PL79336B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania bacytracyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bacytracyny na drodze fermentacji glebinowej.Bacytracyna jest antybiotykiem wytwarzanym przez tlenowe laseczki przetrwalnikujace, nalezace do ro¬ dzaju Bacillus. Antybiotyk ten nie jest zwiazkiem jednorodnym, lecz jest mieszanina polipeptydów o podobnej budowie chemicznej. Po raz pierwszy zostal opisany w 1945 r w Science 102 376 (1945) przez Johnson, Ankera i Meleneya. Bacytracyna wywiera hamujace dzialanie przede wszystkim na drobnoustroje Gram-dodatnie nie dziala na drobnoustroje Gram-ujemne z wyjatkiem Neisseria gonorrhoeae i Neisseria meningitidis.Bacytracyna znalazla niewielkie zastosowanie w medycynie ludzkiej i weterynaryjnej, przede wszystkim wleczeniu miejscowym. Szerokie natomiast zastosowanie antybiotyk ten znalazl w zywieniu zwierzat jako do¬ datek do pasz. Mala ilosc bacytracyny dodana do paszy dla drobiu, trzody chlewnej i rogacizny zwieksza wydatnie szybkosc przyrostu wagi zwierzat i powoduje lepsze wykorzystanie paszy przez organizm zwierzecy.Znane sa sposoby wytwarzania bacytracyny przy uzyciu szczepów Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis, wytwarzajacych w pozywkach produkcyjnych duza liczbe przetrwalników (endospor). Przetrwalniki bakteryjne odznaczaja sie wyjatkowa opornoscia na czyrtniki fizyko-chemiczne. Sa one najbardziej wytrzymalymi na pod¬ wyzszona temperature ukladami zywymi, znoszacymi temperatury powyzej 100°C. W przypadku wytwarzania paszowych preparatów bacytracyny, które otrzymuje sie przez suszenie calej objetosci hodowli w suszarce rozpylowej, znaczna czesc zywych przetrwalników pozostaje w preparatach antybiotyku. Zastosowanie w pro¬ cesie suszenia temperatur powodujacych zabicie form cieploopornych szczepu produkcyjnego jest niewskazane ze wzgledu na termolabilnosc biologicznie czynnej substancji. Wynika stad potrzeba stosowania dodatkowych kosztownych operacji takich, jak naswietlanie promieniami y, celem zabicia duzej liczby form przetrwalnych szczepu produkcyjnego, wystepujacych w przygotowywanym preparacie paszowym.Produkcja bacytracyny przy uzyciu obecnie stosowanych szczepów stwarza warunki do zwiekszenia w po¬ mieszczeniach zakladu produkcyjnego zawartosci przetrwalników bakteryjnych, które sa glównym i potencjal¬ nym zródlem przypadkowych zakazen w przymysle, opartym na biosyntezie. Omawiane zagadnienie nabiera szczególnego znaczenia w przypadku zakladów produkcyjnych, prowadzacych równolegle kilka procesów mikro-2 79336 biologicznych. Czestosc bowiem przypadkowych zakazen zalezy w duzym stopniu od liczby przetrwalników bakteryjnych, znajdujacych sie w pomieszczeniach produkcyjnych. Z reguly pozywki produkcyjne i hodowle produkcyjne, zakazone obca mikroflora, wykazuja niskie aktywnosci i nie nadaja sie do dalszego przerobu, co powoduje duze straty finansowe.Sposobem wedlug wynalazku usuwa sie powyzsze wady przez zastosowanie do produkcji bacytracyny szczepów o uposledzonej zdolnosci sporuiacji.Wedlug pismiennictwa naukowego biosynteza bacytracyny wystepuje po zakonczeniu fazy logarytmicznej wzrostu