcje te mozna rów¬ niez opanowac przez podanie doustne okolo 100 g zwiazku na 1 tone pozywienia.Badano jeden z nowych zwiazków, 5-amino-l- metylo-3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)-pirazolo- -4-karbonitryl, i stwierdzono, ze jest on skuteczny91696 8 jako hormon wzrostu, gdy podawany jest doustnie piskletom w dawkach okolo 50 g na 1 tone karmy.Wyzej opisana czynnosc przeciwdrobnoustrójowa tych zwiazków stwierdzono w szeregu wielostron¬ nych prób, jak opisano w dalszym ciagu niniejsze¬ go opisu.Doswiadczenie 1. Badano skutecznosc nowych zwiazków przeciw infekcjom u myszy spowodo¬ wanym przez Pasteurella multocida, przy podawa¬ niu droga wstrzykiwania.Do badan wykorzystano szwajcarskie myszy plci zenskiej o ciezarze 15—20 g. Po odwazeniu mg badanego zwiazku rozpuszczono go w 0,5 ml sulfotlenku dwumetylowego i tak przygotowany roztwór dodano do 9,5 ml zawiesiny soli sodowej karboksymetylocelulozy. Myszom, w grupach po sztuk wstrzykiwano do otrzewnej 0,1 ml w po¬ wyzszy sposób przygotowanej kompozycji doswiad¬ czalnej, co odpowiada dawce 2,5 mg na kilogram ciezaru ciala myszy. Zwiazki badane byly w daw¬ kach 2,5; 5,0 i 7,5 mg na 1 kilogram ciezaru ciala myszy, przy czym sposób przygotowania dawek ,0 i 7,5 mg/kg byl taki sam jak dawki 2,5 mg/kg.Bezposrednio po zazyciu badanego zwiazku myszy byly zakazane podskórnie przy pomocy 16- i 20- godzinnej tryptozowej kultury Pasteurella multo¬ cida, stosujac rozcienczenia równe dziesietnemu logarytmowi 10-4, 10~5, IO-6 i 10~7, przy uzyciu 0,1 mina mysz. Zakazano takze podobne grupy mysz kontrolnych, których przedtem nie traktowano no¬ wymi zwiazkami, przy czym szczepionke zakaza¬ jaca podawano podskórnie. Badane grupy myszy obserwowano codziennie na smiertelnosc oraz na ogólna smiertelnosc w grupach traktowanych no¬ wymi zwiazkami w porównaniu ze smiertelnoscia w grupach kontrolnych nie traktowanych nowymi zwiazkami. Wyniki badan zebrane sa w tabeli I, przy czym kazdy badany zwiazek zidentyfikowa¬ ny jest przy pomocy numeru przykladu, w którym opisano jego synteze.Tabela I Zwiazek I Gru'py kon¬ trolne zaka¬ zone II Grupy kon¬ trolne ;zaka- | zone Dawka w mg/kg V ,0 2;5 — ,0 — Rozcien¬ czenie -* io-» -6 -* io-5 io-« -7 io-4 IO"5 -6 -' io-4 IO"5 -6 IO-' io-4 IO"5 -6 , io-4 IO"5 -6 Przezycie wzgledne 7/10 jft/10 /10 3/10 91/10 18/20 /10 lj/10 3/20 24/30 imo 1/10 1/20 a/30 115/20 2/10 mo 9/10 3/10 /10 1/10 , 49 50 W podanej tabeli w kolumnie 1 wyszczególniono badany zwiazek, w kolumnie 2 dawke badanego zwiazku w mg/kg ciezaru ciala myszy, w kolum¬ nie 3 rozmieszczenie organizmu zakazajacego, a w kolumnie 4 przezycie wzgledne to jest stosunek liczby mysz, które przezyly próbe, przy danej daw¬ ce i rozcienczeniu, do liczby mysz poddanych pró¬ bie.Doswiadczenie 2. W podobny sposób oceniano efektywnosc nowych zwiazków przy opanowywa¬ niu infekcji u kurczat, spowodowanych przez Sal¬ monella typhimurium.Doswiadczenie przeprowadzono na 1-dniowych piskletach o ciezarze okolo 33 g kazde. Z uwagi na wielkosc dawki piskleta podzielono na grupy po 5 sztuk. Czesc pisklat otrzymala badany zwia¬ zek, w postaci zawiesiny w 0,2 ml glikolu poli¬ etylenowego 200, droga podskórnego zastrzyku w szyje. Grupa kontrolna zwiazku nie otrzymala.Wszystkie piskleta zakazano przy pomocy kultu¬ ry bakteryjnej w rozcienczeniu 1:200, przez wstrzykniecie 0,1 ml domiesniowo w noge kazdego pisklecia. Piskleta obserwowano przez 6 dni, przy czym liczbe przypadków smiertelnych w grupie kontrolnej porównywano z liczba przypadków smiertelnych u pisklat, które otrzymaly badany zwiazek. Wyniki badan zebrano w tabeli 2. Bada¬ ne zwiazki oznaczono w taki sam sposób, jak po¬ dano w doswiadczeniu 1.W podanej