JPH05500901A - 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、その生成のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、物質が菌糸体から誘導される、請求項３に記載の菌類の細胞壁物質。

５、ｐＨ６での物質が２０μｍ未満の粒径に分解されたとき少なくとも２０ｍＶ のゼータ電位を有する、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の菌類の細胞 壁物質。

６、物質が２０μｍ未満の平均粒径を有する、請求項１ないし請求項５のいずれ かに記載の菌類の細胞壁物質。

７、請求項１に記載の菌類の細胞壁物質の製造のための方法であって、キチンま たはキトサンを含む菌類は、ａ）有機溶剤で物理的に分解されかつ／または脱脂 され、ｂ）アルカリ処理および／または酵素での処理によって脱タンパクされ、 かつ核酸除去される、方法。

８、ステップａ）における菌類は２０μｍ未満の粒径に物理的に分解される、請 求項７に記載の方法。

９、脱タンパクされた細胞壁物質はキトサンを除去するために酸で抽出される、 請求項７または請求項８に記載の方法。

１０、菌は接合開門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏ　ｔ　ａ）または二核菌門（Ｄｉｋａｒ ｙｏｍｙｃｏｔａ）から選択される、請求項フないし請求項９のいずれかに記載 の方法。

１１、細胞壁物質は菌糸体から得られる、請求項フないし請求項１０のいずれか に記載の方法。

１２、水系培地から負に帯電された生成物を回収または除去する方法において請 求項１ないし請求項６のいずれかにしたがった細胞壁物質の使用。

１３、細胞または生物学的に活性な化合物が細胞壁物質上で固定化される、請求 項１２に記載の使用。

１４、細胞は、バクテリア、イースト、菌類の菌糸体ないし植物および動物細胞 からなるグループに属する、請求項１３に記載の使用。

１５、化合物は、アミラーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、デオキシリボヌクレア ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ ルコースイソメラーゼ、リパーゼ、リゾチーム、パパイン、ペニシリンアシラー ゼ、ペプシン、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、ウレアーゼなら びに動物、植物および微生物の源からの任意の酵素からなるグループＩ口属する 酵素である、請求項１３に記載の使用。

１６、固定化は任意の架橋剤の存在なしでおこなわれる、請求項１３ないし請求 項１５に記載の使用。

１７．固定化は架橋剤の存在において行なわれる、請求項１３ないし請求項１５ に記載の使用。

明　細　書 凝集剤特性を有する菌の細胞壁物質、 その生成のための方法 この発明は、ｐＨ７で正のゼータ電位を有する菌類の細胞壁物質、その使用と同 様に菌の細胞壁物質の生成のための方法に関するものである。

キトサンは、それがアミノ基を含むとき、特に廃水処理における凝集剤として使 用される。大抵の生物分子および細胞は負に帯電されるので、タンパク質、核酸 、バクテリア、脂肪酸、セルロース繊維のような有機物質を含む廃水物質はその 廃水を浄化するために正に帯電されたキトサンと凝集させられてきた。

一般に、キトサンは海の老廃残留物、たとえば、カニ、小エビ、クルマエビおよ びオキアミの殻から生成されてきた。最初に、キチン（ポリアセチルグルコサミ ン）は酸によって殻から抽出され、それから、アルカリ不溶性でありかつ酸可溶 性ポリマであるキトサンを生成するために高い温度で濃縮アルカリ性溶液によっ て加水分解されてきた。

キトサンは通常酸性溶液において抽出されかつ可溶化されてきた。濾過の後、そ の液体は、キトサンが沈殿させられ、回収されるようにアルカリによって中和さ れた。

接合菌類およびある子嚢菌類の菌糸体もまたキチンまたはキトサンを含む。キト サン−グルカン−複合体は、４時間の間１２８℃で４０％水酸化ナトリウムによ ってケヵビ属ルウキシ（Ｍｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉｉ）およびアスペルギルス属ニ ガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）の菌糸体から抽出されてきた。キ トサン−グルカン−複合体は、ＩＲスペクトラムによって検出されるアミノ基を 有し、かつコロイド滴定（マザレリ（Ｍｕｚｚａｒｅｌｌｉ。

リカード（Ｒｉｃａｒｄｏ）、ドイツ　オフエンルガングスシュリフト（Ｏｆｆ ｅｎｌｅｇｕｎｇｓｓｃｈｒｉｆｔ）２　９２３　８０２．１９７９）によって 示される正の電荷を有する酢酸可溶性の白い粉であった。さらに、菌のキトサン はアブシディア属フルレア（Ａｂｓｉｄｉａ　ｃ。

ｅｒｕｌｅａ）から生成されたと報告されている。アブシディア属コルレアの菌 糸体は１時間２％水酸化ナトリウム煮沸によって除タンパクされた。それから、 そのキトサンは２％酢酸によって除タンパクされた菌糸体から抽出され、可溶化 されたが、その酢酸不溶性物質は捨てられた（Ｗ。

■、マクガーレン他、プロセス生化学、（ＰｒｏｃｅｓｓＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）１９．８８−９０．１９８４）。

この発明にしたがうと、細胞壁物質の中のへキソサミンの存在次第で、酸性およ びアルカリ性の環境の双方において水不溶性であり、かつ７のｐＨ値で正のゼー タ電位を有する菌の細胞物質は、優れた凝集剤および固定化特性を有するという ことがわかった。ゼータ電位は、マルバーン・ゼータサイザ（Ｍａｌｖｅｒｎ　 Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）における２０μｍ未満の粒径を有する細胞壁物質上でめら れた。この発明の細胞壁物質が小さな粒子の状態でない場合は、その物質はゼー タ電位が決定され得る前に分解されなければならない。それはなお海綿状の菌の 構造を有し、かつ大量のグルコサミン単位を含む。

