Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania sulfoglikopepltydów z glikopeptydów ekstrahowanych z mleka lub kazeiny. Otrzymane sposobem wedlug wynalazku sole amoniowe i metali sulfoglikopepty- dów stosuje sie do celów terapeutycznych podczas leczenia zmian w stawach i 'wrzodów zoladka jako srodki do gojenia blizn i fibrynolityczne.Ekstrakcja glikopeptydów z mleka róznych ssa¬ ków lub z otrzymanej z mleka kazeiny jest znana i przedstawiona w literaturze. Znany jest równiez sposób wytwarzania sulfoglikopeptydów z glikopep¬ tydów dkistrahowanych z organów zwierzecych zwlaszcza ze sluzówki zoladka lub dwunastnicy swin.Stwierdzono, ze sposób wytwarzania znanych sul¬ foglikopeptydów nie jest efektywny podczas stoso¬ wania go do sulfonowania glikoprotein ekstrahowa¬ nych z mleka lub kazeiny. Nie mozna przystosowac warunków stosowanych do efektywnego sulfonowa¬ nia glikoprotein ekstrahowanych z organów zwierze¬ cych, zwlaszcza sluzówki zoladka czy dwunastnicy swin do procesu sulfonowania glikoprotein ekstra¬ howanych z mleka lub kazeiny ze wzgledu na róz¬ ny sklad chemiczny tych dwóch rodzajów glikopro¬ tein. Sklad chemiczny glikoprotein otrzymanych z mleka lub kazeiny w stosunku do glikoprotein otrzymanych z organów zwierzecych charakteryzu¬ je sie wyzszym stosunkiem aminokwasu do weglo¬ wodorów oraz wyzsza zawartoscia aminokwasów za¬ wierajacych grupe fosforytowa i kwasu neurami- nowego.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wy¬ twarzania glikopeptydów ekstrahowanych z mleka luib kazeiny uwzgledniajacego szczególnie charakte¬ rystyczne wlasciwosci tych glikopeptydów.Sposób sulfonowania glikopeptydów ekstrahowa¬ nych z bialka lub kazeiny wedlug wynalazku pole¬ ga na tym, ze glikopeptydy ekstrahowane z mleka lub kazeiny rozpuszcza sie w aprotycznym, nie aro- miatyciznym rozpuszczalniku mieszajacym sie z wo da, dodaje trzeciorzedowa amine o temperaturze wrzenia 100—250°C i wytworzony produkt poddaje sie sulfonowaniu przez skontaktowanie go ze srod- kiem sulfonujacym, takim jak kwas siarkowy, ole- um, kwas chlorosulfonowy addukt bezwodnika siar¬ kowego i zwiazku organicznego, przy czym utrzy¬ muje sie temperature od —20°C do +20°C, a na¬ stepnie ogrzewa do temperatury 60—90°C i wy- dziela otrzymany sulfogiikopeptyd. Ewentualnie gli- kopeptyd dodaje sie po dodaniu trzeciorzedowej aminy lub srodka sulfonujacego.Stwierdzono, ze optimum warunków sulfonowania glikopeptydów ekstrahowanych z organów zwierze- cych otrzymuje sie po wytworzeniu zawiesiny w srodowisku reakcyjnym zawierajacym trzeciorzedowa zasade heterocykliczna w taki sposób, ze sulfono¬ wanie ma miejsce w fazie heterogenicznej.W przypadku glikopeptydów ekstrahowanych z mleka luib kazeiny optimum sulfonowania ma 9477594775 miejsce po rozpuszczeniu glikopeptydów w fazie rozpuszczalnika zawierajacej aprotyczny, nie aro¬ matyczny zwiazek mieszajacy sie z woda i trzecio¬ rzedowa zasade, korzystnie zasade aromatyczna o temperafturze wrzenia 100—250°C.Roztwór glikopeptydu wyekstrahowanego z mleka lub kazeiny w warunkach najbanrtTziej odpowiednich do przeprowadzania procesu stanowi mieszanine z trzeciorzedowa zasada, korzystnie trzeciorzedowa zasada heterocykliczna, taka jak pirydyna, metylo- pirydyna, dwusmietylapirydyna i chinolina oraz apro- tycznym, injeLaromatycznym rozpuszczalnikiem nie miefizsj^cttn "sie z jroda, takim jak dwunoetyllofor- mamid, dwumetyi ramid, dwumeCyloacetamid itp.Poszczególne etapy przeprowadzania sposobu we¬ dlug wynalazku opisano