tabeli II w kolumnie 1 wyszczegól¬ niono badane zwiazki, w kolumnie 2 dawke ba¬ danego zwiazku w mg/kg, a w kolumnie 3 prze¬ zycie wzgledne.Tabela II 60 Zwiazek I II - Grupy kontrolne zakazone Dawka mg/kg 60 7,5 3,75 60 7,5 — Przezycie wzgledne 47/70 27/50 "36/50 22/35 11/25 (14/15 6/15 1/15 1/5 91/50 Doswiadczenie 3. Dzialanie nowych zwiazków o ogólnym wzorze 1, przy podawaniu doustnym przeciw Pasteurella multocida, rasa wyizolowana z wolu, u mysz, jako zwierzat — zywicieli, wyka¬ zano w sposób nastepujacy: Do doswiadczenia wykorzystano biale myszy szwajcarskie plci zenskiej o ciezarze 15—20 g kaz¬ da. Siedem grup po dziesiec myszy w kazdej trak¬ towano dawka 100 g badanego zwiazku na 1 tone pozywienia. Srodek leczniczy w pozywieniu my¬ szy otrzymywaly przez 2 dni przed zakazeniem i przez 7 dni po zakazeniu. Podobne grupy myszy, lecz zywione bez srodka przeciwdrobnoustrojowe¬ go, wykorzystano jako grupy kontrolne. Zarówno grupy myszy traktowanych nowymi zwiazkami, jak i grupy kontrolne, zakazano przy pomocy 16—91 696 godzinnej kultury Pasteurella multocida, rasa wyizolowana z wolu, w rozcienczeniu równym lo- garytmowi dziesietnemu z 10-2-^10-8, w dawce 0,1 ml na mysz podawanej podskórnie. Myszy ob¬ serwowano przez 7 dni, po czym obliczono dawke polowicznej smiertelnosci LD50 dla róznych trak¬ towanych grup mysz, jak równiez dla grup kon¬ trolnych. Odejmujac wartosc LD50 kazdej trakto¬ wanej grupy od wartosci LE50 grupy kontrolnej otrzymuje sie liczbe zwana wskaznikiem ochron- nosci. Im wyzsza jast wartosc wskaznika ochron- nosci, tym wieksza jest czynnosc zwiazku przeciw infekcji.Wyniki tego doswiadczenia dla trzech najbar¬ dziej czynnych zwiazków zestawiono w tabeli III, przy czym w kolumnie 1. wyszczególniono badane zwiazki, zidentyfikowane w sposób podobny jak podano w doswiadczeniu 1, a w kolumnie 2 poda¬ no wskaznik ochronnosci zwiazku.Tabela III Zwiazek I i Wskaznik ochronnosci ,6 13 Doswiadczenie 4. W doswiadczeniu tym oznaczo¬ no dzialanie niektórych nitroimidazoli przeciw Sal¬ monella typhimurium u pisklat, przy podawaniu ich w karmie.Jednodniowym piskletom, podzielonym na gru¬ py po 12 sztuk, podawano w sposób ciagly zwia¬ zek I w dawkach po 100, 50, 25 i 10 g na tone karmy. Do doswiadczenia wlaczono kilka serii nie- leczonych zakazonych zwierzat grup kontrolnych.Pierwszego dnia wszystkim seriom podano do pi¬ cia 50 ml tryptozowej kultury Salmonella typni- murium, która umieszczono jako pierwszy napój w poidle i która sluzyla jako srodek zakazajacy.Codziennie rejestrowano smiertelnosc, a piskle¬ ta które przezyly, wazono 10-ego dnia, to jest dnia zakonczenia doswiadczenia. Wyniki zebrano w ta¬ beli IV, przy czym badane zwiazki oznaczone sa w sposób podany wyzej, w kolumnie 1 wyszczegól- . niono badany zwiazek, w kolumnie 2 dawke ba¬ danego zwiazku w gramach na tone karmy, w ko¬ lumnie. 3 podano numer serii kontrolowanej na kazdy zwiazek i kazda dawke, w kolumnie 4 prze¬ zycie wzgledne, a w kolumnie 5 przecietny kon¬ cowy ciezar kurczat.T a bel a IV Kontrola Salmonella typhimurium u Zwiazek I Grupy kontrolne zakazone . I .Grupy kontrolne zakazone I Grupy kontrolne zakazone ¦I Grupy kontrolne zakazone Dawka gj/tbna 100 —f 50 -— —J — Numer serii 3 6 3 6 3 6 •3 6 kurczat (doustnie) Przezycie wzgledne /36 24/72 36/36 45/72 36/36 47/72 28/36 59/72 Sredni koncowy ciezar kurczat 105 g 85 116 94 121 98 97 98 Doswiadczenie 5.A. Wybrane przyklady nowych zwiazków ocenio¬ no z punktu widzenia ich dzialania przeciw infek¬ cji u kurczat spowodowanej przez Pasteurella multocida przy podawaniu doustnym. 