たとえば、ウシ血清アルブミンのようなタンパク質のための、かつリボ核酸のよ うな核酸のための細胞壁物質の凝集能力はキトサンの凝集能力よりもはるかに高 い。その細胞壁物質は、細胞壁とタンパク質の凝集物に酢酸を加えることによっ て簡単に再生されることができる。凝集された液体のｐＨが酢酸によって減少さ せられるとき、凝集物は消え、タンパク質が水の中で溶解する。この細胞壁物質 は濾過または遠心分離によって回収されることができる。

この発明にしたがった菌の細胞壁物質は、化学化合物、ポリマ、たとえば酵素お よびホルモンのようなタンパク質の負に帯電された生成物を核酸と同様に水系の 液体から回収または除去する工程において、選択凝集剤、キャリアおよび／また はイオン交換体として使用されることができる。

さらに、屠殺場、イーストおよびマーガリン工場、魚の缶詰の製造業、ならびに パルプおよび紙産業からの廃水のような廃水が、その細胞壁物質を凝集剤として 使用することによって有利に清浄されることができる。

菌の細胞壁物質はまた微生物細胞および酵素の固定化のための優れた生物キャリ アである。しばしば、その結合力はあまりにもしっかりとしているので、固定化 された細胞および酵素は、激しい攪拌にさらされた水溶液中でと同様に高いイオ ン強度、酸性の、かつアルカリ性の水溶液において安定している。細胞は、バク テリア、イースト、菌の菌糸体、植物細胞および動物細胞からなるグループから 選ばれてよく、かつ酵素は、アミラーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、デオキシリ ボヌクレアーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースオキシ ダーゼ、グルコースイソメラーゼ、リパーゼ、リゾチーム、パパイン、ペニシリ ンアシラーゼ、ペプシン、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、ウレ アーゼならびに動物、植物および微生物の源からの任意の酵素からなるグループ から選択されてもよい。

酸性ｐＨ値で等電点を有する細胞および酵素は、ｐＨ値およそ７および７未満で 細胞壁物質上に固定化され得る。

ある場合には、形成された凝集物はあまりにも安定しているので、架橋剤を使用 する必要はない。ある場合、たとえば、細胞および酵素が中性またはアルカリ性 のｐＨ値で等電点を有するとき、凝集物は形成されないかもしれないが、または 、形成された凝集物は高いイオン強度溶液において、または激しい攪拌の間安定 は不十分であるかもしれない。

これらの場合において、ジアルデヒドおよびジイソシアナートのような二価性試 薬が従来の態様で架橋のために使用されてもよい。固定化が架橋剤で、または架 橋剤なしで達成されるかどうかにかかわりなく、この発明にしたがって固定化さ れた酵素は並はずれた酵素活性および保持を示した。

この発明にしたがった菌の細胞壁物質は、菌が脂質、タンパク質、核酸およびキ トサンを除去するために抽出にされされる工程によってキチンまたはキトサンを 含む菌から調製される。通常、菌は、また抽出を容易にするために物理的に分解 される。適当な工程にしたがって、菌糸体は、ａ）　有機溶剤での処理によって 物理的に分解および／または脱脂され、 ｂ）　アルカリまたは酵素での処理によって除タンパクされ、核酸除去され、か つもし望まれるならば、キトサンを除去するために酸で処理される。

この発明の工程において、その細胞壁がキチンまたはキトサンを含む任意の菌が 使用されることができる。適当な菌の例は、アスペルギルス属、フザリウム属お よびペニシリウム属を有する二核菌門（Ｐｈｙｌｕｍ　Ｄｉｋａｒｙｏｍｙｃｏ ｔａ）と同様に、アブシディア属、ケヵビ属およびクモノスカビ属を有する接合 菌量（Ｐｈｙｌｕｍ　Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）である。これらの菌は、たとえば 、窒素源、炭素源およびビタミンを含む液体培地において培養されてもよい。他 の窒素源の例は、（ＮＨ４）２３０４、ＮＨ４Ｃｌ１ＮＨ４Ｎｏ３のような無機 源または尿素、ペプトン、大豆タンパクおよびコーンステイープリカーのような 有機源である。イースト抽出はビタミン供給として添加されてもよい。適当な炭 素源はグルコース、ラクトース、マルトース、スクロース、スターチおよび糖み っのような炭水化物である。培養条件は重要でないが従来の方法が適用され得る であろう。

物理的分解ステップは、音波処理、ミル摩砕、砂振動および高速せん断のような 任意の従来の方法によって行なわれることができるが、好ましくは分解は凍結− 加圧によって行なわれる。分解された細胞壁は、好ましくは２０μｍ未満の粒径 を有する。分解の後、細胞内原形質物質は水で洗い落とされることができる。

分解された細胞壁は好ましくは脂質を除去するためにメタノール、エタノール、 ヘキサン、クロロホルム、アセトンおよびベンゼンのような有機溶剤での抽出に さらされる。

溶剤の中でエタノールが好ましいものである。

脱脂された細胞壁はそれからタンパク質および核酸を除去するためにアルカリま たは酵素で処理される。適当なアルカリ溶液はＫＯＨＳＮａＯＨ，Ｃａ　（ＯＨ ）２　、およびＮＨ４ＯＨの水溶液である。酵素プロテアーゼはタンパク質を除 去するために使用されることができ、かつ酵素ヌクレアーゼは核酸を除去するた めに使用され得るであろう。

アルカリの濃度は使用される菌の門に依存する。好ましくは、それは接合菌に対 してはＮａＯＨの０．２Ｎ−２，ＯＮであって、子嚢菌類に対してはおおよそ８ Ｎである。細胞壁が物理的分解にさらされないとき、または２０μｍより大きな 平均粒径に帰する穏やかな分解にさらされるだけならば、アルカリでの処理は接 合菌に対しては、ＮａＯＨの１．ＯＮまたはそれより高いような比較的強いアル カリ溶液を使用することによって行なわれるべきである。

