Sposób wytwarzania acylazy penicylinowej Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania, oczy¬ szczania i wyosabniania enzymu z Escherichia coli, majacego zdolnosc odszczepiania bocznych lancu¬ chów niektórych penicylin, tworzac przy tym kwas 6- aminopenicylanowy.Wiadomo, ze wiele mikroorganizmów, zarówno bakterii, jak i grzybów, wytwarza enzymy, które moga hydrolizowac wiazanie amidowe w pozycji 6 penicylin. Enzymy te okresla sie ogólnie nazwa acylaz lub amidaz penicylinowych (J.M.T. Hamil- ton-Miller Bacteriological Reviews 30 (1966) 761).Przy wytwarzaniu kwasu 6-aminopenicylanowego na skale przemyslowa stosuje sie korzystnie zawie¬ siny komórek E. Coli, zawierajace acylaze lub ami¬ daze.Metody te maja jednak szereg wad. Poniewaz enzym znajduje sie przewaznie wewnatrz komórek, przeto, aby mógl dzialac na penicyline, musi ona -wpierw przeniknac do wnetrza komórek, co spra¬ wia, ze caly proces jest powolny. Poza tym uzyty szczep moze zawierac równiez inne enzymy, które inaktywuja penicyline lub utworzony kwas 6-ami_ no-penicylanowy rozszczepiajac wiazanie /ff-lakta- mowe, albo zanieczyszczaja komórki organizmami, które wytwarzaja wspomniane enzymy. Poniewaz zas acylaza stanowi tylko bardzo mala czesc za¬ wartosci komórek, przeto proces, w którym stosuje sie cale organizmy, ma te niedogodnosc, ze duza ilosc materialu opóznia jego przebieg.Inna wada znanych metod, w których stosuje sie 10 15 20 25 30 mikroorganizmy w calosci, jest to, ze do szeregu czynnosci niezbednych w celu otrzymania pólsyn- tetycznych penicylin, trzeba dodac jeszcze czynnosc oddzielania, na przyklad odsaczania, organizmów od cieczy reakcyjnej, w której pierwotny lancuch boczny zostal odszczepiony od biosyntetycznych penicylin. Oprócz tego traci sie pewne ilosci kwasu penicylanowego przez adsorpcje w komórkach oraz na skutek rozkladu pod wplywem produktów prze¬ miany materii w komórkach. Powazny problem sta¬ nowi równiez oddzielanie kwasu 6-aminopenicyla¬ nowego od innych produktów, powstajacych podczas procesu odszczepiania bocznego lancucha.Jak wiadomo (Batchelor i in. Lancet I (1968) 1175), kwas 6-aminopenicylanowy, otrzymany znana metoda przy uzyciu calych komórek mikroorganiz¬ mów, moze zawierac bialkowe zanieczyszczenia zdolne do wywolywania niebezpiecznych reakcji alergicznych u ludzi i zwierzat. Penicyliny, otrzy¬ mane z takiego zanieczyszczonego kwasu 6-amino- penicylinowego, moga zawierac wymienione zanie¬ czyszczenia, powodujace wiele reakcji alergicznych, zaobserwowanych przy stosowaniu takich penicylin (G.T. Stewart, Amer. Heart. J. 1968, 429).W celu usuniecia tych zanieczyszczen, kwas 6- -aminopenicylanowy lub wytworzone zen penicyliny nalezy poddawac dodatkowym procesom oczyszcza¬ nia, na przyklad przez dialize lub filtracje zelowa (kanadyjski opis patentowy nr 771 662).Podczas tych dodatkowych zabiegów traci sie zna- 831683 83 168 4 czne ilosci kwasu 6-aminopenicylanowego lub peni¬ cyliny, czego dowodzi wydajnosc benzylopenicyliny, wynoszaca przy metodzie podanej w brytyjskim opi¬ sie patentowym nr 1078 847 tylko 12% lub wydaj¬ nosc fenoksymetylopenicyliny (brytyjski opis pa¬ tentowy nr 1114 311) wynoszaca 56% wydajnosci teoretycznej.Wszystkich tych niedogodnosci unika sie, stosujac nie zawierajacy komórek, to znaczy oczyszczony preparat enzymowy otrzymany sposobem wedlug wynalazku. Kwas 6-aminopenicylanowy, wytworzo¬ ny przy uzyciu takiego oczyszczonego preparatu enzymowego do rozerwania wiazania amidowego w pozycji 6 penicylin, otrzymuje sie z dobra wydaj¬ noscia i zasadniczo wolny od bialkowych zanieczy¬ szczen. Przez acylowanie takiego kwasu otrzymuje sie z dobra wydajnoscia i bez dalszego oczyszczania penicyliny nie powodujace schodzen alergicznych.W literaturze znajduje sie szereg wzmianek o próbach wytwarzania oczyszczonych preparatów enzymowych z szczepów E. coli. Jedna z tych metod Borkar i in. Hindustan Antibiotics Buli. 4, (1961) 48, 152 polega na traktowaniu zawiesiny komórek w fosforanowej substancji buforowej falami ultra¬ dzwiekowymi, a nastepnie frakcjonowane stracanie i chromatografowanie kolumnowe.W wyniku tych procesów uzyskuje sie 25-krotne oczyszczenie. Inny sposób (Holt i Stewart, Nature 201 (1964) 824) polega na osuszaniu przez wymraza- nie i dializowaniu odsaczonej brzeczki hodowli. Me¬ toda ta nie daje dobrych wyników, gdyz otrzymuje sie produkt zanieczyszczony. Lepsze wyniki, a mia¬ nowicie