4—5-tygodniowe kurczeta podzielono na grupy po 8 sztuk i podawano im w karmie nowe zwiaz¬ ki. Dla kazdego zwiazku przeprowadzono dwie serie doswiadczen. Dwadziescia cztery godziny po rozpoczeciu podawania zwiazku w karmie, grupy zwierzat traktowane, jak równiez kontrolne grupy zwierzat nietraktowane, zakazono dozylnie brzecz¬ ka kultury Pasteuroila multocida. Kazde kurcze otrzymalo 0,5 ml 12-godzinnej tryptozowej kultury w 100-krotnym rozcienczeniu. Kurczeta obserwo- 53 60 65 wano przez 7 dni po zakazeniu porównujac smier¬ telnosc w grupach traktowanych ze smiertelnoscia w grupie kontrolnej. Z kazdego kurczecia padlego podczas próby pobrano serce i watrobe, w celu zbadania ich na obecnosc Pasteurella multocida.Po zakonczeniu doswiadczenia wszystkie zywe kurczeta zostaly zabite, po czym wyjeto im serca i watroby w celu ustalenia obecnosci Pasteurella multocida.Wyniki doswiadczenia zebrano w tabeli V, przy czym w kolumnie 1 tej tabeli wyszczególniono badany zwiazek, w kolumnie 2 podano wielkosc dawki, w kolumnie 3 numer serii, w kolumnie 4 wydzielenie kultury Pasteurella multocida, a w kolumnie 5 przezycie wzgledne.11 91696 Tabela V 12 Kontrola Pasteurella multocida u kurczat 'Zwiazek I Grupy kontrol¬ ne zakazone Dawka gl/tona 100 Sleria 1 •2 calkowite 1 2 calkowite Wydzielenie kultury Pasteurella multocida 0/ 8 1/ 8 ~1/16~ 8/ 8 8/ 8 16/16 Przezycie wzgledne 8/ 8 8/ 8 16/16 0/ 8 2/ 8 | 2/16 \ B. To samo doswiadczenie przeprowadzono na indykach. Do próby wykorzystano 8-tygodniowe indyki, przy czym badane zwiazki podawano in¬ dykom w karmie. Po uplywie 24 godzin po rozpo¬ czeciu podawania zwiazków indyki zakazano przy pomocy 0,5 ml brzeczki kultury Pasteurella multo¬ cida, w 100-krotnym rozcienczeniu. Doswiadczenie kontynuowano przez 7 dni po zakazeniu, porównu¬ jac liczbe indyków padlych w grupach traktowa¬ nych z liczba indyków padlych w grupie kontrol¬ nej. Podobnie jak w doswiadczeniu z kurczetami, indykom padlym podczas próby pobrano serce i watrobe w celu zbadania na obecnosc Pasteurel¬ la multocida. Indyki, które przezyly zostaly za¬ bite i równiez pobrano im serca i watroby w celu zbadania na obecnosc Pasteurella multocida.Wyniki doswiadczenia zebrano w tabeli VI, przy czym w kolumnie 1 tabeli wyszczególniono bada¬ ny zwiazek, w kolumnie 2 podano dawke badane¬ go zwiazku w gramach na tone karmy, w kolum¬ nie 3 stosunek liczby indyków, z których wyho¬ dowano Pasteurella multocida, do liczby indyków badanych, a w kolumnie 4 przezycie wzgledne.Tabe 1 a VI Kontrola Pasteurella multocida u indyków Zwiazek I Grupy kontrolne zakazone Dawka g/tona 100 Wydzielenie kultury Pasteurella multocida 0/5 4/5 Przezycie wzgledne /5 1/5 Doswiadczenie 6. W nizej podany sposób prze¬ prowadzono ocene skutecznosci wybranych nitro- imidazoli, przy podawaniu doustnym, przeciw in¬ fekcji u kurczat, spowodowanej przez Escherichia coli. -tygodniowym kurczetom typu brojlerów pod¬ wiazano skrzydla i kazde indywidualnie zwazono, po czym utworzono serie po 8 kurczat w ten spo¬ sób, ze sredni ciezar kurczat w kazdej serii byl taki sam. Kazde traktowanie zwiazkiem przepro¬ wadzono dla trzech serii. Podawanie zwiazku do karmy rozpoczeto na 24 godziny przed zakazeniem. 40 45 Do zakazenia zastosowano Escherichia coli, rasa nr 2-1-8. Szczepionka zakazajaca bylo 0,5 ml 15-18- -godzinnej tryptozowej kultury, w 10-krotnym roz¬ cienczeniu, podawanej do prawego piersiowego worka powietrznego kazdego kurczecia. Osiem do dziesieciu dni po zakazeniu wszystkie zyjace kur¬ czeta wazono i badano na zmiany chorobowe; Kazde kurcze, które padlo podczas doswiadczenia, bylo takze badane na zmiany chorobowe, takie jak zapalenie osierdzia i watroby, a takze na obecnosc Escherichia coli. Sredni ciezar ptaka przed trak¬ towaniem nowymi zwiazkami wynosil 790 g. Ba¬ dany zwiazek