脱脂され、脱タンパクされ、かつ核酸除去された細胞壁からのキトサンの除去は 選択的なことであるが、細胞壁物質の製造の工程においては好ましいステップで ある。酸の処理によって、遊離キトサンは溶解されかつ細胞壁から除去される。

酢酸は好ましい酸であるが、希塩酸およびギ酸のような他の酸もまた使用されて もよい。除去されたキトサンはｐＨを９．０に調整することによって沈殿させら れることができる。

この発明の工程によって生成された細胞壁物質はへキソサミンを含み、かつ酸お よび中性ｐＨ値で正のゼータ電位。

を呈し、かつ好ましくはそのゼータ電位はｐＨ６で２０ｍＶを越える。

ｐＨ７では、脱脂された細胞壁と同様に物理的に分解された細胞壁は水中で負に 帯電される。しかしながら、次の酢酸抽出の後と同様にアルカリ抽出の後で、分 解された細胞壁物質は正のゼータ電位（正電荷）を示す。通常、この発明の分解 された細胞壁は２０μｍ未満の平均粒径を有する。

この発明の細胞壁物質はｐＨ４とｐＨ７との間でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） 、およびｐＨ３，５とｐＨ５，２との間でイーストＲＮＡを凝集させる優れた能 力を有した。

屠殺場ならびにイースト、マーガリンおよび魚の缶詰製造工場からの廃水はｐＨ ６で細胞壁物質によって容易に清浄されることができる。

この発明はさらに以下の実施例によって説明される。

実施例１ 以下の表１にしたがった５つの異なった接合菌株と２つの異なった子嚢菌類株は グルコース、イースト抽出および鉱質塩類を含む培地において培養された。成長 の後、菌糸体はナイロンのネット上で濾過されかつＸ−プレスにおいて分解され た。分解された菌糸体は水で洗われ、それから熱いエタノールで、接合菌に対し ては熱いＩＮ　ＮａＯＨ。

かつ子嚢菌類に対しては８Ｎ　ＮａＯＨで２回、熱水で２回、かつ最後に０．２ Ｎ酢酸で抽出され、各々の抽出ステップには濾過が続いた。変更されたエルシン ーモーガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ）法（ジョージＣ，チェン他、応用環境 微生物学（Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉ　ｒ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）、±旦、１３−１ ６．１９８３）によって検出されたようなヘキソサミン含量と得られた細胞壁物 質のゼータ電位（マルバーン・ゼータサイザＩＩ、マルバーンインストルメンツ 　リミテッド（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ、）、英国ウ ォーセスターシャ（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ）ＷＲ１４１ＡＱ、マルバー ン）とは、細胞壁物質およびキトサンの収率と同様に以下の表２に示される。た いていの細胞壁物質は５ないし１０μｍの粒径を有した。

表１ Ａ　アブシディア属コルレア（Ａｂｓｉｄｉａ　ｃｏｅｒｕｌｅａ）ＩＭＩ　３ ８５００ Ｂ　ヶカビ属ｓｐ、（Ｍｕｃｏｒ　ｓｐ、）（チャイニーズ分離株（Ｃｈｉｎｅ ｓｅ　１ｓｏｌａｔｅ））Ｃヶカビ属ルウキシ（Ｍｕｃｏｒ　ｒｏｕｘｉ　１） ＡＴＣＣ２４９０５ Ｄ　クモノスカビ属オリゴスポラス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓｏｌｉｇｏｓｐｏｒｕｓ ）ＭＵＣＬ　１８８１３Ｅ　クモノスカビ属オリザエ（Ｒｈｆｚｏｐｕｓ　ｏｒ ｙｚａｅ）ＣＢＳ　１１２．０７ Ｆ　アスペルギルス属ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）ＣＣＵＧ　 ｓｐ。

Ｇ　フザリウム属ポアエ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｐｏａｅ）ＣＣＵＧ　２２４２５ ＡＴＣＣ＝アメリカンタイプカルチャーコレクション、米国２０８５２メリーラ ンド州、ロックビル、パークローンドライブ１２３０１　（ＡｍｅｒｉｃａｎＴ ７ｐｅ　ＣｕｒＩＩｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｖ ｎＤｒｉｙｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒ７ｍａｎｄ　２０８５２．　ＵＳ Ａ、）ＣＢＳ＝セントラールビュロ　ポル　シクシマルキュルチュア、ジュリア ナラーン６７ａ、２６２８ＢＣデルフト、オランダ（Ｃｅｎ＋「ａａｌｂｕｒｅ ａｕ　ｖｏａ「　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｕｌｉａｎａｌａａｎ 　６７ａ、２６２８　ＢＣＤｅｌｌｔ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、）ＣＣＵＧ＝ カルチャーコレクション、ユニバーシティオブゲーテボルグ、グルデーズガタン １０．Ｓ−４１３４６ゲーテボルグ、スウェーデン（Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ ｅｃｔｉｏｎ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ１７　ｏｊ　Ｇｉｔｅｂｏｒｇ、　Ｇｕｌｄ ｈｅｄｓｇａｊａｎ　１０．　Ｓ−４１３４６Ｇｉ＋’ｔｅｂｏｒｇ、５ｖｅｄ ｅ＋＋） ＩＭＩ＝コモンウエルス　マイコロジカル　インステイテユート、英国、サリー 、キュー　（Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｊｈ　Ｍ７ｃｏｌｏｇｉｃａｌ　１ｎｓｊｉ ｔｔ＋ｔｅ、　Ｋｅｙ、５ｕｒｒｅ７．　Ｅｎｇｌａｎｄ、　） ＭＵＣＬ＝ミコテーク　ド　リュニバルシテ　カトリクド　ルバン、プラス　ク ロア　デュ　シュド　３　Ｂｔｅａ、１３４８ルランーラーノーブ、ベルギー（ Ｍ７ｃｏｔｈｅｑｕｅ　ｄｅ　ｌ’Ｕｎｉｖｅｒｓｉｍｅ　Ｃａ１ｈｏｌｉｑｕ ｅ　ｄｅ　Ｌｏｕｖｘｉｎ、Ｐｌｉｃｅ　Ｃｔｏｉｘ　ｄ。

