NO751908L - - Google Patents

Description

"Fremgangsmåte for fremstil-

ling avBulfoglykopeptider"

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangeiåte for fremstilling av aulfoglykopeptider ved å gå ut fra glykopeptider ekstrahert fra melk eller tilsvarende kaaeiner. Ammonium- og metall-salter av de således oppnådde aulfoglykopeptider kan brukes som terapeutiske midler ved behandling av artroser og mavesår samt som arrhindrende og fibrinolytlike midler.

Ekstrahering av glykopeptider fra melk av forskjellige pattedyr eller fra de tilsvarande kaseiner er allerede velkjent. Det er også kjent en fremgangsmåte for fremstilling av sulfoglyko-peptlder ved å gå ut fra glykopeptider ekstrahert fra dyreorganer, særlig fra moge-slimhinnen eller tolvfingertarmen hos svin.

Oet er nå funnet at arbeidsbetingelsene som brukes for å fremstille de kjente sulfoglykopeptider ikke er effektive når de an-vendes for sulfonering av glykoproteiner ekstrahert fra melk eller kaseiner. Umuligheten av å overføre de arbeidsbetingelser som elk fektivt sulfonerer glykoproteiner ekstrahert fra dyreorganer, særlig fra mave-slimhinnen eller tolvfingertarmen hos svin, på fremgangsmåten f or sulfonering av glykolproteiner ekstrahert fra melk eller kaseiner, skyldes den forskjellige kjemiske sammensetning =v de to typer av glykolproteiner. Den kjemiske sammensetning av glykoproteiner oppnådd fra melk eller kaseiner er nemlig, i forhold til glykoproteiner ekstrahert fra dyreorganer,karakterisert vedet høyere forhold mellom aminosyre- og karbohydratinnholdet, samt ved enastørre mengde av fosforylerte aminosyrer og neuraminsyre.

Foreliggende oppfinnelse har derfor som formål å tilveie-bringe en fremgangsmåte for fremstilling av sulfoglykopeptider ved å gå ut fra glykopeptider ekstrahert fra melk eller kaaeiner, ved hvilken arbeidstrinnene er av en slik art at de svarer til de særlige egenskaper av disse glykopeptider.

Fremgangsmåten for sulfonering av glykopeptider ekstrahert fra melk- eller kaseiner Uoverensstemmelse med oppfinnelsen, omfatter følgende trinns

a) oppløsning av et glykopeptid ekstrahert fra melk oller kasein

i et aprotisk, ihke-aromatisk, vannblandbart løsningsmiddel, b) tilsetning til løsningen av a) av en tertiær bae©aom har et kokepunkt fra ca. 100°C til ce. 250°c, c) sulfonering av produktet av b) ved å bringe det i kontakt rød et eulf©nøringsmiddel valgt fra gruppen bestående av svovelsyre,

oleura, klorsulfonayre eller et addukt av svovelsyreanhydrid og en organisk forbindelse, til å begynne med ved on temperatur på

fra oa. -20°c til + 20°c, og deretter ved on temperatur fra ca.

60°C til ca. 90°C, og gjenvinning av det resulterende sulfonyl-glykopeptid. Glykopeptidet kan tilsettes, hvis Ønsket, etter tilsetningen av den tertiære base, elter til og med etter tilsetningen av sulfoneringsmiddelet, istedenfor i trinn a).

Det er nå funnet at selv om de optimale eulf oner ing sb<3-tingelsar, når det gjelder glykopeptider ekstrahert fra dyreorganer, oppnås fiår glykopaptidet er suspendert i et reaksjonamodium bestående av on høterocyklisk tertiær base på@n 3lik måte at sulfo-néBingsreaksjonon finner sted i en heterogen fase, oppnås de optimale sulfoneringsbetingeIser, når det gjelder sulfoglykopeptider ekstrahert fra melk eller kaseiner, når. glykopaptidet er fullsten-dig oppløst i en lØsningsmiddeJLfase bestående av en aprotisk, ikke-aromatisk, vannblandbar forbindelse og en tertiær base, fortrinnsvis en aromatisk base, som har et kokepunkt på fra ca. 1C0°Ctil 250°C

For å oppnå oppløsning av glykopeptidet ekstrahert fraQBlk eller kaseiner under betingelser som egner seg best for gjen-nomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er det fordelaktig å bruke i blanding med den tertiære base, som fortrinnsvis er en

heterooykllsk tertiær base valgt fra gruppen bestående av pyridin, metylpyridin, dimetylpyridin og kino lin, et aprotisk, ikke-aromatisk vannblandbart løsningsmiddel, så som f.eks. dimstylformamid, dimetylSulfoksyd, heksametylfosforamid, dimetylacetamid og lignende. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen skal nå beskrives de-taljert under henvisning til hoved-arbeidstrinnene.

