Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia czystego, krystalicznego enzymu penicylinacy¬ lazy z Esoherichiia coli.Penicylinacylaza (pcinicyliinamldaza, penicylindea- cylaza) (EC) Enzyme Comissaon (3.5.1.11) jest enzy¬ mem znanym od dluzszego czasu [(K. Sakaguchi i S. Murao, J. agr. Chem. Soc, Japonia, 23, 411/1950)], hydroilizujaeym wiazanie amidowe w polozeniu 6 benzylopenieyliny, z wytworzenieim kwasu 6-ami- nopenicylamowego (6 APS) i kwasu fenylooctowe¬ go. Obecnosc tego enzymu wykazano w znacznej ilosci bakterii i grzybów [(J. M. T.Hamiltcn-Miller, Bact. Rev. 30, 761/1966)]. Penicylinacylaza z E. coli posiada szeroki zakres specyficznego dzialania. Po¬ za benzylopenicylina hydroMzuje ona znaczna ilosc 15 innych penicylin, na przyklad penicyline X i am¬ picyline, jak równiez szereg amidów kwasu feny¬ looctowego, podstawionych przy.amidowym atomie azotu rodnikami alifatycznymi lub aromatycznymi oraz jego pochodne podstawione przy weglu a lub 20 przy pierscieniu benzenowym [(M. Cole, Biochem.J. 115 733/1969); W. Kaufmamn i K. Bauer, Nature 203, 520/1964)].Dzialanie tego enzymu wykorzystuje sie szeroko w skali wielkotechmicznej do wytwarzania 6 APS M z benzylopendcyliny. Sposób ten dotychczas reali¬ zowano w technice, stosujac cale komórki zawie¬ rajace ten enzym (niemiecki opis patentowy nr 1111778) lub enzym wyekstrahowany * z komórek, lecz dalej nie oczyszczony (opis patentowy St. 2 Zjedn. Am. nr 31297546) lub tez nieoczyszczony enzym zaadsorbowany na bentonicie (opis patento¬ wy St. Zjedn. Am, nr 3446705). W tym ostatnim przypadku przyklady podaja opis siposoibu tylko dla penicylinacylazy z Bacillus megaterium i z Streptomyees tak, ze nie dostarczaja one infor¬ macji dotyczacych enzymu z E. coli.Adsorbowanie protein i enzymów na bentonicie jest wprawdzie znane (Methods in Enzyrmology, tom I, 96), lecz dotychczas udawalo sie jedynie w bardzo rzadkich przypadkach wyeluowac adsonp- cyjnie zwiazany enzym z dobra wydajnoscia i o podwyzszonej czystosci.Stosowanie calych komórek lub wyekstrahowa¬ nego, lecz nieoiczyszczonego enzymu posiada jednak szereg wad. Wada taka jest zwlaszcza rozklad uzytej penicyliny przez dzialanie innych enzymów, zawartych w surowych preparatach, zwlaszcza pe- nicylino-p-laktamazy, co powoduje spadek wy¬ dajnosci 6 APS. Inna wazna wada jest zanieczysz¬ czanie 6 APS przez proteiny, (prowadzace do aler¬ gicznych reakcji przy stosowaniu u czlowieka syntetycznych penicylin wytworzonych z 6 APS.Zanieczyszczenia te mozna usunac z 6 APS jedy¬ nie za pomoca szeregu kosztownych i polaczonych ze stratami etapów oczyszczania.Przy stosowaniu czystego preparatu penicylina¬ cylazy unika sie wymienionych wad, zwiazanych ze stosowaniem calych komórek luib surowego,' wolnego od komórek enzymu. Dofyidhjczajs jednak 83 71383 713 nie rozporzadzano prostym, dajacym sie przepro¬ wadzic w technice sposobem wytwarzania czyste¬ go enzymu.Czesciowe oczyszczanie penicylinacylazy w mniej¬ szych ilosciach opisano juz w wielu publikacjach [(CP. S. Borikar i inni, Hindustan Antibiotics Buli. 4, ,152, /1961); A. Szentrimai, Acta Microbiolcgica Acad. Soi. Humg. 