Ｓｕｄ　３　Ｂｔｅａ、ｌ３４８　Ｌｏｕｒａｉｎ−１ａ−Ｎｅｏｖｅ、Ｂｅｌ ｇｉａｍ、　） 表２ 株 （表１を劃［）　Ａ　Ｂ　ＣＤ　Ｅ　Ｆ　Ｇ重量％　１０．８　９．５９　８． １１　８．８２　７．Ｇ８　９．Ｇ３　１５．９キトサンの収率 重量％　１０．２　５．６１　２．９７　７，７７　１１．０４　＋、９７　０ ．３２細胞豐物賓の ゼータ電位、ｍＶ ｐＨ７，０１８，４９，２１４，５６，８７，６１３，６１８，７ｐＨ６，０３ １，３３０，０２４，９２５，８２８，０２５，１４０，０比較として、未精製 の細胞壁物質は分解および分解された細胞壁を水中で完全に洗うことによって株 Ｂおよび株Ｅから調製された。分解された細胞壁物質の一部は脱脂のために熱い エタノールで抽出された。脱脂された細胞壁物質と未精製の細胞壁物質との双方 のゼータ電位が測定された。

以下の結果が得られた。

表３ ゼータ電位ｍＶ 株Ｂ　株Ｅ 未精製細胞壁　ｐＨ４−１１，７−１２゜７脱脂された細胞壁　〃−１６．１　 −１４．７未精製細胞壁　ｐＦ６　−６０．２　−３５．０脱脂された細胞壁　 １ｌ−３７，７−２７，３上記から、４を超えるｐＨ値での未精製の細胞壁物質 は負のゼータ電位を呈する一方で、この発明にしたがって生成された細胞壁物質 は正に帯電されることが明らかである。

較テストもまた行なわれた。ウォーリングブレンダ（Ｗａｒｉｎｇ　ｂｌｅｎｄ ｏｒ）における分解の後、ゼータ電位は測定されｐＨ７，０で負であるとわかっ た。

実施例２ 実施例１からの３．６ｍｇ乾燥重量の細胞壁物質および１ｍｌウシ血清アルブミ ンＢＳＡ　（６ｍｇ／ｍｌ）は１０ｍ１試験管にピペットで分注された。６．０ のｐＨ値へのｐＨ調整の後懸濁液体積が６ｍｌになるような量で水が添加された 。最終のＢＳＡ濃度は１ｍｇ／ｍｌで、細胞壁物質は６００ｐｐｍであった。実 施例１のテストからの正に帯電された細胞壁物質がＢＳＡと混合されたとき、凝 集および集成が直ちに現われた。正に帯電された細胞壁物質の代わりに、実施例 １における比較からの負に帯電された未精製の細胞壁物質および脱脂された細胞 物質が使用されたとき、凝集または集成は起こらなかった。キトサンでの比較テ ストもまた行なわれた。凝集能力は２７８ｎｍでのＵＶ吸光度でめられ、以下の ように計算された。

凝集の能力＝１ｎ−０°　０゛（上澄み）×１００（％）Ｏ，Ｄ、（ＢＳ＾対照 ） 以下の結果が得られた。

１／　文字Ａ−Ｇは表１にあてはまる。

２／　ペニシリウム属フレキュエンタンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｆｒｅｑ ｕｅｎｔａｎｓ）ＣＣＵＧ　ｓｐ。

３／　５０ないし１１００ｐｐの濃度での最大能力４／　およそ３００ｐｐｍの 濃度での最大能力テストから、この発明の細胞壁物質は優れたＢＳＡ凝集能力を 有し、この点に関してキトサンに勝っているということが明らかである。

実施例３ クモノスカビ属オリザｘ　（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）Ｃ８４１１２， ０７は実施例１と同じ態様で培養されかつ集菌された。菌糸体は３時間の間直接 熱いエタノールで洗われかつ抽出された。乾燥の後、脱脂された菌糸体が得られ 、かつその１５ｇは主に実施例１と似た態様でＮａＯＨおよび酢酸で処理された が、ＮａＯＨの濃度は０゜２Ｎであった。水での洗浄の後、アルカリ処理された 菌糸体は０．２Ｎ酢酸中で懸濁され、高いせん断力（ウルトラタラックス（Ｕｌ ｔｒａ　ｔｕｒｒａｘ、西ドイツ、スト−フェン（Ｓｔａｕｆｅｎ）、ジャンク ＆カンケル（Ｊａｎｋｅ　＆　Ｋｕｎｋｅ　ｌ））のもとて１分間分解され、そ れは３００ｍ　ｌの４．１２ｍｇ／ｍｌの生体凝集剤をもたらした。遠心分離お よび９．０への水の液相のｐＨ調整の後、７．６５重量％の収率でキトサンが得 られた。この発明にしたがった細胞壁物質の収率は６．７７重量％であった。Ｂ ＳＡの凝集は、クモノスカビ属オリザエＣＢ５１１２．０７から異なった濃度の 細胞壁生体凝集剤で実施例２でのように行なわれた。得られた結果は表５に示さ れる。

