PL63340B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 25.X.1967 (P 123 220) 25.IX.1971 63340 KI. 12 o, 26/01 MKP C 07 g, 3/00 CZYTELNIA QM£D Patentowego Polsklij Izeczps^.-ej lh-,;¦¦¦ ,i Wspóltwórcy wynalazku: Arnold Adamiec, Bogdan Rakowski, Janina Zurkowska, Lucja Pilch Wlasciciel patentu: Kutnowskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa" Przed¬ siebiorstwo Panstwowe, Kutno (Polska) Sposób otrzymywania produktów odbudowy digilanidów takich, jak digitoksyna, gitoksyna, digoksyna i/lub ich mieszaniny Wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania pro¬ duktów odbudowy digilanidów takich jak digitoksy¬ na, gitoksyna, digoksyna i/lub ich mieszaniny. Sub¬ stancje te wchodza w sklad preparatów, majacych szerokie zastosowanie w praktyce klinicznej przy leczeniu schodzen w przypadkach niewydolnosci krazenia pochodzenia sercowego, zwlaszcza w prze¬ wleklej niedomodze serca, jak i przy przeroslym miesniu sercowym.Wiadomo, ze substancje te mozna otrzymywac kilkoma sposobami na drodze hydrolizy alkalicznej kompleksu digilanidów ABC, w wyniku której w czasteczkach poszczególnych digilanidów nastepuje odszczepienie grupy acetylowej, oraz na drodze hy¬ drolizy enzymatycznej, w wyniku której w powsta¬ lych czasteczkach poszczególnych dezacetylodigila- nidów nastepuje odszczepienie czasteczki glikozy.Ale podczas gdy hydroliza grup acetylowych w czasteczkach digilanidów lub acetylodigitoksyny, acetylogitoksyny i acetylodigoksyny w lagodnych warunkach srodowiska alkalicznego zachodzi sto¬ sunkowo latwo i nie nastrecza trudnosci, to hydro¬ liza enzymatyczna czasteczki glikozy w czastecz¬ kach digilanidów lub ich dezacetyloodpowiedników przebiega jedynie przy zastosowaniu odpowiednich enzymów, a przy tym prowadzenie procesu jest bardzo skomplikowane, uciazliwe i w skali prze¬ myslowej stwarza wiele trudnosci. Najbardziej do¬ stepnym zródlem enzymów, pod wplywem których nastepuje odszczepienie czasteczki glikozy od cza- 10 15 25 steczek poszczególnych digilanidów, sa liscie Digi¬ talis lanata lub Digitalis purpurea.Wedlug jednego ze znanych sposobów liscie Di¬ gitalis lanata ekstrahuje sie kilkakrotnie za pomoca organicznych rozpuszczalników w celu usuniecia z nich glikozydów, garbników i innych zanieczysz¬ czen. Liscie po wyekstrahowaniu i odsaczeniu sta¬ nowia preparat enzymatyczny, który zawiera znacz¬ na ilosc zanieczyszczen, utrudniajacych prawidlowy przebieg hydrolizy enzymatycznej, wyizolowanie otrzymanych produktów, ich oczyszczanie itp.Równiez niekorzystne wyniki przynosi stosowanie zwiazków olowiu do oczyszczania ekstraktów digi- lanidowych, poniewaz osady tych zwiazków adsor- buja znaczne ilosci produktu, a poza tym odsacza¬ ja sie bardzo trudno. W rezultacie dlugotrwalych i pracochlonnych operacji oraz zuzywania znacznej ilosci rozpuszczalników wydajnosc procesu jest nis¬ ka.Wedlug innego sposobu wyjsciowym materialem do otrzymywania produktów odbudowy digilanidów sa liscie Digitalis lanata, które obok pelnego kom¬ pleksu digilanidów A, B i C zawieraja równiez en¬ zymy zdolne do odszczepiania czasteczki glikozy od