szczególowo ponizej.GMkopeptyd wyekstrahowany z mleka lub" kazeiny najpierw suszy sie, a nastepnie rozpuszcza w apro- tycznym nie aromatycznym rozpuszczalniku miesza, jacym sie z woda takim jak dwumetylafoamaimid, dwumetylosulfotleneit, szesciometylofosforamid, dwu- metyloacetamid itp. lo otrzymanego w ten sposób roztworu dodaje sie trzeciorzedowa zasade, korzy¬ stnie zasade aromatyczna o temperaturze wrzenia 100—250*0. Szczególnie korzystnie stosuje sie bez¬ wodna pirydyne.Jako odpowiedni srodek sulfonujacy stosuje sie kwas siarkowy, oleum, kwas chlorosuftonowy i ad- dukty bezwodnika siarkowego ze zwiazkami orga¬ nicznymi, takimi jak pirydyna, dioksan i trzeciorze¬ dowe aminy, np. trójetyloamina. Jezeli stosuje sie oleum lub kwas chlorosulfonowy mozna dodawac osobno srodek sulfonujacy z zasada heterocyfiTiczna i stosowac otrzymany addukt w sulfonowanej mie¬ szaninie reakcyjnej.Reakcje sulfonowania przeprowadza sie przez kontaktowanie mieszaniny rozpuszczalnika zawie¬ rajacego glikopeptyd ze srodkiem sulfonujacym w tempera/turze —20°C do -fS0°C, i nastepnie podwyz¬ szenie temperatury eto 60—00°C, korzystnie 80°C w ciagu 4—8 godzin, korzystnie 5 godzin.Po zakonczeniu sulfonowania sulfonowany pro¬ dukt zbiera sie przez saczenie i oczyszcza wydzie¬ lony z fazy rozpuszczalnika produkt przez dialize lub obróbke zywica jonowymienna.Otrzymane sole gilkopeptydów przeprowadza sie nastepnie w sól sodowa z wodorotlenkiem sodu i sól sodowa wytraca sie przez rozcienczenie jej wodnego roztworu odpowiednimi rozpuszczalnikami, takimi jak aceton lub metanol.Taka sama procedura moze byc stosowana do przeprowadzania sulfoglikopeptydu w sole z innymi .metalami alkalicznymi metalami ziem alkalicznych i metalami ciezkimi lub sól amonowa.Sole te mozna otrzymac z sulfoglikopeptydu po. chodzacego z sulfonowanej mieszaniny reakcyjnej przez zobojetnienie wodorotlenkiem metalu alka¬ licznego, metalu ziem alkalicznych lub amonu jak równiez z soli' sodowej przez podwójna wymiane z sola metalu ziem alkalicznych lub sola metalu ciezkiego. Sole, otrzymane przez zobojetnienie sul¬ foglikopeptydu wodorotlenkiem metalu, wyosabnla sie przez obróbke wodnych roztworów tych soli substancja wytracajaca, taka jak aceton lub meta¬ nol.Stwierdzono, ze szczególnie korzystne rezultaty otrzymuje sie wówczas, gdy przed wytraceniem do. da sie mala ilosc (to jest 3—7% wagowych w sto¬ sunku do wodorotlenku) octanu lub halogenku tego samego metalu, którego wodorotlenek byl uzyty do zobojetnienia mieszaniny reakcyjnej. W tym celu najbardziej korzystne sa kationy potasu, litu, wap¬ nia, baru, strontu i amonu.Reakcje podwójnej wymiany pomiedzy sola, so¬ dowa sulfoglikopeptydu a solami innych metali przeprowadza sie w roztworze wodnym. Anion tej soli korzystnie stanowi anion octanu lub halogen¬ ku. Reakcje podwójnej wymiany przeprowadza sie przez wstepne perkolowanie wodnego roztworu soli sodowej sulfoglikopeptydu przez kolumne wypel¬ niona zywica silnie kationowymienna, która uprzed. nio wysala sie kationem metalu, którego sól gliko¬ peptydu chce sie otrzymac.Perkolowany roztwór poddaje sie dzialaniu sub¬ stancji wytracajacej, takiej jak aceton lub meta¬ nol, korzystnie po dodaniu malej ilosci octanu lub halogenku tego samego metalu, który chce sie otrzymac. Szczególnie korzystne sa sole sulfogliko- peptydów z nastepujacymi metalami a mianowicie cynku, wapnia, baru, strontu, miedzi, niklu, kobal¬ tu, magnezu, bizmutu, zlota i glinu.W tablicy 1 podano analityczne wartosci charak¬ teryzujace