PL63864B1 - - Google Patents

Description

05.VI.1967 Niemiecka Republika Demokratyczna Opublikowano: 10.XII.1971 63864 KI. 6 a, 22/10 MKP C 07 g, 7/00 UKD Wspóltwórcy wynalazku: Dietmar Schopfel, Johann Huber Wlasciciel patentu: Forschungsinstitut fiir die Garungsindustrie, Enzymo- logie und technische Mikrobiologie, Berlin (Niemiec¬ ka Republika Demokratyczna) Sposób wytwarzania suchych preparatów proteinowo-enzymatycznych Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza- nia suchych preparatów proteinowo-enzymatycz¬ nych o malej zawartosci soli z osadu otrzymanego przez wytracanie enzymów i bialek z cieczy pow¬ stajacych po hodowli mikroorganizmów oraz z wy¬ ciagów pochodzenia roslinnego lub zwierzecego.Wiadomo, ze substancje bialkowe mozna wydzie¬ lac ze srodowiska wodnego w postaci ich nieroz¬ puszczalnych w wodzie zwiazków z tanina.W znanych metodach zwiazki te oczyszcza sie od soli nieorganicznych przez traktowanie woda, a na¬ stepnie ekstrahuje sie enzym mieszaninami wody z rozpuszczalnikiem organicznym. Znana jest takze metoda oddzielania za pomoca ligniny i/lub kwa¬ sów garbnikowych amyloglikozydazy od enzymów utrudniajacych rozszczepienie skrobii. Z szwajcar¬ skiego opisu patentowego nr 412744 i brytyjskiego opisu patentowego nr 969936 znany jest sposób wy¬ tracania enzymów garbnikami naturalnymi, na przyklad tanina, polegajacy na stracaniu garbni¬ kiem enzymu i nastepnie na ekstrahowaniu wyzej podanymi rozpuszczalnikami.Stwierdzono, ze suche preparaty proteinowo-en- zymatyczne o malej zawartosci sold otrzymuje sie ze znacznie lepsza wydajnoscia i o lepszej jakosci, jezeli do wytracania enzymów i bialek zawartych w cieczach póhodowianych, powstajacych w wyniku hodowli mikroorganizmów, na przyklad bakterii lub plesni, albo w wyciagach z tkanek roslinnych lub zwierzecych, jako substancje o charakterze garbni- 10 20 25 30 ków stosuje sie garbniki syntetyczne, tak zwane syntany, o wzorze ogólnym podanym na rysunku, w którym Y oznacza grupe wodorotlenowa lub ami¬ nowa, X oznacza grupe -^SOg—, -hSO—, —S02.NH—, —NH— i/lub grupe o wzorze -^C/R*/—, w którym R oznacza atom wodoru lufo rodnik metylowy, n oznacza zero lufo liczbe calkowita 1—3, o oznacza liczbe calkowita 1—3, p oznacza zero lub liczbe 1, a m oznacza liczbe równa co najmniej 3, przy czym jeden z obu pierscieni benzenowych tego zwiazku jest bezposrednio lub poprzez grupe —OH*— pod¬ stawiony grupa sulfonowa.Z otrzymanego osadu ekstrahuje sie nastepmie so¬ le nieorganiczne i substancje garbnikowe, po czym osad suszy sie, otrzymujac gotowy preparat.Jak wiadomo, budowa syntanów rózni sie znacz¬ nie od budowy naturalnych garbników, na przy¬ klad taniny, totez nie mozna bylo oczekiwac, ze po wytraceniu enzymów i bialek za pomoca synta- nu mozliwe bedzie wyekstrahowanie syntanu lub produktu jego addycji z bialkiem za pomoca mie¬ szaniny wody z acetonem lufo z etanolem, jak to od¬ bywa sie w przypadku wytracania tanina.Syntany stosowane w sposobie wedlug wynalazku sa produktami kondensacji fenoli jedno- lufo wielo- wodorotlenowych, kwasów fenólokarboksylowych i fenolosulfonowych, a takze amidów kwasów fenolo- sulfonowych, kwasów ligninosulfonowych i aroma¬ tycznych amin. W celu zwiekszenia rozpuszczal¬ nosci w wodzie, zgodnie z wynalazkiem stosuje sie 63 86463 864 syntany zawierajace grupe sulfonowa. Grupa ta moze pochodzic