CN116768944A - 一种n-乙酰神经氨酸的提纯方法 - Google Patents

一种n-乙酰神经氨酸的提纯方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种N‑乙酰神经氨酸的提纯方法，属于生物工程技术领域，包括以下步骤：将含有N‑乙酰神经氨酸的转化液与酸混合后进行酸化，得到酸化液；将所述酸化液依次通过陶瓷膜微滤、电渗析除盐，得到除盐液；将所述除盐液通过离子交换树脂吸附、水顶洗和洗脱，得到洗脱液；将所述洗脱液依次进行纳滤浓缩和再次浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液依次进行活性炭脱色和干燥，得到N‑乙酰神经氨酸晶体。本发明提供的方法制备得到N‑乙酰神经氨酸晶体的色谱纯度≥99％，含量≥99％，白度≥90，含水率≤2％。操作简单，环境友好，便于工业化生产。

Description

一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法。
背景技术
N-乙酰神经氨酸，也称唾液酸，唾液酸在自然界分布很广，唾液酸广泛存在于各种生物组织中，是糖蛋白、低聚糖和糖脂的重要成分，通常在糖蛋白和糖脂的末端以糖甙的形式存在，特别在哺乳动物的脑、神经组织、血液、颌下腺、黏蛋白、初乳中存在较多。但有时，血清、体液和尿中也能发现游离的唾液酸。
唾液酸的生物学功能有两大类，即唾液酸本身能被识别的受体作用和掩盖其它分子的掩蔽作用。近年来也发现，唾液酸及其衍生物在各种生命活动调节中起着重要的作用，与许多疾病密切相关，在抑制唾液酸转移酶和抗癌转移、促进神经细胞增长与抗老年痴呆症、抑制唾液酸酶与抗病毒、抑制白细胞薪附与抗炎等方面，此外唾液酸在控制细胞黏液浓度、抗识别、抗肿瘤等生理功能上也具有很大作用。
关于唾液酸的工业化制备方法主要有天然物抽提法、化学合成法和酶法合成。天然产物提取法是唾液酸最原始的生产方式，通过特殊步骤将唾液酸从燕窝、卵黄、乳清等天然产物中提取得成。尽管唾液酸在自然界中分布广泛，然而因为含量低、组成结构复杂、提取过程繁琐、回收率低、环境污染大等问题，这必然影响到唾液酸的开发和利用。而化学合成法则是以某些糖类或非糖类物质为底物，经化学催化剂催化合成唾液酸，该方法虽然能实现规模化生产，但反应条件要求严苛，生产工艺繁琐复杂，且中间产物大多不利于后期分离纯化过程，难以在保证产品品质的同时满足工业化生产需求。随着生物技术的发展，酶法合成法已成为市场上最有竞争力的唾液酸生产方式，具有条件温和、专一性强、转化率高、所得产物纯度高等明显优势。在唾液酸酶法转化液中，除了反应底物丙酮酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖胺以及反应产物唾液酸等主要成分外，还有微生物细胞及其碎片、杂蛋白、无机盐和色素等多种成分。因此开发高效率、低成本的唾液酸提取方法对促进唾液酸的产业化显得至关重要。
在唾液酸酶法转化液中，除了反应底物丙酮酸钠、N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰甘露糖胺以及反应产物唾液酸等主要成分外，还有微生物细胞及其碎片、杂蛋白、无机盐和色素等多种成分。因此开发高效率、低成本的唾液酸提取方法对促进唾液酸的产业化显得至关重要。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法，本发明提供的方法得到的N-乙酰神经氨酸色谱纯度、含量和白度高，工艺简单、环境友好。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法，包括以下步骤：
将含有N-乙酰神经氨酸的转化液与酸混合后进行酸化，得到酸化液；
将所述酸化液依次通过陶瓷膜微滤、电渗析除盐，得到除盐液；
将所述除盐液通过离子交换树脂吸附、水顶洗和洗脱，得到洗脱液；
将所述洗脱液依次进行纳滤浓缩和再次浓缩，得到浓缩液；
将所述浓缩液依次进行活性炭脱色和干燥，得到N-乙酰神经氨酸晶体。
优选地，所述含有N-乙酰神经氨酸的转化液为通过固定化双酶转化后获得的含有N-乙酰神经氨酸的转化液。
优选地，所述酸化液的pH值为1.8～2.5。
优选地，所述陶瓷膜的虑孔的直径为50～100nm。
优选地，所述除盐液的电导率为2～4mS/cm2。
优选地，所述离子交换树脂为强碱型阴离子树脂；所述水顶洗的程度为顶洗至所得顶洗液中N-乙酰葡萄糖胺的浓度≤50μg/ml；所述洗脱剂为甲酸水溶液。
优选地，所述纳滤浓缩所用纳滤膜的截留分子量为50～300道尔顿；所述纳滤浓缩所得浓缩液中N-乙酰神经氨酸的质量浓度为10～20％。
优选地，所述再次浓缩后所得浓缩液中N-乙酰神经氨酸的质量浓度为30～40％。
优选地，所述活性炭的用量为浓缩液体积的1～5％；所述活性炭脱色的温度为40～70℃，时间为15～50min。
