PL48039B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwa¬ rzania fruktozy o stopniu czystosci wymaganym zwlaszcza przy przygotowywaniu z niej roztwo¬ rów infuzyjnych.Terapeutyczne stosowanie samej fruktozy jak i w roztworze jest ogólnie znane.Pozadane jest przy wszystkich postaciach stosowania aby preparat byl wolny cd glukozy.Podczas gdy w roztworach fruktozy stosowa¬ nych doustnie, domieszki, a takze male ilosci glukozy zasadniczo nie przeszkadzaja, to roz¬ twory fruktozy do celów infuzyjnych wyma¬ gaja {preparatów o najwyzszej czystosci.Znane jest otrzymywanie fruktozy albo z sa¬ charozy, albo z roslinnego polifruiktozanu, na przyklad linuliny. Otrzymywanie fruktozy z sacharozy przez hydrolityczny rozpad polaczo¬ ny z selektywnym stracaniem fruktozy daje w rezultacie preparat wolny od wszelkich nie¬ organicznych i organicznych niecukrów, który zawiera jednak zawsze do 10% glukozy. Roz¬ twór calkowicie wolny od glukozy mozna o- trzymac z sacharozy na 'drodze technicznej tyl¬ ko z duzym nakladem kosztów. Od niedawna znane sa sposoby, w których przez mikrobio¬ logiczne oddzialywanie na zawierajacy sacha¬ roze roztwór pozywki mozna albo udzial glu¬ kozy wykorzystac selektywnie, albo glukoze w taki sposób spolimeryzowac (dekstran), ze latwo ja oddzielic cd pozostalej fruktozy. W obydwóch sposobach oprócz reakcji glównej maja miejsce jeszcze inne jak na przyklad synteza oligosacharydów i niskoczasteczko- wych polisacharydów. Substancje te trudno oddzielaja sie od fruktozy. Takze tylko przy stosowaniu kosztownych procesów oczyszcza¬ nia mozna uwolnic fruktoze od innych sklad¬ ników roztworu kultury, zwlaszcza od bial¬ ka. Proces oczyszczania mozna bylo pominac przez zastosowanie do oddzialywania czystego roztworu enzymatycznego. Z doswiadczen wy-nika jednakze, ze wytwarzanie czystych roztwc- rów enzymatycznych jest kosztowne.Wedlug wynalazku unika sie niedogodnosci ©pisanych^ powyzej sposobów przez stosowanie do hydrolizy* lewanów'otrzymanych mikrobiolo¬ gicznie, które dzieki ich rozpuszczalnosci w wo¬ dzie i nierozpuszczalnosci w nizszych alkoho¬ lach i ketonach mozna latwo uwolnic od wszystkich towarzyszacych cukrów i innych organicznych substancji, zwlaszcza bialka, przez wytracanie 'niskoczasteczkowymi alkoholami lub ketonami, jak metanol, etanol, prcpanol i aceton tak, ze calkowicie oczyszczony polifruk- tozan mozna poddawac hydrolizie. Lewany, jak wiadomo, wytwarzane sa z sacharozy przez szereg mikroorganizmów takich jaik: Pseudo- monais sjpec, BaicUilfUs myxa i Aerobaeter levaiiicus.Sposób wedlug wynalazku umozliwia uzyska¬ nie stosunkowo wysokiej wydajnosci objetoscio¬ wej lewami, podczas gdy srednie wydajnosci lewami uzyskane ze zwyklej kultury przezna¬ czonej do syntezy, zawierajacej okolo 10% **&- charczy, wynosza w warunkach technicznych 50% teorii, co odpowiada okolo 2,5% (cie¬ zar/objetosc) wydajnosci objetosciowej. Aby u- zyskac wydajnosc objetosciowa wieksza niz 5%, jaka niezbedna jest do przeróbki, nalezy podniesc stezenie cukru powyzej 30%. Stwarza to jednak szkodliwe