oczyszczenie 40-krotne uzyskuje sie przy oczyszczaniu enzymu E. coli metoda stracania siar¬ czanu amonowego i adsorpcje zelowa za pomoca fosforanu wapniowego oraz chromatografowanie na celulozie DEAE wyciagu z komórek E. coli w fo¬ sforanowej substancji buforowej, poddanego dzia¬ laniu fal ultradzwiekowych (Szentirmai, Acta Microb. Acad. Scient. Hung. 12 (1966) 395.Sakaguchi i Marao (japonski opis patentowy nr 26050/64) otrzymali z niewielka wydajnoscia oczy¬ szczony preparat enzymowy z E. coli, ekstrahujac komórki boranowa substancja buforowa w ciagu dluzszego okresu czasu lub w ciagu krótszego czasu przy zastosowaniu dzialania fal ultradzwiekowych.Z wyciagu mozna nastepnie otrzymac enzym w po¬ staci stalej, po straceniu siarczanem amonowym, dializie i suszeniu przez wymrazanie. Johnson i Hardcastle {amerykanski opis patentowy nr 3 297 546) otrzymali roztwór enzymu z E. coli przez traktowanie kultury komórkowej zwiazkiem o wzo¬ rze MX2, przewaznie Ca(N03)2, a nastepnie czwarto- rzerzedowym zwiazkiem amonowym, odsaczanie komórek i mieszanie ich z woda w ciagu kilku go¬ dzin i odsaczanie zawiesiny oraz oczyszczanie prze¬ saczu weglem aktywowanym.Wiadomo równiez, ze enzymy zawarte w komór¬ kach bakterii moga byc wyzwalane przez wytlacza¬ nie zawiesin komórek pod wysokim cisnieniem przez maly otwór. Duerre i Rflbi (Appl. Microbiol. 11 (1964) 467) przy badaniu nie amidazy penicylino¬ wej, lecz innych enzymów wystepujacych w E. coli, stwierdzili, ze w celu uzyskania maksymalnego wy¬ zwalania enzymów trzeba stosowac cisnienie powy¬ zej 1050 atmosfer. Jednakze przy stosowaniu tak wysokiego cisnienia ulegaja równiez rozerwaniu scianki komórek i znaczna ich czesc przechodzi do 5 roztworu, Frazer (Nature 167 (1951) 33) stwierdzil, ze komórki E. coli ulegaja rozrywaniu na mala skale przy wytlaczaniu ich z bomby pod cisnieniem gazu, wynoszacyrn 85—63 atm.W odróznieniu od podanych wyzej znanych metod io stwierdzono obecnie, ze wewnatrzkomórkowa acy- laze penicylinowa mozna ekstrahowac z E. coli za pomoca wody na duza skale, jezeli komórki lub ich zawiesine w wodzie albo w mieszaninie wody z roz¬ puszczalnikami organicznymi podda sie dzialaniu 15 cisnienia wynoszacego co najmniej 35 atm, lecz nie przekraczajacego cisnienia, przy którym nastepuje rozrywanie komórek i nastepnie nagle rozprezy.Zgodnie z tym wynalazek umozliwia wytwarzanie preparatu acylazy penicylinowej z E. coli na drodze 20 znanej fermentacji szczepu E. coli wytwarzajacego ten enzym, oddzielaniu cieczy z hodowli i szybkiego wytlaczania materialu komórkowego przez waski otwór lub szczeline pod cisnieniem co najmniej 35 atm, lecz nie wyzszym od cisnienia, przy którym za- 25 chodzi nadmierne rozrywanie komórek. Stwierdzo¬ no, ze takie nadmierne rozrywanie komórek nie zachodzi przy stosowaniu cisnienia wynoszacego 210 atm. Wytloczony material miesza sie z woda ewen-. tualnie z dodatkiem organicznego rozpuszczalnika 30 i/lub zasady, na przyklad wodorotlenku sodowego lub trójetyloaminy, w celu rozpuszczenia enzymu.Wedlug wynalazku, oddzielanie cieczy z hodowli i wytlaczanie materialu komórkowego przeprowadza sie równoczesnie za pomoca separatora odsrodko- 35 wego, wyposazonego w urzadzenie samooczyszcza- jace i pracujacego w temperaturze 0—50°C, korzy¬ stnie 15—40°C, przy czym oddzielany material ko¬ mórkowy wytlacza sie okresowo w ciagu 0,05—1,0 sekundy, a korzystnie 0,1—0,5 sekundy, przez szcze- 40 line na obwodzie, majaca szerokosc 0,1—1,5 mm, a korzystnie 0,3—0,7 mim, stosujac cisnienie 35—140 atm, korzystnie 63—77 atm.W razie potrzeby brzeczke nasyca sie organicz¬ nym rozpuszczalnikiem o malej rozpuszczalnosci w 45 wodzie, na przyjdad octanem butylu, octanem izo- butylu lub octanem amylu, w celu zabicia mikro¬ organizmu i ulatwienia procesu rozdzielania. W ra¬ zie potrzeby mozna przemywac material komórko¬ wy w separatorze woda. Wytloczony material ko¬ so mórkowy miesza sie w temperaturze 10—50°C, a korzystnie 20—40°C, w ciagu 0,10—5,0 godzin, nie¬ kiedy korzystnie 0,25—3,0 godzin, a zwlaszcza 0,25—1,0 godziny, w mieszalniku o sprawnie dzia¬ lajacym mieszadle, w celu rozpuszczenia enzymu, 55 ewentualnie z dodatkiem 1,0—5,0% organicznego rozpuszczalnika nie mieszajacego sie z woda, na przyklad ketonu metyloizobutylowego, octanu bu¬ tylu, octanu izobutylu, octanu amylu, bezenu, to¬ luenu lub chloroformu. 