优选地，所述N-乙酰神经氨酸晶体的色谱纯度≥99％，含量≥99％，白度≥90，含水率≤2％。
有益技术效果：
本发明提供了一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法，包括以下步骤：将含有N-乙酰神经氨酸的转化液与酸混合后进行酸化，得到酸化液；将所述酸化液依次通过陶瓷膜微滤、电渗析除盐，得到除盐液；将所述除盐液通过离子交换树脂吸附、水顶洗和洗脱，得到洗脱液；将所述洗脱液依次进行纳滤浓缩和再次浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液依次进行活性炭脱色和干燥，得到N-乙酰神经氨酸晶体。本发明提供的方法制备得到N-乙酰神经氨酸晶体的色谱纯度≥99％，含量≥99％，白度≥90，含水率≤2％。操作简单，环境友好，便于工业化生产。
具体实施方式
本发明提供了一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法，包括以下步骤：
将含有N-乙酰神经氨酸的转化液与酸混合后进行酸化，得到酸化液；
将所述酸化液依次通过陶瓷膜微滤、电渗析除盐，得到除盐液；
将所述除盐液通过离子交换树脂吸附、水顶洗和洗脱，得到洗脱液；
将所述洗脱液依次进行纳滤浓缩和再次浓缩，得到浓缩液；
将所述浓缩液依次进行活性炭脱色和干燥，得到N-乙酰神经氨酸晶体。
本发明将含有N-乙酰神经氨酸的转化液与酸混合后进行酸化，得到酸化液。
在本发明中，所述含有N-乙酰神经氨酸的转化液优选为通过固定化双酶转化后获得的含有N-乙酰神经氨酸的转化液，更优选为在pH为7，温度为30℃下N-乙酰葡萄糖胺和丙酮酸钠与固定化N-乙酰葡萄糖胺-2-差向异构酶和固定化N-乙酰神经氨酸醛缩酶混合制备得到的N-乙酰神经氨酸转化液。
所述N-乙酰神经氨酸转化液优选包括以下质量百分含量的组分：丙酮酸钠25～30％，N-乙酰葡萄糖胺40～45％，其余为悬浮物和杂蛋白。
在本发明中，所述酸优选为浓盐酸或浓硫酸。本发明对酸的用量没有特殊限定，能够使酸化液的pH值达到要求即可。本发明所述酸化液的pH值优选为1.8～2.5，更优选为2.0～2.3。本发明通过酸化使pH值达到电渗析的等电点附件，便于对其进行电渗析处理。
得到酸化液后，本发明将所述酸化液依次通过陶瓷膜微滤、电渗析除盐，得到除盐液。
在本发明中，所述陶瓷膜的虑孔的直径优选为50～100nm，更优选为75～85nm。
具体地，本发明将将所述酸化液通过陶瓷膜微滤机进行微滤后得到浓缩液和第一澄清液；将浓缩液继续顶洗得到第二澄清液；合并第一澄清液和第二澄清液后进行电渗析除盐。
在本发明中，所述第一澄清液的体积优选为酸化液体积的85～95％，更优选为90％；所述第二澄清液体积为酸化液体积的25～35％，更优选为30％。
在本发明中，所述除盐液的导电率优选为2～4mS/cm2，更优选为3mS/cm2。本发明通过陶瓷膜过滤掉转化液中的悬浮物，使物料澄清。
得到除盐液后，本发明将所述除盐液通过离子交换树脂吸附、水顶洗和洗脱，得到洗脱液。
在本发明中，所述离子交换树脂优选为强碱型阴离子树脂，更优选为含有季铵基官能团的阴离子树脂；所述水顶洗的程度为顶洗至所得顶洗液中N-乙酰葡萄糖胺的浓度≤50μg/ml；所述洗脱剂为甲酸水溶液；所述甲酸水溶液的质量浓度优选为5～20％，更优选为10～15％。
得到洗脱液后，本发明将所述洗脱液依次进行纳滤浓缩和再次浓缩，得到浓缩液。
在本发明中，所述纳滤浓缩所用纳滤膜的截留分子量为50～300道尔顿，更优选为100～250道尔顿，最优选为150～200道尔顿；所述纳滤浓缩所得浓缩液中N-乙酰神经氨酸的质量浓度优选为10～20％，更优选为15％；所述再次浓缩所得浓缩液中N-乙酰神经氨酸的质量浓度为30～40％，更优选为35％。
得到浓缩液后，本发明将所述浓缩液依次进行活性炭脱色和干燥，得到N-乙酰神经氨酸晶体。
在本发明中，所述活性炭的用量优选为浓缩液体积的1～5％，更优选为2～3％；所述活性炭脱色的温度优选为40～70℃，更优选为50～60℃；所述活性炭脱色的时间优选为15～50min，更优选为20～40min，最优选为25～30min。
在本发明中，所述干燥优选为喷雾干燥；所述N-乙酰神经氨酸晶体的色谱纯度≥99％，含量≥99％，白度≥90，含水率≤2％。
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
取2m3N-乙酰神经氨酸转化液，用浓硫酸调pH至2.0，用陶瓷膜微滤机(50nm)微滤，微滤得到1.8m3澄清液后开始用生活饮用水顶洗浓缩液，微滤顶洗0.6m3水后，共收集2.4m3滤液。微滤液用电渗析进行除盐，除盐至料液电导为2mS/cm2，得到除盐液2.3m3。将除盐液经离子交换柱(装填量为1m3阴离子树脂)上柱，上柱流速为1BV/h，上柱完成后用4m3水顶洗离交柱，再用5％的甲酸进行洗脱，收集洗脱液3.3m3。将洗脱液经纳滤浓缩除杂后获得纳滤浓缩液0.8m3，纳滤浓缩液继续进单罐浓缩，浓缩至N-乙酰神经氨酸浓度30％，转入脱色罐后投入8kg活性炭，70℃下脱色30min，过滤得脱色液，脱色液经喷雾干燥获得98kgN-乙酰神经氨酸，水分1.5％，色谱纯度99.5％，HPLC外标法测得质量百分含量为99.2％，白度92。