drobnoustroju,! jest scisle zwiazana z procesem sporuiacji (R.W. Bernlohr, G.D. Novelli: Arch. Bio- chem.Biophys. (1960187 232; R.W. Bernlohr G.D. Novelli: Arch. Biochem. Biophys., (1963), 103 9; G. Balassa, H. Ionesco, P.Schaeffer:Cómpt. Rend. (1963), 267,966).Obecnie stwierdzono, ze bacytracyne mozna wytwarzac przy uzyciu mutantów niezdolnych do tworzenia endoepor, czyli mutantów asporogennych, lub mutantów oligosporogennych o wybitnie ograniczonej zdolnosci sporuiacji. Celem otrzymania takich szczepów poddaje sie komórki drobnoustrojów, wytwarzajacych bacytra- cyne, dzialaniu znanych czynników mutagennych fizycznych i chemicznych.W hodowlach mutantów asporogennych z reguly nie stwierdza sie w ogóle form cieploopornych. Pojawia- nie sie w takich hodowlach malej liczby przetrwalników jest zwiazana z rzadko wystepujacym zjawiskiem mu¬ tacji powrotnej. Wsród mutantów oligosporogennych, charakteryzujacych sie zmniejszona zdolnoscia sporuiacji, spotyka sie takie, które wytwarzaja w 1 ml hodowli 10 lub nawet 100 000 000 razy mniej form cieploopornych w porównaniu ze szczepem wyjsciowym. Czestosc tworzenia endospor u kazdego mutanta oligosporogennego jest cecha stala, która przekazywana jest komórkom potomnym.Paszowe preparaty bacytracyny otrzymywane w hodowli mutantów asporogennych i szczepów o wybitnie uposledzonej zdolnosci sporuiacji praktycznie nie zawieraja form cieploopornych szczepu produkcyjnego. Nalezy nadmienic , ze w preparatach paszowych zazwyczaj wykrywa sie mala liczbe drobnoustrojów, poniewaz niektóre etapy produkcyjne, np. suszenie hodowli w suszarce rozpylowej, przeprowadza sie w warunkach niejalowych.Szczepy stosowane do wytwarzania bacytracyny sposobem wedlug wynalazku wykazuja istotne róznice morfologiczne, hodowlane i fizjologiczne w odniesieniu do szczepów wyjsciowych. Wystepujace róznice miedzy omawianymi szczepami wynikaja z tabel 1,2 i 3. Róznice te dotycza zdolnosci tworzenia endospor, redukcji azotanów do azotynów, koagulacji i peptonizecji mleka, typu i intensywnosci wzrostu na róznych podlozach, uplynniania zelatyny oraz wytwarzania kwasu z weglowodanów i alkoholi. Wykazane róznice sa tak znamienne, ze z punktu widzenia zasad obecnej taksonomii bakterii, bez uwzglednienia kryteriów ekologicznych, otrzymane przez nas szczepy moznaby uznac nie tylko za nowe gatunki, ale nawet za odrebna grupe taksonomiczna.Dodatkowa zaleta otrzymywanych szczepów o uposledzonej zdolnosci sporuiacji jest wytwarzanie duzych ilosci bacytracyny na prostych i tanich pozywkach. Otrzymane przez nas mutanty wykazuja w hodowli na trzesawce obrotowej aktywnosc rzedu 400 j/ml (okolo 8000mcg/ml) bacytracyny. Aktywnosc ta jest znacznie wyzsza w porównaniu z aktywnosciami (325 j/ml) notowanymi np. w opisie patentowym St. Zjedn. Ameryki 2.828.246.Hodowle mutantów asporogennych i oligosporogennych, wykazujace wysokie stezenia bacytracyny, sa dogodnym materialem wyjsciowym nie tylko do otrzymywania preparatów bacytracyny dla celów paszowych, lecz równiez preparatów bacytracyny dla celów leczniczych.Szczepy o uposledzonej zdolnosci sporuiacji wykazuja stabilnosc pod wzgledem cechy wytwarzania bacy¬ tracyny. Kilkakrotne