Oppløsning

Glykopeptid ekstrahert fra melk eller kasein blir først grundig tørret og malt og deretter oppløst i et aprotisk, ikke-aromatisk, vann-blandbart løsningsmiddel, f.eks. dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, heksametylformamid, dlmetylacetamid og lignende. Den således oppnådde løsning tilsettes en tertiær base, fortrinnsvis en aromatisk base, som har et kokepunkt fra ca. 100°C til 250°C. Typiske tettlære heterocykliske baser omfatter pyridin, metylpyri-diner, etylpyridiner, dimetylpyridiner og kinolin. Det foretrekkes særlig vannfri pyridin.

Sulfonering

Passende sulfoneringsmidler omfatter svovelsyre, oleum, klorsulfonsyre og addukter av svovelsyreanhydrid med organiske for-bindelser, så som pyridin, dioksan og tertiære aminer (f.eks. tri-etylamin). Ilår man bruker oleum eller klorsulfonsyrer, kan det være fordelaktig å kombinere separat sulfoneringsmiddelet med den heterocykliske base, og bruke det resulterende addukt ved sulfoneringsreaksjonen.

Sulfonering«reaksjonen utføres ved å bringe den glykopeptid rholdige løsningsmiddel-blanding i kontakt med sulfoneringsmiddelet ved en begynnelseétemperatur mellom ca. -20°c og ca, +20°C, og deretter ved en høyere temperatur mellom ca. 60°c og ca. 90°C, fortrinnsvis ved ca. 80°c, i fra 4 til 8 og fortrinnsvis 5 timer. Mengden av sulfoneringsmiddelet er mellom ca. 400 og 600%, fortrinnsvis 500%, beregnet på vekten av glykopeptidet.

Ved slutten av sulfoneringsreaksjonen saoales sulfonatpro-duktet ved filtrering, og forurensningene fjernes med oppløsnings-fasen ved dialyse eller ved behandling med ionebytfeeharpikser.

Sulfoglykopeptid- salter

Des således oppnådde sulfoglykopeptid blir deretter om-dannet til det tilsvarende natrlumsalt med natriumhydroksyd, og natriumsaltet blir utfelt ved fortynning av dets vannløsninger mød passende løsningsmidler, så som aceton eller metanol.

Den samme arbeidsmåte kan generelt brukes for å omdanne sulfoglykopeptidet til tilsvarende salter med andre alkali-, jordalkali- og tungmetaller, eller til tilsvarende ammoniumsalter.

Disse salter kan oppnås fra det samme sulfoglykopeptld dannet ved sulfoneringsreaksjonen, ved hjelp av nøytralisering med alkali-, jordalkali eller ammoniumhydroksyd samt fra natriumsaltet ved dobbelt utvekslingsreaksjon med et jordalkalimetall- eller tungmetallsalt. Salter oppnådd ved,nøytralisering av sulfoglykopeptld med metallhydroksyd blir isolert ved behandling av deres vandige løsninger med et fellingsmiddel, så som aceton eller metanol. Det ér funnet at særlig gunstige resultater oppnås når det før utfellingen tilsettes en liten mengde av fra ca. 3 til ca. 7 vekt% basert på vekten av hydroksydet, av et acetat eller halogenid av det samme metall hvis hydroksyd brukes for nøytraliseringsreak-sjonen. Kationer som egner seg best for denne utførelsesform er kalium, litium, kalsium, barium, stronium og ammonium.

Den dobbelte utvekslingsreaksjon mellom sulfoglykopeptid-natriumsaltet og salter av andre metaller utføres i vandig løsning, idet anionet av vedkommende salt fortrinnsvis bestar av et acetat eller halogenid. Den dobbelte utvekslingsreaksjon kan utføres ved å perkoleré en vandig løsning av natriumsaltet av sulfoglykopeptid gjennom en søyle av sterk kationisk bytteharpiks som tidligere er blitt forsaltet med det metallkation hvis sulfoglykopep^idsalt ønskes fremstilt. Den perkolerte løsning blir deretter behandlet med et fellingsmiddel, så som aceton eller metanol, fortrinnsvis etter tilsetning av en mindre mengde av et acetat eller halogenid av det samme metall hvis salt ønskes erholdt. Særlig fordelaktig kan ved denne dobbelte utvekslingsreaksjon fremstilles salter av sulfoglykopeptld med følgende metallerssink, kalsium, barium, strontium, kobber, nikkel, kobolt, magnesium, vismut, gull og aluminium.

Z den følgende tabell angis endel analytiske verdier som er karakteristiske for natriumsalter av sulfoglykopeptld fremstilt som angitt ovenfor, svarende til materialer med laveste og høyeste sulfoneringøgradj

Fra farmakologisk synspunkt består .fordelene oppnådd ved sulfonering av glykopeptid ekstrahert fra keeein i tilstedeværelsen av nye raavesårhindrende, antipeptiske og utsondringshindrende egenskaper.