ze zwiazku sulfonowego uzytego do kondensacji lub tez moze byc wprowadzona do tego produktu droga jego sulfonowania.Drugi przypadek dotyczy zwlaszcza produktów 5 kondensacji fenoli jednowodoroUlenowych, przy czym sulfonowanie prowadzi sie korzystnie tak, aby na 1 czasteczke produktu kondensacji nie wprowa¬ dzic wiecej -niz ,1 grupy sulfonowej.Sposobem wedlug wynalazku, roztwór zawieraja- 10 cy enzymy i substancje bialkowe traktuje sie roz¬ tworem syntanu w takiej ilosci, aby jego stezenie w mieszaninie wynosilo (J,5—5% wagowych. Proces wytracania prowadzi sie: w temperaturze JO-^500 C, a korzystnie 10—30°C. -• ¦ 15 Temperatura nie ma zasadniczego wplywu na przebieg procesu, lecz wplywa na predkosc powsta¬ wania osadu i jego lponsyistenoje. Wartosc pH sro¬ dowiska, w którym odbywa sie stracanie, dostoso¬ wuje sie do rodzaju stracanych substancji bialko- 20 wych i enzymów oraz rodzaju uzytego syntanu, przy czym w przypadku uzycia garbników aniono¬ wych stracanie prowadzi sie w srodowisku kwas¬ nym.Wytracony produkt odwirowuje sie, odsacza lub 25 dekantuje i nastepnie ekstrahuje woda lub miesza¬ nina wody z organicznymi rozpuszczalnikami mie¬ szajacymi sie z woda, takimi jak alkohole jedno- lub wielowodorotlenowe, ketony, eteroglikoile, diok¬ san i czterowodorofuran. ";¦''' 30 Za pomoca ekstrakcji usuwa sie z osadu sole nieorganiczne i nadmiar uzytego syntanu. W celu unikniecia obnizenia aktywnosci produktów zawie¬ rajacych enzymy, proces ekstrakcji prowadzi sie w temperaturze nizszej od temperatury pokojowej, korzystnie w temperaturze 0—10° C. Po ekstrakcji osad suszy sie w znany sposób, otrzymujac gotowy produkt.Przyklad I. 1,5 litra przesaczu hodowli bak¬ teryjnej Bacillus subtilis, zawierajacego jako glów- 40 ny enzym amylaze, traktuje sie roztworem weglanu sodowego do uzyskania wartosci ipH wynoszacej 7.Nastepnie do przesaczu dodaje sie mieszajac w tem¬ peraturze 22° C wodny roztwór syntanu, bedacego sulfonowanym produktem kondensacji o wzorze po- 45 danym na rysunku, w którym X oznacza grupe —C/CH3/2^, Y oznacza grupe wodorotlenowa, n i o- oznaczaja liczbe lam oznacza liczbe równa co najmniej 3.Wartosc pH wodnego roztworu syntanu przed dodaniem do przesaczu doprowadza sie za pomoca weglanu potasowego do 7,0. Dodaje sie taka ilosc roztworu syntanu, aby jego stezenie w mieszaninie wynosilo okolo 2% wagowych, to jest 0,8'% wago¬ wych w przeliczeniu na aktywna substancje garbni¬ ka. Po dodaniu syntanu z przesaczu wytraca sie 55 osad, który odwirowuje sie, przemywa dwukrotnie acetonem w temperaturze okolo 3° C i suszy w tem¬ peraturze 30° C pod cisnieniem 20 torów.Otrzymuje sie 3,70 g suchego produktu o aktyw¬ nosci 1765000 jednostek amylazy, podczas gdy ak- 60 tywnosc przesaczu uzytego do procesu wynosi 2140500 jednostek amylazy, co oznacza wydajnosc procesu wynoszaca 82,5% wydajnosci teoretycznej.Przyklad II. Do 1 litra przesaczu hodowli bakteryjnej Bacillus subtilis zawierajacego jako 65 35 50 glówny enzym 16750 jednostek proteazy i majacego wartosc pH 7,0 dodaje sie roztwór syntanu, którego wartosc pH uprzednio doprowadzono za pomoca amoniaku do 7,0. Uzyty syntan stanowi produkt po¬ likondensacji fenolu dwuwodorotlenowego, formal¬ dehydu i kwasu hydroksynaftalenosulfonowego o wzorze podanym na rysunku, w którym X oznacza grupe —OH2—, Y oznacza grupe wodorotlenowa n i p oznaczaja zero, o