PL83713B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia czystego, krystalicznego enzymu penicylinacy¬ lazy z Esoherichiia coli.Penicylinacylaza (pcinicyliinamldaza, penicylindea- cylaza) (EC) Enzyme Comissaon (3.5.1.11) jest enzy¬ mem znanym od dluzszego czasu [(K. Sakaguchi i S. Murao, J. agr. Chem. Soc, Japonia, 23, 411/1950)], hydroilizujaeym wiazanie amidowe w polozeniu 6 benzylopenieyliny, z wytworzenieim kwasu 6-ami- nopenicylamowego (6 APS) i kwasu fenylooctowe¬ go. Obecnosc tego enzymu wykazano w znacznej ilosci bakterii i grzybów [(J. M. T.Hamiltcn-Miller, Bact. Rev. 30, 761/1966)]. Penicylinacylaza z E. coli posiada szeroki zakres specyficznego dzialania. Po¬ za benzylopenicylina hydroMzuje ona znaczna ilosc 15 innych penicylin, na przyklad penicyline X i am¬ picyline, jak równiez szereg amidów kwasu feny¬ looctowego, podstawionych przy.amidowym atomie azotu rodnikami alifatycznymi lub aromatycznymi oraz jego pochodne podstawione przy weglu a lub 20 przy pierscieniu benzenowym [(M. Cole, Biochem.J. 115 733/1969); W. Kaufmamn i K. Bauer, Nature 203, 520/1964)].Dzialanie tego enzymu wykorzystuje sie szeroko w skali wielkotechmicznej do wytwarzania 6 APS M z benzylopendcyliny. Sposób ten dotychczas reali¬ zowano w technice, stosujac cale komórki zawie¬ rajace ten enzym (niemiecki opis patentowy nr 1111778) lub enzym wyekstrahowany * z komórek, lecz dalej nie oczyszczony (opis patentowy St. 2 Zjedn. Am. nr 31297546) lub tez nieoczyszczony enzym zaadsorbowany na bentonicie (opis patento¬ wy St. Zjedn. Am, nr 3446705). W tym ostatnim przypadku przyklady podaja opis siposoibu tylko dla penicylinacylazy z Bacillus megaterium i z Streptomyees tak, ze nie dostarczaja one infor¬ macji dotyczacych enzymu z E. coli.Adsorbowanie protein i enzymów na bentonicie jest wprawdzie znane (Methods in Enzyrmology, tom I, 96), lecz dotychczas udawalo sie jedynie w bardzo rzadkich przypadkach wyeluowac adsonp- cyjnie zwiazany enzym z dobra wydajnoscia i o podwyzszonej czystosci.Stosowanie calych komórek lub wyekstrahowa¬ nego, lecz nieoiczyszczonego enzymu posiada jednak szereg wad. Wada taka jest zwlaszcza rozklad uzytej penicyliny przez dzialanie innych enzymów, zawartych w surowych preparatach, zwlaszcza pe- nicylino-p-laktamazy, co powoduje spadek wy¬ dajnosci 6 APS. Inna wazna wada jest zanieczysz¬ czanie 6 APS przez proteiny, (prowadzace do aler¬ gicznych reakcji przy stosowaniu u czlowieka syntetycznych penicylin wytworzonych z 6 APS.Zanieczyszczenia te mozna usunac z 6 APS jedy¬ nie za pomoca szeregu kosztownych i polaczonych ze stratami etapów oczyszczania.Przy stosowaniu czystego preparatu penicylina¬ cylazy unika sie wymienionych wad, zwiazanych ze stosowaniem calych komórek luib surowego,' wolnego od komórek enzymu. Dofyidhjczajs jednak 83 71383 713 nie rozporzadzano prostym, dajacym sie przepro¬ wadzic w technice sposobem wytwarzania czyste¬ go enzymu.Czesciowe oczyszczanie