De farmakologiske resultater viste at oulfoglykopeptid-salter ifølge oppfinnelsen ikke var toksiske selv ved doser av

400 mg/kg endoperitonea.lt, og 1 g/kg oralt. Kår den ble admini-strert oralt ved dose på 40, 64, 102,4 og 163,8 mg Ag, bevirket sulfoglykopeptld'en hindring av mavesårgraden på '&i^^Mc^fc""a£p"(N.S.), ~ 0^~ §®7^ fWe~^&&©976%, ' Den antipeptiske aktivitet ble undersøkt både in vivo og in vito. De anvendte konsentrasjoner (fra 0,5 til 4 mg/ral) og de administrerte doser (fra 40 til 160 mg Ag) kunne sam-menlignes med dem som allerede er beskrevet for andre sulfonerte

makromolekyler (Lietti o.a.,Boll. Soc. It.Biol. Sper. 47.493, 1971). ■*■ -

Den utsondringshindrende aktivitet kunne påvises når man stimulerte oyreutsondringen ved hjelp av histamin og pantagastrih. De følgende, ikke begrensende eksempler illustrerer fremgangsmåten Ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

En blanding av 170 ml dimetylformamid (DMF) og 230 ml pyridin ble kjølt til -20°C. Til denne løsning ble tilsatt 60 ml kibrsulfonsyre idet man sørget for ikke å overskride en temperatur på -15°C. Under disse betingelser dannet det seg et addukt pyridin/ klorsulf onsyre. Tii denne addukthoIdige fase ble det under omrø-ring ved 20°c tilsatt 20 gram av glykopeptid ekstrahert fra melk som tidligere var grundig tørket og kulemalt. Etter at tilsetningen var fullført ble temperaturen hevet til 80 c og holdt ved 80°C i 3 timer. Opphetningen og omrøringen ble da avbrutt og man lot blandingen stå ved romtemperatur i 2 timer. Det dannet seg en gelmassé som ble Isolert ved dekahtering. Fra denne masse ble utfelt ved tilsetning av 150 ral metanol et gul-aktig pulver som ble samlet opp ved filtrering og oppløst i 250 ml vann. Den vandige løsning ble behandlet ned 200 ml av en kation-bytteharpiks ("Araberlite" (^R-120) • Etter 10 minutter ble harpiksen fjernet ved filtrering, og filtratet ble behandlet med 200 ml av anion-bytteharpiks ("Amberlite" XR-410). Også denne harpiks ble fjernet ved filtrering etter 10 minutter, og pB av filtratet ble inestilt til 12 ved hjelp av en^natriumhydroksyd-løsning og deretter tii 6,5 ved tilsetning av eddlksyre. Løsningen ble fordampet under nedsatt trykk til et volum av 200 ml og deretter behandlet med 4 gram av natriumjodid og fortynnet med 1,2 volumdeler aceton, hvorved man oppnådde utfelling. Utfellingen ble vasket med etanol inntil jodidioner forsvant, deretter med etyleter og til slutt tørket.

Det er samlet opp 19 gram av et alfenbenfarvet pulver som hadde følgende sammensetnings

Eksempel 2

Til en blanding av dimetylformamid (180 ml) og tørr pyridin (180 ml) kjølt til - 20°C i en reaksjonsbeholder ble tilsatt en blanding av 16 ml rykende svovelsyre (65% SO^) og 16 ml konsen-trert svovelsyre, idet man sørget for ikke å overskride -15°c. Til den således oppnådde suspensjon ble tilsatt 15 g av et glykopeptid oppnådd fra kumelk-kasein, grundig tørket og malt i en kulémølle, under omrøring ved 20°c. Etter at tilsetningen var fullført, ble temperaturen av blandingen hevet til 75°C og holdt ved denne verdi i 2,5 timer. Omrøringen ble deretter avbrutt og blandingen holdt ved 75°C i 90 minutter.

En oljeaktig masse avsatte seg på bunnen av reaksjonsbeholderen og ble separert ved dekantering. Tilsetning av©etyl-alkohol (120 ml) ga en klebrig utfelling som ble vasket tsad metanol, deretter med etyleter, hvilket ga 23 g av et lysebrunt pulver. Råproduktet ble oppløst i 250 ml destillert vann og renset som beskrevet i forangåeride eksempel.