12, 395/1966); D. A. Seflf i inni, BiotechnoliOgy and Bioemgineering 11, 337, /1969)].Sposoby te przebiegaja poprzez szereg etapów wy¬ tracania, adsorpcji lub chromatografii i daja je¬ dynie niewielkie wydajnosci. Ponadto w niemiec¬ kim qpisie wylozeniowym nr 1907365 opisane jest czesciowe oczyszczanie w wiekszej skali za pomoca wytracania tanina i oczyszczania za po¬ moca szeregu wymieniaczy jonowych. Preparat acylazy okreslony jako elektroforetycznie jedno¬ rodny otrzymala Bomdareva i inni [(Biochemistry (tos.) 34, 76, /1969)] w skali laboratoryjnej za po¬ moca wytracania siarczanem amonowym, chroma¬ tografii na celulozie GM i ahromatogirafii na ce¬ lulozie DEAE z wydajnoscia 27%. Dotychczas nie opisano krystalizacji penicylinacylazy. Te znane sposoby daja albo tylko czesciowo oczyszczony enzym, albo tez sa skomplikowane i polaczone ze stratami.Celem wynalazku jest opracowanie prostego spo¬ sobu wytwarzania czystej penicylinacylazy, a tak¬ ze krystalizacji, poniewaz jest ona kryterium czystosci, a ponadto zawiesina krysztalów jest trwala postacia nadajaca sie do przechowywania i transportu enzymu.Przedmiotem wynalazku jest prosty sposób wy¬ twarzania czystej penicylinacylazy z E. ^oli i jej krystalizacji. Za pomoca etapu adsorpcji eluowania za pomoca bentonitu osiaga sie znaczne zmniej¬ szenie objetosci, umozliwiajace przeprowadzenie sposobu wedlug wynalazku w skali technicznej.Czynnosc ipenicylinacylazy wytworzonej sposo¬ bem wedlug wynalazku oznacza sie za pomoca nowego kolorymetrycznego testu, wykorzystujacego szeroki zakres specyficznosci enzymu. (E. Rauen- busch, publikacja w przygotowaniu). Jako suibstirat stosuje sie kwas 6-nitro-3-/N-feinyloacetylo-/amino- -benzóesowy (NIPAB). Pomiar przeprowadza sie w 0,002 m roztworze, przy wartosci pH=7,5, w temperaturze 25°C i przy 405 nm. Wspólczynnik ekstynkcji molowej kwasu 6-initro-3-amino-banzo- -esowego, powstajacego w reakcji wynosi 9090 —i l»mol—1#cm . Jedna jednostka enzymatyczna (E) rozszczepia 1 (Limol substratu na minute. Rozszcze¬ pianie benzylopenicyliny w tych samych warun¬ kach przebiega okolo 1,5 razy predzej. Czynnosci wlasciwe sa odniesione do protein oznaczonych metoda biuretowa..Sjposobem wedlug wynalazku wychodzi sie z su¬ rowego ekstraktu z komórek E. coli. Ekstrakt ten wytwarza sie na przyklad z hodowli komórek E. coli wytworzonej wedlug niemieckiego opisu pa¬ tentowego nr 1111117718 lub zwlaszcza z mutanta E. coli ATOC 21 728, opisanego w niemieckim zgloszeniu patentowym (P 21i54213.,2), dzialaniem 3% metyloizobutyloketonu przy wartosci pH=7—8 lub droga przeróbki mechanicznej, przy czym pe- wicylinacylaza przechodzi do roztworu w 70-^90 %».Ten surowy ekstrakt, w celu latwiejszego wy*. tracenia szczatków komórek i jednoczesnego oczyszczenia ipenicylinacylazy przez wytracenie 9 nieczynnej proteiny i innych cial towarzyszacych, nastawia sie na wartosc pH 3,5^5,5, zwlaszcza ,0 przez dodatek kwasu minerainego, na,przyklad HC1, HN08, H2JSD4, H3PO4 lub innego mocnego kwasu, na przyklad kwasu octowego i wytracone substancje oddziela w znany sposób za pomoca odwirowania lub odsaczenia i je