60 w ceiu ulatwienia ekstrakcji enzymu z wytloczo¬ nego materialu komórkowego mozna do mieszaniny dodac nieorganicznej zasady, na przyklad wodoro¬ tlenku sodwego, potasowego lub amoniaku, albo trzeciorzedowej zasady organicznej, na przyklad os trójetyloaminy lub N-etylopiperydyny, doprowa-5 83 168 6 dzajac wartosc pH mieszaniny do 6,5—9,0, a korzy¬ stnie do 7,0—8,5.Otrzymany w ten sposób roztwór enzymu, ewen¬ tualnie po rozcienczeniu woda, uwalnia sie od po¬ zostalego materialu komórkowego i innych stalych zanieczyszczen za pomoca znanych metod, na przy¬ klad odsaczania lub odwirowywania albo obu tych metod ewentualnie z dodatkiem pomocniczych srod¬ ków odbarwiajacych, klarujacych lub ulatwiajacych saczenie, na przyklad wegla aktywowanego, tlenku glinowego, sproszkowanej celulozy, ziemi okrzem¬ kowej, lub innych stalych srodków o niewielkiej zdolnosci adsorbowania.Korzystnie jest oddzielac wieksza czesc materia¬ lu komórkowego przez odwirowanie i nastepnie przesaczac otrzymany odciek. W celu dodatkowego oczyszczania enzymu zakwasza sie wodny roztwór do wartosci pH=3,0—6,0, korzystnie 4,0—5,0, odsa¬ cza wytracony, nieaktywny osad i ponownie dopro¬ wadza wartosc pH do jej poprzedniej wysokosci.Acylaze penicylinowa, zawarta w uwolnionym od komórek i ewentualnie czesciowo oczyszczonym, wodnym roztworze, mozna wytracac przez trakto¬ wanie tego roztworu srodkami takimi, jak tanina, które z substancjami bialkowymi wytwarzaja tru- dnorozpuszczalne kompleksy. Korzystnie jest, jezeli roztwór enzymu o wartosci pH=4—6, a zwlaszcza 4,5—5,5, traktuje sie tanina w takiej ilosci, aby jej stezenie wynioslo 300—900 czesci/milion, w obecno¬ sci srodków wytwarzajacych wiazania chelatowe, na przyklad kwasu etylenodwuaminoczterooctowego, w celu wytworzenia zwiazków kompleksowych z jona¬ mi zelaza.Wytworzony kompleks enzymu z tanina mozna wyosabniac w znany sposób, na przyklad przez od¬ saczanie lub odwirowywanie. Mozna go przemywac, suszyc i odwadniac na przyklad przez wymrazanie lub przez traktowanie organicznymi rozpuszczalni¬ kami mieszajacymi sie z woda, na przyklad aceto¬ nem. Mozna tez stosowac ten kompleks bezposre¬ dnio do usuwania bocznego lancucha w penicyli¬ nach, na przyklad w benzylopenicylinie, jak to omówiono w brytyjskim zgloszeniu patentowym nr 33734/67.Acylaze, zawarta w kompleksie straconym za po¬ moca taniny, przeprowadza sie do wodnego roz¬ tworu przez rozpuszczenie zwiazku kompleksowego w wodzie przy wartosci pH=7—9, korzystnie 7,5— 8,5. Mozna tez potraktowac kompleks mieszanina wody i nie mieszajacego sie z woda rozpuszczalni¬ ka, na przyklad n-butanolu, przy wartosci pH=4— 7, a korzystnie 4,5—5,5.Trzecia wreszcie metoda oddzielania taniny od acylazy polega na tym, ze kompleks enzymu z ta¬ nina miesza sie z woda i powstala zawiesine prze¬ puszcza sie przez anionowy wymieniacz jonowy, na przyklad dwuetyloaminoetyloceluloze, który wiaze tanine, a enzym rozpuszcza sie w wodzie. Ilosc wo¬ dy niezbedna w operacjach jest znacznie mniejsza od tej, jaka znajduje sie w pierwotnych roztworach enzymu, totez w ten sposób uzyskuje sie znaczny wzrost aktywnosci enzymatycznej roztworów.Wedlug wynalazku, acylaze penicylinowa zawarta w roztworze mozna stezac i oczyszczac za pomoca wymieniacza jonowego. Korzystnie jest adsorbo- wac enzym na kationowym wymieniaczu jonowym, na przyklad znanym pod nazwa SE-Sephadex lub OM-Sephadex lub na karboksymetyloceMozie, przepuszczajac roztwór enzymu, doprowadzony do wartosci pH=3,5—6, a korzystnie 4,0-^5,0, przez kolumne wymieniacza. Mozna tez wymieniacz do¬ dawac do roztworu i mieszac. Z wymieniacza jono¬ wego eluuje sie acylaze przy wartosci pH=6,0—8,0 za pomoca slabych roztworów buforowych, na przyklad 0,2 m roztworu octanu amonowego lub octanu trójhydroksymetyloamonowego.W celu otrzymania bardziej czystych preparatów enzymowych, jony nieograniczone i zanieczyszczenia o malych czasteczkach usuwa sie z roztworów en¬ zymu za pomoca dializy woda. Mozna tez roztwory enzymowe, w razie potrzeby po stezeniu ich do za¬ wartosci 25—100 img substancji stalej na I litr, pod¬ dawac filtracji zelowej. Stezenie tych roztworów prowadzi sie w temperaturze ponizej 50°C.Roztwory enzymu, otrzymane w jednym z opisa¬ nych wyzej stadiów procesu, nadaja sie bezposre¬ dnio do odszczepiania bocznych lancuchów natural¬ nych penicylin, zwlaszcza do usuwania bocznego lancucha w benzylopenicylinie.Zgodnie z wynalazkiem, acylaze w stanie stalym wyosabnia sie z wodnego roztworu