pasazowanie na podlozu agarowym i przechowywanie hodowli agarowej w ciagu kilku .tygodni w temperaturze 2-4°C, jak równiez przechowywanie szczepów w postaci zliofilizowanej, nie wplywalo na obnizenie aktywnosci antybiotycznej. Omawiane szczepy mozna liofilizowac w nastepujacych zawieszal- nikach: 20% inaktywowana surowica koriska, mleko odtluszczone i roztwór, zawierajacy 10% sacharozy i 1% zelatyny.Szczepy o uposledzonej zdolnosci sporuiacji mozna rozmnazac na podlozu agarowym, zawierajacym rózne zródla azotu (pepton, wyciag miesny, wyciag slodowy i inne wyciagi roslinne i zwierzece). Zródlem wegla moga byc cukry proste lub wielocukry. Ponadto agarowe podloze moze zawierac dodatki soli mineralnych i soli kwasów organicznych oraz mikroelementy.Sposobem wedlug wynalazku proces biosyntezy bacytracyny prowadzi sie przy uzyciu szczepów z rodzaju Bacillus niezdolnych do tworzenia endospor lub szczepów o wybitnie ograniczonej zdolnosci sporuiacji, w tem¬ peraturze ponizej 42°C, korzystnie w temperaturze 33-35°C. na odpowiednich pozywkach zawierajacych przyswajalne zródla azotu i wegla pochodzenia roslinnego i/lub zwierzecego oraz sole mineralne i sole kwasów organicznych, przy równoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu w czasie potrzebnym do wytworzenia antybiotyku w hodowli, z której otrzymuje sie znanymi metodami preparaty bacytracyny dla celów paszowych i leczniczych.3 79336 W pozywkach plynnych jako zródlo azotu stosuje sie odtluszczona make sojowa, wyciagi i hydrolizaty z maki sojowej, maka z nasion slonecznikowych, make z orzeszków ziemnych, make rybna, drozdze, wyciag drozdzowy, wyciag namokowy kukurydzy i/lub siarczan amonowy i azotany.Jako zródlo wegla stosuje sie korzystnie rozpuszczalne i nierozpuszczalne weglowodany, np. glukoze techniczna, sacharoze i inne cukry proste lub ich mieszaniny, skrobie, make ziemniaczana, make kukurydziana lub ich mieszaniny z wymienionymi uprzednio cukrami prostymi.Ponadto pozywki produkcyjne wzbogaca sie róznymi solami mineralnymi i solami kwasów organicznych takich, jak kwas mlekowy, kwas glukonowy, lub kwas octowy, oraz mikroelementami.Wyjsciowym materialem szczepiennym dla pozywek plynnych sa hodowle na agarze skosnym lub liofiliza- ty szczepów. Proces wytwarzania bacytracyny prowadzi sie na plynnych pozywkach w temperaturze ponizej 42°C przy równoczesnym mieszaniu i napowietrzaniu w aparaturze powszechnie stosowanej w przemysle fermen¬ tacyjnym.Przyklad I. Fermentacje prowadzi sie w.trzech stadiach.Stadium posiewowe I. Kolby Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml, zawierajace 30 ml pozywki posiewowej nr 1 lub nr 2 o skladzie nizej podanym: Pozywka posiewowa nr 1 Maka sojowa odtluszczona 2,0% Makaziemniaczana 1,5% CaC03 0,5% (NH4)2S04 0,2% MgS04-7H20 0,3% MnS04-5H20 0,01% Woda wodociagowado 100% Sterylizacja: 117°C w ciagu 25 minut. Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,7.Pozywka posiewowa nr 2 Maka sojowa odtluszczona 2,0% Drozdze browarnicze(suszone) 0,2% Makaziemniaczana 1,5% CaC03 0,5% MgS04-7H20 0,33% (NH4)2S04 0,2% MnS04»5H20 0,01% Woda wodociagowado 100% Sterylizacja, jak wyzej. Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,8.Zaszczepiono komórkami szczepu o uposledzonej zdolnosci sporulacji, zebranymi oczkiem, czy z dwudnio¬ wej hodowli na agarze skosnym i wstawiono na trzesawke obrotowa o 240 obr/min. Inkubowano 24 godziny w temperaturze 33°C. Otrzymana hodowla sluzyla jako inoculum dla stadium II.Stadium posiewowe II. Do kolb Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml, zawierajacych po 30 ml pozywki posie¬ wowej nr 1 lub nr 2, dodano po 0,2 ml hodowli stadium I. inkubowano w temperaturze 33°C na trzesawce obrotowej o 240 obr/min w ciagu 18 godzin.Stadium produkcyjne. Do kolb Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml, zawierajacych 30 ml pozywki produk¬ cyjnej o skladzie nizej podanym: Pozywka produkcyjna Maka sojowa odtluszczona 4,5% Makaziemniaczana 2,0% Kwas mlekowy spozywczy 1,2% CaC03 0,4% MgS04-7H20 0,1% MnS04*5H20 0,01% KH2P04 0,01% (NH4)2S04 0,2% Woda wodociagowado 100% (Sterylizacja: 117°C w ciagu 30 minut. Po sterylizacji wartosc pH wynosila 6,7). - dodano hodowle stadium 11 w ilosci 1% w stosunku do objetosci pozywki.Fermentacje prowadzono w temperaturze 33°C na trzesawce obrotowej o 240 obr/min. Po zakonczeniu fermentacji, co nastapilo po uplywie 38 godzin, plyny fermentacyjne wykazywaly aktywnosc 408 j/ml.73336 4* Przykladll. Stadium I. Kofby Erlenmeyera o pojemnosci 500 ml, zawierajace po 30 ml plywki po* siewowi] nr 1 lub nr 2, zaszczepiono zltofilizowana zawiesina szczepu (przed liofilizacja: 0,2 mi zawiesiny zaw*& rajacej 10* komórek (ml) i inkubowano w temperaturze 33°C w ciagu 24 godzin. Otrzymana hodowle uzyto jako inoculum do stadium posiewowego i I.Hodowle stadium II i stadium produkcyjnego przeprowadzono w sposób podany w przykladzie I. Po 37 godzinach fermentacji aktywnosc plynów fermentacyjnych wynosila 384 j/ml bacytracyny. PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania bacytracyny na drodze fermentacji gl$birx vej przy uzyciu szczepów z rodzaju Bacil- lus, znamienny tym, ze proces biosyntezy prowadzi sie przy uzyciu szczepów, niezdolnych do tworzenia endo- spor lub o wybitnie ograniczonej zdolnosci sporulacji, w temperaturze ponizej 42°C, korzystnie w temperaturze 33-35°C, na plynnych pozywkach, zawierajacych przyswajalne zródla azotu i wegla pochodzenia roslinnego i/lub zwierzecego oraz sole mineralne i sole kwasów organicznych, przy równoczesnym mieszaniu i napowietrza¬ nia w czasie potrzebnym do wytworzenia antybiotyku w hodowli, z której otrzymuje sie znanymi metodami produkt dla celów paszowych i leczniczych.79336 5 Tabela 1 Porównanie wlasciwosci wyjsciowego uczepu Bacillus Jichenifprmis i pochodnego mutanta U3-3793 Podloze _ Bulion zwykly Bulion zawierajacy 7%NaCI Bulion z glukoza Agar z glukoza Agar sojowy Agar Simmonsa z cytrynianem Woda peptonowa Mleko Slupek zelatynowy Podloze azotanowe Podloze Voges- Proskauera Cecha - Ksztalt Barwienie Endospory typ wzrostu wzrost wzrost w warunkach beztlenowych wzrost wzrost wykorzystywanie cytrynianu wzrost wytwarzanie indolu koagulacja s peptonizacja uplynnianie redukcja N03-»N02 wytwarzanie acetoiny Bacillus licheniformis ~ 3 Laseczki wystepujace pojedynczo, w