oznaczono liczba 1.Tabela VII Zwiazek I Grupy kon¬ trolne zaka¬ zone Grupy kon¬ trolne Dawka g/tona 300 200 100 0 0 Liczba kurczat ze zmia¬ nami chorobowymi (liczba kurczat w grupie) 1/24 8/24 16/24 /28 0/16 Przecietny ciezar kurczecia 1014 g 1104 1058 907 1094 Przezycie wzgledne 24/24 24/24 24/24 28/32 16/1613 Wyniki doswiadczenia zebrano w tabeli VII, przy czym w kolumnie 1 wyszczególniono badany zwiazek, w kolumnie 2 podano wielkosc dawki, w kolumnie 3 stosunek liczby kurczat ze zmia¬ nami chorobowymi do liczby kurczat badanych, w kolumnie 4 przecietny ciezar kurczecia, a w ko¬ lumnie 5 przezycie wzgledne.Doswiadczenie 7. Zwiazek 1, 5-amino-l-metylo- -3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazoliloVpirazolo-4-karbo- nitryl, podawano piskletom przeznaczonym na brojlery, w celu oceny jego skutecznosci, jako pro¬ motora wzrostu.Zwiazek w ilosci 50 g na tone typowej karmy dla brojlerów (o podanym nizej skladzie) poda¬ wano wszystkim 8 seriom po 8 ptaków w kazdej serii przez czas trwania doswiadczenia.Tabela VIII 91 696 14 Pasza dla brojlerów Skladniki Kukurydza, zólta, zmielona Makuchy sojowe, luszczone, ekstraho¬ wane rozpuszczalni¬ kami (50°/o) Tluszcz zwierzecy Maczka rybna ze skladnikami rozpuszczalnymi (60%) Wysuszone, rozpusz¬ czalne skladniki go- rzelnicze z kukurydzy Fosforan dwuwap¬ niowy, paszowy Weglan wapnia ((zmielony wapien) Mieszanka witami¬ nowa TK-01 (1,03)! Sól (NaCI) Mieszanka mineralna TK-01 1,02)* Hydroksylowy analog metioniny Procenty 50,0 ,9 6,5 ,0 4,0 1,8 0,8 0,5 0,3 0,1 0,1 100 kg/tona 500 309 65 50 4 18 8 3 2 (2 1000 95 43 1 Mieszanka witami/nowa zawiera 3000 jednostek witaminy A, 900 jednostek witaminy D, 40 mg witaminy E, 0,7 mg witaminy K, 1000 mg choliny, 70 mg niacyny, 4 mg kwasu pantotenowego, 4 mg ryboflawiny, 0,10 mg witaminy B1B, 0,10 mg bio- tyny i 125 mg etoksychiny na kilogram pelnego pozywienia. 2 Mieszanka mineralna zawiera 75 mg manganu, 50 mg cynku, 25 mg zelaza i 1 mg jodu na kilo¬ gram pelnego pozywienia.Przed podaniem zwiazku wszystkie ptaki trzy¬ mano przez 7 dni w zagrodach klepiskowych. Okres traktowania wynosil 21 dni w bateriach star¬ towych, przy czym wode i karme podawano przez caly czas do woli. W okresie wstepnym podawano bez dodatku zwiazku.Wyniki doswiadczenia przedstawiono w tabeli IX, przy czym w kolumnie 1 tabeli IX wyszczegól¬ niono badany zwiazek, w kolumnie 2 podano ilosc badanego zwiazku w karmie, w kolumnie 3 prze¬ cietny przyrost ciezaru w gramach, w kolumnie 4 procentowa poprawe przyrostu ciezaru, w kolum¬ nie 5 wykorzystanie karmy, to jest stosunek zu¬ zytej karmy (F) do przyrostu ciezaru (G), a w ko¬ lumnie 6 polepszenie wykorzystania karmy w pro¬ centach.Doswiadczenie 8. Dwa reprezentatywne zwiazki, a mianowicie zwiazek I i II, badano na ich dzia¬ lanie in vitro przeciw Treponema hyodysenteriae.Treponema hodowano na plytkach agarowych z krwia. Kazda przygotowana plytka zawierala 20 ml agaru „trypticase soy" (Baltimore Biological Laboratory), 5,0 g/l wyciagu z drozdzy (DifcS) i 5% sterylnej krwi kornkiej pozbawionej wlók- nika. Jako plytki sluzyly sterylne plastikowe szalki Petriego o wymiarach 15X100 mm. Inkubacje prze¬ prowadzono w temperaturze 37°C w ciagu 4 dni w warunkach beztlenowych korzystajac z ukladu typu BBL Gas Pak.W tej poczatkowej próbie stezenia badanego zwiazku wynosily 2000—7,8 mcg/ml, a sama pró¬ be przeprowadzono nastepujaco. 