przez wymra¬ zanie do sucha, suszenie metoda fluidyzacji lub rozpylania, albo tez za pomoca stezania pod zmniej¬ szonym cisnieniem lub stracania znanymi metoda¬ mi. W wyniku tych procesów otrzymuje sie staly enzym o wysokiej aktywnosci wlasciwej, nadajacy sie do magazynowania i przenoszenia. Stosowanie takiego stalego, rozpuszczalnego w wodzie preparatu enzymowego daje wiele korzysci technicznych, gdyz umozliwia prace z roztworami o znacznie wiekszym stezeniu niz stezenie, jakie osiaga sie przy znanej metodzie zawiesin komórek. Szczególnie korzystne jest wyosabnianie enzymu za pomoca wymrazania do sucha roztworu enzymu w temperaturze —10°C do 50°C, korzystnie 0—30°C lub suszenie fluidyza¬ cyjne w strumieniu powietrza w temperaturze 10— 55°C, korzystnie 35—45°C.Oczyszczone preparaty enzymowe, otrzymane sposobem wedlug wynalazku, stanowia dobry ma¬ terial wyjsciowy do chemicznego przeksztalcania enzymu, w wyniku czego otrzymuje sie produkty o lepszych wlasciwosciach, a mianowicie aktywniej¬ szych i/lub lepiej nadajacych sie w technice. Enzym ten moze reagowac z materialami o budowie poli- merycznej, na przyklad z polisacharydami trakto¬ wanymi bromkiem cyjanu, dajac produkty, w któ¬ rych enzym jest zwiazany z podstawa polimeru.Produkty takie zachowuja aktywnosc enzymatycz¬ na, co ma te zalete przy stosowaniu ich do roz¬ szczepiania penicylin, ze mozna je latwo oddzielac od roztworu reakcyjnego, na przyklad przez odsa¬ czenie. Polimeryczne preparaty enzymowe mozna takze stosowac w kolumnach do ciaglego wytwa¬ rzania kwasu 6-aniinapenicylanowego, polegajacego na przepuszczaniu roztworu penicylin przez kolu¬ mne.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nizej poda¬ nych przykladach, w których omówiono wytwarza¬ nie i oczyszczanie produktu enzymatycznego nie za¬ wierajacego komórek. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 607 83 168 8 Przyklad I. Wytwarzanie komórek bakterii E. coli. 3 kg namoku kukurydzowego, 135 ml oleju sojowego, 12 ml parafiny i 3 ml cetanolu w 150 litrach wody miesza sie, dodaje 165 ml 45% wodo¬ rotlenku sodowego w celu doprowadzenia wartosci pH mieszaniny do 6,0 i sterylizuje w temperaturze 124°C w ciagu 30 minut w posiewowym zbiorniku fermentacyjnym. Nastepnie roztwór zaszczepia sie 100 ml 20—24 godzinnej kultury E. coli (Astra 1339) ii prowadzi hodowle w temperaturze 25°C, napo^ wietrzajac i mieszajac w ciagu 18 gadzin. 300 kg namoku kukurydzowego, 13,8 kg oleju so¬ jowego, 1,22 kg parafiny, 0,3 kg cetanolu, 21 kg kwasu fenylooctowego i 112 kg chlorku sodowego w 14000 litrach wody traktuje sie 40 kg 45% roz¬ tworu wodorotlenku sodowego, doprowadzajac war¬ tosc pH roztworu do 6,6, po czym roztwór steryli¬ zuje sie w zbiorniku fermentacyjnym w tempera¬ turze 124°C w ciagu 30 minut. Nastepnie chlodzi sie roztwór i zaszczepia przygotowana wyzej kultu¬ re i poddaje hodowli w temperaturze 25°C, miesza¬ jac i napowietrzajac. Po uplywie 24 godzin od za¬ szczepienia, gdy wartosc pH wzrosnie do 8,2, zabi¬ ja sie komórki bakterii przez dodanie 180 litrów octanu butylu i mieszanine chlodzi sie.Przyklad II. Wyosabnianie i oczyszczanie acylazy. a) Mieszanine otrzymana w przykladzie I odwiro¬ wuje sie w separatorze typu De Laval BRPX 213- -35 S, wyposazonym w urzadzenie do samooczy¬ szczania. Paste komórek bakterii zbiera sie w por¬ cjach po 100—120 kg i do kazdej porcji dodaje 3% ketonu metyloizobutylowego i mieszanine homoge¬ nizuje za pomoca mieszalnika systemu Ultra Tur- rax, typ T 110/2M w ciagu 25 minut. Otrzymuje sie lacznie 325 kg masy.Analiza enzymu w róznych stadiach procesu daje nastepujace wyniki, wyrazone w jednostkach umo¬ wnych, przy czym 1 taka jednostka (1 j) oznacza ilosc enzymu zdolna do rozszczepienia w ciagu 1,5 godziny, przy wartosci pH=8,5 i w temperaturze 37°C takiej ilosci benzylopenicyliny, która odpowia¬ da 1 mg kwasu 6-aminopenicylanowego: wytwarzanie na drodze hodowli fermen¬ tacyjnej 5 j/ml odciek 0,33 j/ml odciek z separatora 0,28 j/ml pasta komórek bakterii 212 j/g ciecz w pascie przed homogenizacja 75 j/g ciecz w pascie po homogenizacji 123 j/g. b) Paste komórek bakterii, otrzymana w przy¬ kladzie Ha, stosuje sie do badania rozpuszczania enzymu. Do 100 g pasty dodaje sie 100 ml odjoni¬ zowanej wody. Otrzymana zawiesine, majaca war¬ tosc pH=5,9, poddaje sie nastepujacym próbom. 