PL80726B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania sulfonowych pochodnych glikopeptydu wy¬ ekstrahowanego z narzadów zwierzecych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania sulfonowych pochodnych glikopeptydu wyekstraho¬ wanego z narzadów zwierzecych, o wlasciwosciach farmakologicznych.W polskim opisie patentowym nr 59963 opisano ekstrakcje glikopeptydów, stosowanych jako srodki lecznicze, z pewnych narzadów zwierzecych oraz podano ich wlasciwosci fizyczne i chemiczne. Obec¬ nie stwierdzono, ze glikopeptydy mozna sulfonowac do odpowiednich pochodnych sulfonowych.Te zwiazki sulfonowe maja dzialanie fizjologicz¬ ne, glównie w zastosowaniu do leczenia chorób za¬ palnych, a zwlaszcza w leczeniu zapalen stawów, jak równiez wrzodów zoladka oraz jako srodki re¬ gulujace zabliznianie i fibrynolize.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia sulfonowych pochodnych glikopeptydu wyod¬ rebnionego z blony sluzowej zoladka i z dwuna¬ stnicy swin. Proces obejmuje hydrolize wodna na¬ rzadów zwierzecych, usuwanie kwasnych produk¬ tów ubocznych hydrolizy, rozcienczenie pozostalo¬ sci zwiazkiem i produktu rozpuszczalnikiem nie rozpuszczajacym ich, zawieszenie rozcienczonego produktu w trzeciorzedowej zasadzie heterocyklicz¬ nej, dzialanie czynnikiem sulfonujacym i wyodreb¬ nianie produktu sulfonowania.Ekstrakcje blony sluzowej zoladka i dwuna¬ stnicy swin, w celu otrzymania glikopeptydów, o- pisano w polskim opisie patentowym Nr 59963. W skrócie polega ona na hydrolizie narzadów zwie- 25 30 rzecych woda w temperaturze 50—100°C w ciagu 10—45 minut, przy wartosci pH = 1—10. Kwasne produkty uboczne hydrolizy usuwa sie nastepnie, a pozostaly produkt rozciencza sie rozpuszczalnikiem, nie rozpuszczajacym produktu.Pod koniec hydrolizy wygodnie jest wzmóc wy¬ tracanie kwasnych produktów ubocznych, na przy¬ klad mukopolisacharydów, zawierajacych siarke. W tym celu, jesli hydrolize prowadzono w srodowi¬ sku alkalicznym, mieszanine zakwasza sie slabym kwasem (na przyklad kwasem octowym), co po¬ woduje wytracanie kwasnych produktów ubocz¬ nych. Przesacz uwalnia sie nastepnie od protein przez traktowanie enzymami (na przyklad papaina lub trypsyna) przy odpowiedniej wartosci pH = = 5,5—6,5. Celowe jest równiez, przed traktowa¬ niem enzymani, wstepne usuwanie protein przez dodatek odpowiedniego skladnika, na przyklad kwasu trójchlorooctowego. Po rozcienczeniu otrzy¬ manego przesaczu rozpuszczalnikiem organicznym (alkoholem lub acetonem) otrzymuje sie surowy glikopeptyd w postaci bialego lub orzechowego proszku. Produkty zawieraja jedynie slady siarki, charakteryzuje sie je na podstawie braku kwa¬ sów uronowych. Heksozaminy wystepuja w ilosci 40—50%, aminokwasy w ilosci 13—18°/o, a heksozy w ilosci 27—31%, wagowo.Powyzsze dane analityczne wskazuja, ze substan¬ cje te moga byc zaliczone do grupy glikopeptydów, lecz z drugiej strony obecnosc heksoziamin, brak 8072680726 kwasów uronowych oraz wszelkiego rodzaju grup zawierajacych siarke wskazuja na polisacharydowa budowe substancji.Tak otrzymane glikopeptydy zawiesza sie w trzeciorzedowej zasadzie heterocyklicznej o tempe- 5 raturze wrzenia 100—200°C. Stosuje sie pirydyne, metylopirydyny, etylopirydyny i dwumetylopiry- dyny, a zwlaszcza bezwodna pirydyne. Glikopepty¬ dy sa nierozpuszczalne w tej ostatniej, a wiec re¬ akcje prowadzi sie w zawiesinie. 