Sposób N-acylowania kwasu 6-aminopenicylanowego Przedmiotem wynalazku jest sposób N-acylowa¬ nia kwasu 6-aminopenicylanowego dla wytwarza¬ nia penicylin oraz ich nietoksycznych soli.Stosowanie reakcji N-acylowania kwasu 6-ami¬ nopenicylanowego w procesach wytwarzania peni¬ cylin i ich soli nie bylo dotychczas znane.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku zwiazki sa wartosciowymi srodkami przeciwbakteryjnymi, stanowia dodatki odzywcze do pasz zwierzecych, srodki do leczenia zapalenia gruczolu sutkowego (mastitis) u bydla, oraz sa srodkami leczniczymi stosowanymi dla drobiu i zwierzat, nie wylacza¬ jac czlowieka, w leczeniu chorób infekcyjnych po¬ chodzenia bakteryjnego.Nietoksyczne sole obejmuja nietoksyczne sole metali takich jak sód, potas, wapn, glin, sól amo¬ nowa i podstawione sole amonowe, na przyklad sole takich nietoksycznych amin jak trójalkiloami- ny, w tym trójetyloamine, prokaine, dwubenzylo- amine, N-benzylo-|3 fenetyloamine, 1-efenamine, N,N'-dwubenzyloetylenodwuamine, dehydroabiety- loamine, N,N'-bisdehydroabietyloetylenodwuamine oraz inne aminy, które stosowane byly do two¬ rzenia soli z benzylopenicylina.Przedmiotem wynalazku jest sposób N-acylowa¬ nia kwasu 6-aminopenicylanowego w wyniku któ¬ rego otrzymane penicyliny o duzym stopniu czy¬ stosci moga byc bezposrednio izolowane.Sposób N-acylowania kwasu 6-aminopenicylano¬ wego polega na tym, ze roztwór zawierajacy kwas 2 6-amimopenicylanowy lub sól, ester, amid, ewen¬ tualnie inna czynna pochodna poddaje sie reakcji ze stalym acylujacym polimerem, zasadniczo nie¬ rozpuszczalnym w tym roztworze i posiadajacym 5 powtarzajace sie grupy o wzorze —RCOB—, w którym RCO oznacza organiczny rodnik acylowy, zas B oznacza uaktywniony rodnik w polimerze, nastepnie oddziela sie z roztworu substancja stala i odzyskuje z niej pochodna N-acylowa lub jej io nietoksyczna sól.Polimery acylujace odpowiadaja wzorowi 1, w którym RCO i B maja znaczenia podane wyzej, A jest powtarzajacym sie fragmentem szkieletu syntetycznego polimeru lub czescia naturalnego 15 polimeru, który moze byc modyfikowany, zas n jest liczba calkowita. Acylujacy polimer moze byc otrzymany w wyniku reakcji odpowiedniego nie acylowanego polimeru z czynnikiem acylujacym sluzacym do wprowadzenia grupy RCO. Mozna sto- 20 sowac znane sposoby acylowania, zwlaszcza za po¬ moca halogenku kwasowego RCOX, w którym X jest chlorowcem, lub przez sprzezenie z kwasem RCOOH w obecnosci srodka kondensujacego ta¬ kiego jak karbodwuimid. Typowym nieacylowanym U polimerom odpowiadaja wzory: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. We wzorach tych A±—A^ sa powtarzajacy¬ mi sie fragmentami szkieletu polimeru, zas min sa liczbami calkowitymi. W trakcie acylowania po- 30 limeru grupa RCO wchodzi w odpowiednie poloze- 79 94579945 3 nie. Na przyklad u polimerów posiadajacych grupe o wzorze 26 rodnik OH przechodzi w RCOO—; u polimeru o wzorze 8 rodnik —N=C=N — rea¬ guje z acylujacym kwasem RCOOH dajac w re¬ zultacie grupe —NH.C(OOCR)=N—; u polimeru o wzorze 22 grupa p — COOH tworzy ze srodkiem acylujacym mieszany bezwodnik RCO.O.OC—.Mozna stosowac szereg polimerów, które moga byc usieciowane.Otrzymana po N-acylacji penicyline odzyskuje sie latwo w czystej postaci przez oddzielenie nie¬ rozpuszczalnego polimeru, nastepnie odparowanie roztworu, ekstrakcje lub liofilizacje, ewentualnie innym odpowiednim sposobem dajacym substancje stala, a jezeli jest to potrzebne, mozna penicyline odzyskiwac w postaci nietoksycznej soli.Sposób ten jest odpowiedni zarówno dla metody periodycznej jak i ciaglej i w tym ostatnim