czasteczek poszczególnych digilanidów. Liscie te ekstrahuje sie za pomoca wody, przy czym ekstra¬ howane digilanidy pod wplywem zawartych w lis¬ ciach enzymów traca czasteczke glikozy i przecho¬ dza odpowiednio w acetylodigitoksyne, acetylogito- ksyne i acetylodigoksyne, które w toku dalszych 6334063340 operacji poddaje sie hydrolizie alkalicznej. Jednak¬ ze i ten sposób jest malo przydatny ze wzgledu na dlugotrwale i uciazliwe operacje, nadmierne zuzy¬ wanie rozpuszczalników, trudnosci przy oczyszcza¬ niu ekstraktów i niska wydajnosc koncowych pro¬ duktów.Znane sa równiez sposoby przeprowadzania hy¬ drolizy enzymatycznej digilanidów za pomoca en¬ zymów z plesni i drobnoustrojów, z slimaka Helix pomatice, z slimaka winniczka itp. Jednak stosowa¬ nie tych sposobów do procesów w skali przemyslo¬ wej nie ma wiekszego znaczenia.Wynalazek ma na celu z procesu otrzymywania produktów odbudowy digilanidów na drodze hydro¬ lizy enzymatycznej wyeliminowanie wprowadzania do reakcji duzych ilosci lisci, a z nimi róznych za¬ nieczyszczen, stosowania nadmiernych ilosci rozpu¬ szczalników i pracochlonnych operacji poprzez za¬ stosowanie czystego kompleksu digilanidów A, B i C lub poszczególnych jego skladników albo ich dezacetylopochodnych oraz latwo dostepnych enzy¬ mów, zdolnych do szybkiego i pelnego odszczepia- nia czasteczki glikozy od czasteczek hydrolizowa- nych produktów.Stwierdzono, ze produkty odbudowy digilanidów takich jak digitoksyna, gitoksyna, digoksyna i/lub ich mieszaniny o wysokim stopniu czystosci mozna otrzymywac w prosty sposób i z dobrymi wydaj- nosciami, jezeli mieszanine digilanidów ABC lub ich dezacetyloodpowiedników albo poszczególne di- gilanidy A, B lub C albo tez ich dezacetyloodpo- wiedniki podda sie hydrolizie enzymatycznej w srodowisku: wodno-metanolowym o wartosci pH = = 5—6 w temperaturze 38—45°C w ciagu 24 godzin za pomoca preparatu enzymatycznego, otrzymane¬ go uprzednio ze zwierzecego górnego odcinka prze¬ wodu trawiennego wraz z jego trescia. W tym celu swieze odpady poubojowe zwierzat rzeznych, skla¬ dajace sie z górnego odcinka przewodu trawiennego zwierzecia wraz z jego trescia sieka sie i maCer*uje za pomoca wody w ciagu okolo dwóch godzin w temperaturze pokojowej, po czym odciska na prasie lub odwirowuje na wirówce z perforowanym beb¬ nem.Do otrzymanej metnej cieczy dodaje sie substan¬ cji buforujacej typu fosforanowego, octanowego lub cytrynianowego i zakwasza do uzyskania wartosci pH = 5—6. Uzyskuje sie gotowy preparat enzyma¬ tyczny w postaci wodnej zawiesiny, nadajacy sie do bezposredniego zastosowania w procesie hydro¬ lizy enzymatycznej digilanidów. Mozna równiez otrzymac wedlug wynalazku preparat enzymatycz¬ ny w postaci stalej. W tym celu metna ciecz po maceracji posiekanych odpadów poubojowych od¬ wirowuje sie, a otrzymany osad osusza w acetonie.W dalszym toku postepowania wedlug wynalazku mieszanine digilanidów A, B i C lub ich poszcze¬ gólne skladniki albo tez ich dezacetyloodpowiedni- ki w roztworze wodno-metanolowym wprowadza sie do przygotowanej uprzednio wodnej zawiesiny preparatu enzymatycznego o