odrzuca.Ze znajdujacego sie nad osadem klarownego roz¬ tworu adsorfbuje sie penicylinacylaze przez dodatek mineralu glinokrzemianowego, zwlaszcza typu montmoryloinitu, zwlaszcza bentonitu. Mineral od¬ dziela sie w znany sposób przez odsaczenie ' lub odwirowanie i nastepnie eluuje sie penicylinacyla¬ ze z pozostalosci za pomoca odpowiedniego roztwo¬ ru soli.Adsorpcje penicylinacylazy na minerale mozna przeprowadzic przy przewodnictwie wlasciwym roztworu 0—5 mJS i wartosci pH 3,5—8,0. Ko¬ rzystnie utrzymuje sie przewodnictwo 1—4 mS i wartosc pH 5,0. Roztwór enzymu nastawia sie na zadane przewodnictwo przez rozcienczenie, od- solenie za pomoca ukladu mieszanych wymieniaczy jonowych i za pomoca innych znanych sposobów odsalania. - - ¦ -. . .~ _.Najlepsze wydajnosci i stopien wzbogacenia przy nastepujacym eluowaniu uzyskuje sie, dodajac do¬ kladnie tyle bentonitu, ile potrzeba dla 100% ad¬ sorpcji enzymu, co ustala sie przez pomiar czyn¬ nosci w próbce roztworu nad osadem. W korzyst¬ nych warunkach odpowiada to okolo 2,0—5,0 g bentonitu/g rozpuszczonych protein. Jeszcze lepsze oczyszczenie osiaga sie przeprowadzajac frakcjo¬ nowana adsorpcje, przy czym dodaje sie poczat¬ kowo okolo Vs calej ilosci bentonitu, przy czym adsorpoji ulega prawie wylacznie nieczynne oibce 40 bialko. Po oddzieleniu dodanego bentonitu adsor- buje sie penicylinacylaze przez dodanie reszty ben¬ tonitu. W celu eluowania zaadsorfooWanej penicy¬ linacylazy stosuje sie 0,1—ll,0^molarne wodne roztwory nieorganicznych lub organicznych soli, 45 takich jak na przyklad fosforanu, siarczanu, octa¬ nu, przy wartosci pH 6,0—9,0. Stosuje sie zwla¬ szcza 0,1 — l,0^molarne roztwory octanu sodu lub potasu przy wartosci pH 8,5, poniewaz Wtedy, w porównaniu z solami dwu- i trójwartosciowych 50 anionów, eluowaniu ulaga zwlaszcza penicylinacy- laza. W sumie uzyskuje sie przez adsorpcje na ben¬ tonicie i eluowanie enzymu 4^6-krotne wzboga¬ cenie z wydajnoscia okolo 70-^90%.Szczególne zalety tego sposobu oczyszczania pole- 55 gaja na prostocie jego przeprowadzania równiez w skali technicznej, zmniejszeniu objetosci roz¬ tworu zawierajacego enzym do 1/i0 surowego ek¬ straktu i uzyskania stezonego roztworu wzbogaco¬ nego enzymu, co w sposób istotny ulatwia dalsza przeróbke..Dalsze oczyszczanie penicylinacylazy do czystego enzymu bialkowego prowadzi sie sposobem wedlug wynalazku droga chromatografii na odpowiednich 59 makroporowatydh wymieniaczach jonowych i na-83 713 6 stepujacej krystalizacji. Mozna przy tym uzyskac dzialaniem wymieniacza anionowego aillbo wymie¬ niacza kationowego roztwór czesciowo oczyszczo¬ nego enzymu, z którego mozna wykrystalizowac czysty enzym przez dodatek wytracajacej soli. Albo tez uzyskuje sie w 2 etapach przez dzialanie wy¬ mieniaczem kationowym i wymieniaczem aniono¬ wym w dowolnej kolejnosci roztwór czystego je¬ dnorodnego enzymu, z którego równiez mozna wykrystalizowac enzyim.Jako wymieniacze anionowe stosuje sie zwla¬ szcza celuloze, podstawiona zasadowymi gruipami, na przyklad aminoetyloceluloze, dwuetyioamino- etyloceiuloze (celuloza DEAE), trójetyloaminoetylo- celuioze (celuloza TEAE) i