1. Odwirowuje sie zawiesine przy 5000 G (sila od¬ srodkowa mierzona jako wielokrotnosc przyspiesze¬ nia ziemskiego) w ciagu 20 minut i okresla aktyw¬ nosc enzymatyczna w odcieku. 2. Zawiesine homogenizuje sie w mieszalniku Ultra Turrax w ciagu 5 minut, ochladzajac próbke w kapieli lodowej, w celu niedopuszczenia, aby temperatura próbki wzrosla powyzej 35°C. Nastep¬ nie odwirowuje sie próbke, jak wyzej w punkcie 1 i okresla aktywnosc odcieku. 3. Do zawiesiny dodaje sie, mieszajac, wodoro¬ tlenku sodowego w celu doprowadzenia wartosci pH do 8,5, po czym próbke homogenizuje sie i od¬ wirowuje, jak wyzej podano oraz oznacza aktyw- 5 nosc odcieku. 4. Do zawiesiny dodaje sie 3% ketonu metyloizo¬ butylowego i nastawia wartosc pH jak w punkcie 3, po czym homogenizuje sie, odwirowuje i oznacza aktywnosc w odcieku.Wyniki prób rozpuszczania sa nastepujace: Jednostek/gram % calosci zawiesina bakterii 106 100 odciek otrzymany w próbie 1 29 28 15 odciek otrzymany w próbie 2 62 59 odciek otrzymany w próbie 3 73 69 odciek otrzymany w próbie 4 83 78 c) 175 kg zhomogenizowanej pasty bakteryjnej o aktywnosci 190 j/g rozciencza sie 175 kg wody 20 i do mieszaniny dodaje, mieszajac, 22,7 kg Hyflo, 22,7 kg Celite 505 i 10,2 kg Fibraflo, po czym od¬ dziela sie faze wodna, za pomoca filtru typu Funda i osad przemywa 50 litrami wody. Otrzymuje sie 290 kg polaczonych roztworów o aktywnosci 48 j/g. 25 d) 1 kg zhomogenizowanej pasty o aktywnosci 212 j/g rozciencza sie 2,0 litrami wody, dodaje 220 ml 0,5 n roztworu wodorotlenku sodowego w celu doprowadzenia wartosci pH do 8,5 i miesza w tem¬ peraturze 20°C w ciagu 30 minut. Nastepnie odwi- 30 rowuje sie mieszanine z sila odsrodkowa 13200 G w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C, dekantuje odciek i przesacza go, otrzymujac 2,7 kg roztworu o aktywnosci 50 j/g.Ponowne zmieszanie dwukrotne osadu z 1 litrem 35 wody w ciagu 5 minut przy wartosci pH=8,5 i od¬ wirowanie daje dodatkowo 2 kg roztworu enzymu 0 aktywnosci 11 j/g. Laczna wydajnosc acylazy mie¬ rzona aktywnoscia wynosi 74% wydajnosci teore¬ tycznej. 40 e) 2 kg klarownego roztworu acylazy o aktyw¬ nosci 50 j/g, otrzymanego w sposób, opisany w przy¬ kladzie II d, poddaje sie liofilizacji, otrzymujac 98,5 g stalej acylazy o aktywnosci 950 j/g. f) 2 kg klarownego roztworu acylazy, o aktyw- 45 nosci 50 j/g, otrzymanego w sposób, opisany w przy¬ kladzie Ud, poddaje sie suszeniu metoda rozpylania, otrzymujac 92 g stalej acylazy o aktywnosci 920 j/g. g) 1 kg klarownego roztworu acylazy, o aktyw¬ nosci 52 j/g, otrzymanego w sposób, opisany w przy- 50 kladzie Ud, poddaje sie w ciagu 8 godzin procesowi dializy za pomoca wody wodociagowej. Otrzymany roztwór liofilizuje sie, otrzymujac 20,5 g stalej acy¬ lazy o aktywnosci 2400 j/g. h) 245 kg klarownego roztworu acylazy o aktyw- 55 nosci 48 j/, otrzymanego w sposób, opisany w przy¬ kladzie II c, miesza sie i traktuje 2,2 kg 9 m kwasu octowego, w celu uzyskania wartosci pH=4,5. Kon¬ tynuuje sie mieszanie w ciagu 1 godziny i nastepnie przesacza mieszanine, do przesaczu dodaje miesza- 60 jac 4,5 kg 7 m wodorotlenku amonowego, w celu doprowadzenia do wartosci pH=8,0. Po uplywie 1 godziny mieszanine przesacza sie i do przesaczu dodaje 2,0 kg 9 m kwasu octowego, doprowadzajac wartosc pH do 5. Otrzymuje sie 220 kg roztworu 65 o aktywnosci 47,5 j/g.9 83 168 10 i) 500 g odcieku o aktywnosci 52 j/g, otrzymanego w sposób, opisany w przykladzie II d, doprowadza sie do wartosci pH i miesza w ciagu 15 minut w temperaturze 0°C, w celu wytracenia zanieczyszczen bialkowych. Nastepnie mieszanine odwirowuje sie, alkalizuje przesacz do wartosci pH=7,5, otrzymujac czysty roztwór o aktywnosci 40 j/g. 500 g tego roz¬ tworu dializuje sie woda pitna w ciagu nocy i wy- mraza do sucha, otrzymujac 4 g produktu o aktyw¬ nosci 4900 j/g. j) 1 kg homogenizowanej pasty bakterii o aktyw¬ nosci 128 j/g odwirowuje sie przy 13200 G w ciagu 30 minut, w temperaturze 0°C. 500 g odcieku o ak¬ tywnosci 80 j/g dekantuje sie, przesacza i przesacz stosuje do enzymatycznego rozszczepiania penicyli¬ ny, w celu otrzymania kwasu 6-aminopenicylano¬ wego.Przyklad III. Wytwarzanie kompleksu acy- lazy z tanina. 