10 Czynnikami sulfonujacymi sa: kwas chlorosulfo- nowy, kwas siarkowy, oleum i addukty trójtlenku siarki z pirydyna lub dioksanem.Sulfonowanie przeprowadza sie przez zmieszanie zawiesiny glikopeptydu i czynnika sulfonujacego 15 w temperaturze od okolo — 40°C do okolo 0°C i u- trzymywanie mieszaniny w temperaturze 50—80°C, korzystnie w temperaturze 75°C, w ciagu 4—8 go¬ dzin, korzystnie w ciagu 5 godzin. Ilosc czynnika sulfonujacego moze wynosic 400—600%, korzystnie 20 500%, wagowo, w stosunku do uzytego glikopepty¬ du.Po zakonczeniu reakcji sulfonowania produkt wyodrebnia sie poprzez dialize lub poprzez dzialanie wymieniacza jonowego kationowego, anionowego 25 lub obu równoczesnie.Sulfonowane glikopeptydy (oznaczane w dalszym ciagu opisu symbolem SGLP) przeprowadza sie na¬ stepnie w odpowiednie sole sodowe, przez trakto¬ wanie wodorotlenkiem sodu i wytraca z wodnego 30 roztworu przez rozcienczenie odpowiednim rozpusz¬ czalnikiem, jak metanol lub aceton. SGLP mozna przeprowadzac w sole innych metali alkalicznych, amoniaku, metali ziem alkalicznych lub metali ciezkich. 35 Sole SGLP otrzymuje sie z roztworu po sulfono¬ waniu przez zobojetnienie wodorotlenkiem metalu alkalicznego, wodorotlenkiem ziem alkalicznych lud wodorotlenkiem amonu. Mozna je równiez o- trzymac z soli sodowej SGLP przez podwójna wy- 40 miane z sola metalu ziem alkalicznych lub glinu lub z sola metalu ciezkiego.Sole otrzymywane przez zobojetnienie SGLP wo¬ dorotlenkiem metalu wyodrebnia sie przez wytra¬ canie z wodnego roztworu metanolem lub aceto- 45 nem. Najlepsze rezultaty otrzymuje sie dodajac do¬ datkowo przed wytraceniem do acetonu lub meta¬ nolu, stosowanego do wytracania SGLP, niewielka ilosc octanu lub halogenku, majacego ten sam ka¬ tion, jak uzyty wodorotlenek. Ilosc ta wynosi so 3—7% wagowo, w stosunku do zuzytego wodoro¬ tlenku. Powyzszy sposób jest korzystny do otrzy¬ mywania soli potasowych, litowych, wapniowych, barowych, strontowych i amonowych.Reakcje podwójnej wymiany miedzy sola sodowa 55 SGLP i solami innych metali prowadzi sie w roz¬ tworze wodnym. Najdogodniej jest stosowac sole, gdzie anionem jest octan lub halogenek. Podwójna wymiane mozna przeprowadzic równiez przez per- kolowanie wodnego roztworu soli sodowej SGLP 60 przez kolumne z silnie kationowym wymieniaczem jonowym uprzednio aktywowanym metalem, które¬ go sól chce sie otrzymac. Roztwór z perkolatora zadaje sie nastepnie czynnikiem stracajacym, na przyklad acetonem lub metanolem. Przed strace- 65 niem dogodnie jest dodac