oznacza liczbe 2, a m oznacza liazJbe równa 00 najmniej 3.Syntan dodaje sie w takiej ilosci, aby jego steze¬ nie w mieszaninie wynosilo 1,5% wagowych, to jest 0,6% wagowych aktywnej substancji garbnika. Po dwugodzinnym mieszaniu w temperaturze 30° C od¬ wirowuje sie otrzymany osad, ekstrahuje dwiema porcjami acetonu po 100 ml i suszy pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Otrzymuje sie 2,2 g suchego pro¬ duktu o aktywnosci 13200 jednostek proteazy, co oznacza 78,9% wydajnosci teoretycznej.Przyklad III. Do 1000 ml przesaczu z hodowli bakteryjnej Bacillus subtilis zawierajacego proteaze jako glówny enzym, o sumarycznej aktywnosci wy¬ noszacej 29800 jednostek proteazy, którego pH wy¬ nosi 6,0 dodaje sie roztwór syntanu (2% produktu), który uprzednio doprowadzono do wartosci pH = 6,0 za pomoca rozcienczonego wodorotlenku sodo¬ wego.Uzyty syntan stanowi produkt polikondensacji kwasu fenolokarboksylowego i kwasu ligninosulfo- nowego o wzorze podanym na rysunku, w którym X oznacza grupe —CH2—, Y oznacza grupe wodoro¬ tlenowa, n oznacza zero, o i p oznaczaja liczbe 1, a m oznacza liczbe co najmniej równa 3 i w którym na 6 pierscieni przypada 1 czasteczka kwasu ligni- nosulfonowego. Po jednogodzinnym mieszaniu w temperaturze 40° C oddziela sie osad, który nastep¬ nie miesza sie z 50 md wody i rozpuszcza dodajac w temperaturze okolo 5°C 30 ml izopropanolu. Przez podwyzszenie stezenia izopropanolu do 65% wy¬ traca sie z ukladu proteaze, po czym odwirowuje ja. Pozostala ciecz zostaje wzbogacona w glówna ilosc soli z plynu pohodowlanego i wprowadzony syntan.Po wysuszeniu odwirowanego osadu pod zmniej¬ szonym cisnieniem otrzymuje sie 1,60 g produktu o aktywnosci 22250 jednostek. Wydajnosc procesu, uwzgledniajac aktywnosc surowca i produktu wy¬ nosi 74,8% wydajnosci teoretycznej.Przyklad IV. Do 1000 ml przesaczu z hodo¬ wli bakteryjnej Bacillus subtilis zawierajacego kompleks enzymowy wytwarzajacy celuloze o su¬ marycznej aktywnosci wynoszacej 43000 jednostek celulozy, którego wartosc pH wynosi 5,5, dodaje sie roztwór syntanu, którego wartosc pH ustalono rów¬ niez na 5,5. Stezenie syntanu w ukladzie poddawa¬ nemu straceniu wynosi 2% produktu (okolo 0,7% substancji aktywnej garbnikowej). Temperatura wynosi okolo 17° C.Uzyty syntan stanowi produkt polikondensacji kwasu fenolosulfonowego o wzorze podanym na rysunku, w którym X oznacza grupe —S02—, Y oznacza grupe wodorotlenowa, n i p oznaczaja ze¬ ro, o oznacza liczbe 1, a m oznacza liczbe wieksza od 4. Po jednogodzinnym mieszaniu wytracony osad odwirowuje sie, po czym miesza z 50 ml wody, a nastepnie w temperaturze okolo 5^C rozpuszcza63 864 przez dodanie 30 ml etanolu. Po podwyzszeniu ste¬ zenia etanolu do 70% objetosciowych wytraca sie osad zawierajacy enzym, który .nastepnie oddziela sie przez odwirowanie.Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 22° C otrzymuje sie 4,5 g suchego pre¬ paratu o aktywnosci wynoszacej 36000 jednostek celulozy.Wydajnosc procesu uwzgledniajac aktywnosc su¬ rowca i produktu wynosi wiec 83,7% wydajnosci teoretycznej.Przyklad V. Do 8000 ml przesaczu z hodowli bakteryjnej Bacillus subtiilis, zawierajacego glównie kompleks enzymowy zdolny do rozszczepiania /?