185 kg roztworu acylazy, frakcjonowanego w sposób opisany w przykladzieII h, majacego aktyw¬ nosc 47,5 j/g, miesza sie i traktuje 50 g kwasu ety- lenodwuamino-czterooctowego, a nastepnie roztwo¬ rem 166 g taniny i 55 g siarczynu sodowego w 5,5 litra wody. Mieszanine miesza sie w ciagu 1 godziny z 1,5 kg Celite 505 i 700 g siarczynu sodowego i przesacza, otrzymujac 3950 g osadu, stanowiacego kompleks acylazy z tanina i majacego aktywnosc 1930 j/g.Przyklad IV. Otrzymywanie acylazy z kom¬ pleksu taninowego. a) 30,4 g wilgotnego osadu o aktywnosci 1930 j/g, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie III, traktuje sie 30 ml acetonu, ochlodzonego do tempe¬ ratury —10°C do —30°C. Aceton dodaje sie powoli mieszajac. Po rozpuszczeniu sie powstalego osadu dodaje sie jednorazowo dalsze 200 ml ochlodzonego acetonu i odsacza. Osad przemywa sie zimnym ace¬ tonem i suszy w powietrzu w temperaturze pokojo¬ wej w ciagu nocy. Otrzymuje sie 15,4 g produktu o aktywnosci 3650 j/g. b) 3750 g wilgotnego kompleksu acylazy z tanina, majacego aktywnosc 1930 j/g, otrzymanego w spo¬ sób opisany w przykladzie III, miesza sie z 5 li¬ trami 0,1 molowego roztworu octanu amonowego o wartosci pH=5,0 i 2,5 litrami butanolu. Do mie¬ szaniny dodaje sie 50 g siarczynu sodowego i tyle kwasu octowego, aby utrzymac wartosc pH=5,0.Miesza sie w ciagu 20 minut i odsacza. Otrzymuje sie 6650 ml fazy wodnej o aktywnosci 800 j/ml. c) 1000 ml roztworu acylazy o aktywnosci 48 j/ml, frakcjonuje sie w sposób podany w przykladzie II h i traktuje tanina, jak opisano w przykladzie III.Kompleks taniny z acylaza odsacza sie i miesza z 100 ml roztworu buforowego o wartosci pH=8,0, zawierajacego 0,1 m roztworu octanu amonowego.Miesza sie w ciagu 1 godziny, utrzymujac wartosc pH=8,0 i odsacza. Otrzymuje sie 100 ml roztworu acylazy o aktywnosci 220 j/ml. d) Wilgotny kompleks taniny z acylaza miesza sie z 100 ml roztworu buforowego, jak w przykla¬ dzie IV c i traktuje 2 g celulozy DEAE, miesza w ciagu 15 minut i odsacza, otrzymujac 90 ml roz¬ tworu acylazy o aktywnosci 494 j/ml. e) 36,6 g wilgotnego kompleksu taniny z acylaza, o aktywnosci 1250 j/g, otrzymanego w sposób opi¬ sany w przykladzie III, miesza sie z 150 ml 0,2 m octanu amonowego jako roztworu buforowego o wartosci pH=8,0 i nastawia wartosc pH miesza- 5 niny na wartosc 8,0. Miesza sie w ciagu 10 minut, dodaje 60 ml butanolu, a nastepnie zakwasza 9 m kwasem octowym do wartosci pH=5,0. Miesza sie dalej w ciagu 10 minut i odsacza, otrzymujac 166 ml fazy wodnej o aktywnosci 140 j/ml. 10 Przyklad V. Liofilizacja osadu taniny z acy¬ laza 86,1 g wilgotnego kmpleksu taniny z acylaza, o aktywnosci 1600 j/g, otrzymanego w sposób opisa¬ ny w przykladzie III, chlodzi sie do temperatury —30°C i suszy w temperaturze 25°C pod cisnieniem 15 0,1—0,2 mm Hg. Otrzymuje sie 28,5 g suchego pro¬ duktu o aktywnosci 2340 j/g. a) Suszenie metoda rozpylowa 5 litrów klarowne¬ go roztworu acylazy o aktywnosci 47,5 j/ml, otrzy¬ manego w sposób opisany w przykladzie II h, roz- 20 pyla sie w powietrzu o temperaturze 110—115°C przy wlocie i o temperaturze 70—75°C przy wylo¬ cie. Proces prowadzi sie w ciagu 1 godziny, otrzy¬ mujac 85 g produktu o aktywnosci 380 j/g; b) Suszenie metoda fluidyzacji. 100 g sproszko- 25 wanej celulozy miesza sie z 200 g roztworu acylazy o aktywnosci 162 j/g, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie IV b. Otrzymana mieszanine fluidy- zuje sie w strumieniu powietrza w temperaturze 40°C w ciagu 90 minut. Otrzymuje sie 93,2 g su- 30 chego proszku o aktywnosci 284 j/g.Przyklad VI. Oczyszczanie acylazy metoda chromatograficzna przez wymiane jonów. a) 5000 ml roztworu acylazy o aktywnosci 48 j/ml, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie II c, 35 zakwasza sie 9 m kwasem octowym do wartosci pH=4,6 i pozostawia na noc, a nastepnie przesacza na zimno i klarowny przesacz kieruje na kolumne jonitowa o srednicy 8 om i dlugosci 15 cm, zawie¬ rajaca preparat sulfoetylowy Sephadex C50 w 0,1 m 40 octanie amonowym o pH=4,6.Kolumne wymywa sie 650 ml octanu amonowego jako substancji buforowej o pH=4,6. Acylaze eluuje sie 0,2 m roztworem octanu amonowego o wartosci pH=8,0 jako substancje buforowa, otrzymujac 640 45 ml produktu o aktywnosci 326 j/ml, b) 5550 ml oczyszczonego roztworu acylazy o ak¬ tywnosci 800 j/ml, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie IV b, zakwasza sie do wartosci pH= 4,6 i postepujac metoda podana w przykladzie VI a, so otrzymuje sie 2350 ml produktu o aktywnosci 1610 j/ml. c) 250 ml roztworu oczyszczonego w sposób po¬ dany w przykladzie VI b, majacego aktywnosc 1610 j/ml, chlodzi sie do temperatury —40°C i su- 55 szy pod cisnieniem 0,1—0,2 mm Hg w temperaturze 