sulfoglikopeptyd i sól sodowa otrzymana z niego (najnizsze i najwyzsze wartosci).Tablica 1 s N P Heksozaminy Heksozy Proteiny Kwas N-acetyloneuraminowy Lepkosc Wartosc pH —11% —9% 0,2-0,5% 6-9% 9—12% 45—50% —8% 1,15—1,30 cP £~7 | Sulfonowane glikopeptydy ekstrahowane z kazei¬ ny wykazuja nowe wlasciwosci przeciwwrzodowe, przeciwtrawienne i antysekretyczne.Badania farmakologiczne potwierdzily, ze sole sul¬ foglikopeptydu otrzymane sposobem wedlug wyna¬ lazku byly nietoksyczne w dawkach 400 mg/kg do- jelitowe i 1 g/kg doustnie. Przy stosowaniu doust¬ nym sulfoglikopeptyd w dawkach 40, 64, 102,4 i 163,8 mg/kg powoduje hamowanie stopnia owrzo¬ dzenia odpowiednio w 15% (NJS), 46% (PO, 01), 70% i 76%.Dzialanie antytrawSenne badano in vivo i in vi_ tro. Stosowane stezenie (od 0,5—4 mg/ml) i poda¬ wane w dawkach od 40—160 mg/kg byly porówny¬ wane z innymi sulfonowanymi makroczasteczkami (Lietti i wspólpracownicy, Boli. Soc. IL Biol. Sper. 47, 493, 1971).Dzialanie antysekretyczne bylo zauwazone przy wydzielaniu kwasu stymulowanym przez histamine i pentagastryne,, 23 40 45 50 55 6094775 Ponizsze przyklady ilustruja przedmiot wynalaz¬ ku, nie ograniczajac jego zakresu.Przyklad I. Mieszanine 170 ml dwumetylo- formamidu (DMP) i 230 ml pirydyny chlodzi sie do temperatury —20°C. Do otrzymanego roztworu do¬ daje sie 60 ml kwasu chlorosulfonowego i utrzy¬ muje w temperaturze nie przekraczajacej —15°C.W tych warunkach wytwarza sie addukt pirydy¬ na—'kwas chlorosulfonowy. Do fazy zawierajacej addukt dodaje sie 20 g uprzednio osuszonego i zmie¬ lonego glikopeptydu ekstrahowanego z mleka, pod¬ czas mieszania w temperaturze 20°C. Po dodaniu, temperature podwyzsza sie do 80°C i mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w tej temperaturze w cia¬ gu 3 godz. Po czym mieszanine pozostawia sie do odstania w temperaturze pokojowej w ciagu 2 go¬ dzin. Zelowata mase wyosabnfa sie przez dekanta- cje.Z wydzielonej masy przez dodanie 156 ml meta¬ nolu wytraca sie proszek koloru zóltego, który zbie¬ ra sie przez saczenie i rozpuszcza w 250 ml wody.Roztwór wodny traktuje sie 2ti0 ml zywicy katio- nowowymiennej (ArfrfberrtteR JR-120). Po 10 mi¬ nutach zywice oddziela sie przez saczenie a przesacz traktuje sie 200 ml zywicy wymieniacza anionowe¬ go (AmberliteR IR-4I0). Zywice te po 10 minu¬ tach oddziela sie równiez przez saczenie i wartosc pH przesaczu dorpowadza sie do 12 za pomoca roz¬ tworu wodorotlenku sodu, a nastepnie do pH 6.5 za pomoca kwasu octowego. Roztwór odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci 200 ml, nastepnie traktuje 4 g jodku sodu i rozciencza 1,2 objetosciami acetonu, przy czym wytraca sie osad.Wytracony osad przemywa sie etanolem az do znik¬ niecia jonów jodu, a nastepnie eterem etylowym i na zakonczenie osusza.Otrzymuje sie 19 g proszku koloru kosci slonio¬ wej o nastepujacym skladzie: Wilgotnosc = 4,9% S = 8,35% N = 7,05% P = 0,3% Heksozoaminy = 7,71% Heksozy = 11,6% Proteiiny = 46,44% Kwas N-acetyloneuraminowy = 5,9% Lepkosc = 1,237 cP Wartosc pH = 5,8 (1% w 0,5% NaOl) Na = 6% Przyklad Ii. Mieszanine 180 ml DMF w 180 ml bezwodnej pirydyny chlodzi sie do temperatury —20°C, a nastepnie dodaje mieszanine 18 ml dy¬ miacego kwasu siarkowego (65% SOj) i 16 ml ste¬ zonego kwasu siarkowego, przy czyim utrzymuje sie temperature nie przekraczajaca —15°C. Do otrzy¬ manej zawiesiny dodaje sie 15 g glikopeptydu otrzymanego z kazeiny mleka krowiego, suszy i roz. drabnia w mlynie kulowym podczas mieszania w temperaturze 20°C. Nastepnie temperature miesza¬ niny podwyzsza sie do 75aC i utrzymuje ja w ciagu 2,5 godz. Po czym mieszanie przerywa sie i mie¬ szanine utrzymuje sie w temperaturze 7ff*fc w cia¬ gu 90 minut. 