Przedmiotem wynalazku jest enzymatyczny spo¬ sób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego i penicylin nie powodujacych objawów alergicz¬ nych.Wiadomo, ze wiele mikroorganizmów, zarówno bakterii jak i grzybów, wytwarza enzymy, które moga hydroilizowac wiazanie amidowe w pozycji 6 penicylin. Enzymy te okresla sie ogólnie nazwa acylaz lub amidaz penicylinowych (J.M.T. Hamil- ton^Miller Bacteriological Reviews 30/1966/761).Przy wytwarzaniu kwasu 6-aminopenicylanowego na skale przemyslowa stosuje sie korzystnie za¬ wiesiny komórek E. Coli zawierajace acylaze lub amidaze. Metody te maja jednak szereg wad. Po¬ niewaz enzym znajduje sie ppzewaznie wewnatrz komórek, przeto aby mógl on dzialac na penicyline, ta ostatnia powinna wpierw przeniknac do wne¬ trza komórek, co sprawia, ze caly ten proces jest powolny. Poza tym uzyty szczep moze zawierac równiez inne enzymy, które inaktywuja penicyline lub utworzony kwas 6-aminopenicylanowy, roz¬ szczepiajac wiazanie |3-laktamowe, albo zanieczy¬ szczaja komórki organizmami, które wytwarzaja wspomniane enzymy. Poniewaz zas acylaza stano¬ wi tylko bardzo mala czesc zawartosci komórek, przeto proces, w którym stosuje sie cale organiz¬ my, ma te niedogodnosc, ze duza ilosc materialu opóznia jego przebieg.Inna wada znanych metod, w których stosuje sie mikroorganizmy w calosci, jest to, ze do szeregu czynnosci niezbednych w celu otrzymania pólsyn- tetycznych penicylin, trzeba dodac jeszcze czyn¬ nosc oddzielania, na przyklad odsaczania, organiz¬ mów od cieczy reakcyjnej, w której pierwotny lancuch boczny zostal odszczepiony od biosynte- tycznych penicylin. Oprócz tego traci sie pewne ilosci kwasu penicylanowego przez adsorpcje w komórkach oraz na skutek rozkladu pod wply¬ wem produktów przemiany materii w komórkach.Powazny problem stanowi równiez oddzielanie kwasu 6-aminopenicylanowegó od innych produk¬ tów, ipowstajacyeh podczas procesu odszczepiania bocznego lancucha. Jak wiadomo (Batchelor i in.Lancet I /1968/ 1175), kwas 6-aminopenicylanowy, otrzymany znana metoda przy uzyciu calych ko¬ mórek mikroorganizimów, moze zawierac bialkowe zanieczyszczenia zdolne do wywolywania niebez¬ piecznych reakcji alergicznych u ludzi i zwierzat.Penicyliny otrzymane z takiego zanieczyszczonego kwasu 6-aminopenicylanowego moga zawierac wy¬ mienione zanieczyszczenia, powodujace wiele reak¬ cji alergicznych, zaobserwowanych przy stosowa¬ niu takich penicylin (G.T. Stewart, Amer. Heart.J. 1968, 429). W celu usuniecia tych zanieczyszczen, kwas 6-aminopenicylanowy lub wytworzone zen penicyliny nalezy poddawac dodatkowym proce¬ som oczyszczania, na przyklad przez dialize lub filtracje zelowa (kanadyjski opis patentowy nr 771662). Podczas tych dodatkowych zabiegów traci sie znaczne ilosci kwasu 6-araiinopenicylanowego 95 58295 582 4 lub penicyliny, czego dowodzi wydajnosc benzylo- penicyliny, wynoszaca przy metodzie podanej w brytyjskim opisie patentowym nr 107*8847 tylko 12% lub wydajnosc fenoksymetylopenicyliny (brytyjski opis patentowy nr 1114311) wynoszaca 56% wydaj¬ nosci teoretycznej.Wszystkich tych niedogodnosci unika sie, stosu¬ jac nie zawierajacy komórek, to znaczy oczyszczo¬ ny preparat enzymowy otrzymany wedlug patentu polskiego nr 83168. Kwas 6-aminopenicylanowy, / wytworzony przy uzyciu takiego oczyszczonego pre¬ paratu enzymowego do rozerwania wiazania ami¬ dowego w pozycji 6 penicylin, otrzymuje sie z do¬ bra wydajnoscia i zasadniczo wolny od bialkowych zanieczyszczen. Przez acylowanie takiego kwasu otrzymuje sie z dobra wydajnoscia i bez dalszego oczyszczania penicyliny nie powodujace objawów alefgJcznych. ..'V.Wedlug wynalazku wewnatrzkomórkowa acylaze penicylinowa stosowana do wytwarzania kwasu 