odpowiednie poprzecznie usieciowane dekstrany, na przyklad DEAE—Se- phadexlR i QAE—Se^phadexR. Oczyszczanie na tych wymieiniaczadh anionowych mozna prowadzic przy wartosci pH 6^5—0,0. Korzystnie oczyszcza¬ nie prowadzi sie na kolumnie. Enzym adsorbuje sie z rozcienczonego roztworu soli i eluuje przez obnizenie wartosci pH lub podwyzszenie stezenia soli w buforze eluujacym. Czynnosc penicylicna- cylazowa jest zawarta w pierwszej eiuowanej z kolumny frakcji o maksymalnej zawartosci pro¬ tein. Korzystnie eluuge sie przy gradiencie steze¬ nia 0,01—04 m fosforanu potasu przy wartosci pH 7,0. Wydajnosc w tym etapie oczyszczania wy¬ nosi 80^90%.Jako wymieniacze kationowe stosuje sie zwla¬ szcza celuloze podstawiona grupami kwasnymi, na przyklad sulfoetyloceluloze, fosfoceluloze, karbo- ksymetylo-ceiuloze, poprzecznie usieciowane dek¬ strany, na przyklad SE—SephadeK^, SP—Se- phadex, GM—Sephadex i zele akryloamidowe, na przyklad CM^Bio-^GelR lub wytworzone wedlug Biochemistry 8, 4074 (1969) zele poliakryloamidowe zawierajace grupy karboksylowe i makroporowate zywice jonowymienne, na przyklad LewatitR SP—100, SP—120, CNP.Adsorpcja penicylinacylazy na wymieniaczach kationowych nastepuje z 0,01—0,1 m roztworu soli przy wartosci pH 3^5^6,0, zwlaszcza przy pH 5,0 albo przez dodanie wymieniacza jonowego do roz¬ tworu enzymu albo przez przepuszczenie roztworu enzymu przez kolumne wypelniona wymieniaczem.Eluowanie prowadzi sie albo pirzy wyzszej war¬ tosci pH 6,0^8,5, albo korzystniej przy stalej wartosci pH przez stopniowe podwyzszenie steze¬ nia soli lub w postaci gradientu liniowego. Ko¬ rzystnie w celu wytworzenia czystej penicylinacy¬ lazy eluowanie prowadzi sie przy wartosci pH 5,0 za pomoca liniowego gradientu 0,05—0,5 m octa¬ nu sodowego lub potasowego. Eluoja penicylina¬ cylazy nastepuje w tych warunkach jako ostro zaznaczona strefa w okolo 0,2 m octanie sodowym z wydajnoscia 80—90%.Z roztworów znacznie wzbogaconych w penicy- linacylaze, uzyskanych przez stosowanie tylko wy¬ mieniaczy anionowych lub w polaczeniu z wymie¬ niaczem kationowym, doprowadza sie enzym do krystalizacji przez wytracenie odpowiednia sola, zwlaszcza siarczanem amonowym. Sól mozna do¬ dac w postaci stezonego roztworii albo w postaci stalej. Bardzo rozcienczone roztwory enzymu zate- za sie korzystnie uprzednio w znany sposób, na przyklad za pomoca saczenia membranowego lub przez wytracenie siarczanem amonowym do 70% nasycenia i ponowne rozpuszczenie osadu w mniej¬ szej objetosci. Krystalizacja nastepuje, w zalezc nosci od stezenia protein z 45% do 55% nasycone¬ go roztworu siarczanu amonowego, zwlaszcza przy wartosci pH 6,0—7,0 i w temperaturze pokojowej w ciagu kilku dni. Szybko wytworzone krysztaly, posiadaja pod mikroskopem postac polamanych igiel. Przy powolnej krystalizacji otrzymuje sie bardzo regularne plytki :og. 1 — rysunek wedlug zdjecia przy 200-fcrotinyim powiekszeniu. Roztwór krystalizowanego enzymu daje w elektroforezie dyskowej (7% zelu, pH 8,9) tylko jedno ostre pas¬ mo (fig. 2).Czysta krystaliczna penicylinacylaza posiada na¬ stepujace charakterystyczne wlasciwosci: specyficznosc: rozszczepianie benzyiopenicyliny, N-fenyloacetylo-L-asparaginy, kwasu 6-nitro-3- -(N-fenyloaceJtylo)-aminofoenzoesowego i innych ami¬ dów kwasu fenylooctowego; ciezar czasteczkowy: 71000 ± 2000 z równowagi sedymentacji z czastkowa objetoscia wlasciwa V= = 0,665 ml/g; 7000 ± 5000 na podstawie cienko¬ warstwowego saczenia przez zel; wspólczynnik sedymentacji: S°2o,w= 2,56 ± 0,035 przy pH 7,4; widmo w nadfiolecie (fig. 3): w buforze fosfo¬ ranowym pH 7,0 (A) i w 0,1 n/NaOH (B); widmo CD: pH 4 — 10 (fig. 4) warunki: <250 nm: 0,085 mgAnl, d = 0,1 om; 250 nm: 0,085 mg/ml, d = 1 cm.Analiza aminokwasów: punkt izoelektryczny: 6,8 ± 0,2 (oznaczony za po¬ moca ogniskowania elektrycznego).Stosowane w powyzszym opisie nazwy handlo¬ we maja nastepujace znaczenie: SeiphadexR: zastrzezony znak towarowy firmy Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala; Biogel R : zastrzezony znak towarowy firmy Bio- -Rad Laboratories; LewatitR: zastrzezony znak towarowy firmy 45 Farbenfabriken Bayer AG; Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób we¬ dlug wynalazku.Przyklad I. 50 a. Surowy ekstrakt z komórek E. coli stosowa¬ ny w sposobie wedlug wynalazku wytwarza sie prowadzac hodowle E. coli wedlug niemieckiego opisu patentowego nr HHr778, zatezajac hodowle za pomoca wirowania do konsystencji szlamu 55 i roztwarzajac komórki droga mieszania w ciagu szeregu godzin po dodaniu 3% metyloizobutylo- ketonu i nastawieniu wartosci pH na 7,5. b. 90 litrów tak wytworzonego surowego eks¬ traktu nastawia, sie na pH 5,0 i odwirowuje. 60 Otrzymuje sie 80 litrów klarownego roztworu, za¬ wierajacego -62 000 jednostek o czynnosci wlasci¬ wej 0,25 E/mg. Roztwór ten odsala sie do wairtosci 1,5 mS przez zmieszanie go z mieszanina wymie¬ niaczy jonowych (Lewatit * M 600 i S 100) *: zastrzezony znak towarowy firmy Farbenfabriken 407 Bayer AG). Po odsaczeniu wymieniaczy jonowych dodaje sie, po nastawieniu wartosci pH na 5,0, 350 g bentonitu (typ SF, firma Serva, Heidel¬ berg), miesza w ciagu 30 minut i oddziela bentonit na wirówce przelotowej. Odwirowany bentonit eiu¬ uje sie 5 litrami 0,5 m buforu z fosforanu sodo¬ wego o wartosci ,2 litrów, zawierajacych 40 000 E (65%) o czyn¬ nosci wlasciwej .1,45 E/mg. c. 9 000 E tego eluatu odsala sie za pomoca saczenia przez zel, nastawia wartosc pH na 5,0 i nanosi na kolumne 5X100 om z SE-Sephadex, zrównowazonym 0,05 m octanem sodowym przy wartosci pH 5,0. Eluuije sie za pomoca gradientu linearnego po 4 litry 0,07 i 0,25 m octanu sodowe¬ go, wartosc pH 5,0. Polaczone czynne frakcje za¬ wieraja 8,100 E (90%). Po zatezeniu za pomoca wytracania siarczanem amonowym do 70% nasy¬ cenia czynnosc wlasciwa wynosi 5,8 E/mg. d. Do stezonego roztworu enzymu dodaje sie nasycony roztwór siarczanu amonowego do okolo 50% nasycenia. Odwirowuje sie powstale przy tym leiklkie zmetnienie. Podczas przechowywania w tem¬ peraturze 4°C po kil!ku dniach nastepuje krysta¬ lizacja. ; Przyklad II. 60 litrów surowego roztworzo¬ nego ekstraktu, wytworzonego wedlug przykladu la nastawia sie na wartosc pH 5,0 i odwirowuje.Klarowny roztwór nad osadem zawiera 92.000 E o czynnosci