penicylinacylazy w mniej¬ szych ilosciach opisano juz w wielu publikacjach [(CP. S. Borikar i inni, Hindustan Antibiotics Buli. 4, ,152, /1961); A. Szentrimai, Acta Microbiolcgica Acad. Soi. Humg. 12, 395/1966); D. A. Seflf i inni, BiotechnoliOgy and Bioemgineering 11, 337, /1969)].Sposoby te przebiegaja poprzez szereg etapów wy¬ tracania, adsorpcji lub chromatografii i daja je¬ dynie niewielkie wydajnosci. Ponadto w niemiec¬ kim qpisie wylozeniowym nr 1907365 opisane jest czesciowe oczyszczanie w wiekszej skali za pomoca wytracania tanina i oczyszczania za po¬ moca szeregu wymieniaczy jonowych. Preparat acylazy okreslony jako elektroforetycznie jedno¬ rodny otrzymala Bomdareva i inni [(Biochemistry (tos.) 34, 76, /1969)] w skali laboratoryjnej za po¬ moca wytracania siarczanem amonowym, chroma¬ tografii na celulozie GM i ahromatogirafii na ce¬ lulozie DEAE z wydajnoscia 27%. Dotychczas nie opisano krystalizacji penicylinacylazy. Te znane sposoby daja albo tylko czesciowo oczyszczony enzym, albo tez sa skomplikowane i polaczone ze stratami.Celem wynalazku jest opracowanie prostego spo¬ sobu wytwarzania czystej penicylinacylazy, a tak¬ ze krystalizacji, poniewaz jest ona kryterium czystosci, a ponadto zawiesina krysztalów jest trwala postacia nadajaca sie do przechowywania i transportu enzymu.Przedmiotem wynalazku jest prosty sposób wy¬ twarzania czystej penicylinacylazy z E. ^oli i jej krystalizacji. Za pomoca etapu adsorpcji eluowania za pomoca bentonitu osiaga sie znaczne zmniej¬ szenie objetosci, umozliwiajace przeprowadzenie sposobu wedlug wynalazku w skali technicznej.Czynnosc ipenicylinacylazy wytworzonej sposo¬ bem wedlug wynalazku oznacza sie za pomoca nowego kolorymetrycznego testu, wykorzystujacego szeroki zakres specyficznosci enzymu. (E. Rauen- busch, publikacja w przygotowaniu). Jako suibstirat stosuje sie kwas 6-nitro-3-/N-feinyloacetylo-/amino- -benzóesowy (NIPAB). Pomiar przeprowadza sie w 0,002 m roztworze, przy wartosci pH=7,5, w temperaturze 25°C i przy 405 nm. Wspólczynnik ekstynkcji molowej kwasu 6-initro-3-amino-banzo- -esowego, powstajacego w reakcji wynosi 9090 —i l»mol—1#cm . Jedna jednostka enzymatyczna (E) rozszczepia 1 (Limol substratu na minute. Rozszcze¬ pianie benzylopenicyliny w tych samych warun¬ kach przebiega okolo 1,5 razy predzej. Czynnosci wlasciwe sa odniesione do protein oznaczonych metoda biuretowa..Sjposobem wedlug wynalazku wychodzi sie z su¬ rowego ekstraktu z komórek E. coli. Ekstrakt ten wytwarza sie na przyklad z hodowli komórek E. coli wytworzonej wedlug niemieckiego opisu pa¬ tentowego nr 1111117718 lub zwlaszcza z mutanta E. coli ATOC 21 728, opisanego w niemieckim zgloszeniu patentowym (P 21i54213.,2), dzialaniem 3% metyloizobutyloketonu przy wartosci pH=7—8 lub droga przeróbki mechanicznej, przy czym pe- wicylinacylaza przechodzi do roztworu w 70-^90 %».Ten surowy ekstrakt, w celu latwiejszego wy*. tracenia szczatków komórek i