6- -aminopenicylanowego mozna ekstrahowac z E. coli za pomoca wody na duza skale, jezeli komórki lub ich zawiesiny w wodzie albo w mieszaninie wody z rozpuszczalnikami organicznymi podda sie dzia¬ laniu cisnienia wynoszacego co najmniej 35 atm., lecz nie przekraczajacego cisnienia, przy którym nastepuje rozrywanie komórek i nastepnie nagle rozprezy. Zgodnie z tym wytwarzanie preparatu acylazy penicylinowej z E.coli prowadzi sie na drodze znanej fermentacji szczepu E.coli wytwa¬ rzajacego ten enzym, oddzielaniu cieczy z hodowli i szybkiego wytlaczania materialu komórkowego przez waski otwór lub szczeline pod cisnieniem co najmniej 35 atm., lecz nie wyzszym od 210 atm.Wytloczony material miesza sie z woda, ewentual¬ nie z dodatkiem organicznego rozpuszczalnika i/lub zasady, na przyklad wodorotlenku sodowego lub trójetyiloaminy, w celu rozpuszczenia enzymu.Oddzielanie cieczy z hodowli i wytlaczanie ma¬ terialu komórkowego przeprowadza sie równoczes¬ nie za pomoca separatora odsrodkowego, wyposa¬ zonego w urzadzenie samooczyszczajace i pracuja¬ cego w temperaturze 0^50°C, korzystnie 15—40°C, przy czym oddzielany material komórkowy wytla¬ cza sie okresowo w ciagu 0,05—1,0 sekundy, a ko¬ rzystnie 0,1^0,5 sekundy, przez szczeline na obwo¬ dzie, majaca szerokosc 0,1^1,5 mm, a korzystnie 0,3—0,7 mm, stosujac cisnienie do 136 atm, korzyst¬ nie 63—77 atm. W razie potrzeby brzeczke nasyca sie organicznym rozpuszczalnikiem o malej roz¬ puszczalnosci w wodzie, na przyklad octanem bu¬ tylu, octanem izobutylu lub octanem amylu, w ce¬ lu zabicia mikroorganizmu i ulatwienia procesu rozdzielania. W razie potrzeby mozna przemywac material komórkowy w separatorze woda.Wytloczony material komórkowy miesza sie w temperaturze 10—50*C, a korzystnie 20—40°C, w ciagu 0,10—5,0 godzin, niekiedy korzystnie 0,25—3,0 godzin, a zwlaszcza 0,25—1,0 godziny, w mieszal¬ niku o sprawnie dzialajacym mieszadle, w celu roz¬ puszczenia enzymu, ewentualnie z dodatkiem 1,0— —5,0% organicznego rozpuszczalnika nie miesza¬ jacego sie z woda, na przyklad ketonu metyloizo- butylowego, octanu butylu,^ octanu izobutylu, octa¬ nu amylu, benzenu, toluenu lub chloroformu.W celu ulatwienia ekstrakcji enzymu z wytlo¬ czonego materialu komórkowego mpzna do mie¬ szaniny dodac nieorganicznej zasady, na przyklad wodorotlenku sodowego, potasowego lub amoniaku, albo trzeciorzedowej zasady organicznej, na przy¬ klad trójetyiloaminy lub N-etylopiperydyny, dopro¬ wadzajac wartosc pH mieszaniny do 6,5—9,0, a ko¬ rzystnie do 7,0^8,5.Otrzymany w ten sposób roztwór enzymu, ewen- tualnie po rozcienczeniu woda, uwalnia sie od po¬ zostalego materialu komórkowego i innych stalych zanieczyszczen za pomoca znanych metod, na przy¬ klad odsaczania lub odwirowywania albo obu tych metod, ewentualnie z dodatkiem pomocniczych srodków odbarwiajacych, klarujacych lub ulatwia¬ jacych saczenie, na przyklad wegla aktywowanego, tlenku glinowego, sproszkowanej celulozy, ziemi okrzemkowej lub innych stalych srodków o nie¬ wielkiej zdolnosci adsorbowania. Korzystnie jest oddzielac wieksza czesc materialu komórkowego przez odwirowanie i nastepnie przesaczac otrzy¬ many odciek. W celu dodatkowego oczyszczania enzymu zakwasza sie wodny roztwór do wartosci pH 3,0—6,0, korzystnie 4,0—5,0, odsacza wytracony, nieaktywny osad i ponownie doprowadza wartosc pH do jej poprzedniej wysokosci.Oczyszczone enzymy i roztwory enzymów, otrzy¬ mane sposobem wedlug opisu patentowego polskie¬ go nr 83168 nadaja sie bardzo dobrze do wytwa- rzania kwasu 6-aminopenicylanowego przez od- szczepianie bocznego lancucha w penicylinach, a zwlaszcza w benzylopenicylinie. Wydajnosc i czystosc kwasu otrzymywanego za pomoca tak wytworzonych enzymów jest znacznie wyzsza