25°C. Otrzymuje sie 2,11 g oczyszczonej acylazy o aktywnosci 190000 j/g. d) 230 ml roztworu acylazy, oczyszczonego w spo¬ sób podany w przykladzie VI b, majacego aktyw¬ no nosc 1610 j/ml, steza sie przez odparowywanie pod obnizonym cisnieniem do objetosci 24 ml. 15 ml otrzymanego koncentratu o aktywnosci 15000 j/ml wprowadza sie na kolumne o srednicy 2,5 cm i dlu¬ gosci 100 cm, wypelniona preparatem Sephadex & 65 75 i eluuje dejonizowana woda. Otrzymuje sie 10883 11 ml roztworu acylazy o aktywnosci 1710 j/ml. Susze¬ nie tego roztworu przez wymrazanie daje produkt o aktywnosci 92500 j/g. e) 72 mg preparatu acylazy, otrzymanego w spo¬ sób podany w przykladzie VI a, a nastepnie wysu¬ szonego przez wymrazanie, rozpuszcza sie w 2,7 ml 0,005 m roztworu buforowego o wartosci pH=6,30, zawierajacego fosforan sodowy i dializuje za po¬ moca takiego samego roztworu buforowego, a na¬ stepnie podaje na kolumne, zawierajaca karboksy- metyloceluloze. Kolumna ma dlugosc 13,5 cm i sre¬ dnice 0,9 cm i jest uprzednio zrównowazona roztwo¬ rem buforowym. Kolumne eluuje sie nastepujacymi roztworami buforowymi: 0,005 m roztwór fosforanu sodowego o pH = 6,30 (okolo 17 ml) 0,02 roztwór fosforanu sodowego o pH=6,35 (oko¬ lo 17 ml) i 0,1 roztwór fosforanu sodowego o pH= 6,35.Zbiera sie frakcje po 1,3 ml i oznacza absorpcje swiatla przy dlugosci fali 280 milimikronów. Enzym eluuje sie calkowicie za pomoca 0,1 m roztworu bu¬ forowego, przy czym eluat zawiera tylko 10% pier¬ wotnej zawartosci substancji bialkowych, zas okolo 90% bialka nieaktywnego znajduje sie w frakcjach eluowanych roztworem buforowym 0,005 m. f) 100 ml roztworu otrzymanego w sposób, poda¬ ny w przykladzie II h, dializuje sie destylowana woda, a nastepnie 0,005 m roztworem buforowym fosforanu o wartosci pH=6,0 w ciagu 24,5 godzin, po czym dodaje sie 12,5 mg/ml dwuetyloaminoety- locelulozy, zrównowazonej wspomnianym wyzej roz¬ tworem buforowym. Celulozowy wymieniacz jono¬ wy oddziela sie po uplywie 30 minut, przy czym nie stwierdza sie spadku aktywnosci acylazy, ale absorpcja swiatla przy dlugosci fali 280 milimikro¬ nów wynosi tylko 10% poprzedniej wartosci. Na¬ stepnie absorbuje sie enzym za pomoca karboksy- metylocelulozy, traktuje kwasem solnym i plucze lub zrównowaza 0,005 m octanem sodowym o pH= 5,5. W obu przypadkach stosuje sie rózne ilosci wy¬ mieniacza jonowego, a mianowicie 12,5 mg i 3,2 mg na 1 ml. Po oddzieleniu wymieniacza aktywny en¬ zym eluuje sie po zanurzeniu wymieniacza w wo¬ dzie i podwyzszeniu wartosci pH do 6—7 i stezenia jonów przez dodawanie 0,1 m fosforanowego roz¬ tworu buforowego. Wydajnosc wynosi okolo 80% wydajnosci teoretycznej. g) 100 ml roztworu otrzymanego w sposób, opisa¬ ny w przykladzie II h, dializuje sie destylowana woda i nastepnie 0,005 m fosforanowym roztworem buforowym o wartosci pH=6,0 w ciagu 22 godzin.Roztwór traktuje sie dwukrotnie dwuetyloamino- etyloceluloza w ilosci 12,4 mg/ml, zarównowazona wyzej wspomnianym roztworem buforowym.Nastepnie do roztworu dodaje sie tego samego wymieniacza jonowego w ilosci 13 mg/ml w postaci odmiany wodorotlenowej, przy czym aktywnosc acylazy nie obniza sie. Wymieniacz jonowy oddzie¬ la sie po uplywie 30 minut od chwili jego dodania.Po dodaniu ostatniej porcji pH wzrasta do 8,31.Calkowite zaabsorbowanie enzymu nastepuje po do¬ daniu postaci wodorotlenowej wymieniacza w ilosci 50 mg/ml przy pH=9,ll. Po oddzieleniu wymienia¬ cza jonowego i zdyspergowaniu go w wodzie, eluuje 168 12 sie enzym zakwaszajac do wartosci pH okolo 6.Wydajnosc wynosi ponad 60% wydajnosci teore¬ tycznej, a czystosc otrzymanego enzymu, mierzona za pomoca pomiaru absorpcji swiatla przy dlugosci 5 fali 280 milimikronów, wzrasta 20-krotnie. h) 100 ml roztworu, otrzymanego w sposób, opi¬ sany w przykladzie II c, odsala sie czesciowo przez dialize destylowana woda w ciagu 1 godziny i na¬ stepnie traktuje karboksymetyloceluloza typu H+, 10 w ilosci okolo 40 mg/ml, nastawiajac wartosc pH na 4,0—4,5. Oddziela sie wymieniacz jonowy i eluuje zaabsorbowana acylaze zwiekszajac wartosc pH do okolo 6 i dodajac fosforanowego roztworu buforo¬ wego w celu zwiekszenia stezenia jonów. 