wartosci pH = 5-—6 i miesza w temperaturze 38—45°C w ciagu 24 godzin.Po tym czasie mase poreakcyjna przesacza sie i ewentualnie alkalizuje w celu przeprowadzenia hy¬ drolizy alkalicznej znajdujacego sie w roztworze produktu i przesacza, po czym przesacz wysala sola kuchenna, a wydzielony osad odsacza, oczysz¬ cza i ewentualnie rozdziela na poszczególne sklad¬ niki. 5 Nizej podane przyklady wykonania sposobu we¬ dlug wynalazku wyjasniaja blizej jego istote, nie ograniczajac zakresu wynalazku.Przyklad I. 1,5 kg swiezych odpadów poubo¬ jowych zwierzat rzeznych, stanowiacych górny od- 10 cinek przewodu trawiennego z jego trescia, sieka sie i miesza z 1,5 litra wody w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej, a nastepnie odciska na prasie i do otrzymanej metnej cieczy dodaje bufo¬ ru octanowego i mieszanine zakwasza kwasem 15 octowym do uzyskania wartosci pH = 5,2. Uzyskuje sie gotowy preparat enzymatyczny w postaci wod¬ nej zawiesiny nadajacy sie do bezposredniego prze¬ prowadzenia enzymatycznej hydrolizy czasteczki glikozy w czasteczkach digilanidów lub ich dezace- 20 tyloodpowiedników.Przyklad II. 10 kg swiezych odpadów poubo¬ jowych zwierzecych z górnego odcinka przewodu trawiennego wraz z trescia sieka sie i maceruje za pomoca 5 litrów wody w temperaturze pokojowej 25 w ciagu 2 godzin po czym odciska na prasie lub odwirowuje na wirówce z perforowanym bebnem.Uzyskana metna ciecz przenosi sie na szybkoobro¬ towa wirówke i zawiesine odwirowuje. Osad z wi¬ rówki miesza sie z 300 ml wody destylowanej i 30 powstala papke wprowadza do 3. litrów oziebione¬ go acetonu, dokladnie miesza i osad odsacza, prze¬ mywa acetonem i suszy na powietrzu. Otrzymuje sie 30 g preparatu w stanie suchym, który nadaje sie do dluzszego przechowywania w temperaturze 0—5°C.Przyklad III. Postepuje sie jak w przykladzie II z tym, ze swiezo otrzymany preparat enzyma¬ tyczny w postaci wodnej zawiesiny metnej zadaje sie siarczanem amonu, a wydzielony osad preparatu. 40 enzymatycznego odsacza sie, osusza acetonem i su¬ szy.Przyklad IV. Do swiezo przygotowanego pre¬ paratu enzymatycznego w postaci wodnej zawiesi¬ ny, otrzymanego wedlug przykladu I, wprowadza 45 sie roztwór wodno-metanolowy 1 g mieszaniny di¬ gilanidów A i B, zawierajacego 60p/o digila- nidu A i okolo 30 procent digilanidu B. Mase reakcyjna miesza sie i utrzymuje w temperaturze 38—45°C w ciagu 24 godzin. Po tym czasie mase 50 poreakcyjna alkalizuje sie w celu przeprowadzenia hydrolizy grupy acetylowej w powstalych czastecz¬ kach acetylodigitoksyny i acetylogitoksyny, a na¬ stepnie produkt poreakcyjny zakwasza sie kwasem octowym do uzyskania wartosci pH = 5,5, dodaje 55 150 g soli kuchennej i ogrzewa do temperatury 80°C w ciagu pól godziny. Wydzielony osad odsa¬ cza sie, przemywa woda i suszy. Otrzymany osad ekstrahuje sie 3 razy po 50 ml suchego chlorofor¬ mu. Z zebranych ekstraktów oddestylowuje sie 60 chloroform do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Uzyskuje sie 0,6 g czystego produktu o zawartosci 80 procent digitoksyny i 10 procent gitoksyny.Przyklad V. Do zawiesiny 6 g suchego pre¬ paratu enzymatycznego, otrzymanego wedlug przy- 65 kladu II, w 900 ml destylowanej wody o wartosci 3563340 pH = 5,2, nastawionej za pomoca buforu fosforano¬ wego wprowadza sie roztwór wodno-metanolowy dezacetylodigilanidu C, otrzymany z 1,5 g digilani- du C na drodze hydrolizy alkalicznej, o wartosci pH =¦ 5,0. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w temperaturze 38—45°C przy silnym mieszaniu w ciagu 24 godzin. Po tym czasie do mieszaniny po¬ reakcyjnej dodaje sie 300 g soli kuchennej, a po jej rozpuszczeniu 2 litry metanolu i po dokladnym wymieszaniu przesacza. Z przesaczu oddestylowuje sie metanol, a z pozostalosci wyodrebnia otrzyma¬ na digoksyne i oczyszcza na drodze krystalizacji.Uzyskuje sie 0,65 g czystego produktu o zawartosci 95 procent digoksyny.Przyklad. VI. Do swiezo przygotowanego pre¬ paratu enzymatycznego w postaci metnej zawiesiny wodnej, otrzymanego wedlug przykladu I, wprowa¬ dza sie wodno-metanolowy roztwór 2,5 g dezacety¬ lodigilanidu C. Mieszanine reakcyjna utrzymuje sie w temperaturze 38—45°C w ciagu 24 godzin przy ciaglym mieszaniu. Po tym czasie dodaje sie 1 kg soli kuchennej, miesza do rozpuszczenia sie soli i do powstalej mieszaniny wprowadza 5 litrów metanolu, dokladnie miesza, po czym przesacza. Z przesaczu oddestylowuje sie metanol pod zmniej¬ szonym cisnieniem, wydzielony osad odsacza i oczyszcza na drodze krystalizacji. Otrzymuje sie 1,8 g czystej digoksyny. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób otrzymywania produktów odbudowy digilanidów, takich jak digitoksyna, gitoksyna, di- goksyna i/lub ich mieszaniny, z digilanidów A, B i C na drodze ich dezacetylowania za pomoca hy¬ drolizy alkalicznej oraz odszczepiania czasteczki glikozy za pomoca hydrolizy enzymatycznej, zna- 5 mienny tym, ze mieszanine digilanidów lub deza- cetylodigilanidów A, B i C lub poszczególne digi- lanidy albo dezacetylodigilanidy poddaje sie hydro¬ lizie enzymatycznej w srodowisku wodno-metano- lowym o wartosci pH = 5—6, do którego dodano 10 preparat enzymatyczny, otrzymany z górnego od¬ cinka przewodu trawiennego wraz z jego trescia, stanowiacy odpad poubojowy zwierzat rzeznych, w temperaturze 38—45°C w ciagu 24 godzin przy ciaglym mieszaniu, po czym w przypadku stosowa- l5 nia jako substratu digilanidów, zawierajacych grupe acetylowa, mase poreakcyjna poddaje sie w znany sposób reakcji hydrolizy alkalicznej,'a nastepnie z mieszaniny poreakcyjnej wyodrebnia koncowe pro¬ dukty, oczyszcza je i ewentualnie rozdziela na po- 20 szczególne skladniki.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie preparat enzymatyczny, otrzymany przez posiekanie górnego odcinka przewodu trawiennego zwierzat rzeznych wraz z jego trescia, zmacerowa- 25 nie go woda w temperaturze pokojowej i odcisnie¬ cie maceratu na prasie i nastepnie albo przez do¬ danie do odcieku substancji buforujacej typu fos¬ foranowego, octanowego lub cytrynianowego i za¬ kwaszenie uzyskanego produktu do wartosci pH = 30 = 5—6 albo przez wyodrebnienie osadu z odcieku za pomoca odwirowania, zawieszenie uzyskanego osadu w acetonie i wysuszenie. PL