jednoczesnego oczyszczenia ipenicylinacylazy przez wytracenie 9 nieczynnej proteiny i innych cial towarzyszacych, nastawia sie na wartosc pH 3,5^5,5, zwlaszcza ,0 przez dodatek kwasu minerainego, na,przyklad HC1, HN08, H2JSD4, H3PO4 lub innego mocnego kwasu, na przyklad kwasu octowego i wytracone substancje oddziela w znany sposób za pomoca odwirowania lub odsaczenia i je odrzuca.Ze znajdujacego sie nad osadem klarownego roz¬ tworu adsorfbuje sie penicylinacylaze przez dodatek mineralu glinokrzemianowego, zwlaszcza typu montmoryloinitu, zwlaszcza bentonitu. Mineral od¬ dziela sie w znany sposób przez odsaczenie ' lub odwirowanie i nastepnie eluuje sie penicylinacyla¬ ze z pozostalosci za pomoca odpowiedniego roztwo¬ ru soli.Adsorpcje penicylinacylazy na minerale mozna przeprowadzic przy przewodnictwie wlasciwym roztworu 0—5 mJS i wartosci pH 3,5—8,0. Ko¬ rzystnie utrzymuje sie przewodnictwo 1—4 mS i wartosc pH 5,0. Roztwór enzymu nastawia sie na zadane przewodnictwo przez rozcienczenie, od- solenie za pomoca ukladu mieszanych wymieniaczy jonowych i za pomoca innych znanych sposobów odsalania. - - ¦ -. . .~ _.Najlepsze wydajnosci i stopien wzbogacenia przy nastepujacym eluowaniu uzyskuje sie, dodajac do¬ kladnie tyle bentonitu, ile potrzeba dla 100% ad¬ sorpcji enzymu, co ustala sie przez pomiar czyn¬ nosci w próbce roztworu nad osadem. W korzyst¬ nych warunkach odpowiada to okolo 2,0—5,0 g bentonitu/g rozpuszczonych protein. Jeszcze lepsze oczyszczenie osiaga sie przeprowadzajac frakcjo¬ nowana adsorpcje, przy czym dodaje sie poczat¬ kowo okolo Vs calej ilosci bentonitu, przy czym adsorpoji ulega prawie wylacznie nieczynne oibce 40 bialko. Po oddzieleniu dodanego bentonitu adsor- buje sie penicylinacylaze przez dodanie reszty ben¬ tonitu. W celu eluowania zaadsorfooWanej penicy¬ linacylazy stosuje sie 0,1—ll,0^molarne wodne roztwory nieorganicznych lub organicznych soli, 45 takich jak na przyklad fosforanu, siarczanu, octa¬ nu, przy wartosci pH 6,0—9,0. Stosuje sie zwla¬ szcza 0,1 — l,0^molarne roztwory octanu sodu lub potasu przy wartosci pH 8,5, poniewaz Wtedy, w porównaniu z solami dwu- i trójwartosciowych 50 anionów, eluowaniu ulaga zwlaszcza penicylinacy- laza. W sumie uzyskuje sie przez adsorpcje na ben¬ tonicie i eluowanie enzymu 4^6-krotne wzboga¬ cenie z wydajnoscia okolo 70-^90%.Szczególne zalety tego sposobu oczyszczania pole- 55 gaja na prostocie jego przeprowadzania równiez w skali technicznej, zmniejszeniu objetosci roz¬ tworu zawierajacego enzym do 1/i0 surowego ek¬ straktu i uzyskania stezonego roztworu wzbogaco¬ nego enzymu, co w sposób istotny ulatwia dalsza przeróbke..Dalsze oczyszczanie penicylinacylazy do czystego enzymu bialkowego prowadzi sie sposobem wedlug wynalazku droga chromatografii na odpowiednich 59 makroporowatydh wymieniaczach jonowych i na-83 713 6 stepujacej krystalizacji. Mozna przy tym uzyskac dzialaniem wymieniacza anionowego aillbo wymie¬ niacza kationowego roztwór czesciowo oczyszczo¬ nego enzymu, z którego mozna wykrystalizowac czysty enzym przez dodatek wytracajacej soli. Albo tez uzyskuje sie w 2 etapach przez dzialanie wy¬ mieniaczem kationowym i wymieniaczem aniono¬ wym w dowolnej kolejnosci roztwór czystego je¬ dnorodnego enzymu, z którego równiez mozna wykrystalizowac enzyim.Jako wymieniacze anionowe stosuje sie zwla¬ szcza celuloze, podstawiona zasadowymi gruipami, na przyklad aminoetyloceluloze, dwuetyioamino- etyloceiuloze (celuloza DEAE), trójetyloaminoetylo- celuioze (celuloza TEAE) i odpowiednie poprzecznie usieciowane dekstrany, na przyklad DEAE—Se- phadexlR i QAE—Se^phadexR. Oczyszczanie na tych wymieiniaczadh anionowych mozna prowadzic przy wartosci pH 6^5—0,0. Korzystnie oczyszcza¬ nie prowadzi sie na kolumnie. Enzym adsorbuje sie z rozcienczonego roztworu soli i eluuje przez obnizenie wartosci pH lub podwyzszenie stezenia soli w buforze eluujacym. Czynnosc penicylicna- cylazowa jest zawarta w pierwszej eiuowanej z kolumny frakcji o maksymalnej zawartosci pro¬ tein. Korzystnie eluuge sie przy gradiencie steze¬ nia 0,01—04 m fosforanu potasu przy wartosci pH 7,0. Wydajnosc w tym etapie oczyszczania wy¬ nosi 80^90%.Jako wymieniacze kationowe stosuje sie zwla¬ szcza celuloze podstawiona grupami kwasnymi, na przyklad sulfoetyloceluloze, fosfoceluloze, karbo- ksymetylo-ceiuloze, poprzecznie usieciowane dek¬ strany, na przyklad SE—SephadeK^, SP—Se- phadex, GM—Sephadex i zele akryloamidowe, na przyklad CM^Bio-^GelR lub wytworzone wedlug Biochemistry 8, 4074 (1969) zele poliakryloamidowe zawierajace grupy karboksylowe i makroporowate zywice jonowymienne, na przyklad LewatitR SP—100, SP—120, CNP.Adsorpcja penicylinacylazy na wymieniaczach kationowych nastepuje z 0,01—0,1 m roztworu soli przy wartosci pH 3^5^6,0, zwlaszcza przy pH 5,0 albo przez dodanie wymieniacza jonowego do roz¬ tworu enzymu albo przez przepuszczenie roztworu enzymu przez kolumne wypelniona wymieniaczem.Eluowanie prowadzi sie albo pirzy wyzszej war¬ tosci pH 6,0^8,5, albo korzystniej przy stalej wartosci pH przez stopniowe podwyzszenie steze¬ nia soli lub w postaci gradientu liniowego. Ko¬ rzystnie w celu wytworzenia czystej penicylinacy¬ lazy eluowanie prowadzi sie przy wartosci pH 5,0 za pomoca liniowego gradientu 0,05—0,5 m octa¬ nu sodowego lub potasowego. Eluoja penicylina¬ cylazy nastepuje w tych warunkach jako ostro zaznaczona strefa w okolo 0,2 m octanie sodowym z wydajnoscia 80—90%.Z roztworów znacznie wzbogaconych w penicy- linacylaze, uzyskanych przez stosowanie tylko wy¬ mieniaczy anionowych lub w polaczeniu z wymie¬ niaczem kationowym, doprowadza sie enzym do krystalizacji przez wytracenie odpowiednia sola, zwlaszcza siarczanem amonowym. Sól mozna do¬ dac w postaci stezonego roztworii albo w postaci stalej. Bardzo rozcienczone roztwory enzymu zate- za sie korzystnie uprzednio w znany sposób, na przyklad za pomoca saczenia