wairuniki fizjologiczne dla wzrostu mikroorganizmów^ gdyz okolo 20% za¬ rodników ginie wskutek za sdlnie zahamowane¬ go wzrostu, przy czym czas fermentacji wzrasta z pieciu do okolo dziesieciu dni.Jak wiadomo z literatury zwiekszenie wydaj¬ nosci lewanu uzyskuje sie przez dodawanie do kultury przeznaczonej do syntezy malych ilosci lewanu dla zapoczatkowania fermentacji. Do¬ datek tak zwanego startera — lewanu podwyz¬ sza wydajnosc uwarunkowana wysokim steze¬ niem cukru (powyzej 30%), jednakze czas trwa¬ nia syntezy wynosi wówczas 10 dni.Z zalaczonego wykresu wynika, ze maximum tworzenia sie lewanu z czasem znacznie odbie¬ gla od maximfum rozmnazania sie bakterii. Ma- ximium tworzenia sie lewanu obserwuje sie po zakonczeniu nasilenia okresu wzrostowego mi¬ kroorganizmów. Wynalazek wiec polega na pro¬ wadzeniu procesu dwustopniowego w ten spo¬ sób, ze w 1-szym stopniu prowadzi sie rczmna- zanie mikroorganizmów przy jednoczesnym tworzeniu sie w optymalnych warunkach star¬ tera—lewanu, podczas gdyw2-gim stopniu — nastepuje wlasciwa synteza przy zwiekszonej ilosci cukru, bez widocznej juz szkody dla wzro¬ stu bakterii. Przez prowadzenie dwustopniowe¬ go procesu mozna zatem uzyskac w 1-say.m, stopniu +- mase bakteryjna, znaczna czesc fer¬ mentu i starter — lewan, podczas gdy w 2-gim stopniu przez dodanie odpowiedniej ilosci sa¬ charozy podnosi sie wydajnosc objetosciowa le¬ wanu tak dalece, ze wynosi ona wiecej niz 5%.Wedlug wynalazku oba stopnie procesu mozn& prowadzic nie tylko w7 sposób okresowy al« takze i ciagly.Roztwór lewanu uzyskany w dwustopniowym procesie j'est wskutek wysokiej wydajnosci obje¬ tosciowej bardzo lepki, jego wartosc pH = 4 4,5, a ilosc niezuizytej sacharozy wynosi poni¬ zej 5%. Przeróbka lewanu moze odbywac sie bezposrednio w fenmentorze albo w dostatecz¬ nie duzym zbiorniku tak zwanym zbiorniku do stracania. W celu wprowadzona roztworu lewa¬ nu do kotla do' stracania nalezy zmniejszyc lepkosc roztworu kultury lewanu. Dokonuje sie tego przez rozcienczenie taka iloscia alkoholu na przyklad metanolu, aby lewan jeszcze sie nie wytracil. W kotle do wytracania przez dalszy dodatek alkoholu wytraca sie lewan z roztworu kultury i oddziela. Aby lewan calkowicie wy¬ tracic z roztworu jego kultury, potrzeba przy stosowaniu metanolu dwu- do czterokrotnej ilosci w odniesieniu do ilosci roztworu kultury.Niepozadane substancje towarzyszace produkto¬ wi wytracenia, a mianowicie glukoza, sole i bialka usuwa sie przez ponowne wytracanie straconego surowego produktu za pcmoca niz¬ szych alkoholi i ketonów. Po jednorazowym straceniu produkt wolny juz jest od weglo¬ wodanów, po dwukrotnym stracaniu otrzy¬ muje sie czysty lewam, odpowiedni do przygotowywania roztworów infuzyjnyoh.Z pirocesem stracania mozna polaczyc przesa¬ czenie przez warstwy filtracyjne i (lub) obrób¬ ke za pomoca substancji adsorbujacych, jak ziemia okrzemkowa lub wegiel aktywowany.Dzieki temu stopien oczyszczenia tylko nieznacz¬ nie sie polepsza. Poza tym powstaja straty w lewanie, który przylega i pozostaje na substan¬ cjach absorbujacych wzglednie na warstwach filtracyjnych. Z lewanu oczyszczonego przez stracanie przygotowuje sie 5°/Jlowy wodny roz¬ twór. Roztwór ten ogrzewa sie i zadaje kwa¬ sem, na przyklad kwasem solnym lub sufostan- - 2 -clami dajacymi jeny wodorowe, na przyklad kwasnymi solami lub wymieniaczami kationo¬ wymi i hydrolizuje. Temperatura hydrolizy, jak równiez stezenie jonów wodorowych moga zmieniac sie w szerokich granicach, jednak w przypadku otrzymywania roztworów fruktozy do celów infuzyjnych, optymalne warunki sa przy wartosci pH wiekszej cd 2, temperaturze ponizej 90°C i czasie trwania hydrolizy ponizej 5 minut w celu unikniecia zbrunatnienia, jak równiez przegrupowania w ubozsze w wode zwiazki fruktozy (dwubezwodnik dwufruktozy).W przypadku zastosowania wymieniacza katio- noiwego mozna prowadzic hydrolize w sposób ciagly zarówno w kotle, jak równiez w kolum¬ nie. Wartosc pH, temperatura i czas trwania hydrolizy moga sie zmieniac w zaleznosci od ciezaru czasteczkowego lewanu, jego czystosci oraz stopnia zhydrolizowania tak, ze uzyskuje sie niskoczasteczkowe lewany lub oligosachary- dyny szeregu lewanu.Przy otrzymywaniu fruktozy do celów iniu- zyjnych konieczne jest usuniecie pozostalych soli i substancji bialkowych. W celu usuniecia bialka mozna stosowac znane metody jak wy¬ tracanie i przesaczanie. W przypadku lewanu zhydnolizawanego do fruktozy, substancje bial¬ kowe koaguluja sie w trakcie oziebiania sie roz¬ tworu po przeprowadzeniu hydrolizy i nastepnie latwo mozna je usunac przez odsaiczenie. Usu¬ wanie soli nastepuje za pomoca wymieniacza jonowego.W celu wytworzenia roztworów infuzyjnych o odpowiednim stezeniu fruktozy po ich oczysz¬ czeniu stosuje sie zageszczenie w prózni.Sposób wedlug wynalazku pozwala dzieki uzyskaniu wysokiej wydajnosci objetosciowej jak równiez wskutek mozliwosci prostego i sku¬ tecznego oczyszczania na otrzymywanie prepa¬ ratów fruktozy, które odpowiadaja wysokim wymaganiom,, jesli chodzi o stopien czystosci.Juz wskutek jednorazowego stracenia lewanu polaczonego z hydroliza otrzymuje sie krysta¬ liczna fruktoze. Po dwóch straceniach fruktoza jest tak czysta, ze oprócz stosowania jej do ce¬ lów infuzyjnych nadaje sie ona do wszelkich mozliwych zastosowan terapeutycznych. Obec¬ nosci innych cukrów niz fruktoza nie mozn«j stwierdzic nawet metoda chromatografi-czna.Procesy oczyszczania, które maja miejsce po straceniu, maja jedynie na celu uzyskanie norm jakosci roztworów irifuzyjnych pod wzgle¬ dem zawartosci soli i bialka. (N 1 nig/100 ml).Przyklad I. Sluzem z 5-cio dniowej hodowli szczepu (Pseudomonas sp.) zaszczepia sie 100 ml roztworu przeznaczonego do dalszego szczepie- tiia o nastepujacym skladzie: 4% sacharozy 1,5% peptonu 0,5% Na^HPO., . 12H20 0,5% NaCl pH = 7,0 ± 0,2 Po 24 godzinach wstrzasania roztworu w temperaturze 20 — 23°C, roztwór kultur do szczepienia dodaje sie do 1 litra roztworu prze¬ znaczonego do syntezy o nastepujacym skladzie: 120 g sacharozy 5 g peptonu 1 g Na2HP04 . 