od 85 tej, jaka uzyskuje sie przy stosowaniu enzymów wytwarzanych wczesniejszymi metodami, przy uzy¬ ciu zawiesin komórek E.coli.Stwierdzono równiez, ze kwas 6-aminopenicyla¬ nowy, otrzymany przy zastosowaniu preparatów 40 enzymowych wytwarzanych powyzszymi sposobem, zawiera bardzo niewiele lub wcale nie zawiera za¬ nieczyszczen bialkowych o dzialaniu alergicznym, wystepujacych w produktach otrzymywanych przy uzyciu zawiesin komórek E.coli. Ma to wielkie 45 znaczenie w technice, gdyz umozliwia wytwarzanie penicylin nie majacych wlasciwosci alergicznych bezposrednio z kwasu 6-aminopenicylinowego, bez dodatkowych czynnosci oczyszczania. W ten spo¬ sób mozna wytwarzac penicyliny nie majace wlas- 50 ciwosci alergicznych, na przyklad a-fenoksyetylo- penicyline, a-fenoksypropylopenicyline, 2,6-dwu- metoksyfenylopenicyline, 3-(o^chlorofenylo)-5-me- tylo-4-izoksazolilopenicyline, a-karbozylobenzylope- nicyline, a-azydoibenzylopenicyline i 55 lopenicyline.Acylaze penicylinowa z E.coli vmozna tez stoso¬ wac do usuwania bocznego lancucha estrów pe¬ nicyliny, zwlaszcza estrów benzylopenicyliny. Ba¬ dania wykazaly, ze preparaty enzymatyczne wy- 60 twarzane powyzszymi sposobami nadaja sie bardzo dobrze do tego procesu i sa skuteczniejsze od za¬ wiesin komórek E.coli, stosowanych uprzednio.Stwierdzono równiez, ze te preparaty enzymowe nadaja sie lepiej niz zawiesiny komórek przy en- 65 zymatycznej syntezie penicylin z kwasu 6-amino-5 penicylanowego i prekursora bocznego lancucha (W.K. Kauftnann i in. Antitmicrobial Agents Ann. 1960, 1).Oczyszczone preparaty enzymowe stanowia dobry material wyjsciowy do chemicznego przeksztalca¬ nia enzymu, w wyniku czego otrzymuje sie pro¬ dukty o lepszych wlasciwosciach, a mianowicie aktywniejszych i/lub lepiej nadajacych sie w tech¬ nice. Enzym ten moze reagowac z materialami o budowie polimerycznej, na przyklad z polisacha¬ rydami traktowanymi bromkiem cyjanu, dajac pro¬ dukty, w których enzyim jest zwiazany z podstawa polimeru. Produkty takie zachowuja aktywnosc en¬ zymatyczna i maja te zalete przy stosowaniu ich do rozszczepiania penicylin, ze mozna je latwo oddzielac od roztworu reakcyjnego, na przyklad przez odsaczanie. Polimeryozne preparaty enzy¬ mowe mozna takze stosowac w kolumnach do ciaglego wytwarzania kwasu 6-amiinopenicylano- wego, polegajacego na przepuszczaniu roztworu penicylin przez kolumne.Wynalazek jest blizej wyjasniony w nizej po¬ danych przykladach, w których omówiono wytwa¬ rzanie produktu enzymatycznego nie zawierajace¬ go komórek, wytwarzanie kwasu 6-aminopenicyla- nowego z (naturalnych penicylin, na przyklad z ben- zylopenicyliny, jak równie z wytwarzanie synte¬ tycznych penicylin z kwasu 6-aminopenicylano- wego.Przyklad I. Wytwarzanie komórek bakterii E.coli. 3 ^kg namoku kukurydzowego, 135 ml oleju sojowego, 12 ml parafiny i 3 ml cetanolu w 150 litrach wody miesza sie, dodaje 165 ml 45% wodo¬ rotlenku sodowego w celu doprowadzenia wartosci pH mieszaniny do 6,0 i sterylizuje w temperaturze 124°C w ciagu 30 minut w posiewowym zbiorniku fermentacyjnym. Nastepnie roztwór zaszczepia sie 100 ml 20^24 godzinnej kultury E.coli (Astra 1339) i prowadzi hodowle w temperaturze 25°C, napo¬ wietrzajac i mieszajac, w ciagu 18 godzin 300 kg namoku kukurydzowego, 13,8 kg oleju sojowego, 1,22 kg parafiny, 0,3 kg cetanolu, 21 kg kwasu fenylooctowego i 112 kg chlorku sodowego w 14 000 litrach wody traktuje sie 40 kg 45% roztworu wo¬ dorotlenku sodowego, doprowadzajac wartosc pH roztworu do 6,6 po czym roztwór sterylizuje sie w zbiorniku fermentacyjnym w temperaturze 124°C w ciagu 30 minut. Nastepnie chlodzi sie roztwór i zaszczepia przygotowana wyzej kultura i poddaje hodowli w temperaturze 25°C, mieszajac i napo¬ wietrzajac. Po uplywie 24 godzin od zaszczepienia, gdy wartosc pH wzrosnie do 8,2, zabija sie ko¬ mórki bakterii przez dodanie 180 litrów octanu butylu i mieszanine chlodzi sie.Przyklad Itl. Wyosabnianie i oczyszczanie acylazy. a) Mieszanine otrzymana w przykladzie I od¬ wirowuje sie w separatorze typu De Laval BRPX 213-35S, wyposazonym w urzadzenie do sa¬ mooczyszczania. Paste komórek bakterii zbiera sie w porcjach po 100—1:20 kg i do kazdej porcji do¬ daje -3% ketonu metyloizobutylowego i mieszanine homogenizuje za pomoca mieszalnika systemu Ultra Turrax, typ T110/2M w ciagu 25 minut.Otrzymuje sie lacznie 325kg masy. 582 Analiza enzymu w róznych stadiach procesu daje nastepujace wyniki, wyrazone w jednostkach- umownych, przy czym 1 taka jednostka (1 j) ozna¬ cza ilosc enzymu zdolna do rozszczepienia w ciagu 1,5 godziny, przy wartosci pH 8,5 i w temperatu¬ rze 37°C takiej ilosci benzylopenicyliny, która. od¬ powiada 1 mg kwasu 6-aminopenicylanowego: wytwarzanie na drodze hodowli fermentacyjnej 5 j/ml odciek 0,33 j/ral odciek z separatora 0,28 j/ml pasta komórek bakterii 212 j/g ciecz w pascie przed homogenizacja 75 j/g Ciecz w pascie po homogenizacji 123 j/g. b). Paste komórek bakterii, otrzymana w przy¬ kladzie Ha, stosuje sie do badania rozpuszczania enzymu. Do 100 g pasty dodaje sie 100 ml odjo- nizowanej wody. Otrzymana zawiesine, majaca wartosc pH 5,9, poddaje sie nastepujacym próbom. 1. Odwirowuje sie zawiesine przy 5000 G (sila odsrodkowa mierzona jako wielokrotnosc przyspie¬ szenia ziemskiego) w ciagu 20 minut i okresla ak¬ tywnosc enzymatyczna w odcieku. 2. Zawiesine homogenizuje sie w mieszalniku Ultra Turrax w ciagu 5 minut, ochladzajac próbke w kapieli lodowej, w celu nie dopuszczenia, aby temperatura próbki wzrosla powyzej 35°C. Nastep¬ nie odwirowuje sie próbke jak wyzej w punkcie 1 i okresla aktywnosc odcieku. ^ 3. Do zawiesiny dodaje sie mieszajac wodoro¬ tlenku sodowego w celu doprowadzenia wartosci pH do 8,5, po czym próbke homogenizuje sie i od¬ wirowuje jak wyzej podano oraz oznacza aktyw¬ nosc odcieku. n 4. Do zawiesiny dodaje sie 3% ketonu metylo¬ izobutylowego i nastawia wartosc pH jak w punk¬ cie 3, po czym homogenizuje sie, odwirowuje i oz¬ nacza aktywnosc w odcieku.Wyniki prób rozpuszczania sa nastepujace: Jedn./gram % calosci zawiesina bakterii 106 100 m odciek otrzymany w próbie 1 29 28 odciek otrzymany w próbie 2 62 59 45 odciek otrzymany w próbie 3 73 69 odciek otrzymany w próbie 4 83 78 c). 175 kg zhomogenizowanej pasty bakteryjnej o aktywnosci 190 j/g rozciencza sie 175 kg wody i do mieszaniny dodaje mieszajac 22,7 kg Hyflo, eo 22,7 kg Celite 505 i 10,2 kg Fibraflo, po czym od¬ dziela sie faze wodna za pomoca filtru typu Funda i osad przemywa 50 litrami wody. Otrzymuje sie 290 kg polaczonych roztworów o aktywnosci 48 j/g. d). 1 kg zhomogenizowanej pasty o aktywnosci 55 212 j/g rozciencza sie 2,0 litrami wody, dodaje 220 ml 0,5 n roztworu wodorotlenku sodowego w celu doprowadzenia wartosci pH do 8,5 i miesza w temperaturze 20°C w ciagu 30 minut. Nastepnie odwirowuje sie mieszanine z sila odsrodkowa 60 13200 G w ciagu 30 minut w temperaturze 0°C, dekantuje odciek i przesacza go otrzymujac 2,7 kg roztworu o, aktywnosci 50 j/g. Ponowne zmiesza¬ nie dwukrotne osadu z 1 litrem wody w • ciagu minut przy wartosci pH 8,5 i odwirowanie daje 65 dodatkowo 2 kg roztworu enzymu o aktywnosci11 j/g. Laczna wydajnosc acylazy mierzona aktyw¬ noscia wynosi 74% wydajnosci teoretycznej. e). 2 kg klarownego roztworu acylazy o aktyw¬ nosci 50 j/g otrzymanego w sposób opisany w przekladzie - lid, poddaje sie liofilizacji, otrzymu¬ jac 98,5 g stalej acylazy o aktywnosci 950 j/g. f). 