membranowego lub przez wytracenie siarczanem amonowym do 70% nasycenia i ponowne rozpuszczenie osadu w mniej¬ szej objetosci. Krystalizacja nastepuje, w zalezc nosci od stezenia protein z 45% do 55% nasycone¬ go roztworu siarczanu amonowego, zwlaszcza przy wartosci pH 6,0—7,0 i w temperaturze pokojowej w ciagu kilku dni. Szybko wytworzone krysztaly, posiadaja pod mikroskopem postac polamanych igiel. Przy powolnej krystalizacji otrzymuje sie bardzo regularne plytki :og. 1 — rysunek wedlug zdjecia przy 200-fcrotinyim powiekszeniu. Roztwór krystalizowanego enzymu daje w elektroforezie dyskowej (7% zelu, pH 8,9) tylko jedno ostre pas¬ mo (fig. 2).Czysta krystaliczna penicylinacylaza posiada na¬ stepujace charakterystyczne wlasciwosci: specyficznosc: rozszczepianie benzyiopenicyliny, N-fenyloacetylo-L-asparaginy, kwasu 6-nitro-3- -(N-fenyloaceJtylo)-aminofoenzoesowego i innych ami¬ dów kwasu fenylooctowego; ciezar czasteczkowy: 71000 ± 2000 z równowagi sedymentacji z czastkowa objetoscia wlasciwa V= = 0,665 ml/g; 7000 ± 5000 na podstawie cienko¬ warstwowego saczenia przez zel; wspólczynnik sedymentacji: S°2o,w= 2,56 ± 0,035 przy pH 7,4; widmo w nadfiolecie (fig. 3): w buforze fosfo¬ ranowym pH 7,0 (A) i w 0,1 n/NaOH (B); widmo CD: pH 4 — 10 (fig. 4) warunki: <250 nm: 0,085 mgAnl, d = 0,1 om; 250 nm: 0,085 mg/ml, d = 1 cm.Analiza aminokwasów: punkt izoelektryczny: 6,8 ± 0,2 (oznaczony za po¬ moca ogniskowania elektrycznego).Stosowane w powyzszym opisie nazwy handlo¬ we maja nastepujace znaczenie: SeiphadexR: zastrzezony znak towarowy firmy Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala; Biogel R : zastrzezony znak towarowy firmy Bio- -Rad Laboratories; LewatitR: zastrzezony znak towarowy firmy 45 Farbenfabriken Bayer AG; Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób we¬ dlug wynalazku.Przyklad I. 50 a. Surowy ekstrakt z komórek E. coli stosowa¬ ny w sposobie wedlug wynalazku wytwarza sie prowadzac hodowle E. coli wedlug niemieckiego opisu patentowego nr HHr778, zatezajac hodowle za pomoca wirowania do konsystencji szlamu 55 i roztwarzajac komórki droga mieszania w ciagu szeregu godzin po dodaniu 3% metyloizobutylo- ketonu i nastawieniu wartosci pH na 7,5. b. 90 litrów tak wytworzonego surowego eks¬ traktu nastawia, sie na pH 5,0 i odwirowuje. 60 Otrzymuje sie 80 litrów klarownego roztworu, za¬ wierajacego -62 000 jednostek o czynnosci wlasci¬ wej 0,25 E/mg. Roztwór ten odsala sie do wairtosci 1,5 mS przez zmieszanie go z mieszanina wymie¬ niaczy jonowych (Lewatit * M 600 i S 100) *: zastrzezony znak towarowy firmy Farbenfabriken 407 Bayer AG). Po odsaczeniu wymieniaczy jonowych dodaje sie, po nastawieniu wartosci pH na 5,0, 350 g bentonitu (typ SF, firma Serva, Heidel¬ berg), miesza w ciagu 30 minut i oddziela bentonit na wirówce przelotowej. Odwirowany bentonit eiu¬ uje sie 5 litrami 0,5 m buforu z fosforanu sodo¬ wego o wartosci ,2 litrów, zawierajacych 40 000 E (65%) o