przy¬ padku, oddzielanie roztworu zawierajacego penicy¬ line zachodzi latwo, jezeli polimer acylujacy zo¬ stal uzyty w postaci kolumny. Kwas 6-aminopeni- cylanowy lub sól albo jego czynna pochodna prze¬ puszcza sie w roztworze przez kolumne wypelnio¬ na acylujacym polimerem, zas przebieg reakcji moze byc sledzony za pomoca potencjometryczne- go miareczkowania, na przyklad stosujac w zwy¬ kly sposób elektrode szklana i kalomelowa. Do re¬ akcji N-acylacji mozna stosowac rozpuszczalniki wodne i bezwodne, na przyklad dwumetyloforma- mid lub acetonitryl.Nastepujace przyklady od I—IV opisuja sposób przygotowania odpowiednich polimerów acyluja- cych, zas przyklady V—VIII wyjasniaja wynala¬ zek.Przyklad I. 5,4 g kwasu fenylooctowego (40 mM) w 20 ml acetonitrylu dodawano do zawie¬ siny 4 g poli-4-hydroksy-3-nitrostyrenu usieciowa- nego za pomoca 4% wagowo, dwuwinylobenzenu (zawierajacego 5,9 mM grup hydroksylowych na 1 g) w 50 ml acetonitrylu. Mieszanine reakcyjna poddawano mieszaniu w ciagu 10 minut w tempe¬ raturze 0°C, równoczesnie dodajac roztwór zawie¬ rajacy 8,4 g (40 mM) N,N'-dwucykloheksylokarbo- dwuimidu w 20 ml acetonitrylu. Mieszanine reak¬ cyjna mieszano przez 1 godzine w temperaturze 0°C, a nastepnie przez dalsze 5 godzin w tempera¬ turze pokojowej. Polimer fenyloacetylowy odsaczo¬ no, ogrzewano do wrzenia z metanolem dla usu¬ niecia produktu ubocznego N,N'-dwucykloheksylo- -mocznika i przemywano eterem. Po wysuszeniu w prózni otrzymano 8,5 g poliestru, który zawieral 3,5 mola pozostalosci fenyloacetylowych na 1 gram.Przyklad II. 4,6 g chlorku a-fenoksypropio- nylu (25 mM) dodawano do zawiesiny 5 g poli-4- -hydroksy-3-nitrostyrenu usieciowanego za pomo¬ ca 4% wagowo dwuwinylobenzenu w 50 ml aceto¬ nitrylu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 10 minut w temperaturze 0°C dodajac do niej 2,8 ml pirydyny (30 mM). Mieszanie kontynuowano przez cala noc w temperaturze 4°C, po czym odsa¬ czono utworzony polimer a-fenoksypropionylowy, przemywano 0,5 n kwasem siarkowym, woda, me¬ tanolem i eterem. Po wysuszeniu pod zmniejszo¬ nym cisnieniem otrzymano 5,7 g poliestru, który 4 zawieral 1 mM reszt a-fenoksypropionylowych na 1 gram.Przyklad III. Powtarzajac sposób wedlug przykladu I lub przykladu II otrzymuje sie inne poliacylowane polimery odpowiadajace wzorowi ogólnemu RCOB, które zostaly zestawione w ta¬ beli 1.Nr 1 2 2 3 2 4 5 6 7 Polimer PNP PNP PNP PNP PNP PNP PNP NHS NHS Grupa RCO fenyloacetylowa 3-(2-chlorofenylo) -5- -metylo-4-izoksazoli- lokarbonylowa »» 2,6-dwumetoksyben- zoilowa 3-(2-chlorofenylo) -5- -metylo-4-izoksazoli- lokarbonylowa ienylomalonylowa a-fenoksypropionylo- wa fenyloacetylowa 2,6-dwumetoksyben- | | |zoilowa Metoda wedlug przykladu 1 1 2 1 2 1 2 1 1 Wiazace mM/g 3 2 1,6 1,6 1,6 1,1 1 2,3 1,7 PNP = poli-4-hydroksy-3-nitrostyren usieciowany 30 za pomoca 4% wagowo dwuwinylobenzenu NHS = kopolimer imidu kwasu N-hydroksyburszty- nowego i etylenu Przyklad IV. 0,5 g (3,55 mM) imidu kwasu poli-N-hydroksybursztynowego rozpuszczono w 30 35 ml dwumetyloformamidu ogrzewajac do tempera¬ tury 50°—60°C w ciagu 15—30 minut. Nastepnie do¬ dawano roztwór 1 g (okolo 3,5 M) kwasu D (-)- -a-N-karbobenzoksyaminofenylooctowego w 5 ml dwumetyloformamidu, po czym roztwór 825 mg 40 (mM) dwuimidu kwasu N,N-dwucykloheksylokar- boksylowego w 5 ml dwumetyloformamidu. Miesza¬ nine mieszano w temperaturze pokojowej w ciagu 12 godzin, przesaczono i przesacz wlano do 10 obje¬ tosci etanolu. Wytracony produkt staly oddzielono 49 przez wirowanie, przemyto dwukrotnie etanolem przez dekantacje i suszono pod zmniejszonym ci¬ snieniem