wlasciwej 0,45. Przez dodanie miesza- 3 nego wymieniacza jonowego odsala sie do 1,0 mS.Do tego roztworu przy wartosci pH 5,0 dodaje sie poczatkowo 150 g bentonitu i odwirowuje. Nastep¬ nie dodaje dalsze 200 g bentonitu, odwirowuje i eiuuje 5 litrami 1 m octanu sodowego przy war- 3 tosci pH 8,0. Wydajnosc wynosi 51000 (53%) o czynnosci wlasciwej 1,8 E/mg.Eluat odsala sie droga saczenia przez zel i z nie¬ go otrzymuje, jak opisano w przykladzie Ic, drcga chromatografii na SE-Seip!hadex roztwór czystego 4< enzymu. Roztwór zateza sie i wykrystalizowuje penicylinacylaze przez dodatek nasyconego roztwo¬ ru siarczanu amonowego, jak opisano w przykla¬ dzie Id. 45 Przyklad III. Roztworzony surowy ekstrakt wytworzony z 2900 litrów hodowli E. coli wedlug przykladu la) nastawia sie na wartosc pH 5,0 i odwirowuje. Klarowny roztwór nad osadem w ilosci .256 litrów zawiera 150.000 E o czynnosci 50 wlasciwej 0,32. Przez rozcienczenie woda do 920 litrów obniza sie przewodnictwo wlasciwe do 2 mS, dodaje 1 kg bentonitu i odwirowuje po mie¬ szaniu w ciagu 1 godziny. Po eluowaniu 0,5 m octanem sodowym przy wartosci pH 8,0 otrzymuje ^ sie 6,9 litrów zawierajacych 60 000 E o czynnosci wlasciwej 1,2 E/mg. Droga drugiej elucji bento¬ nitu za pomoca 0,5 m fosforanu sodowego otrzy¬ muje sie dalsze 9800 E. Wydajnosc calkowita 47%. 47 000 E pierwszego eluatu odsala sie droga sa- ^ czenia przez zel, nastawia wartosc pH na 5,0 i adsorbuje ilosciowo przez zmieszanie z okolo 400 ml wilgotnego SE-.Seplhade!x, zrównowazonego za pomoca 0,05 m octanu sodowego przy wartosci pH 5,0. Zel iSE^Sepihadex odsacza sie i umieszcza ^ 713 8 w kolumnie o srednicy 5 om, zawierajacej juz 1600 ml swiezego SEnSephadeK w 0,05 m octanie sodowym przy wartosci pH 5,0. Nastepnie eiuuje sie liniowym gradientem po 4 litry 0,07 m i 0*25 3 m octanu sodowego przy wartosci pH 5,0. Pola¬ czone frakcje zawieraja 36 000 E czystego enzymu o czynnosci wlasciwej 5,3 E/mg.Roztwór czystego enzymu zateza sie i zadaje ostroznie, do wystapienia lekkiego zmetnienia, sta- w lym siarczanem amonowym. Krystalizacja nastepu¬ je po kilku dniach w temperaturze 4°C.Przyklad IV. a. Surowy ekstrakt z komórek E. coli stosowa¬ ny w sposobie wedlug wynalazku wytwarza sie zatezajac hodowle E. coli ATCC 21 728 za pomoca wirowania do konsystencji szlamu i roztwarzajac komórki znanymi mechanicznymi sposobami, ewentualnie dodajac 3% metyloizobutyloketoinu. b. 610 litrów tak wytworzonego surowego eks- D traktu, zawierajacego 1,3 X 106 E rozciencza sie odjonizowana woda do 2100 litrów, nastawia war¬ tosc pH na 5,0 kwasem siarkowym i odwirowuje.W klarownej cieczy nad osadem stwierdza sie 1,42«106 E o czynnosci wlasciwej 0,42 E/mg. Po ' nastawieniu ipH na wartosc 5,0 dodaje sie, mie¬ szajac, 13,8 kg bentonitu {typ B II, firmy Enbsloh) i po uplywie 30 minut oddziela w wirówce prze¬ plywowej. Oddzielony bentonit eiuuje sie za po¬ moca 90 litrów 0,5 m roztworu octanu sodowego przy wartosci pH 8,0 i odsacza. Otrzymuje sie 92,5 litrów zawierajacych 1,12«106 E (86%) o czyn- ~nosci wlasciwej Xfi4 E/mg. c. 1 litr eluatu z bentonitu, wytworzonego we¬ dlug punktu