5 ml kazdego badanego zwiazku o 20-krotnym rozcienczeniu w brzeczce tryptozowej i wyjalowionego przez filtr zmieszano w serii flaszek z 90 ml agaru sojowego tripticase stopionego z wyciagiem drozdzowym.Z kolei do kazdej flaszki dodano 5 ml krwi kon¬ skiej. Zawartosci flaszek wykorzystano nastepnie do przygotowania serii plytek agarowych z krwia, o podwójnie zmniejszajacych sie rozcienczeniach, w granicach 100—0,39 mcg/ml.Zwiazek I Próba kon¬ trolna Dawka g/tona 50 Tab Przecietny przyrost ciezaru 564 Ig 531 g ela IX Poprawa przyrostu ciezaru •/a 6,21 F/G 1.582 1.688 Polepszenie wykorzystania karmy */• 6,28 Treponema do zaszczepiania tych plytek przy¬ gotowano przez umieszczenie 3,0 ml sterylnej brzeczki tryptozowej na powierzchni plytki, na 65 której nastepowal rozwój treponema. Do uwolnie¬ nia treponeima z agaru wykorzystano sterylny tampon bawelniany. Z kolei zawiesine te 100-krot-15 nie rozcienczono i kazda z plytek zawierajacych badane zwiazki zaszczepiono przy pomocy 0,01 ml, równolegle z plytkami kontrolnymi, nie zawiera¬ jacymi badanych zwiazków. Plyn zaszczepiajacy rozlozono w ten sposób, ze pokryl on powierzchnie kazdej plytki. Do tego celu do kazdej plytki za¬ stosowano wygieta sterylna pipete plastikowa.Plytki poddano inkubacji w temperaturze okolo 36°C przez okolo 4 dni, po czym treponema zba¬ dano. Za minimalne hamujace stezenie kazdego ba¬ danego zwiazku i(MIC) przyjeto stezenie, przy któ¬ rym nie nastepowal rozwój treponema.Wszystkie reprezentatywne zwiazki wstrzymy¬ waly rozwój treponema przy wszystkich badanych dawkach, przy czym MIC dla obydwu zwiazków bylo' nizsze lub równe 0,39 mcg/ml.Doswiadczenie powtórzono stosujac zwiazek 1 w podwójnie zmniejszajacych sie rozcienczeniach, w granicach 100—0,048 mcg/ml. Ustalono, ze MIC dla zwiazku I w tej próbie bylo 0,097 mcg/ml.Doswiadczenie 9. W nizej podany sposób usta¬ lono czynnosc in vivo zwiazku 1 przeciw Trepone¬ ma hyodysenteriae.Prosieta zakupione do doswiadczenia in vivo by¬ ly zdrowymi prosietami przeznaczonymi do tuczu.Do osrodka badawczego sprowadzono 24 prosieta, z których kazde zostalo indywidualnie zwazone i oznaczone za pomoca znaczka zawieszonego na uchu. Prosieta podzielono na 4 grupy po 6 sztuk w ten sposób, ze przecietny ciezar prosiat w kaz¬ dej grupie byl taki sam. Po 6 dniach, gdy prosie¬ ta przystosowaly sie do nowego otoczenia i wa¬ runków, do karmy dwóch grup prosiat dodano 5- -amino-1-metylo-3-(l-mety lo-5-nitro-2-imidazolilo) pirazolo-4-karbonitryl (zwiazek I) w ilosci 100 g/t.Karma posiadala sklad podany w tabeli X. 91 696 16 Tabe Skladniki Kukurydza, zólta, zmielona Makuchy sojowe, luszczone, ekstrahowa¬ ne rozpuszczalnika¬ mi, 50M Maczka alfalfa od¬ wodniona, 17°/o Odpadki miesne, 55°/o Maczka rybna Gorzelnicze wysuszone skladniki rozpuszczal¬ ne (kukurydza) Tluszcz zwierzecy Weglan wapniowy Fosforan dwuwapnio- wy, paszowy Sól (NaCl) Mieszanka witami¬ nowa SW-031 Hydroksylowy analog metioniny, 93% Mieszanka mineralna, AN-032 1 Razem la X Udzial procentowy 73,20 12,30 2,50 2,50 2,50 2,25 2,00 0,70 0,50 0,50 0,50 0,20 0,10 100,00 kg/tone 732 123 50 7 1000 1 II to 40 45 50 55 90 61 1 Kazdy kilogram mieszanki zawiera 77,161 jed¬ nostek USP witaminy Dt, 2,205 jednostek miedzy¬ narodowych witaminy E, 441 mg ryboflawiny, 1.620 mg kwasu pantotenowego, 2,205 niacyny, 4,4 mg witaminy B12, 441 mg witaminy K, 19,180 mg choliny, 110 mg kwasu foliowego', 165 mg pi- rydoksyny, 110 mg tiaminy i 22 mg biotyny. 