w temperaturze pokojowej. Wydajnosc wynosila 0,85 g polimeru, który zawieral 2,1 mM reszt a-N-karbobenzoksyamino-fenyloacetylowych 50 na 1 gram. Nastepnie 0,25 g tego polimeru w 3 ml kwasu octowego lodowatego zadano 3 ml 48% bro- mowodoru w kwasie octowym, mieszano przez 90 minut w temperaturze pokojowej, po czym oddzie¬ lono polimer, przemywano go kolejno kwasem oc- 55 towym lodowatym, izopropanolem i eterem i znów suszono pod zmniejszonym cisnieniem otrzymujac 0,2 g polimeru zawierajacego reszty a-aminofeny- loacetylowe. Zawartosc bromowodoru w zywicy, oznaczona metoda Volharda, wynosila 2,3 mM na 60 1 gram.Przyklad V. 60 mg (0,25 mM) soli potasowej kwasu 6-aminopenicylanowego dodawano do 4,5 ml zawiesiny zawierajacej dwumetyloformamid oraz polimer nr 1, podany w tabeli 1, w ilosci odpowia- 65 dajacej 1 molowi reszty fenyloacetylowej. Miesza-5 79945 6 nine reakcyjna mieszano w ciagu 1 godziny w tem¬ peraturze pokojowej, po czym polimer usunieto przez odwirowanie, dwukrotnie przemyto dwumety- loformamidem, zawierajacym 10% wody, a nastep¬ nie polaczono przesacz z przemywkami. Polaczone roztwory odparowywano pod zmniejszonym cisnie¬ niem, zas pozostalosc rozpuszczono w octanie ety¬ lu. Otrzymany roztwór przemywano 0,01 n kwasem solnym i woda, nastepnie osuszono bezwodnym siarczanem sodowym (Na2S04), przesaczono i roz¬ puszczalnik usunieto przez odparowanie pod zmniej¬ szonym cisnieniem. Wydajnosc benzylopenicyliny oznaczona jodometrycznie, analize na zawartosc siarki oraz metoda biologiczna odpowiadala do 92% wydajnosci teoretycznej.Przeprowadzenie benzylopenicyliny w sól potaso¬ wa nastepuje przez dodanie równowaznej ilosci wodnego roztworu kwasnego weglanu potasu, po czym otrzymany produkt poddaje sie liofilizacji.Przyklad VI. Postepujac wedlug przykladuV i stosujac poliacylowane polimery, podane w tabeli 1, otrzymano penicyliny wymienione w tabeli 2.Tabela 2 Poliacylowany polimer z tabeli 1, uzyty Jako srodek acylujacy Nr 1 6 3 2 5 4 Produkt rruuiui benzylopenicylina benzylopenicylinaj 2,6-dwumetoksyfenylo- penicylina 3-(2-chlorofenylo)-5-me- tylo-4-izoksazolilopeni- cylina a-fenoksyetylopenicyji- na a-karboksybenzylopeni- cylina Wydajnosc % 90—98 51 76 50—70 95 100 | Przyklad VII. Kolumne o srednicy 1 cm na¬ pelniono do wysokosci 10 cm, w przyblizeniu 4 g poliacylowanego polimeru nr 1 z tabeli 1, zawiera¬ jacego okolo 8 mM reszty fenyloacetylowej i poste¬ powano w sposób nastepujacy. Wymieniony poli¬ mer zawieszono w dwumetyloformamidzie, zawie¬ rajacym 10% wody i wprowadzono do kolumny, pozostawiajac czastki do osadzenia. Roztwór zawie- 5 rajacy 0,5 mM soli potasowej kwasu 6-aminopeni- cylanowego w 10 ml dwumetyloformamidu prze¬ puszczano dwukrotnie przez kolumne w ciagu okolo 2,5 godzin. Wydajnosc zebranie benzylopenicyliny z dolnej czesci kolumny wynosila 98%'.Przyklad VIII. Polimer przygotowany, jak opisano w przykladzie IV, zawieszono w dwume¬ tyloformamidzie i dodano oziebiony roztwór kwasu 6-aminopenicylanowego w wodnym roztworze kwa¬ snego weglanu potasowego tak, aby zawartosc wo¬ dy w koncowej mieszaninie wynosila 15% wago¬ wych, a stosunek molarny uaktywnionych reszt a-aminofenyloacetylowych do kwasu 6-aminopeni¬ cylanowego wynosil 4:1. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 2 godzin w temperaturze poko¬ jowej. Nastepnie calosc mieszaniny reakcyjnej zmieszano z buforem cytrynianowym o wartosci pH = 2,2 i roztwór badano w analizatorze amino¬ kwasów (Beckman Model 120C) stosujac bufor cy- trynianowy o wartosci pH = 4,26 jako eluent dla okreslenia zawartosci D(-)-a-aminobenzylopenicyli- ny. PL PL