2 kg klarownego -roztworu acylazy, o aktyw¬ nosci 50 j/g, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie Ud, poddaje sie suszeniu metoda roz¬ pylania, otrzymujac 92 g stalej acylazy o aktyw¬ nosci 920J/g. g). 1 kg klarownego roztworu acylazy, o aktyw¬ nosci 52 j/g, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie lid, poddaje sie w ciagu 8 godzin procesowi dializy za pomoca wody wodociagowej.Otrzymany roztwór liofilizuje- sie, otrzymujac ,5 g stalej acylazy o aktywnosci 2400 j/g. h). 245 kg klarownego roztworu acylazy o aktyw¬ nosci 48 j/g, otrzymanego w sposób opisany w przykladzie He, miesza sie i traktuje 2,2 kg 9 m kwasu octowego, w celu uzyskania wartosci pH 4,5. Kontynuuje sie mieszanie w ciagu 1 godziny i nastepnie przesacza mieszanine, dp przesaczu do¬ daje mieszajac 4,5 kg 7 m wodorotlenku amono¬ wego, w celu doprowadzenia do wartosci pH 8,0.Po uplywie 1 godziny mieszanine przesacza sie i do przesaczu dodaje 2,0 kg 9 m kwasu octowego, doprowadzajac wartosc pH do 5. Otrzymuje sie 220 kg roztworu o aktywnosci 47,5 j/g. i). 500 g odcieku o aktywnosci 52 j/g, otrzyma¬ nego w sposób opisany w przykladzie 2d, dopro¬ wadza sie do wartosci pH 4 i miesza w ciagu 15 minut w temperaturze 0°C, w celu wytracenia za¬ nieczyszczen bialkowych. Nastepnie mieszanine od¬ wirowuje sie, alkalizuje przesacz do wartosci pH 7,5, otrzymujac czysty roztwór o aktywnosci 40 j/g. 500 g tego roztworu dializuje sie woda pitna w ciagu nocy i wymraza do sucha, otrzymujac 4 gy produktu o aktywnosci 4900 j/g. j). 1 -kg homogenizowanej pasty bakterii ov ak¬ tywnosci 128 j/g odwirowuje sie przy 13 200 G *w ciagu 30 minut, w temperaturze 0°C. 500 g od¬ cieku o aktywnosci 80 j/g dekantuje sie, przesacza i przesacz stosuje do enzymatycznego rozszczepia¬ nia penicyliny, w celu otrzymania kwasu 6-amino- penicylanowego. r Przyklad III. Sprzeganie acylazy E.coli z po¬ limerami: a). Roztwór agarowy (2,5 ml 4% Sepharose 4B) przesacza sie oddzielony wilgotny osad miesza w ciagu 8 minut przy pH' 11,5—12,0 z 2 ml 5% roz¬ tworu wodnego bromku cyjanu ochlodzonego lo¬ dem. Powstaly zel odsacza sie przemywa na saczku woda ochlodzona (Lodem i nastepnie ochlodzonym ' za 'pomoca lodu 0,1 m roztworem boraksu. Prze¬ myty osad miesza sie z 4 ml 0,1 m roztworu bo- raiksu i nastepnie z 0,106 g acylazy E.coli o aktyw¬ nosci 159 000 j/g otrzymanej w sposób opisany w patencie polskim nr 83168 w przykladzie VIId.Mieszanie- prowadzi sie w ciagu 24 godzin w tem¬ peraturze 4°C. Powstala mieszanine odsacza sie, przemywa Osad woda i otrzymuje 1,2 g wilgotnego polimeru o aktywnosci wlasciwej 679 j/g. b). 0,100 g Sephadex G 25 miesza sie w ciagu 8 minut przy pH 11,5—12 z 2 ml ochlodzonego lo- 582 8 dem 5% roztworu wodnego bromku cyjanu i odsa- - cza. Otrzymany zel przemywa sie lodowata woda i nastepnie 4 ml lodowatego 0,1 m wodnego roz¬ tworu boraksu. Do tego osadu dodaje sie 0,106 g acylazy E.coli o aktywnosci 159 000 j/g, otrzyma¬ nej w sposób podany w przykladzie VIId, wymie¬ nionego patentu i miesza w temperaturze 4°C w ciagu 24 godzin, nastepnie nastawia sie war¬ tosc pH mieszaniny na 7,5 i odsacza mieszanine, przemywajac osad woda. Otrzymuje sie 0,3 g po¬ limeru o aktywnosci wlasciwej 212 j/g. c). Powtarza sie proces opisany w przykladzie Illb, stosujac 0,1 g DEAE-Sephadex A50 zamiast Sephadex G25. Otrzymuje sie 1,25 g wilgotnego po- limeru o aktywnosci wlasciwej 435 j/g. d). Powtarza sie proces opisany w przykladzie Illb, stosujac .