12HaO 5 g NaCl 1 litr wody z sieci wodociagowej pH = 7,0 ± 0,2 Te kulture ~ fermentacyjna napowietrza sie lekko tak dlugo (200 om3 powielara/niiiifiite) az jej pH osiagnie wartosc 6. Nastepnie fermenta¬ cje prowadzi sie dialej bez napowietrzania. Po osiagnieciu wartosci pH = 4,5 fermentacja jest zakonczona, zwykle po okolo 50 godzinach.Wydajnosc: 25,5 g lewanu.Roztwór miesza sie z 4 litrami metanolu i stracony Iewan po osadzeniu uwalnia od pozc- stalego roztworu przez defkantacje. Osad roz¬ puszcza sie w trakcie mieszania w 0,5 litra wo¬ dy destylowanej i ponownie miesza z 2 litra¬ mi metanolu. Po osadzeniu Mie lewanu, roztwór dekantuje sie. Lewan, obecnie calkowicie oczyszczony z cukrów rozpuszcza sie w 0,5 litra wody destylowanej i ogrzewa do temperatury 85°C. Nastepnie dodaje sie kroplami 6 n kwas solny w ciagu 30 sekund do uzyskania wartosci pH = 2, po czym w ciagu 2 minut utrzymuje sie temperature 85°C, a nastepnie roztwór ozie¬ bia przez umieszczenie n&cz^nia reakcyjnego w wodzie lodowatej. Po osiagnieciu temperatury 25°C roztwór doprowadza sie do wartosci pH = 5 za pomoca 1 n NaOH. W celu skoagu- lowania bialka roztwór utrzymuje sie w ciagu 8 godzin w temperaturze + 4°C, po czyni prze¬ sacza przez warstwy filtracyjne (EKS 11). W celu usuniecia soli, roztwór przeprowadza sie kolejno przez wymieniacz kationowy (KPS 200) i wymieniacz anionowy (L 150), po czym za- - 3 -geszcza w prózni w temperaturze 'do 40*C do zawartosci 20% fruktozy.Wydajnosc: 108 ml 20%-owego roztworu fruk¬ tozy.Przyklad II. Roztworem kultur do szczepie¬ nia otrzymanym w sposób podany w przykla¬ dzie I zasizczepia sie 3,5 litra roztworu przezna¬ czonego do syntezy o nastepujacym skladzie: 210 g sacharozy 17,5 g peptonu 7,5 g Na2HP04 . 12H20 10,5 g NaCl 3,5 1 wody z sdeci wodociagowej ipH =¦ 7,0 ± 0,2 I stopien procesu.Kulture fermentacyjna napowietrza sie umiar¬ kowanie do uzyskania wartosci pH = 4,7 (0,3 objetosci powietrza/objetosc (roztworu kultu¬ ry/minute) w ciagu okolo 40 godzin. Nastepnie kulture fermentacyjna przeprowadza sie w wa¬ runkach sterylnych do drugiego naczynia reak¬ cyjnego..II stopien procesu.Roztwór przeznaczony do syntezy ma w dru¬ gim naczyniu reakcyjnym nastepujacy sklad: 875 g sacharozy 1,75 1 wody z sieci wodociagowej Po polaczeniu roztworu z produktem z pierw¬ szego naczynia wartosc pH wynosi 5.1. Po obni¬ zeniu sie wartosci pH do 4,1 podczas syntezy lewanu. proces jest zakcnczcny, co na ogól na¬ stepuje po 40 godzinach.Wydajnosc: 293 g lewanu.Wydajnosc objetosciowa: 5,6% (ciezar/objetosc).Tak otrzymany roztwór miesza sie z 20 litra¬ mi metanolu w celu wytracania lewanu, po czym dekantuje, a pozostaly lewan rozpusz¬ cza w 5 litrach destylowanej wody i ogrzewa do temperatury 50CC dodajac 30 ml 1 n HC1.Po 20 minutach roztwór oziebia sie i przez do¬ danie lugu sodowego (0,1 n doprowadza jego wartosc pH do 5 ± 0,5. Roztwór odstawia sie na noc w temperaturze -j- 8°C i przez odsacze¬ nie uwalnia od wytraconego osadu, po czyim zageszcza sie w prózni do zawartosci 70% fruk¬ tozy i po zaszczepieniu kilkoma krysztalkami fruktozy odstawia do wykrystalizowania, Lug