parach lub krótkich lancuszkach. Konce komórek zaokraglone Gramo-dodatnie wytwarza elipsoidalne endospory, ulozone central¬ nie lub paracentralnie rosnie w postaci kozuszka na powierzchni bulionu rosnie w postaci kozuszka na powierzchni bulionu dobry obfity, pomarszczony, o zabarwieniu bezowym obfity, o zabarwieniu bezowym wykorzystuje (+ ++) rosnie w postaci kozuszka nie wytwarza koaguluje i peptonizuje uplynnia redukuje wytwarza Mutant U3-3793 _ Laseczki wystepujace pojedynczo, w parach lub - krótkich lancuszkach. Konce komórek zaokraglone Gramo-dodatnie nie wytwarza wzrost dyfuzyjny wzrost dyfuzyjny nieznaczny slaby przezroczysty slaby przezroczysty + - wzrost dyfuzyjny nie wytwarza nie koaguluje i nie peptonizuje nie uplynnia redukuje +•' — Objasnienie: = watpliwe79336 Tabela 2 Porównanie wlasciwosci wyjsciowego szczepu Bacillus subtilis i dwóch pochodnych mutantów Podloze . 1 ~ Bulion zwykly Cecha 2 Ksztalt Barwienie Endospory wzrost Bulion zawierajacy 7%NaCI Bulion z glukoza Agar z glukoza Agar sojowy Agar Simmonsa z cytrynianem wzrost i wzrost w warun¬ kach beztleno¬ wych wzrost wzrost Baciilus subtilis 3 laseczki wystepuja¬ ce pojedynczo, w parach, lub krót¬ kich lancuszkach. Konce komórek za¬ okraglone Gramo-dodatnie wytwarza elipsoi¬ dalne endospory. ulozone central¬ nie lub paracentralnie rosnie w postaci kozuszka mi po¬ wierzchni bulionu kozuszka na po¬ wierzchni bulionu nieznaczny obfity, pomarszczo¬ ny, o zabarwieniu bezowym obfity, o zabar¬ wieniu bezowym wykorzystywanie wykorzystuje cytrynianu Woda peptonowa wzrost Mleko Slupek zelaty¬ nowy Podloze azota¬ nowe Podloze wytwarzanie indolu koagulacja i peptonizacja uplynnianie redukcja N03-N02 wytwarzanie Voges-Proskaueraacetoiny rosnie w postaci kozucha nie*wytwarza koaguluje i pepto- nizuje uplynnia redukuje wytwarza Mutant Ip 120742 4 laseczki wystepuja¬ ce pojedynczo, w parach lub krót¬ kich lancuszkach. Konce komórek za¬ okraglone Gramo-dodatnie endospory elipsoli- dalne, ulozone centralnie lub pa¬ racentralnie. Wytwarza okolo 20000000 razy mniej w porównaniu ze szczepem wyjsciowym wzrost dyfuzyjny rosnie w postaci wzrost dyfuzyjny dosc dobry dosc dobry, bezbarwny dosc dobry, przezroczysty wykorzystuje wzrost dyfuzyjny nie wytwarza nie koaguluje i niepeptonizuje uplynnia nie redukuje wytwarza Mutant NG 120769 5 laseczki wystepuja¬ ce pojedynczo, w parach lub krót¬ kich lancuszkach. Konce komórek za¬ okraglone Gramo-dodatnie nie wytwarza wzrost dyfuzyjny wzrost dyfuzyjny nie rosnie slaby, przezro¬ czysty slaby, przezro¬ czysty wykorzystuje wzrost dyfuzyjny nie wytwarza nie koaguluje i nie peptonizuje nie uplynnia redukuje wytwarza79336 Tabe la 3 Wytwarzanie gazu i kwasu z weglowodanów i alkoholi przez badane szczepy Weglowodan Bacillus Bacillus Mutant Mutant Mutant lub alkohol subtilis licheni- Ip 120742 NG120769 U3-3793 formis kwas + + + + Arabinoza gaz — - — — — kwas ++ ++ ++ ++ ++ Glukoza gaz — kwas — Laktoza ^ gaz — kwas ± Mannttol gaz — kwas — Ksyloza gaz — kwas ++ Sacharoza gaz — kwas — SorbitoJ gaz _ kwas — Ramnoza gaz — ++ ++ ++ ++ Objasnienie: Znak + oznacza intensywnosc wytwarzania znak — oznacza brak wytwarzania PL