czyn¬ nosci wlasciwej .1,45 E/mg. c. 9 000 E tego eluatu odsala sie za pomoca saczenia przez zel, nastawia wartosc pH na 5,0 i nanosi na kolumne 5X100 om z SE-Sephadex, zrównowazonym 0,05 m octanem sodowym przy wartosci pH 5,0. Eluuije sie za pomoca gradientu linearnego po 4 litry 0,07 i 0,25 m octanu sodowe¬ go, wartosc pH 5,0. Polaczone czynne frakcje za¬ wieraja 8,100 E (90%). Po zatezeniu za pomoca wytracania siarczanem amonowym do 70% nasy¬ cenia czynnosc wlasciwa wynosi 5,8 E/mg. d. Do stezonego roztworu enzymu dodaje sie nasycony roztwór siarczanu amonowego do okolo 50% nasycenia. Odwirowuje sie powstale przy tym leiklkie zmetnienie. Podczas przechowywania w tem¬ peraturze 4°C po kil!ku dniach nastepuje krysta¬ lizacja. ; Przyklad II. 60 litrów surowego roztworzo¬ nego ekstraktu, wytworzonego wedlug przykladu la nastawia sie na wartosc pH 5,0 i odwirowuje.Klarowny roztwór nad osadem zawiera 92.000 E o czynnosci wlasciwej 0,45. Przez dodanie miesza- 3 nego wymieniacza jonowego odsala sie do 1,0 mS.Do tego roztworu przy wartosci pH 5,0 dodaje sie poczatkowo 150 g bentonitu i odwirowuje. Nastep¬ nie dodaje dalsze 200 g bentonitu, odwirowuje i eiuuje 5 litrami 1 m octanu sodowego przy war- 3 tosci pH 8,0. Wydajnosc wynosi 51000 (53%) o czynnosci wlasciwej 1,8 E/mg.Eluat odsala sie droga saczenia przez zel i z nie¬ go otrzymuje, jak opisano w przykladzie Ic, drcga chromatografii na SE-Seip!hadex roztwór czystego 4< enzymu. Roztwór zateza sie i wykrystalizowuje penicylinacylaze przez dodatek nasyconego roztwo¬ ru siarczanu amonowego, jak opisano w przykla¬ dzie Id. 45 Przyklad III. Roztworzony surowy ekstrakt wytworzony z 2900 litrów hodowli E. coli wedlug przykladu la) nastawia sie na wartosc pH 5,0 i odwirowuje. Klarowny roztwór nad osadem w ilosci .256 litrów zawiera 150.000 E o czynnosci 50 wlasciwej 0,32. Przez rozcienczenie woda do 920 litrów obniza sie przewodnictwo wlasciwe do 2 mS, dodaje 1 kg bentonitu i odwirowuje po mie¬ szaniu w ciagu 1 godziny. Po eluowaniu 0,5 m octanem sodowym przy wartosci pH 8,0 otrzymuje ^ sie 6,9 litrów zawierajacych 60 000 E o czynnosci wlasciwej 1,2 E/mg. Droga drugiej elucji bento¬ nitu za pomoca 0,5 m fosforanu sodowego otrzy¬ muje sie dalsze 9800 E. Wydajnosc calkowita 47%. 47 000 E pierwszego eluatu odsala sie droga sa- ^ czenia przez zel, nastawia wartosc pH na 5,0 i adsorbuje ilosciowo przez zmieszanie z okolo 400 ml wilgotnego SE-.Seplhade!x, zrównowazonego za pomoca 0,05 m octanu sodowego przy wartosci pH 5,0. Zel iSE^Sepihadex odsacza sie i umieszcza ^ 713 8 w kolumnie o srednicy 5 om, zawierajacej juz 1600 ml swiezego SEnSephadeK w 0,05 m octanie sodowym przy wartosci pH 5,0. Nastepnie eiuuje sie liniowym gradientem po 4 litry 0,07 m i 0*25 3 m octanu sodowego przy wartosci pH 5,0. Pola¬ czone frakcje zawieraja 36 000 E czystego enzymu o czynnosci wlasciwej 5,3 E/mg.Roztwór czystego enzymu zateza sie i zadaje ostroznie, do wystapienia