表５ 細胞壁物質　ｐｐｍ　１００　２００　４００　６００　８００ＢＳＡ凝集　３ ８　６５　９５　９５　９４実施例４ １ｍ１の量でのイーストから誘導されたリボ核酸（ＲＮＡ）溶液（純度７８％、 ０．０５％ＮＨ４ＯＨおよび１０％ＮａＣ１中の０．５ｍｇ／ｍｌ）は、実施例 １でのようにクモノスカビ属オリザエＣＢ８１１２．０７から調製された２、７ ５ｍ１細胞壁物質（１，６ｍｇ／ｍｌ）および０．１ｍ１２Ｎ酢酸とともに試験 管へ加えられた。混合物のｐＨ値は０．１Ｎ　ＮａＯＨを添加することによって 調整された。凝集能力がめられた。ＲＮＡは７０℃での０゜５Ｎ過塩素酸での加 水分解の後２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出された（Ｓ、オーラ（Ｏｈｌ ａ）他、応用微生物学２２、ｐ４１５−４２１．１９７１）。以下の結果が得ら れた。

表８ ｐＨ３，５４，０４，５５，０５，５６，２ＲＮＡ凝集％　８９　９４　９５　 ９７．　９７　９７結果から、この細胞壁物質はＲＮＡ上で優れた凝集能力を有 したということが明らかである。比較として、キトサンは上記ｐＨ値での広範囲 の濃度においてＲＮＡを凝集し細胞壁生体凝集剤でのＢＳＡの凝集はｐＨ６，０ で実施例２でのように行なわれた。ケカビ属ｓｐ、（Ｍｕｃｏｒｓｐ、）（チャ イニーズ分離株）およびクモノスカビ属オリザエＣＢ５１１２．０７の細胞壁生 体凝集剤は以下のように３回再生された。ＢＳＡ−生体凝集剤凝集物は遠心分離 され、５ｍｌ　Ｏ，２Ｎ　ＨＡｃ中で再懸濁され、２０分間激しく攪拌され、１ ０分間４０００ｒｐｍで遠心分離され、５ｍｌ　０．２Ｎ　ＨＡｃ中で再懸濁さ れ、かつ再び１分間攪拌された。遠心分離の後、沈降物は１０ｍ１水で２回洗わ れ、最後に１５分間４０００ｒｐｍで遠心分離された。再生された細胞壁生体凝 集剤はＢＳＡを凝集させるために再使用された。

表９　細胞壁生体凝集剤の再生 凝集条件：　Ｂ　Ｓ　Ａ　１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　、細胞壁生体凝集剤１．２ ｍｇ／ｍｌ　ｐＨ６，０ 細胞壁　利用の時間　ＢＳＡ凝集 生体凝集剤 ケカビ属ｓｐ、　１　９５．１ （チャイニーズ分離株）　２　９８．６クモノスカビ属オリザエ　１　９５．２ ＣＢＳ　Ｌ１２．０７　２　９７．２ ３　９８．５ ４　９８．６ 結果から、凝集能力は再生によって不利に影響を受けなかったということが明ら かである。

実施例６ イースト工場、マーガリン工場、屠殺場および魚の缶詰工場からの廃水は細胞壁 生体凝集剤によって清浄された。

クモノスカビ属オリザエＣＢ５１１２．０７またはケカビ属ｓｐ、（チャイニー ズ分離株）の細胞壁生体凝集剤懸濁液は実施例１でのように準備された。凝集剤 懸濁液は、高い攪拌速度で２０秒間の間、５０ｍ１水サンプルに、最終体積の６ ０ｍ１（魚缶詰工場からの水で１００ｍ１）まで添加された。ｐＨはＮａＯＨま たはＨＣＩで６．０−６゜２に調整され、かつサンプルは２分間ゆっくりと攪拌 された。サンプルは７５分間の間（魚の缶詰工場水で１８０分間）沈降のために おかれ、その後上澄み液２５　ｍ　ｌは濁度測定のためにピペットで吸われた。

残留濁度として示される廃水清浄の結果は以下の表に示される。

表１０ 凝集剤　濁度　残留濁度（ＦＴＵ） （ＦＴＵ）　ケカ　ビ属Ｓｐ、　クモノスカビ属オリザエ〜からの廃水　対照　 ｍｇ／ｌ　ｍｇ／１５０　１００　４００　５０　１００　４０Ｇイースト工場 　２３　２１　１８　７　２０　１６　ｇマーガリン工場５１　２７　１８　１ ０　１８　６　１０層屠殺場　４２　１７　１２　９　１１　１０　１１魚缶詰 工場　−＊　９０　２７　１７　２９　２２　２３＊測定せず 実施例７ ０．２５ｍ１ペニシリンＶアシラーゼ（７８Ｕ／ｍｌ、５、ＯＵ／ｍｇタンパク 質）　、５．０ｍｇ／ｍ１での１゜５５ｍ１細胞壁物質（実施例１にしたがって 生成されたクモノスカビ属オリザエ、ＣＢＳ　１１２．０７）、および１　ｍ　 ｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５（ＫＰＢ）が１０ｍ１試験管へ 分注されるとすぐ、異なった量の２．５％グルタルアルデヒドおよび最終蒸留水 が総体積５．０ｍｌになるように加えられた。最終グルタルアルデヒド濃度は０ ．０４％から０．１６％に変化した。すべての混合物は４℃で一晩中振とうされ た。固定化されたペニシリンＶアシラーゼは遠心分離によって回収された。沈降 物は、ｌＱｍｌ蒸留水で２回、２ｍｌ　３Ｍ　ＮａＣｌで１回、かつ１０ｍ１蒸 留水で２回連続して洗われ、最後に５．０ｍｌへと蒸留水中で懸濁され、徹底的 に混合され、そして固定化されたペニシリンＶアシラーゼの活性は以下のように められた。