6 Oleista mase odlozona na dnie naczynia reak¬ cyjnego oddziela sie od fazy górnej przez dekanta- cje. Dodanie 120 ml alkoholu metylowego powoduje wytracenie kleistego osadu, który przemywa sie naj- pierw metanolem, a nastepnie eterem etylowym, otrzymujac 23 g proszku koloru jasnobrazowego.Surowy produkt rozpuszcza sie w 250 ml wody de¬ stylowanej i oczyszcza w sposób analogiczny do opi¬ sanego w poprzednim przykladzie. io Otrzymuje sie 16 g proszku Koloru kosci slonio¬ wej o nastepujacym skladzie: Wilgotnosc = 5,45% S = 8,48% N = 6,96% P = 0,24% Heksozoaminy = 7,32% Heksozy = Tl,53% Proteiny = 47,15% Kwas N-acetyloneuraiminowy = 6,1% Lepkosc = 1,195 cP Wartosc pH -« 6 (1% w 0,5% NaCl) Na = 6,1% Przyklad III. Mieszanine 200 g bezwodnej pi¬ rydyny i 300 g metylosulfotlenku chlodzi sie do temperatury —20°C. Do mieszaniny wkrapla sie 50 ml kwasu chlorosuifonowego, przy czyim utrzymuje sie temperature nie przekraczajaca 20°C. Po doda- niu kwasu chlorosuifonowego mieszanine utrzymuje sie w temperaturze 20°C. Nastepnie do mieszaniny dodaje sie 15 g glikopeptydu wyekstrahowanego z mleka, który uprzednio osuszono i dokladnie roz¬ drobniono w mlynie kulowym.Po dodaniu glikopeptydu mieszanine ogrzewa sie do temperatury 85°C i utrzymuje sie ja w ciagu 4 godz. Nastepnie mieszanine pozostawia sie do od¬ stania w temperaturze pokojowej w ciagu 3 godz.Na dnie reaktora odklada sie zelatynowa przezro- 40 czysta masa, która oddziela sie od górnej fazy przez dekantacje. Dodanie 120 ml metanolu powoduje, ze z zelatynowej masy wytwarza sie produkt koloru kosci sloniowej, który rozpuszcza sie w 200 ml wo¬ dy destylowanej i poddaje oczyszczaniu w sposób *: analogiczny do opisanego w poprzednich przykla¬ dach.Ostatecznie otrzymuje sie 18 g proszku koloru bia¬ lego o nastepujacym skladzie (w odniesieniu do su¬ chego produktu): so S = 9,1% N « 6,7% . P = 0,2% Heksozaminy = 7,6% Heksozy = 11,2% 55 Kwas N-acetyloneuraminowy = 5,8% Lepkosc = 1,2 cP Wartosc pH = 6 Na = 6,3% 60 Przyklad IV. 100 g soli sodowej glikopeptydu wyekstrahowanego z mleka krowiego i sulfonowa¬ nej w sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dzie I rozpuszcza sie w 1000 ml wódy i wlewa do 1000 ml 0,3 M roztworu azotanu bizmutu w lodo- 65 watym kwasie octowym.94 775 7 Jezeli do otrzymanego roztworu doda sie 2000 ml metanolu wytraci aie osad. Osad zbiera sir? pi^.e^ odwirowanie i przemywa 3-krotnie za pomoca mie¬ szaniny metanol—kwas octowy 3:1, a nastepnie 3-ferotnie acetonem, otrzymujac 110 g proszku. Pro¬ szek suszy sie pod zmniejszonym cisnieniem i roz¬ puszcza sie w 15 objetosciaeh destylowanej wody.Do roztworu dodaje sie 1 N roztwór wodorotlenku sodu, az do wartosci pH 6,5. Po rozcienczeniu 1,5 objetosciami acetonu wytraca sie osad. Osad zbiera sie przez odwirowanie, przemywa 3-krotnie miesza- nLna ao£'-on : woda 2 :1 i 3-kro^nie acetonem. Kon¬ cowy produkt po osuszeniu pod zmniejszonym cis¬ nieniem daje 105 g produktu zawierajacego 7,8% S i 17,1% Bi.Przyklad V. Postepujac w sposób analogicz¬ ny do opisanego w przykladzie IV otrzymuje sie nastepujace sole sulfonowanego glikopeptydu: a) sól magnezowa sulfonowanego glikopeptydu.Analiza: Mg = 5,3 S = 9,l b) sól wapniowa sulfonowanego glikopeptydu.Analiza: Na = 5,6 S = 8,9 c) sól glinowa suflonowanego glikopeptydu.Analiza: Al = 8,6 S = 8,6 PL