实施例2
取2m3N-乙酰神经氨酸转化液，用浓硫酸调pH至2.0，用陶瓷膜微滤机(50nm)微滤，微滤得到1.8m3澄清液后开始用生活饮用水顶洗浓缩液，微滤顶洗0.6m3水后，共收集2.4m3滤液。微滤液用电渗析进行除盐，除盐至料液电导为3mS/cm2，得到除盐液2.3m3。将除盐液经离子交换柱(装填量为1m3阴离子树脂)上柱，上柱流速为1BV/h，上柱完成后用4m3水顶洗离交柱，再用10％的甲酸进行洗脱，收集洗脱液3.0m3。将洗脱液经纳滤浓缩除杂后获得纳滤浓缩液0.8m3，纳滤浓缩液继续进单罐浓缩，浓缩至N-乙酰神经氨酸浓度30％，转入脱色罐后投入5kg活性炭，70℃下脱色30min，过滤得脱色液，脱色液经喷雾干燥获得102kgN-乙酰神经氨酸，水分1.6％，色谱纯度99.2％，HPLC外标法测得质量百分含量为99.0％，白度90。
实施例3
取2m3N-乙酰神经氨酸转化液，用浓硫酸调pH至2.0，用陶瓷膜微滤机(50nm)微滤，微滤得到1.8m3澄清液后开始用生活饮用水顶洗浓缩液，微滤顶洗0.6m3水后，共收集2.4m3滤液。微滤液用电渗析进行除盐，除盐至料液电导为4mS/cm2，得到除盐液2.3m3。将除盐液经离子交换柱(装填量为1m3阴离子树脂)上柱，上柱流速为1BV/h，上柱完成后用4m3水顶洗离交柱，再用10％的甲酸进行洗脱，收集洗脱液3.0m3。将洗脱液经纳滤浓缩除杂后获得纳滤浓缩液0.8m3，纳滤浓缩液继续进单罐浓缩，浓缩至N-乙酰神经氨酸浓度40％，转入脱色罐后投入10kg活性炭，70℃下脱色30min，过滤得脱色液，脱色液经喷雾干燥获得108kgN-乙酰神经氨酸，水分1.4％，色谱纯度99.3％，HPLC外标法测得质量百分含量为含量99.2％，白度91。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种N-乙酰神经氨酸的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含有N-乙酰神经氨酸的转化液与酸混合后进行酸化，得到酸化液；
将所述酸化液依次通过陶瓷膜微滤、电渗析除盐，得到除盐液；
将所述除盐液通过离子交换树脂吸附、水顶洗和洗脱，得到洗脱液；
将所述洗脱液依次进行纳滤浓缩和再次浓缩，得到浓缩液；
将所述浓缩液依次进行活性炭脱色和干燥，得到N-乙酰神经氨酸晶体。
2.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述含有N-乙酰神经氨酸的转化液为通过固定化双酶转化后获得的含有N-乙酰神经氨酸的转化液。
3.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述酸化液的pH值为1.8～2.5。
4.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述陶瓷膜的虑孔的直径为50～100nm。
5.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述除盐液的电导率为2～4mS/cm2。
6.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述离子交换树脂为强碱型阴离子树脂；所述水顶洗的程度为顶洗至所得顶洗液中N-乙酰葡萄糖胺的浓度≤50μg/ml；所述洗脱剂为甲酸水溶液。
7.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述纳滤浓缩所用纳滤膜的截留分子量为50～300道尔顿；所述纳滤浓缩所得浓缩液中N-乙酰神经氨酸的质量浓度为10～20％。
8.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述再次浓缩后所得浓缩液中N-乙酰神经氨酸的质量浓度为30～40％。
9.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述活性炭的用量为浓缩液体积的1～5％；所述活性炭脱色的温度为40～70℃，时间为15～50min。
10.根据权利要求1所述的提纯方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸晶体的色谱纯度≥99％，含量≥99％，白度≥90，含水率≤2％。
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