2 Kazdy kilogram mieszanki zawiera 50 g manga¬ nu w postaci siarczanu, 100 g cynku w postaci weglanu, 50 g zelaza w postaci siarczanu zelazo¬ wego, 5 g miedzi w postaci tlenku, 1,5 g jo¬ du w postaci jodku potasowego oraz co najwyzej 150,a co najmniej 130 g wapnia w postaci wegla¬ nu wapniowego.Pozostale dwie grupy prosiat karmiono w iden¬ tyczny sposób, lecz bez dodatku badanego zwiazku.Na ósmy dzien po rozpoczeciu doswiadczenia (dwa dni po rozpoczeciu podawania badanego zwiazku) wszystkie prosieta, to jest 12 prosiat traktowa¬ nych badanym zwiazkiem i 12 prosiat kontrol¬ nych, zostaly zakazone doustnie biegunka swinska.Szczepionka zakazajaca pochodzila z okreznicy za¬ kazonej biegunka swinska i przygotowano ja wy¬ korzystujac zakazona okreznice i postepujac we¬ dlug sposobu podanego przez Harrisa i wspólpra¬ cowników, Swins Dysentery: Przeglad, Iowa State University Veterinarian nr 1, 4—11 (1971). Kaz¬ demu prosieciu podano doustnie 10 ml szczepionki.Dwie grupy prosiat traktowane badanym zwiaz¬ kiem otrzymywaly go do woli w swojej karmie przez kolejne 20 dni. Na drugi dzien po zakoncze¬ niu dodawania zwiazku do karmy (19 dni po zaka¬ zeniu) jedna grupa prosiat otrzymujaca badany zwiazek oraz jedna z grup kontrolnych zostaly zabite i zbadane na zmiany chorobowe wskutek swinskiej biegunki. Innej grupie, która otrzymy¬ wala badany zwiazek oraz pozostalej grupie kon¬ trolnej podawano dalej karme bez dodatku bada¬ nego zwiazku trzymajac je przez nastepne 8 dni i obserwujac je pod katem nawrotu biegunki swin¬ skiej, co czesto zdarza sie przy tej chorobie. Po uplywie wymienionego czasu (28 dni po zakaze¬ niu) wszystkie pozostale prosieta zostaly zabite i zbadane na zmiany pochorobowe.W doswiadczeniu prowadzono codziennie reje¬ stracje smiertelnosci. Konsystencje kalu i obecnosc krwi i/lub sluzu rejestrowano podczas doswiadcze¬ nia codziennie w odniesieniu do zagrody. Prosieta wazono indywidualnie w czasie zakazenia oraz 7, 14, 19, 21 i 28 dnia doswiadczenia.Przyrosty ciezaru i dane co do smiertelnosci, jak równiez ogólna liczbe dni, podczas których obser¬ wowano biegunke i sluzowo-krwiste stolce w róz¬ nych zagrodach, zestawione sa w tabeli XI. Prze¬ cietny przyrost ciezaru dla grupy prosiat otrzy¬ mujacych zwiazek I i zabitych 19 dni po zakaze¬ niu wynosil 22,0 funty w porównaniu z jedynie 4,8 funtów dla zakazonych, nieleczonych grup kon¬ trolnych zabitych w tym czasie. Sredni przyrost ciezaru prosiat w grupie leczonej, zabitych 28 dni po zakazeniu, wynosil 35,9 funtów, podczas gdy dla zakazonych nieleczonych grup kontrolnych za¬ bitych po takim samym czasie, wynosil 21,8 funtów.Zadne prosie otrzymujace badany zwiazek nie pa¬ dlo podczas próby, wobec 4 prosiat z zakazonych grup kontrolnych, które padly. Biegunki nie wy¬ kryto u prosiat otrzymujacych badany zwiazek, lecz byla widoczna przez cale 23 dni u nieleczonych pro¬ siat kontrolnych.17 91 696 18 Pierwsze oznaki sluzu i krwi, typowe dla bie¬ gunki swinskiej, pojawily sie u nieleczonych pro¬ siat kontrolnych w przyblizeniu po 1 tygodniu po zakazeniu i byly obserwowane przez cale 17 dni.Sluzu " i krwi nie obserwowano w zadnym mo¬ mencie doswiadczenia w grupach prosiat otrzy¬ mujacych badany zwiazek. Takze nie byl obserwo¬ wany nawrót biegunki swinskiej w grupie prosiat otrzymujacych badany zwiazek i trzymanych od 17 do 28 dnia na podstawowej racji paszowej bez dodatku badanego zwiazku wienstwie do nieleczonych prosiat kontrolnych, u których biegunka ciagnela sie dalej przy trzy¬ maniu ich od 17 do 28 dnia na podstawowej racji paszowej.Zaobserwowano róznice w zmianach chorobo¬ wych przy _ sekcji prosiat leczonych i zakazonych prosiat kontrolnych. Okreznice trzech z czterech padlych prosiat kontrolnych byly krwotoczne. Przy Doswiadczenie 10. Oznaczono podatnosc bakterii beztlenowych, zarówno gram-dodatnich, jak i gram-ujemnych, na reprezentatywna liczbe no¬ wych zwiazków wedlug niniejszego wynalazku, korzystajac z agarowej metody rozcienczen. Bak¬ terie wyizolowano z pacjentów przebywajacych na leczeniu w Osrodku Medycznym Uniwersytetu w Indianie. Wyizolowane bakterie zidentyfikowano w laboratorium anaerobowym Centrum Medyczne¬ go przy pomocy kryteriów opracowanych przez Dowella i