- glukanu zawartego w jeczmieniu, o sumarycznej aktywnosci wynoszacej 187000 jednostek glukanazy i o wartosci pH = 6,5 dodaje sie roztwór syntanu o tej .samej wartosci pH.Stezenie syntanu w mieszaninie wynosi 0,5% wzglednie 0,2% substancji aktywnej garbnikowej.Uzyty syntan stanowi produkt pdLikondensacji kwa¬ sów aminosulfonowych o wzorze podanym na ry¬ sunku, w którym Y oznacza grupe —S02 • NH—, Y oznacza grupe —NH2, n i p oznaczaja zero, o ozna¬ cza liczbe 1, a m oznacza liczbe równa co najmniej 6. Podczas gdy stosowane w przykladach I—IV syntany mialy charakter anionowy, to syntan uzyty w tym przykladzie jest amfoteryczny. Po jednogo¬ dzinnym mieszaniu w temperaturze pokojowej osad oddziela sie od cieczy i ekstrahuje 300 ml mieszanina acetonu z woda, zawierajacej 80% ob¬ jetosciowych acetonu i nastepnie 200 ml miesza¬ niny acetonu z woda, zawierajacej 65% objetos¬ ciowych acetonu.Otrzymuje sie 11,5 g suchego preparatu o suma¬ rycznej aktywnosci wynoszacej 149000 jednostek glukanazy. Wydajnosc procesu, uwzgledniajac ak¬ tywnosc surowca i produktu wynosi 79,6% wydaj¬ nosci teoretycznej.Przyklad VI. Do 2000 ml przesaczu z hodowli bakteryjnej Aspergillus niger, zawierajacego kar- boksymetyloceluloze o sumarycznej aktywnosci wy¬ noszacej 3260 jednostek, którego wartosc pH wy¬ nosi 6,2 dodaje sde roztwór syntanu (2% produktu) o takiej samej wartosci pH. 10 20 25 30 45 Uzyty syntan stanowi produkt polikondensacji aniliny i formaldehydu, o wzorze podanym na ry¬ sunku, w którym X oznacza grupe —CH2, Y ozna¬ cza grupe —NH2, n i p oznaczaja zero,"o oznacza liczbe 1, a m oznacza co najmniej liczbe 4. Produkt ten jest zwiazkiem o charakterze kationowym. Po okolo dwugodzinnym mieszaniu wytracony osad od¬ dziela siie i pod zmniejszonym cisnieniem ekstrahuje dwiema porcjami po 50 ml acetonu w temperaturze pokojowej.Po oddzieleniu cieczy i wysuszeniu osadu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie 6 g su¬ chego preparatu o sumarycznej aktywnosci wyno¬ szacej 2250 jednostek.Wydajnosc procesu wynosi 69,0% wydajnosci teo¬ retycznej.W sposób analogiczny do opisanego w przykla¬ dach I—VI prowadzi sie proces przy uzyciu syntanu o wzorze podanym na rysunku, w którym X ozna¬ cza grupe —SO— lub grupe —NH—, a pozostale symlbole maja wyzej podane znaczenie. PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania suchych preparatów protei- nowo-enzymatycznych o malej zawartosci soli na drodze wytracania enzymów oraz bialek zawartych w cieczach pohodowlanych po prowadzeniu hodowli mikroorganizmów, takich jak bakterie lub plesnie, albo w wyciagach z tkanek roslinnych lub zwierze¬ cych, substancjami o charakterze garbników i na¬ stepnie ekstrakcje z uzyskanego osadu soli nieor¬ ganicznych i substancji o charakterze garbników woda lub mieszanina wody z rozpuszczalnikiem or¬ ganicznym mieszajacym sie z woda i wysuszenie otrzymanego produktu, znamienny tym, ze jako substancje o charakterze garbnika stosuje sie zwia¬ zek o wzorze podanym na rysunku, w którym Y oznacza grupe wodorotlenowa lub aminowa, X oznacza grupe —S02—, —SO—, —S02.NH—, —NH— lub grupe o wzorze —C/R/2—, w którym R oznacza atom wodoru lub rodnik metylowy, n oznacza zero lub liczbe calkowita 1—3, o oznacza liczbe calkowi¬ ta i—3, p oznacza zero lub liczbe 1, a m oznacza liczbe równa co najmniej 3, przy czym jeden z obu pierscieni benzenowych tego zwiazku jest bezpo¬ srednio lub poprzez grupe —CH2— podstawiony grupa sulfonowa. (CH3)„ Wo (C00H) J (CH3)n m (Y), (C00H). Wzór PL PL