-04 g sproszkowanej celulozy (M&- cherey, Nagel and Co, MN-300). Otrzymuje sie 0,35 g polimeru o aktywnosci wlasciwej 261 j/g.Przyklad IV. Wytwarzanie kwasu 6-amino- penicylanowego. Do 283 g roztworu enzymu o ak¬ tywnosci 42 j/g dodaje sie 20 g roztworu soli po¬ tasowej ibenzylopenicyliny w 317 ml wody. Miesza¬ nine poddaje sie hodowli w temperaturze 37°C, utrzymujac wartosc' pH 7,8 przez okresowe doda¬ wanie 2,5 n roztworu wodorotlenku sodowego.Po uplywie 6 godzin mieszanine zawierajaca .7 g kwasu 6-aminopenicylanowego (92% wydaj- ' nosci teoretycznej) odsacza sie. Wartosc pH prze- saczu doprowadza sie do 3 przez dodanie 5n kwa¬ su solnego i ekstrahuje polowa objetosci ketonu metyloizobutylowego w celu usuniecia pozostalej benzylopenicyiliny i odszczepionego kwasu fenylo¬ octowego.Wyekstrahowany roztwór rozdziela sie, wartosc pH fazy wodnej nastawia na 7,5 i steza roztwór do objetosci 120 ml pod zmniejszonym cisnieniem.Stezony roztwór chlodzi sie do temperatury 5°C i odsacza. Po zakwaszeniu przesaczu 5 n kwasem 40 solnym do wartosci pH 4,3 wytraca sie krystalicz¬ ny kwas 6-aminopenicylanowy. Produkt ten od¬ sacza sie, przemywa mala iloscia zimnej wody i nastepnie bezwodnym acetonem, po czym suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 8,84 g 45 kwasu 6^aminopenicylanowego o czystosci 95%.Wydajnosc produktu w przeliczeniu na benzylo- penicyline wynosi 72% wydajnosci teoretycznej.Przyklad V. Wytwarzanie kwasu 6-amino¬ penicylanowego. 50 a). Do 375 g roztworu enzymu o aktywnosci 33.8 j/g, otrzymanego w sposób podany w przy¬ kladzie lic, dodaje sie 21 g soli potasowej benzy- lopenicyliny, rozpuszczonej w 325 ml wody. Roz¬ twór poddaje sie hodowli w temperaturze 37°C, 55 utrzymujac wartosc pH 7,8 przez okresowe doda¬ wanie 2,5 roztworu wodorotlenku sodowego. Po uplywie 6 godzin roztwór chlodzi sie do tempera¬ tury 10°C i przy wartosci pH 2 ekstrahuje 200 ml ketonu metyloizobutylowego, w celu usuniecia po- 60 zostalej benzylopenicyliny i odszczepionego kwasu 6-aminopenicylainowego. Nastepnie oddziela sie fa¬ ze wodna, nastawia na wartosc pH 7,5 i steza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 110 ml.Stezony roztwór chlodzi sie do temperatury 5°C 65 i odsacza. Przesacz zakwasza sie 5 n kwasem sol-95 582 nym do wartosci pH 4,3 i odsacza wytracony, kry¬ staliczny kwas 6-aminapenicylanówy. Krysztaly przemywa sie dwukrotnie 5 ml zimnej wody, a na¬ stepnie dwukrotnie 5 ml bezwodnego acetonu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac 8,51 g kwasu 6-am'inopemicylainowego o czystosci 99%. Wydajnosc w przeliczeniu na benzylopenicyli- ne wynosi 69% wydajnosci teoretycznej.W analogiczny sposób otrzymuje sie kwas 6- aminopenicylanowy, wychodzac z preparatów en- zymowych, wytworzonych metodami opisanymi w nizej wymienionych przykladach zawartych w opisie patentowym polskim nr 83168. Wydajnosc procesów i czystosc otrzymanego kwasu podano w tablicy 1. yw 20 ml acetonu i dodaje do drugiej z wyzej wy¬ mienionych czesci roztworu w octanie etylu i steza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo ml, po czym dodaje .sie lp ml eteru i pozostawia na noc w lodówce. Powstaja biale krysztaly soli benzenosulfonowej estru p-nitrobenzylowego kwa¬ su 6-aminopenicylanowego. Otrzymuje sie 0,8 g produktu o temperaturze topnienia 148—151°C, identycznego a. produktem opisanym w przykla- dzie IV brytyjskiego zgloszenia patentowego nr 33734/67.Przyklad VII. Kwas 6-(D-a-azydofenyloace- tamido)-peniicylanowy.Do 283 g roztworu enzymu o aktywnosci 42 j/g !5 dodaje sde roztwór 20 g sdli potasowej benzyilopenti- Przyklad Vb Vc Vd Ve Vi \ Vg Vh Vi Vj Vk VI Sól potasowa ibenzylo- penicyliny w gramach 21 21 500 21 21 12100 21 21 21 21 21 wytworzo¬ ny wg przykladu IIH IVaj IVb V VIIa VIHb . virc VIId IXb X IXa Tab 1 i c a X Emzyim ilosc wg 6,3 4,2 450 ,4 145 w 0,1 0,11 ,4 2,4 N 0,9 1 aktywnosc j/g 1600 2920 800 2340 87 11610 128000 116500 2400 6000 14000 Kwas 6-aimiinopenicylanowy x j wydajnosc w gramach ,1 9,8 261,3 7,55 9,9 1064 9,3 ,35 9,1 .8,82 9,23 czystosc wi %' 9,8,2 96,0 9(8,5 97,0 100 100 9!8,0 100 100 100 100 wydajnosc ^% 82 718 89 60 31 88 75 85 75 72 7» W tablicy 1, w ostatniej rubryce podano wydaj¬ nosc procesu w stosunku do wydajnosci teoretycz¬ nej, przy uwzglednieniu stopnia czystosci produktu.Przyklad VI. Ester p-nitrobenzylowy kwasu 6-aminopenicylanowego. _ 18,6 g roztworu enzymu o aktywnosci 1610 j/g, otrzymanego w sposób podany w przykladzie VIIib, wedlug opisu patentowego polskiego nr 83168 roz¬ ciencza sie 700 ml wody, 1200 ml metanolu i do¬ daje 0,1 m roztworu wodorotlenku sodowego do uzyskania wartosci pH 7,8. Do tak przygotowane¬ go roztworu dodaje sie 3,1 g estru p-nitrobenzylo¬ wego kwasu benzylopenicylanowego w 60 ml me-* tanolu i miesza w temperaturze -37°C, utrzymujac wartosc pH 7,8 przez dodawanie 0,1 m roztworu wodorotlenku sodowego. Po uplywie 2j5 godziny mieszanine chlodzi sie i ekstrahuje 500 ml octanu etylu.• Warstwe kwasowa oddziela sie i ekstrahuje 250 ml octanu etylu. Warstwy organiczne laczy sie, suszy bezwodnym siarczanem sodowym w ciagu 1 godziny, przesacza i przesacz dzieli na polowy.Jedna z nich steza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem w temperaturze pokojowej, otrzymujac jako oleista pozostalosc 1,1 g estru p-nitrobenzylowego kwasu e^aminopenicylanowego. Produkt ten wyka¬ zuje w podczerwieni pasma przy 3250-1 cm, 1756-1 cm i 1720-1 om, co wskazuje na obecnosc grupy NH2, pierscienia P-laktamowego i grupy estrowej. 0,58 g kwasu benzenosulfonowego rozpuszcza sie 40 45 60 65 cyliny w 317 ml wody i utrzymuje w temperaturze 37°C, dodajac 2,5n roztworu wodorotlenku sodo¬ wego w celu utrzymania wartosci pH 7j8. Po uply¬ wie 6 godzin mieszanine zawierajaca 10,7 g kwasu 6-aminopenicylanowego (9,2%) odsacza sie, chlodzi przesacz do temperatury 5^C i zakwasza do war¬ tosci pH 3,0 za pomoca 10 n kwasu siarkowego, po czym dodaje sie-mieszajac 300 ml ketonu metylo- izobutylowego, zawierajacego 62 miliimole chlorku D-a-azydofenyloacetylu. Miesza sie w ciagu 30 mi¬ nut i dodaje Okresowo 2,5 n roztworu wodorotlenku sodowego w celu utrzymania wartosci pH 3,0.Mieszanine przesacza sie przez 10 g. Celite 505 i oddziela roztwór ketonowy od fazy wodnej.Roztwór w ketonie metyloizobutylowym suszy sie nad 25 g bezwodnego siarczanu sodowego, odsa¬ cza i z przesaczu przez dodanie 41 ml 2n roztwo¬ ru soli sodowej kwasu 2-etyldkapronowego w ke¬ tonie metyloizobutylowym wytraca kwas 6- -azydofenyloacetamido)-penicylanowy w postaci je¬ go sodowej soli. Sól te odsacza sie, przemywa 50 ml ketonu metyloizobutylowego i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C, otrzymujac 16,5 g produktu. Czystosc produktu wynosi 96%, a jego wydajnosc w przeliczeniu na benzylopenicyline wynosi 75% wydajnosci teore¬ tycznej.W analogiczny sposób wytwarza sie sól sodowa kwasu 6-(D-a-azydofenyloacetamido)-penicylanowe- go, stosujac inne preparaty enzymowe, wytworze-95 582 U ne w sposób podany w odpowiednich przykladach opisu patentowego polskiego nr 83168. Wydajnosc i czystosc otrzymanego produktu podano w tabli¬ cy 2, frrzy czym w ostatniej rubryce podano wy¬ dajnosc produktu w procentach, wydajnosci teo¬ retycznej, po uwzglednieniu czystosci produktu. 12 pozostala 1/4 czesc grzbietu zwierzecia zastrzyknie- to próbke 'kwasu 6-aminopenicylanowego, wytwo¬ rzonego znana metoda przy uzyciu calych komórek E.coli.Próbki kwasu 6-ami.nopenicylanOiwego zastrzyki- wano bezposrednio po ich rozpuszczeniu. Jako Tablica 2 Przyklad VIIb VUc VIId Ylle VHf VIIg VIIh Viii - VIIj Sól potasowa benzylo- penicyliny w igraniach 21 21 21 21 21 21 21 21 21 Enzym wytworzo¬ ny jak w przykladzie patentu polskiego W IVa V YIIei VlSb VIIc IXb , X IXa ilosc w gramach 6,3 4,2 ,4 145 6 0,1 ,4 2,4 0,9 aktywnosc w? j/g 1600 2920 2340 .87 1890 128000 2400 6000 14000 Kwas 6-(D-azydofenylo- acetamido)jpenicylanowy wydajnosc W( g 18,9 18,0 16,2 ,4 19,7 18,5 ,5 18,5 ,0 czystosc % 95,8 94,0 89,7 95,8 96,6 96,0 92,7 95,5 91,4 wydajnosc TM % 81 76 65 87 86 79 85 79 82 | Przyklad VIII. Enzymatyczna synteza ben- zylopenicyliny. 