酵素、ｃａ　５　Ｕの１ｍｌ固定化された酵素懸濁液、蒸留水２０ｍ１および２ ，０ｍ１５０ｍＭ　ＫＰＢ、ｐＨ７，５は混ぜられ、かつ２８℃で激しく攪拌さ れ、それから２０ｍ１　４％カリウムペニシリンＶ（蒸留水溶液）が添加された 。ｐＨは１０分間の後１０ｍＭ　ＮａＯＨの滴定で７．５に再調整された。１単 位のペニシリンＶアシラーゼは１分間での１μＭ６−アミノペニシラン酸の生成 として規定される。固定化されたペニシリンＶアシラーゼの活性に対するグルグ ルアルデヒドの濃度の影響は表１１に示され、酵素と細胞壁との間の比は表１２ に示される。

表１１ ＝：：＝＝＝二一一一一一一−一一一一−一−一一一一一一一一一一−−−−− −−−−−−−一一一一−−−−−−−−−−−−−グルタルアルデヒド％　０ ．０４　０．０８　０．１２　０．１６固定化された活性　＋３３０　１６５０ 　１６４０　１６００Ｕ／ｇ乾燥細胞壁 固定化された　５２．８　６５．４　６５．１　６３．６ペニシリンＶアシラ一 ゼ％ この手順は表１１で示されるテストに使用されたものと同じであったが、１０ｍ ｇ／ｍｌでの異なった体積の細胞壁懸濁液および０．１重量％の濃度を与える量 でのグルタルアルデヒドが使用された。

アシラーゼ／　［１，１５０，２００，２５０，３Ｇ　０．４０　０．５０　０ ．７５　１．００細胞１　（Ｗ／Ｗ） 固定化活性　５２３　７１７　９１９　１１４９　１４３５　１７２３　２３２ １　２５５５（Ｕ／ｇ乾燥纏胞ｌ） 固定化ペニシリン　６９．２　７１．３　７３．１　？６．２　７１．３　６８ ．５　６１．５　５Ｇ、８Ｖアシラーゼ（％） ２５％乾燥重量での１．０ｇの圧搾されたパンイースト、サツカロミセス属セレ ビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は１００ｍ１ 　０．０１Ｍ　リン酸緩衝液ｐＨ５，０中で懸濁された。２ｍｌのイースト懸濁 液および（実施例１にしたがって生成された、クモノスカビ属オリザエＣＢＳ　 １１２．０７　５．Ｏｍｇ／ｍｌ）細胞壁物質は、表１３で述べられた比が得ら れるような量で１０ｍ１試験管ヘビペツトで分注された。細胞壁物質に対する乾 燥圧搾イーストの比（ｗ／ｗ）は０゜５ないし３．０に維持された。リン酸緩衝 液０．０１Ｍ。

ｐＨ６，０は５．０ｍｌに添加され、懸濁液は徹底的に混ぜられた。凝集は直ち に現われた。微視的に、凝集物は、細胞壁物質と混ぜ合わされたイースト細胞か らなった。すべての５．０ｍｌ懸濁液はフィルタ紙を通し濾過され、濾液の濁度 は５００ｎｍでめられた。イースト細胞の固定化は以下のように計算された。

固定化（％）＝１００　（１−ＯＤ濾液１０Ｄ対照）以下の結果が得られた。

表１３ 圧搾イースト／　０．５　＋、Ｑ　１．５　２．０　２．５　３．０細胞壁（Ｗ ／Ｗ） イースト細胞の　９８．８　９９．５９９．７　９８．７　８９．５　８６．０ 固定化　％ 細胞壁物質で固定化されたイースト細胞は、激しい攪拌の間、高イオン強度およ び酸性またはアルカリ性水溶液、たとえば、室温で、蒸留水、２％ＮａＣ１，０ １１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ８，０，１％ＮＨ４０Ｈ１０，１，Ｎ　ＨＡｃ、０．１ Ｍ　Ｈ３ＰＯ４，０，ＬＭ　ＨＣＩ中、５００ｒｐｍでの激しい攪拌の間安定で あった。固定化されたイースト細胞は圧搾濾過、真空濾過または遠心分離で処理 されることができた。比較すると、キトサンでのイースト細胞の凝集は２％Ｎａ Ｃｌ溶液中でも蒸留水中でも安定でＣＣＵＧからのシュードモナス属プチダ（Ｐ ｓｅｕｄ。

ｍｏｎａｓ　ｐｕｔ　１ｄａ）ＥＰ　１２６９０は肉エキス培地中で培養され、 遠心分離によって集菌され、水で２回洗われ、１０．８ｍｇ／ｍｌの乾燥重量で 水中で懸濁された。０．５ｍｌの細菌懸濁液および（実施例１にしたがって生成 された、クモノスカビ属オリザエＣＢ８　１１２゜０７）細胞壁物質は、表１４ で示された重量比が得られるような量で１０ｍ１試験管にピペットで分注され、 水が５゜０ｍｌに加えられ、かつ固定化手順および固定化の測定が実施例１の固 定化されたイースト細胞に対してのように行なわれた。

以下の結果が得られた。

表１４ 細菌／細胞壁　０．５５　Ｇ、６８　０．９０　＋、３５　２．７０（Ｗ／Ｗ） 細菌細胞の　９２　９５　９６　９７　６１固定化　％ 細胞壁調製試料およびシュードモナス属プチダは双方とも乾燥重量として与えら れる。シュードモナス属プチダおよび細胞壁の凝集物は、蒸留水、２％ＮａＣ１ ，０，１Ｍリン酸緩衝液ｐ）ｉｓ、０１１％ＮＨ４ＯＨ，０，ＩＮ　ＨＡｃ、０ ．１Ｍ　Ｈ３ＰＯ４および０．１Ｎ　ＨＣＩにおける５００ｒｐｍでの高速攪拌 、濾過および遠心分離手順の間、′パンイーストのそれらと同様に安定していた 。

微生物細胞を細胞壁物質へ固定化する保持能力は高く、１ｇ細胞壁物質（乾燥重 量）につきＬＯ−２，０ｇイースト細胞または０．９−１．３５ｇ細菌細胞であ った。この発明の細胞壁物質は、強い酸性およびアルカリ性水溶液中でさえ高い 保持および安定性があるために、微生物細胞固定化のための良好なマトリックス であるということが明らかである。