15 i) Postepujac w sposób, opisany w przykladzie VI h, przerabia sie jako material wyjsciowy roztwór otrzymany w sposób opisany w przykladzie II h. j) 100 ml roztworu otrzymanego w sposób, opisa¬ ny w przykladzie II c, odsala sie i usuwa bialko, 20 traktujac karboksymetyloceluloza typu H+ w ilosci okolo 25 mg/ml, a nastepnie taka sama iloscia dwu- etyloaminoetylocelulozy typu OH-. Wartosc pH mie¬ szaniny nastawia sie tak, aby nie wykraczala poza 5—7. Proces ten mozna powtarzac, ale trzeba go za- 25 trzymac zanim ulegnie absorpcji znaczna ilosc acy¬ lazy. Enzym adsorbuje sie nastepnie za pomoca kar¬ boksymetylocelulozy i eluuje w sposób opisany w przykladzie VI h. k) 100 ml roztworu, otrzymanego w sposób, po- 30 dany w przykladzie II c lub II h, traktuje sie, jak opisano w przykladzie VII j, ale nie dodaje sie dwuetyloaminoetylocelulozy.Przyklad VII. Stezanie i oczyszczanie acylazy metoda ultrafiltracji. 35 10 ml roztworu, otrzymanego w sposób, podany w przykladzie II c i czesciowo odsolonego i poz¬ bawionego bialka przez traktowanie wymieniaczem jonowym w sposób, opisany w przykladzie VI j, lecz pomijajac faze adsorbowania za pomoca karbo- 40 ksymetylocelulozy, rozciencza sie 40 ml destylowa¬ nej wody i przesacza pod zwiekszonym cisnieniem przez przepone zatrzymujaca calkowicie czasteczki o ciezarze czasteczkowym wiekszym niz 50000. 2 ml koncentratu zawierajacego glównie acylaze suszy 45 sie przez wymrazanie.Przyklad VIII. Stracanie acylazy za pomoca siarczanu amonowego. a) Do 1000 ml oczyszczonego roztworu acylazy, otrzymanego w sposób, opisany w przykladzie IV b 50 i majacego aktywnosc 358 j/ml, dodaje sie 570 g siarczanu amonowego i miesza az do rozpuszczenia sie soli. Roztwór pozostawia sie na przeciag 2 go¬ dzin w temperaturze 5°C i odsacza wytworzony osad. Otrzymuje sie 52,5 wilgotnego produktu o ak- 55 tywnosci 5160 j/g. b) 47,0 g wilgotnego zwiazku, otrzymanego w spo¬ sób, opisany w przykladzie VIII a i majacego ak¬ tywnosc 5160 j/g, suszy sie w powietrzu w tempe¬ raturze 25°C w ciagu nocy. Otrzymuje sie 19,85 g 60 produktu o aktywnosci 7580 j/g.Przyklad IX Oczyszczanie acylazy metoda dializy. 11 ml roztworu acylazy o aktywnosci 48 j/ml, otrzymanego w sposób, opisany w przykladzie II c, poddaje sie dializie za pomoca dejonizowanej 65 wody w ciagu nocy. Otrzymany roztwór liofilizuje13 83 168 sie w sposób opisany w przykladzie V, otrzymujac 0,06 g produktu o aktywnosci 8000 j/g.Przyklad X. Oczyszczanie acylazy przez fil¬ tracje zelowa. 150 g roztworu acylazy o aktywnosci 166 j/g, otrzymanego w sposób, opisany w przykladzie IV b, steza sie przez odparowywanie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 9 ml, filtruje przez kolumne 3X80 cm, wypelniona preparatem Sephadox G 75 i eluuje dejonizowana woda. Otrzymuje sie 80 ml produktu o aktywnosci 21200 jednostek, zawieraja¬ cego 15,2% materialu, zawartego w wyjsciowym surowcu, co ustala sie na podstawie pomiaru adsor¬ pcji przy dlugosci fali 280 milimikronów.Przyklad XI. Sprzeganie acylazy E. coli z po¬ limerami. a) Roztwór agarowy (2,5 ml 4°/q Sepharose 4 B) przesacza sie oddzielony wilgotny osad miesza w ciagu 8 minut przy pH = ll,5—12,0 z 2 ml 5%, roz¬ tworu wodnego bromku cyjanu ochlodzonego lo¬ dem. Powstaly zel odsacza sie przemywa na saczku woda ochlodzona lodem i nastepnie ochlodzonym za pomoca lodu 0,1 m roztworem boraksu. Przemyty osad miesza sie z 4 ml 0,1 m roztworu boraksu i nastepnie z 0,106 g acylazy, E. coli o aktywnosci 159000 j/g, otrzymanej w sposób, opisany w przy¬ kladzie VI d. Mieszanie prowadzi sie w ciagu 24 godzin w temperaturze 4°C. Powstala mieszanine odsacza sie, przemywa osad woda i otrzymuje 1,2 g wilgotnego polimeru o aktywnosci wlasciwej 679 j/g. b) 0,100 g Sephadex G 25 miesza sie w ciagu 8 minut przy pH= ll,5—12 z 2 ml ochlodzonego lo¬ dem 5% roztworu wodnego bromku cyjanu i od¬ sacza. Otrzymany zel przemywa sie lodowata woda i nastepnie 4 ml lodowatego 0,1 m roztworu wod¬ nego boraksu. Do tego osadu dodaje sie 0,106 g acy¬ lazy E. coli o aktywnosci 159000 j/g, otrzymanej w sposób podany w przykladzie VI d i miesza w tem¬ peraturze 4°C w ciagu 24 godzin. Nastepnie nasta¬ wia sie wartosc pH mieszaniny na 7,5 i odsacza mieszanine, przemywajac osad woda. Otrzymuje sie 0,3 g polimeru o aktywnosci wlasciwej 212 j/g. c) Powtarza sie proces, opisany w przykladzie XI b, stosujac 0,1 g DEAE — Sephadex A50 zamiast Sephadex G 25. Otrzymuje sie 1,25 g wilgotnego polimeru o aktywnosci wlasciwej 435 j/g. d) Powtarza sie proces, opisany w przykladzie XI b, stosujac 0,1 g sproszkowanej celulozy (Mache- rey, Nagel and Co, MN — 300). Otrzymuje sie 0,35 g polimeru o aktywnosci wlasciwej 261 j/g. PL PL