Det ble oppnådd 16 g av et alfenbenfarvet pulver med føl-gende sammensetning i

Eksempel 3

Det ble fremstilt en blanding av 200 gram tørr pyridin og 300 g métylsulfokisyd kjølt til -20°C. Til denne blanding ble dråpa vis tilsatt 30 ml klorsulfonsyre, idet man sørget for ikke å overstige temperaturen 20°c. Etter avslutningen av tilsetningen av klor sulf onsyre ble temperaturen av blandingen brakt til 20°C. Deretter ble til blandingen tilsatt 15 gram glykopeptid ekstrahert fra melk og som var tidligere grundig tørket og til slutt malt i en kulemølle. Etter at glykopoptid-tilaetningen «ar avsluttet, ble temperaturen av blendingen hevet til 85°C og holdt ved denne verdi i 4 timer. Man lot blandingen stå ved romtemperatur i 3 timer. På bunnen av reaksjonsbeholderen avsatte det seg en klar, gelatinaktig masse som ble separert ved dekantering fra den overliggende fase. Tilsetning av 120 ml metanol til den gelatinaktigo masse bevirket dannelsen av et lyst elfenbenfaztoet pulver som ble oppløst i 200 ml destillert vann og utsatt f pr den samme rensning sprossas som 1 de forangående eksempler. Til slutt fikk man 18 gram av et hvitt pulver som hadde følgende sammensetning (basert på det tørre produkt) :

Eksempel 4 ''

100 g av natriumsaltet av glykopeptid ekstrahert fra kumelk og sulfonert som beskrevet i eksempel 1 ble oppløst i 1000 ml vann og hellet i 1000 ml av en 0,3 m løsning av vismutnitrat i is-eddik.

Oa 2000 ml av metanol ble tilsatt til løsningen, dannet

det seg en utfelling som ble oppsamlet ved sentrlfugering og vasket tre ganger ved triturering med en 3sl metanol-eddiksyre-blanding og deretter tre ganger med aceton, hvilket ga li<p>gram av et pulverfor-met produkt. Produktet ble tørket under vakuum og deretter oppløst i 15 wolumdeler destillert vann. En 1 n løsning av vandig natriumhydroksyd ble tilsatt til denne løsning for å Innstille dens pB til 6,5. Etter fortynning med 1,5 volumdelér aceton dannet det seg en utfelling.

Denne utfelling ble oppsamlet ved sentrifugering, vasket tre ganger med én 2tl aceton-vann blanding og deretter tre ganger med aceton. Sluttproduktet ble tørket under vakuum og ga 105 g av et produkt som hadde følgende prosentmengde av svovel og vismuts S «-7,8%:, • •;Bi:« 17,1%' -,'

Eksempel 5

Ved å arbeide analogt med metoden som er illustrert i eksempel 4, fikk man følgende salter av sulfonert glykopeptid»

aj magneslumsaltet av sulfonert glykopeptid

b) kalsiumsaltet av sulfonert glykopeptidi c) aluminiumsaltet av sulfonert glykopeptid

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av sulfoglykopeptider ved å gå ut fra glykopeptider ekstrahert fra melk eller kasein, k a-rakterlsert ved følgende trinn»

1) man tilveiebringer en blanding av a) et glykopeptid ekstrahert fra melk eller kasein, b) et aprotisk, ikke-aromatisk, vann-blandbart løsningsmiddel, c) en tertiær base med et kokepunkt fra ca. 100°C til ca. 250°C, d) et sulfonerlngsmiddel valgt fra gruppen bestående av svovelsyre, d oleum, klorsulfonsyre og et addukt av svovelsyreanhydrid og en organisk forbindelse, 2) holder begynnelsestemperaturen ved kontakten mellom glykopeptid r» sulfrwsering&^iddelat ved fra ca. -20°C.til4 ;2 <0> oC, 3) hever temperaturen til et område fra ca. 60°C til ca. 90°c og 4) utvinner det resulterende sulfoglykopeptld.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakter!-s er t ved at det aprotiske løsningsmiddel er dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, heksametylfosforamid eller imetylacetamid.

3.. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at den tertiære Bese er en heterocyklisk base valgt fra gruppen bestående av pyridin, metylpyridin, dimetylpyrldin og klnolin.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakter!-s er t ved at kontaktiden med sulfoneringsmiddelet i trinn 2) og 3) er fra ca. 4 til ca. 8 timer.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, k & r& k t e r i-s e r t ved følgende ytterligere trinns 5) man omsetter sulfoglykopeptidet av 4) med et hydroksyd valgt fra gruppen bestående av alkali-, jordalkalimetall- og ammoniumhydroksyd åox å omdanne sulfoglykopeptidet til dets tilsvarende alkali-, jord-alkalimetsTl eller ammoniumøalt» og

6) man bringer det resulterende produkt av 5) i kontakt med aceton eller metylalkohol for å utfelle nevnte salt.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at hydroksydet er natriumhydroksyd og sulfoglykopep-tidsnltet er natriumsaltet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at en vandig løsning av natriumsaltet perkoleroa gjennom en kation-bytteharpiks som har som kation et metall valgt fra gruppen bestående av sink, kalsium, barium, strontium, kobber, nikkel, kobolt, magnesium, vismut, gull og aluminium.