niewielka ilosc halogen¬ ku lub octanu metali, którego sól uzyto do podwój¬ nej wymiany. Metoda podwójnej wymiany najdo¬ godniej jest otrzymac sole: cynku, wapnia, baru, strontu, miedzi, niklu, kobaltu, magnesu, bizmutu, zlota i glinu.W ponizszej tablicy podano pewne dane anali¬ tyczne, charakterystyczne dla soli sodowych, SGLP, otrzymanych wyzej wymienionymi metodami. Od¬ powiadaja one produktom o najnizszym i najwyz¬ szym stopniu zsulfonowania: S % C °/o H °/o O °/o N °/o Na °/o heksozaminy °/o heksozy °/o CH3CO °/o proteiny °/o kwasy uronowe 3,7 —14,5 42,5 —22,7 6,65— 3,35 39,15—45,65 5,35— 3,0 2,68—10,6 31,7 —18 24,7 —14 8,28— 4,7 14,2 — 8,8 brak Zwiazki proteinowe posiadaja nastepujacy sklad (w % wagowych); kwas asparginowy treonina seryna kwas glutaminowy prolina glicyna alanina walina izoleucyna leucyna lizyna histydyna arginina 2,18 33,68 10,62 5,87 22,96 2,49 5,36 5,16 1,46 4,25 2,02 2,13 1,82 W próbach przeprowadzonych na zwierzetach laboratoryjnych sprawdzono aktywnosc pochod¬ nych sulfonowanych glikopeptydów na; a. powstrzymywanie miejscowego obrzeku w la¬ pach szczurzych, wywolywanego przez carrageeni- ne, serotonine i kaolin; aktywnosc wystepuje juz przy 3,25 mg/kg; dotrzewnie b. usuwanie preg podskórnych; dawka 12,5 mg/kg c. wzrost stopnia regeneracji konczyn; dawka 12,5 mg/kg; dotrzewnie d. przyspieszenie zablizniania ran; dawka 6,25 mg/kg: dotrzewnie; 12,5 mg/kg podskórnie e. powstrzymanie owrzodzenia wywolanego przez podwiazanie odzwiernika i przez hydrokortizon; dawka 12,5 mg/kg dotrzewnie; 50 mg/kg doustnie f. spadek aktywnosci trawiennej soku zoladko¬ wego in vivo i in vitro g. wzrost aktywnosci fibrynoiitycznej oznaczanej metodami: czasu ustepowania euglobuliny, plytek fibrynowych wedlug Astrupa lub tromboelastogra- ficznie; aktywnosc ta wystepuje juz przy dawce 500 gamma/kg h. spadek poziomu cholesterolu i trójglicerydów protoplazmatycznych, po przedluzonym podawaniu szczurom.5 80726 6 Nie stwierdzono toksycznosci u myszy i szczurów przy jednorazowej dawce 3 g/kg i przy podawaniu w ciagu 6 miesiecy dawki 100 mg/kg dziennie.Ponizsze przyklady wyjasniaja sposób wedlug wynalazku, bez ograniczenia jego zakresu.Przyklad I. Ig glikopeptydu, otrzymanego wedlug przykladu V polskiego opisu patentowego Nr 59963, zawieszono w 20 ml bezwodnej pirydyny.Roztwór ochlodzono, mieszajac, do temperatury — 15°C i dodano wolne 5,3 g kwasu chlorosulfono- wego. Ogrzewano do temperatury 60°C w ciagu 6 godzin, ochlodzono, wytracony osad odsaczono i przemyto metanolem. Produkt rozpuszczono w 50 ml wody, dodano 1 n roztwór NaOH do wartosci pH = 10, przesaczono, doprowadzono wartosc pH do 6 za pomoca kwasu octowego i dializowano w cia¬ gu 48 godzin do wody destylowanej, w tempera¬ turze pokojowej uzywajac blony z regenerowanej celulozy.Po zakonczeniu dializy roztwór przesaczono i przesacz liofilizowano. Wydajnosc 0,900 g.Analiza: S — 4,8%; N — 5,15%; Na — 3,46%; heksozaminy — 30,4%; heksozy — 23,6%; kwasy u- ronowe — brak; grupy acetylowe — 7,95%; protei¬ ny — 13,5%.Przyklad II. Ig glikopeptydu, otrzymanego wedlug przykladu V polskiego opisu patentowego Nr 59963, zawieszono w 20 ml bezwodnej pirydyny, ochlodzono mieszajac do temperatury — 40°C i do¬ dano wolno 5,3 g kwasu chlorosulfonowego. Ogrze¬ wano przez 6 godzin do temperatury 60°C, ochlo¬ dzono i odsaczono wydzielony osad. Rozpuszczono go w 50 ml wody, wytracono osad przez rozcien¬ czenie 150 ml metanolu i odsaczono.Wytracony osad rozpuszczono ponownie w 50 ml wody i mieszano przez 1,5 godziny z mieszanina wymieniaczy jonowych (25 ml zywicy IR 120 i 25 ml zywicy TRA 410).Wymieniacze odsaczoino, doprowadzono wartosc pH do 6 za pomoca 1 n roztworu NaOH i roztwór zageszczono pod zmniejszonym cisnieniem do obje¬ tosci 15 ml. Dodano 0,5 g uwodnionego octanu so¬ du i wytracono osad dodajac 60 ml metanolu. Osad odsaczono, przemyto metanolem i eterem, a na¬ stepnie suszono w prózni nad P205.Analiza: S — 3,7%; N — 5,35%; Na — 2,68%, heksozaminy — 31,7%; heksozy — 24,7%; kwasy uronowe — brak; grupy acetylowe — 8,28%; pro¬ teiny — 14,2%.Przyklad III. 2 g glikopeptydu, otrzymane¬ go wedlug przykladu V polskiego opisu patentowe¬ go Nr 59963, zawieszono w 40 ml bezwodnej piry¬ dyna, oziebiono do temperatury — 20°C, dodano wolno, mieszajac, 10,6 g kwasu chlorosulfonowego.Mieszano w temperaturze 65°C w ciagu 1 godziny, a nastepnie ogrzewano do temperatury 65°C, bez mieszania, przez dalsze 2 godziny. Roztwór zde- kantonawo, a zelowata pozostalosc wymyto meta¬ nolem i przesaczono. Osad suszono w prózni w temperaturze 50°C, rozpuszczono w 50 ml wody i mieszono przez 30 minut z 25 ml wymieniacza jo¬ nowego IR 120. Wymieniacz odsaczono, a przesacz poddano tej samej operacji z 25 ml wymieniacza jonowego IRA 410. Wymieniacz odsaczono ponow¬ nie, wartosc pH przesaczu doprowadzono do 11 za pomoca roztworu 1 n NaOH. Ponownie doprowa¬ dzono wartosc pH przesaczu do 6,5 za pomoca 2 n kwasu octowego, dodano 0,2 g uwodnionego octanu sodu, zageszczono w prózni do objetosci 20 ml 5 i wytracono osad przez rozcienczenie 80 ml meta¬ nolu.Produkt odsaczono, przemyto, alkoholem i ete¬ rem, a nastepnie suszono w prózni w temperaturze 50°C. Wydajnosc 3 g. io Analiza: S — 14,65%; N — 3,05%; Na —10,63%; heksozaminy — 18%; heksozy — 14%; kwasy u- ronowe — brak; grupy acetylowe — 4,7%; protei¬ ny — 8,8%.Pr z y k l a d IV. Glikopeptyd sulfonowano zgo- 15 dnie z przepisami podanymi w przykladzie I—III.Wodny roztwór ikwasinego sulfonowanego gliko¬ peptydu, otrzymany przez obróbke mieszaniny re¬ akcyjnej, doprowadzono do wartosci pH = 6 za po¬ moca wodorotlenku baru. Zageszczono pod zmniej- 20 szonym cisnieniem do objetosci 15 ml, dodano 0,5 g chlorku barowego i rozcienczono ponownie 60 ml metanolu, otrzymujac osad soli barowej sulfono¬ wanego glikopeptydu.Analiza: Ba — 23,95%; S — 10,67%. 25 PrzykladV. 