lekkiego zmetnienia, sta- w lym siarczanem amonowym. Krystalizacja nastepu¬ je po kilku dniach w temperaturze 4°C.Przyklad IV. a. Surowy ekstrakt z komórek E. coli stosowa¬ ny w sposobie wedlug wynalazku wytwarza sie zatezajac hodowle E. coli ATCC 21 728 za pomoca wirowania do konsystencji szlamu i roztwarzajac komórki znanymi mechanicznymi sposobami, ewentualnie dodajac 3% metyloizobutyloketoinu. b. 610 litrów tak wytworzonego surowego eks- D traktu, zawierajacego 1,3 X 106 E rozciencza sie odjonizowana woda do 2100 litrów, nastawia war¬ tosc pH na 5,0 kwasem siarkowym i odwirowuje.W klarownej cieczy nad osadem stwierdza sie 1,42«106 E o czynnosci wlasciwej 0,42 E/mg. Po ' nastawieniu ipH na wartosc 5,0 dodaje sie, mie¬ szajac, 13,8 kg bentonitu {typ B II, firmy Enbsloh) i po uplywie 30 minut oddziela w wirówce prze¬ plywowej. Oddzielony bentonit eiuuje sie za po¬ moca 90 litrów 0,5 m roztworu octanu sodowego przy wartosci pH 8,0 i odsacza. Otrzymuje sie 92,5 litrów zawierajacych 1,12«106 E (86%) o czyn- ~nosci wlasciwej Xfi4 E/mg. c. 1 litr eluatu z bentonitu, wytworzonego we¬ dlug punktu b), dializuje sie wobec 0,001 m bufo¬ ru z fosforanu potasowego przy wartosci pH 7,0 :8250 E 1,8 E/mg.Roztwór enzymu nanosi sie na kolumne 10X15 cm z DEAEHSephadex A-50 w takim samym bu¬ forze. Nastepnie eiuuje sie liniowym gradientem po 2 litry 0,01 i 0,1 m buforu przy wartosci pH 7,0. Odbiera sie frakcje po 25 ml. Penicylinacyla- za znajduje sie w frakcjach 1/10—170; 1,2 litra 6760 E (82%) 6 £/Mg. d. Roztwór z c) wytraca sie przez dodanie siar¬ czanu amonowego (472 g/litr), osad odsacza sie i rozpuszcza w wodzie. Cz^sc tego roztworu zawierajaca 4700 E, zadaje sie siarczanem amono¬ wym do 46% nasycenia, odwirowuje do otrzyma¬ nia klarownego roztworu i przechowuje w tempe¬ raturze pokojowej. W ciagu tygodnia rozpoczyna sie krystalizacja. Krysztaly odwirowuje sie, roz¬ puszcza w 0,01 m buforze fosforanowym i diali¬ zuje wobec takiego samego buforu : 3300 E (70%) o 12,45 E/mg.Przyklad V. 60 litrów roztworzonego suro¬ wego ekstraktu wytworzonego wedlug przykladu IVa) nastawia sie na wartosc pH 5,0 i odwirowuje.Klarowny roztwór nad osadem zawiera 155 000 E o czynnosci wlasciwej 0,3 E/img. Przez dodanie mieszaniny wymieniaczy jonowych odsala sie do 1,0 mS: Do tego roztworu dodaje sie przy wartosci pH 5,0 poczatkowo 200 g bentonitu (typ SF, firmy Serva), odwirowuje i osad odrzuca. Nastepnie do¬ daje dalsze 800 g, odwirowuje i eiuuje 20 litrami83 713 9 0,5 m octanu sodowego przy pH 8,0. Wydajnosc wynosi 110 000 E 1,5 E/mg.Roztwór enzymu dializuje sie wobec 0,5 m bu¬ foru z octanu sodowego o wartosci pH 5,0 i na¬ nosi na kolumne 11 X 95 om, wypelniona SE-Se- phadex C-50 w 0/5 m octanie sodowym przy war¬ tosci pH 5,0. Kolumne eluuje sie liniowym gradientem po 15 litrów 0,07 i 0,25 m octanu sodowego o wartosci pH 5,0. Penicylinacylaza znajduje sie w eluacie z 24 — 27 litrów. Wydaj¬ nosc wynosi 88 000 