実施例１０ タチナタマメ（Ｊａｃｋ　ｂｅａｎ）ウレアーゼ７５Ｕ／ｍｇ（シグマケミカル コーポレーション（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉ　ｃａＩ　Ｃｏ））は１ｍｇ／ｍｌで ０．０２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０中で溶解された。４ｍｌのウレアーゼ溶液お よび（実施例１にしたがって生成された、アブシディア属コルレア（Ａｂｓｉｄ ｉａ　ｃｏｅｒｕｌｅａ）ＩＭＩ　３８５００）４ｍｇ／ｍｌ細胞壁物質は、表 １５で示された重量比が得られるような量でＬ　Ｏｍ　ｌ試験管ヘビベットで分 注され、５分間ゆっくりと攪拌され、それから４℃で夜通しおかれた。結合され たウレアーゼを有する細胞壁は遠心分離によって回収された。上澄み液のウレア ーゼ活性がめられ、固定化されないウレアーゼと見なされた。沈殿物は、５ｍｌ 蒸留水、５ｍ１３　Ｎ　ＮａＣ１゜５．０ｍｌ蒸留水×２および５ｍｌ　Ｏ，０ ２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，０で連続的に洗われ、最後に４．０ｍｌ０゜０２Ｍ　 リン酸緩衝液ｐＨ７，０中で懸濁され、徹底的に混ぜられ、固定化されたウレア ーゼ調製試料として使用された。遊離（固定化されない）ウレアーゼとしての上 澄み液および固定化されたウレアーゼの活性は、ウォーシントン　エンザイム　 マニュアル、ｐ１４４、米国ニューシャーシー州フリーホールド、ウォーシント ンバイオケミカルコーポレーション、１９７２　（Ｗｏ＋ｊｈｉｎｇｊｏｎ　Ｅ ｎｚ７ｍｅ　Ｍａｎｕａｌ、ｐ１４４．　Ｗｏｒｆｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｉ　Ｃｏ、、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、　ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ、１ ９７２　）に述べられるように検出された。ウレアーゼ活性の１単位はｐＨ７， ０および２５℃で１分につき１分子のアンモニアを遊離することと規定された。

上澄み液中の遊離ウレアーゼは０．９−３．４％に達した。

以下の結果が得られた。

表１５ ウレアーゼ／細胞壁　２：３　１：２　１：３（Ｗ／Ｗ） 固定化ウレアーゼ　％７５．６　７５．６　７５．６固定化活性 Ｕ／ｇ乾燥細胞壁　３７８００　２８３５０　＋８９００固定化ウレアーゼは固 定化前の初期のウレアーゼ活性の％として与えられる。

４℃および室温での細胞壁固定化ウレアーゼの安定性は表１６に示される。

表１６ 日　０　１１　２７　４２ 活性　％ ４℃　１００　８９　７８　７２ 室温　１００　８９　７１　３４ 固定化ウレアーゼの酵素活性は激しい攪拌条件の下で安定していた。ウレアーゼ 保持３７８００Ｕ／ｇ（乾燥細胞壁）は、親水性合成多孔ポリマビーズ４１６Ｕ ／ｇ（乾燥保持体）（モーラ（Ｍａｕｚ）、オツトー（Ｏｔ　ｔ　Ｏ）他、Ｇｅ ｒ、０ｆｆｅｎ、ＤＥ　３　７１４　２７６．１９８８）のそれと、合成陽イオ ン交換樹脂３４０Ｕ／ｇ（乾燥樹脂）　（Ｈ，Ｊ、モイニハン（Ｍｏｙｎｉｈａ ｎ）他、バイオテクノロジーおよび生物工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａ ｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）　３４：９５１−９６３．１９８９）の それとよりもはるかに高かった。細胞壁へ固定化されたウレアーゼの酵素活性の 半減期は４℃と室温との双方で２７日を越えた。

実施例１１ グルコースオキシダーゼ５９．４Ｕ／ｍｇは２　ｍ　ｇ　／　ｍｌで蒸留水中で 溶解された。４ｍｌのグルコースオキシダーゼ溶液、１．６ｍｌ細胞壁物質（実 施例１にしたがった５、０ｍｇ／ｍｌクモノスカビ属オリザｘｃＢｓ１１２゜０ ７）、２．４ｍｌ蒸留水および０．３２ｍ１の５％グルタルアルデヒドは１０ｍ １試験管にピペットで分注され、混ぜられ、それから４℃で夜通し置かれた。グ ルコースオキシダーゼは、二官能化合物グルタルアルデヒドを架橋剤として使用 して細胞壁物質に固定された。細胞壁固定化グルコースオキシダーゼは遠心分離 によって回収された。沈殿物は１０ｍ１蒸留水×２．１０ｍ１　Ｏ，２５Ｍ　Ｋ Ｃｌ、１０ｍ１蒸留水×２で連続的に洗われ、最後に２００ｍ１蒸留水中で懸濁 された。この２００ｍ１懸濁液は１分間の間、高いせん断力のもとてホモジナイ ズされ、固定化グルコースオキシダーゼが測定された（ウォーシントンエンザイ ム　マニュアル、ｐ１９、米国ニューシャーシー州フリーホールド、ウォーシン トンバイオケミカルコーポレーション、１９７２）。１単位のグルコースオキシ ダーゼ活性は２５℃で１分につき１分子のＨ２Ｏ２のを遊離させる量として規定 された。

固定化グルコースオキシダーゼの保持は、合成ポリアクリルアミンビーズ１００ Ｕ／ｇ（乾燥保持体）（Ｂ、スザジャニ（ＳｚａＪａｎ＋）他、応用生化学およ びバイオテクノロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１４：３７−４７．１９８７）のそれよりもはるか に優れた２６８００Ｕ／ｇ（乾燥細胞壁）であった。固定化グルコースオキシダ ーゼは、固定化前のグルコースオキシダーゼの初期の溶液と比較して４５．１％ の活性を示した。