10 g soli sodowej sulfonowane¬ go glikopeptydu (S = 13,6%), otrzymanego wedlug przykladu III, rozpuszczono w 100 ml wody i do¬ dano 1 n roztwór wodny octanu cynku. Rozcien¬ czono 400 ml metanolu, otrzymujac osad soli cyn- 30 kowej sulfonowanego glikopeptydu.Analiza: Zn — 8,9%; S —'_. lljf]Óó/o-.' " Przyklad VI. 35 g silnie kationowego wy¬ mieniacza jonowego Amberlit IR 120, aktywowa¬ nego znanymi metodami umieszczono w kolumnie 35 o wysokosci 80 cm. Nastepnie przez kolumne prze¬ puszczono 1 1 1%-owego roztworu A1C13.6H20 w ciagu 1 godziny. Kolumne przemyto nastepnie 500 ml destylowanej wody w ciagu 0,5 godziny. Na¬ stepnie przez kolumne przepuszczono roztwór 20 g 40 soli sodowej sulfonowanego glikopeptydu (otrzyma¬ nego wedlug przykladu III; S = 13,6%) w 800 ml wody, w ciagu 4 godzin. Kolumne przemyto nastep¬ nie 500 ml destylowanej wody i eluaty polaczono.Zageszczono je pod zmniejszonym cisnieniem do 45 objetosci 600 ml, dodano 0,5 g AICIS.6H2O i rozcien¬ czono 1200 ml acetonu otrzymujac osad soli glino¬ wej sulfonowanego glikopeptydu.Analiza: Al — 3,5%; S — 11,22%.Przyklad VII. 100 g soli sodowej sulfono- 50 wanego glikopeptydu (14% S) otrzymanego wedlug przykladu III, rozpuszczono w 1000 ml letniej wo¬ dy i wylano do 1000 ml 1/3 molarnego roztworu a- zotanu bizmutu w lodowatym kwasie octowym.Dodano 2000 ml metalonu (1 objetosc). 55 Otrzymany osad odwirowano i przemyto trzy¬ krotnie przez rozdrobnienie w 1500 ml mieszaniny metanolu i lodowatego kwasu octowego w stosun¬ ku 3:1 i kazdorazowe odwirowanie. Osad prze¬ myto w ten sam sposób jeszcze trzykrotnie, uzy- 60 wajac kazdorazowo 1500 ml acetonu. Otrzymany 0- sad w ilosci 128 g suszono w prózni i rozpuszczo¬ no w 15-krotnej objetosci wody (1920 ml) otrzymu¬ jac kwasny roztwór (pH = 4,5). Dodano 1 n roz¬ twór wodorotlenku sodu az do uzyskania wartosci 65 pH = 6,5 i wytracono osad dodajac 1,5 objetosci80726 8 acetonu. Osad odwirowano i przemyto trzykrotnie mieszanina acetonu i wody w stosunku 2:1, odwi¬ rowujac kazdorazowo, a nastepnie przemyto trzy¬ krotnie acetonem. Produkt suszono w prózni otrzy¬ mujac 120 g produktu.Analiza: S — 8%,, Bi — 29%.Przyklad VIII. Sól zlotowa odpowiadajaca soli bizmutowej z przykladu VII otrzymano, sto¬ sujac te sama procedure z tym, ze uzyto 0,3 molar- ny roztwór chlorku zlotowego w lodowatym kwa¬ sie octowym.Postepujac analogicznie jak w procesach opisa¬ nych w przykladach, otrzymano nastepujace sole SGLP: Sól magnezowa sulfonowanego glikopeptydu Analiza: ,Mg — 4,0%; S — 12,07°/o.Sól kobaltowa sulfoi#wanego glikopeptydu Analiza: Co — 7,85%; S — 11,28%.Sól niklowa sulfonowanego glikopeptydu Analiza: Ni — 8,0%; S — 11,13%.Sól miedziowa sulfonowanego glikopeptydu Analiza: Cu — 7,9%; S — 11,5%.Sól wapniowa sulfonowanego glikopeptydu Analiza: Ca — 7,05% S — 12,7%. PL