wspólpracowników, Laboratory Methoda in Anaerobic Bacteriology. Public Health Serv.Publ. nr 1803 (1968. [Center for Disease Control, Atlanta, Ga.]; oraz przez Smitha i wspólpracowni¬ ków, The Bathogenic Anaerobic Bacteria, strony 96—136 (1968) [Charles C. Thomas, Publisher, Springfield, 111]. Wszystkie drobnoustroje przecho¬ wywano w srodowisku glukozowym z posiekanym miesem (Scott Laba) w temperaturze pokojowej. sekcji ustalono, ze piec z osmiu zyjacych prosiat nalezacych do zakazonych grup kontrolnych po¬ siadalo krwotoczne okreznice. Krwi i/lub sluzu nie znaleziono w okreznicy zadnego (prosiecia otrzy- mujacego badany zwiazek. U wiekszosci prosiat otrzymujacych badany zwiazek nieznaczne obsza¬ ry krwotoczne widoczne byly w okreznicy i/lub zoladku. Ten typ zmian chorobowych obserwowa¬ no w przypadku innych grup prosiat nie otrzy¬ mujacych badanego zwiazku i sadzi sie, ze one nie maja zwiazku z biegunka swinska.Wykazano zatem, ze badany zwiazek posiada wysoka skutecznosc przy opanowywaniu wywola¬ nej biegunki swinskiej, w odniesieniu do zapobie¬ gania smiertelnosci, utrzymania przyrostu ciezaru, zapobiegania biegunce i krwisto-sluzowatym stol¬ cem, jak równiez zapobiegania zmianom chorobo¬ wym okreznicy, typowym dla biegunki swinskiej.Wynik prób in vivo podano w ponizszej tabeli.Metoda stosowana w próbach z rozcienczeniem agarowym oparta byla na badaniach Sufctera i wspólpracowników, Antiimiiorob. Ag. Chemother. 3, 188^193 (1973). Rasy bakterii anaerobowych hodo¬ wano w rurkach o wyrniatrach 16X120 mm w ciagu 16—'18 godzin iw osrodku tioglikolanu bez wskaznika 1350 (Becton, Diokinson and Co.), do którego przed autoklawowaniem dodano 5 mcg heminy na 1 mi- lilitr oraz po autoklawowaniu 1 mg wodorowegla¬ nu sodowego i 0,1 mcg menadionu sterylizowanego przez filtr. Rurki wzrostowe dla bakterii Veillonel- la alcalescens zaopatrzono w 5 mg mleczanu sodo¬ wego na 1 mililitr. Rasy bakterii zostaly wyskalo- wane na zmetnienie zgodnie z wzorcem nr 1 Mc Farlanda w srodowisku tioglikolanu bez wskaznika 1350, zawierajacym dodatkowo 0,13% Bacto-agaru (Difco). Kazda rase umieszczano nastepnie na po¬ wierzchni plytki Petriego (o wymiarach 100X15 mm) przy pomocy rejplikatora.Taabela XI Skutecznosc zwiazku 1 przeciw biegunce swinskiej Leczenie 'Zwiazek I 100 g/tona2 Zakazone grupy kontrolne Zwiazek I 100 g/tona2 Zakazone grupy kontrolne Nu¬ mer pró¬ by 1 1 2 2 Ciezar poczat¬ kowy1 (wszyst¬ kie irno- jsiejta) 35,3 (,7 ,3 315,2 Przecietny ciezar prosiat zyjacych (dni) 7, 43,3 ,41,0 421,1 41,6 14 51,0 41,0 50,0 43,6 19 57,3 40,5 ^ ~* 21; 59,7 46,2 '28 — — 71,3 56,0 •Sredni przy¬ rost od dnia zaka¬ zenia i(prosiat Wija¬ cych) 22,0 4,8 ,9 21,8 Smier¬ telnosc (liczba sztuk padlych) '0 2 0 2 Obserwacje kalu (dpiie z bie¬ gunka w 'za¬ grodzie 0 0 13 dn!ie z krwia li slu- fcdmi w /zagro- 'dz}e 0 9 0 8 1 Ciezar podczas zakazania 2 Podawanie zwiazku zaczeto 2 dni przed zakazeniem i kontynuowano przez 20 kolejnych dni Uwaga: Prosieta w grupie 1, zarówno leczone, jak i nieleczone, poddano sekcji 19 dnia po zakazeniu. bel prz< ciej ych 19 57,3 40,5 an i i nie 50 55 6541696 19 Do badan 1 rozcienczeniem agarowym przygo¬ towano 2-krotne rozcienczenie badanych zwiaz¬ ków w odsolonej wodzie, do których nastepnie dodano krwi owczej z laka barwna i sterylizowa¬ nego przez filtr menadionu, tak ze stezenia po roz¬ cienczeniu agarowym wyniosly /odpowiednio 5 pro¬ cent i 10 mcg/ml. Do kazdego rozcienczenia dodano równa objetosc agaru Brucella o podwójnej mocy (Becton, Diclkinson and Co.), na lazni wodnej utrzy¬ mywanej w temperaturze 50°C, a nastepnie wy¬ lano je do szalek Petriego.Wszystkie operacje wykonywano wewnatrz pla¬ stikowej komory rekawicowej, z wyjatkiem