実施例１２ １００ｍｌ細胞壁物質（実施例１にしたがった６、０ｍｇ／ｍｌアブシディア属 コルレアＩＭ１　３８５００）、２０　ｍ　ｌリン酸緩衝液０．１Ｍ、ｐＨ７， ６および５．０ｍｌグルタルアルデヒド２５％が２００ｍ１ビーカー中で混ぜら れ、５分間ゆっくりと攪拌され、それから室温で２時間置かれた。

グルタルアルデヒド活性化された細胞壁物質は焼結ガラス漏斗中での真空濾過に よって回収され、１００ｍ１蒸留水で５回、５０ｍＩ　Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液、 ｐＨ７，６で洗われ、最後に６０ｍＩ　Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７，６中で 懸濁された。１．５Ｕ／ｍｇでの未精製のパパイン３００　ｍ　ｌは、システィ ン０．０５Ｍ５ＥＤＴＡ５Ｘ１０　ＭおよびメルカプトエタノールｌＸ１０’Ｍ を含む２７　ｍ　ｌ蒸留水溶液中で溶解された。パパイン溶液および活性化され た細胞壁物質は混ぜられ、それから４℃で夜通し置かれた。細胞壁固定化パパイ ンは遠心分離によって回収され、５０ｍ１蒸留水×２．５０ｍ１　Ｉ　Ｎ　Ｎａ ＣｌＸ２および５０ｍ１蒸留水×２で連続的に洗われ、蒸留水中で懸濁され、全 体で２０ｇの最終重量になった。

固定化パパインの活性がめられた（ウォーシントンエンザイム　マニュアル、ｐ １３４、米国ニューシャーシー州フリーホールド、ウォーシントンバイオケミカ ルコーボレーション、１９７２）。１単位のパパイン活性は２５℃で１分につき １分子のベンゾイルアルギニンエチルエステルを加水分解するものとして規定さ れた。

固定化パパインの保持は３７０Ｕ／ｇ（乾燥細胞壁）、または固定化前の初期の 未精製のパパインと比較して４９％の活性であって、それは、Ａ、テレフォンス （Ｔｅｌｅｆｏｎｃｕ）他、バイオテクノロジーおよび生物工学（Ｂｔｏｔｅｃ ｈｎｏｔｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅ　ｒ　ｉｎｇ）２３　：１６８ ９−１６７４．１９８１によって報告されたＰ−ベンゾキノン活性化されたセル ロース、７２．４Ｕ／ｇ　（乾燥保持体）のそれよりも高い。

国際調査報告 ＋−ｎ、−ｍ−−＋ｓｏｍニー、ニーｕ−ＰＣＴ／ＳＥ　９０１００６４６国際 調査報告

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．ヘキソサミンを含み、２０μｍ未満の粒径に分解されたときｐＨ値７で正の ゼータ電位を示す菌類の細胞壁物質。
2. ２．ヘキソサミンの含量は少なくとも５重量％である、請求項１に記載の菌類の 細胞壁物質。
3. ３．細胞壁物質は接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）または二核菌門（Ｄｉｋａ ｒｙｏｍｙｃｏｔａ）から選択された菌から誘導される、請求項１または請求項 ２に記載の菌類の細胞壁物質。
4. ４．物質が菌糸体から誘導される、請求項３に記載の菌類の細胞壁物質。
5. ５．ｐＨ６での物質が２０μｍ未満の粒径に分解されたとき少なくとも２０ｍＶ のゼータ電位を有する、請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の菌類の細胞 壁物質。
6. ６．物質が２０μｍ未満の平均粒径を有する、請求項１ないし請求項５のいずれ かに記載の菌類の細胞壁物質。
7. ７．請求項１に記載の菌類の細胞壁物質の製造のための方法であって、キチンま たはキトサンを含む菌類は、ａ）有機溶剤で物理的に分解されかつ／または脱脂 され、ｂ）アルカリ処理および／または酵素での処理によって脱タンパクされ、 かつ核酸除去される、方法。
8. ８．ステップａ）における菌類は２０μｍ未満の粒径に物理的に分解される、請 求項７に記載の方法。
9. ９．脱タンパクされた細胞壁物質はキトサンを除去するために酸で抽出される、 請求項７または請求項８に記載の方法。
10. １０．菌は接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）または二核菌門（Ｄｉｋａｒｙｏ ｍｙｃｏｔａ）から選択される、請求項７ないし請求項９のいずれかに記載の方 法。
11. １１．細胞壁物質は菌糸体から得られる、請求項７ないし請求項１０のいずれか に記載の方法。
12. １２．水系培地から負に帯電された生成物を回収または除去する方法において請 求項１ないし請求項６のいずれかにしたがった細胞壁物質の使用。
13. １３．細胞または生物学的に活性な化合物が細胞壁物質上で固定化される、請求 項１２に記載の使用。
14. １４．細胞は、バクテリア、イースト、菌類の菌糸体ないし植物および動物細胞 からなるグループに属する、請求項１３に記載の使用。
15. １５．化合物は、アミラーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、デオキシリボヌクレア ーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、グ ルコースイソメラーゼ、リパーゼ、リゾチーム、パパイン、ペニシリンアシラー ゼ、ペプシン、プロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、トリプシン、ウレアーゼなら びに動物、植物および微生物の源からの任意の酵素からなるグループに属する酵 素である、請求項１３に記載の使用。
16. １６．固定化は任意の架橋剤の存在なしでおこなわれる、請求項１３ないし請求 項１５に記載の使用。
17. １７．固定化は架橋剤の存在において行なわれる、請求項１３ないし請求項１５ に記載の使用。