Claims (10)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania sulfonowych pochodnych glikopeptydu wyekstrahowanego z blony sluzowej zoladka i dwunastnicy swin, znamienny tym, ze narzady zwierzece hydrolizuje sie w znany sposób w wodzie w temperaturze od 50°C do 100°C w cia¬ gu od 10 minut do 45 minut, przy wartosci pH= = 1—10, nastepnie usuwa sie kwasne produkty uboczne otrzymywane podczas hydrolizy, pozosta¬ losc rozciencza sie rozcienczalnikiem nie rozpusz¬ czajacym produktu, w stosunku 1—3 objetosci roz¬ cienczalnika na 1 objetosc produktu, takim jak aceton, metanol lub etanol, co powoduje wytra¬ cenie glikopeptydu, nastepnie produkt zawiesza sie w trzeciorzedowej zasadzie heterocyklicznej o temperaturze wrzenia od 100°C do 200°C, mie¬ sza sie otrzymana zawiesine z czynnikiem sulfonu¬ jacym takim, jak kwas siarkowy, oleum, kwas chlorosulfonowy lub addukt trójtlenku siarki z pi¬ rydyna lub dioksanem w temperaturze od —40°C do 0°C a nastepnie w temperaturze od 50°C do 80°C i wyodrebnia powstaly produkt sulfonowania i ewentualnie przeprowadza w sole. 5
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako trzeciorzedowa zasade heterocykliczna stosuje sie pirydyne.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze sulfonowanie prowadzi sie w ciagu okolo 4—8 go- io dzin.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze produkt sulfonowania wyodrebnia sie przez dia¬ lize.
5. 5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 15 produkt sulfonowania wyodrebnia sie poprzez pod¬ danie dzialaniu wymieniacza jonowego kationowe¬ go, anionowego lub obu równoczesnie.
6. 6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze produkt sulfonowania poddaje sie reakcji z wodo- 20 rotlenkiem metali alkalicznych, metali ziem alka¬ licznych lub wodorotlenkiem amonu, po czym po¬ wstala sól wyodrebnia sie ze srodowiska reakcji przez wytracenie metanolem lub acetonem.
7. 7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze 25 przed wytraceniem soli ze srodowiska reakcji w acetonie lub metanolu rozpuszcza sie niewielka ilosc acetonu lub halogenku posiadajacego ten sam kation, jak uzyty wodorotlenek.
8. 8. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze 30 jako wodorotlenek stosuje sie wodorotlenek sodu, po czym otrzymana sól sodowa poddaje sie w roz¬ tworze wodnym reakcji podwójnej wymiany z ha¬ logenkiem lub octanem metalu takiego, jak cynk, wapn, bar, stronty miedz, nikiel, magnez, glin, ko- 35 balt, bizmut i zloto po czym wytraca sie sól od¬ powiedniego metalu acetonem lub metanolem.
9. 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze wodny roztwór soli sodowej saczy sie przez katio¬ nowy wymieniacz jonowy zawierajacy jako kation 40 glin, cynk, magnez, nikiel, miedz, wapn, bar, ko¬ balt, bizmut lub zloto, nastepnie do przesaczu do¬ daje sie niewielka ilosc octanu lub halogenku tego metalu po czym wytraca sie odpowiednia sól ace¬ tonem lub metanolem. 45
10. 10. Sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze stosuje sie octan lub halogenek w ilosci 3 do 7% wagowych. CZYTELNIA fMf team- •< <** Olsztynskie Zaklady Graficzne Lz. 2177 (100) Cena zl 10 PL