b), dializuje sie wobec 0,001 m bufo¬ ru z fosforanu potasowego przy wartosci pH 7,0 :8250 E 1,8 E/mg.Roztwór enzymu nanosi sie na kolumne 10X15 cm z DEAEHSephadex A-50 w takim samym bu¬ forze. Nastepnie eiuuje sie liniowym gradientem po 2 litry 0,01 i 0,1 m buforu przy wartosci pH 7,0. Odbiera sie frakcje po 25 ml. Penicylinacyla- za znajduje sie w frakcjach 1/10—170; 1,2 litra 6760 E (82%) 6 £/Mg. d. Roztwór z c) wytraca sie przez dodanie siar¬ czanu amonowego (472 g/litr), osad odsacza sie i rozpuszcza w wodzie. Cz^sc tego roztworu zawierajaca 4700 E, zadaje sie siarczanem amono¬ wym do 46% nasycenia, odwirowuje do otrzyma¬ nia klarownego roztworu i przechowuje w tempe¬ raturze pokojowej. W ciagu tygodnia rozpoczyna sie krystalizacja. Krysztaly odwirowuje sie, roz¬ puszcza w 0,01 m buforze fosforanowym i diali¬ zuje wobec takiego samego buforu : 3300 E (70%) o 12,45 E/mg.Przyklad V. 60 litrów roztworzonego suro¬ wego ekstraktu wytworzonego wedlug przykladu IVa) nastawia sie na wartosc pH 5,0 i odwirowuje.Klarowny roztwór nad osadem zawiera 155 000 E o czynnosci wlasciwej 0,3 E/img. Przez dodanie mieszaniny wymieniaczy jonowych odsala sie do 1,0 mS: Do tego roztworu dodaje sie przy wartosci pH 5,0 poczatkowo 200 g bentonitu (typ SF, firmy Serva), odwirowuje i osad odrzuca. Nastepnie do¬ daje dalsze 800 g, odwirowuje i eiuuje 20 litrami83 713 9 0,5 m octanu sodowego przy pH 8,0. Wydajnosc wynosi 110 000 E 1,5 E/mg.Roztwór enzymu dializuje sie wobec 0,5 m bu¬ foru z octanu sodowego o wartosci pH 5,0 i na¬ nosi na kolumne 11 X 95 om, wypelniona SE-Se- phadex C-50 w 0/5 m octanie sodowym przy war¬ tosci pH 5,0. Kolumne eluuje sie liniowym gradientem po 15 litrów 0,07 i 0,25 m octanu sodowego o wartosci pH 5,0. Penicylinacylaza znajduje sie w eluacie z 24 — 27 litrów. Wydaj¬ nosc wynosi 88 000 E (80%)., 4,2 E/mg. 29 000 E tego roztworu dializuje sie wobec 0,01 m buforu z fosforanu potasowego o wartosci pH 7,0 i nanosi na kolumne 11 X 25 cm zawierajaca DEAE-Sephadex A-50 w 0,01 m fosforanie pota¬ sowym o wartosci 7,0. Eluuje sie gradientem 0,01—Ojl m fosforanu potasowego przy wartosci pH 7,0. Penicylinacylaza zostaje eluowana pod ko¬ niec gradientu. Wydajnosc wynosi 21000 E (73%); 11,2 E/mg.Czesc roztworu zawierajaca 6000 doprowadza sie za pomoca stalego siarczanu amonowego do okolo 45% nasycenia. Po uplywie okolo 2 tygodni tworza sie na sciankach naczynia wielkie kryszta¬ ly. Po dalszych 2 tygodniach utrzymywania w tem¬ peraturze pokojowej odwirowuje sie krysztaly i rozpuszcza w wodzie. Wydajnosc wynosi 4260 E (71%), 13,1 E/mg.Przyklad VI. Eluat z bentonitu wytworzony wedlug przykladu IV zawierajacy 4100 E o 2,0 E/mg dializuje sie wobec 0,05 m octanu sodowego przy wartosci pH 5,0 i nanosi na kolumne 2,5 X 25 cm zawierajaca Lewatit SP — 100 w postaci Na+. Eluuje sie za pomoca gradientu 0,05—0,5 m octanu sodowego przy wartosci pH ,0. Czynne frakcje zawieraja 2020 E (56%), 6,6 E/mg.Roztwór enzymu nastawia sie za pomoca NaOH na wartosc pH 6,5 i doprowadza czysty enzym do krystalizacji iprzez dodanie stalego siarczanu amo¬ nowego do 48% nasycenia. 1250 E (72%), 12,1 E/mg. PL