inku¬ bacji rurek wzrostowych i wylania plytek. Po stwardnieniu plytki umieszczono w komorze re¬ kawicowej przynajmniej na dwie godziny przed szczepieniem. Operacje w komorze rekawicowej przeprowadzono w ogólnosci wedlug Aranki i wspólpracowników, Applied Microbidlogy, 17, 568—576 (1969), lecz wprowadzajac nastepujace zmiany. Suche materialy wprowadzano do komory rekawicowej droga ewakuacji sluzy do 28 cali slupka rteci i wypelnienie jej azotem, a nastepnie kolejna ewakuacje w ten sani sposób i napelnie¬ nie jej mieszanina 80tyo azotu, 10% C02 i lO^/o wo- doru. Plyny i plytki agarowe wprowadzano do ko¬ mory rekawicowej droga opróznienia sluzy do 10 cali slupa rteci i czterokrotne napelnienie gazem.Do wypelnienia sluzy po pierwszych dwóch ewa¬ kuacjach wykorzystano azot, natomiast do dwóch napelnien koncowych — wyzej opisana mieszani¬ ne gazów.Wszystkie plytki poddano inkubacji w tempera¬ turze 37°C w slojach typu Gas Pak (Becton, Di- ckinson and Co.) zawierajacych katalizatory glino¬ we pokryte palladem (reaktywowane po kazdym uzyciu). Wyniki prób sposobem rozcienczenia aga¬ rowego odczytywano okolo 24 godziny od zacze¬ cia inkubacji. Jako minimalne stezenie hamujace rozwój (MIC) przyjeto najnizsze stezenie badanego zwiazku, przy którym nie zaobserwowano rozwo¬ ju bakterii.Wyniki tych badan in vitro zebrano w tabeli X i XI, przy czym badane zwiazki oznaczono w taki sam sposób jak w poprzednich doswiadczeniach.Dla celów porównawczych równolegle próby prze¬ prowadzono takze z antybiotykami cefalotyna i erytromycyna i wyniki wlaczono do tabeli XII i XIII< Tabela XII Podatnosc wyizolowanych bakterii anaerobowych. Minimalne stezenie wstrzymujace rozwój, po 24 go¬ dzinach (mcg/ml) Zwiazek co 11 1 od 3 § 'u .S 8 tJ o a id o 2 3 .2 c ¦B a 0 g 6 g li 13 6 I Ift co cg •fi 8 *'§ .8 3 8 1 o. 5 (U a 9 fi2 in CU 3 li i II iii IV Erytro- mycynia Cefailo- tyna <0,125 <^125 PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych pochodnych pi- razolowych o ogólnym wzorze 1, w którym R ozna- 26 cza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, lub hydrofosyalkilowa o 1—3 atomach wegla, R1 ozna¬ cza grupe NH2, R2 oznacza grupe cyjanowa, zna¬ mienny tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym R » ma wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z malononitrylem w obecnosci akceptora kwaso¬ wego.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 10 w celu wytworzenia 5-amino-l-metylo-3-(l-metylo- -5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-ikarbonitrylu 5- -amino-l-metylo-5-nitro-imidazolo-2-karbonylobro- momeitylohydrazon poddaje sie reakcji z malononi¬ trylem i trój etyloamina w obecnosci metanolu. 15
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia 5-amino-l-(2-hydroksyetylo)-3- -(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karboni- trylu 1 -metylo-5-nitroimidazolo-2-karbonylobromo- 20 -2-hydroksyetylohydrazon poddaje sie reakcji z malonitrylem, trójetyloamina i metanolem.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia 5-amino-l-etylo-3-(l-metylo-5- -nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbonitrylu 1-me- tylo-5-nitroimidazolo-2-karbonylobromoetylohydra- zonu poddaje sie reakcji z malononitrylem, trój- etyloamina i metanolem. 23 30
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w celu wytworzenia 5-amino-l-(n-propylo)-3-(l- -metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbonitry- lu 1-metylo-5-nitroimida zolo-2-karbonylobromo-n- -propylohydrazon poddaje- sie reakcji z malonitry- 35 lem i trój etyloamina.91 696 CH, 02 N-|'N ¦N l X J 1L "-R' Wzór 1 0,N CH, CAC_C=N-NHR Br I C c- Wzór 2 LZG Z-d Nr 2 — 558/77 110 szt. A4 Ctnft 10 il PL