E (80%)., 4,2 E/mg. 29 000 E tego roztworu dializuje sie wobec 0,01 m buforu z fosforanu potasowego o wartosci pH 7,0 i nanosi na kolumne 11 X 25 cm zawierajaca DEAE-Sephadex A-50 w 0,01 m fosforanie pota¬ sowym o wartosci 7,0. Eluuje sie gradientem 0,01—Ojl m fosforanu potasowego przy wartosci pH 7,0. Penicylinacylaza zostaje eluowana pod ko¬ niec gradientu. Wydajnosc wynosi 21000 E (73%); 11,2 E/mg.Czesc roztworu zawierajaca 6000 doprowadza sie za pomoca stalego siarczanu amonowego do okolo 45% nasycenia. Po uplywie okolo 2 tygodni tworza sie na sciankach naczynia wielkie kryszta¬ ly. Po dalszych 2 tygodniach utrzymywania w tem¬ peraturze pokojowej odwirowuje sie krysztaly i rozpuszcza w wodzie. Wydajnosc wynosi 4260 E (71%), 13,1 E/mg.Przyklad VI. Eluat z bentonitu wytworzony wedlug przykladu IV zawierajacy 4100 E o 2,0 E/mg dializuje sie wobec 0,05 m octanu sodowego przy wartosci pH 5,0 i nanosi na kolumne 2,5 X 25 cm zawierajaca Lewatit SP — 100 w postaci Na+. Eluuje sie za pomoca gradientu 0,05—0,5 m octanu sodowego przy wartosci pH ,0. Czynne frakcje zawieraja 2020 E (56%), 6,6 E/mg.Roztwór enzymu nastawia sie za pomoca NaOH na wartosc pH 6,5 i doprowadza czysty enzym do krystalizacji iprzez dodanie stalego siarczanu amo¬ nowego do 48% nasycenia. 1250 E (72%), 12,1 E/mg. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania czystej, krystalicznej pe- nicylinacylazy, znamienny tym, ze surowy ekstrakt z komórek E. coli zawierajacy obok penicylinacy- lazy jeszcze szczatki komórek E. coli, nastawia sie na wartosc pH 3,5^5,5, zwlaszcza 5,0, ekstrakt odwirowuje, zadaje zebrany znad osadu klarowny roztwór penicylinacylazy glinokrzemianami, zwla¬ szcza bentonitem, adsorbat oddziela i eluuje, wytworzony w ten sposób wzbogacony klarowny roztwór penicylinacylazy ohromatografuje na ma¬ kropórowatych wymieniaczach jonowych i z wy¬ tworzonego w ten sposób roztworu czesciowo oczyszczonej penicylinacylazy doprowadza czysty enzym do krystalizacji przez dodanie ewentualnie rozpuszczonego w wodzie siarczanu amonowego.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wymieniacz jonowy stosuje sie wymieniacz anionowy.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wymieniacz jonowy stosuje sie wymieniacz kationowy.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wymieniacz jonowy stosuje sie wymieniacz anionowy i wymieniacz kationowy w dowolnej kolejnosci. FIG. 7 U. FIG. 283 713 ar/o Jem 3,0 2,0 \ W 1 250 260 270 280 290 300 nm 310 FIG. 3A83 713 . 0,1% lem 3,0 2,0 W 260 270 280 290 300 nm 310 FIG. 3B + 14-, FIG. 4 230 250 270 290 nm83 713 I Errata Lam 8, 6 wiersz od góry Jest: czone frakcje zawieraja 36 000 E czystego enzymu Powinno byc: czone czynme frakcje zawieraja 36 000 E czystego enzymu Lam 9, 21 wiersz ad góry Jesit: Czesc roztworu zawierajaca 6000 doprowadza Powinno byc: Czesc roztworu zawierajaca 6000 S doprowadza Cena 10 zl PZG Koszalin Zam. D-618. Naklad 110 egr.. PL