macierzysty usuwa sie przez odwirowanie.Wydajnosc: 120 g krystalicznej fruktozy; 135 g fruktozy w lugu macierzystym.Przyklad III. Sklad roztworu przeznaczonego do szczepienia i roztworów przeznaczonych do syntezy odpowiada podanym w przykladzie I, tylko stezenie sacharozy roztworu przeznaczone¬ go do syntezy w I-szym stopniu procesu wyno¬ si 15%, zas w II-gim stopniu wynosi 60%.Przebieg fermentacji odbywa sie w podobny sposób, jak w przykladzie II. Po osiagnieciu wartosci pH 4,0 w II-gim. stopniu procesu syn¬ teza jest. zakonczona, co nastepuje po lacznym czasie syntezy okolo 100 godzin.Wydajnosc: 400 g lewanu.Wydajnosc objetosciowa: 7,6% (ciezar/objetosc).Roztwór zadaje sie w trakcie mieszania 25 litrami etanolu i po wytraceniu lewanu, dekan¬ tuje. Lewan rozpuszcza sie w 5 litrach wody i dodaje 2,5 litra etanolu. Otrzymany lekko lepki roztwór ogrzewa sie do temperatury 40°C i przepuszcza przez 1 metrowa kolumne silnego wymieniacza kationowego i,KPS 200), zawiera¬ jacego jony wodorowe. Temperature kolumny utrzymuje sie przy 40°C, a czas przebywania roztworu w kolumnie wynosi 30 minut, po czym roztwór doprowadza sie do wartosci pH = 5 i uwalnia w prózni od etanolu.Wydajnosc: 3 litry roztworu fruktozy (12%-owy).Przyklad IV. Wytwarzanie roztworu kultur do szczepienia prowadzi sie sposobem podanym w przykladzie I z ta róznica, ze 100 mil roz¬ tworu kultur do szczepienia wprowadza sie do 900 ml roztworu pozywki o takim samym skla¬ dzie. Po 24-godzinnym wstrzasaniu zaszczepia siie tym roztworem 9 litrów roztworu przezina- czonego do syntezy (I stopien procesu) o na¬ stepujacym skladzie: 1500 g sacharozy 10 g peptonu 10 g Na2HP04 . 12H.O 30 g NaCl 9 1 wody z sieci wodociagowej pH = 7,0 ± 0,2 I stopien procesu.Po obnizeniu sie wairtosci pH roztworu kul¬ tury fermentacyjnej do 5,5 wprcwadza sie roz¬ twór przeznaczony do syntezy (I stopien pro¬ cesu) w sposób ciagly w ilosci 220 ml na go¬ dzine z wyjalowionego zasobnika napelnionego 40 litrami tego roztworu.Taka sama ilosc przeplywa przez odpowied¬ nio nastawiona rure przelewowa z tego zbior¬ nika fermentacyjnego do drugiego zbiornika fermentacyjnego. - 4 -II stopien procesu.Do drugiego zbiornika fermentacyjnego wpro¬ wadza sie w sposób ciagly oprócz stalego do¬ plywu ze zbiornika I, 50%-owy roztwór sacha¬ rozy ze zbiornika zapasowego w stosunku 1 czesc objetosciowa roztworu sacharozy na 2 czesci objetosciowe odcieku z pierwszego abiornika.Rura przelewowa w drugim zbiorniku fer¬ mentacyjnym jest (tak umieszczona, ze w zbior¬ niku tym znajduje sie stale 23 litry roztworu fermentacyjnego. W (ten sposób czas przeby¬ wania roztworu w zbiorniku fermentacyjnym wynosi 70 godzin. Wartosc pH roztworu wy¬ plywajacego z pierwszego zbiornika fermenta¬ cyjnego wynosi 4,5, a wartosc pH roztworu wyplywajacego z 'drugiego zbiornika fermenta¬ cyjnego wynosi 4,0. Pierwszy zbiornik napo¬ wietrza sie tak, ze zawartosc tlenu rozpuszczo¬ nego w wodzie wynosi 2^3 rng 02 na litr.Drugiego zbiornika fermentacyjnego nie napo¬ wietrza sie. Temperaiture w obu zbiornikach utrzymuje