175 g kwasu 6-aminopenicylanbwego i 111 g kwa¬ su fenylooctowego rozpuszcza sie w 10 ml roztwo¬ ru buforowego fosforanu potasowego przy war¬ tosci pH 7y0 i do roztworu dodaje roztwór 3,6 mg acylazy o aktywnosci 128000 j/g, wytworzonej w sposób podany w przykladzie VIIc opisu patento¬ wego polskiego nr 831168 rozpuszczonej w 5 ml woidy.Do mieszaniny dodaje sie tyle 1 m roztworu kwasu ortofosforowego, aby uzyskac wartosc pH ,0, po czyni mieszanine utrzymuje sie w ciagu 4 godzin w temperaturze 37°C przy pH 5,0. Na¬ stepnie ochladza sie powstaly .roztwór i analizuje metoda chromatografii ibibulgwej. Wydajnosc pro¬ cesu przemiany kwasu 6-aminopenicylanowego w benzylopenicyline wynosi 30% wydajnosci teore¬ tycznej.Przyklad IX. Badania antygenowe. Badania przeprowadza sie metoda opisana przez de Weck d in. (Int. Arch. Allergy 33, 1968, 535—567), pole¬ gajaca ma okreslaniu biernego uczulania skórnego u swinek morskich. Za pomoca powtarzanych pod¬ skórnych zastrzyków surowego kwasu 6-aminope¬ nicylanowego i 2 zastrzyków podskórnych pozo¬ stalosci z procesu idializy kwasu 6-aminopenicyla¬ nowego.W badaniach biernej hemaglutynacji ta antysu- rowica wykazywala miano 1/4096. Po 1 ml tej antysurowicy kwasu 6-aminopeni'cyl'anowego za¬ strzykiwarno dozylnie bialej swince morskiej. Po uplywie 24 godzin zastrzykiwano dozylnie 0,1 ml % roztworu blekitu Evansa w roztworze soli ku¬ chennej, a s 1 godzine pózniej podawano sród- skórnie 0^1 ml roztworu, zawierajacego 4 mg kwa¬ su 6-aminopenicylanowego, wytworzonego sposo¬ bami opisanymi w przykladach Vd, Vg i Vi. Na 55 próbke porównawcza zastrzyknieto sródskórnie 0,1 ml zwyklej soli fizjologicznej. Taki sam tok postepowania powtórzono w odniesieniu do dru¬ giej swinki morskiej, z ta róznica, ze zamiast prze- ciwsurowicy kwasu 6-aminopenicylanowego poda¬ wano dozylnie 0,1 ml zwyklej soli fizjologicznej.Po uplywie 2 godzin od zastrzyków sródskór- nych okreslano nasilenie niebieskiej barwy w miej¬ scach zastrzyków, obliczajac iloczyn dwóch prosto¬ padlych do siebie srednic siniaka. Stwierdzono, ze u obu zwierzat wszystkie próbki kwasu 6-amino¬ penicylanowego, zarówno uczulone, jak i próbka uczulona biernie, powoduja rozchodzenie sie barw¬ nika wyrazniejsze niz w miejscu, w którym doko¬ nano zastrzyku soli fizjologicznej. Jednakze, jak to uwidaczniaja wynika podane w tablicy 3, prób¬ ka kwasu 6-aminopenicylanowego otrzymanego w w znany sposób powodowala silniejsza reakcje u uczulonego zwierzecia. Kwas otrzymany sposo¬ bem wedlug wynalazku powodowal ten skutek w mniejszych rozmiarach. Skutek ten okresla sie jako iloczyn dwóch prostopadlych srednic siniaka w mm2. 65 Ta Kwas 6-amino- penicylanowy otrzymany wedlug przykladu Preparat otrzymany przy uzyciu komórek E.coli Vd Vg Vi roztwór fizjologiczny blica 3 zwiierze uczulone ' 256 132 195 156 12 zwierze mie- uczulone 110 120 169 169 12 róznica i 146 22 26 —13 J 195 582 13 14 Wyniki te wykazuja, ze próbka kwasu 6-ami- nopenicylanowego wytworzonego metoda znana i próbki kwasu 6-aminopenicylanowego wytworzo¬ ne sposobem wedlug wynalazku róznia sie odnos¬ nie ich zdolnosci wywolywania biernej reakcji skó¬ ry na uczulenia, a mianowicie kwas 6-aminoipeni- cylanowy wytworzony sposobem wedlug wynalaz¬ ku ma wlasciwosc wywolywania reakcji alergicz¬ nych mniejsza niz kwas 6-aminapenicylanowy wy¬ tworzony znana metoda przy uzyciu calych komó¬ rek E.coli. PL