sie na poziomie 23 ± 2°C, Wszystkie zabiegi robocze odbywaja sie w warunkach sterylnych. Po 180 godzinach przerywa sie fer¬ mentacje. Po uplywie tego czasu z drugiego zbiornika fermentacyjnego odcieklo lacznie 37 litrów. W pierwszym zbiorniku fermentacyj¬ nym pozostaje 10 litrów roztworu fermentacyj¬ nego, a w drugim — 23 litry. Te 23 litry spu¬ szcza sie. Roztwór kultury lewanu pochodzacy z drugiego zbiornika fermentacyjnego (lacznie 37 litrów) wprowadza isie w sposób ciagly z 200 litrami metanolu w trakcie mieszania do kotla do stracania. Nastepnie wprowadza sie tam takze z drugiego zbiornika pozostalosc po za- nozonej fermentacji. Wedlug tego przykladu adza sie 'do dalszej przeróbki lacznie 0 litrów roztworu lewanu. Po zakonczonym acaniu roztwór nad wytraconym lewanem iaga sie. Wydajnosc: 3,8 kg lewanu.Dalszy przebieg procesu jest analogiczny jak przykladzie I. Wydajnosc czystej glukozy: 158 kg.Jezeli zamiast szczepu Pseudomonas sp. sto- wac do syntezy lewanu inne szczepy wytwa- jace lewan jak BaciMus subtalis, Bacillus ymyxa, Aerobacter levanicus, Pseudomonas uorescens i Pseudomonas areofaciens, to wa¬ runki prowadzenia procesu wedlug wynalazku beda mdaly zasadniczo taki sam wplyw na ich aktywnosc. Optimum pH, napowietrzanie, czas przebywania roztworu fermentacyjnego w zbiornikach fermentacyjnych, maksymalne ste¬ zenie sacharozy i stosunek objetosciowy roz¬ tworów w obu stopniach procesu muisza byc dostosowane do specyficznego zachowania sie i zdolnosci produkcyjnych szczepów.Czas przebywania roztworów w zbiornikach fermentacyjnych mozna na przyklad latwo ob¬ liczyc z doswiadczalnie otrzymanej krzywej wydajnosci i wzrostu (patrz wykres). Wedlug wynalazku mozna takze uzyc do dalszej prze¬ róbki roztworu lewanu z pierwszego zbiornika fermentacyjnego. PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania fruktozy, zwlaszcza do celów infuzyjnych, znamienny tym, ze sto¬ suje sie lewan otrzymany na drodze mikro¬ biologicznej w sposób periodyczny lufo ciag¬ ly, który oczyszcza sie przez wytracanie za pomoca hydrofilowych organicznych .roz¬ puszczalników, a nastepnie hydrolizuje za pomoca substancji wydzielajacych jony wo¬ dorowe przy wartosci pH ponizej 1—6, ko¬ rzystnie przy pH powyzej 2 i w temperatu¬ rze 45—1109C, korzystnie ponizej 90°C i o- trzymany roztwór fruktozy przerabia dalej w znany sposób.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze synteze lewanu prowaldzi sie w procesie dwustopniowym, przy czym w pierwszym stopniu procesu zaszczepia sie roztwór kul¬ tury, zawierajacy 1—20%, korzystnie 5—15% sacharozy i prowadzi fermentacje przy na¬ powietrzaniu az do uzyskania optymalnych warunków tworzenia sie lewanu, w drugim zas stopniu procesu fermentacje prowadzi sie nadal przy dodatku sacharozy do uzy¬ skania calkowitego jej stezenia 20^50%, korzystnie 25—30%. VEB Serum — Werk Bernburg Zastepca: inz. Józef Felkner rzecznik patentowyDo opisu patentowego nr 48039 h*. S7CZ£P /S£WOHlW/l£SPfc, fOTu* 2579. RSW „Prasa", Kielce, flaki. 250 egz. BlBLiOTEKAi ^{¦"'l- Pa ten-towego! PL