PL233115B1 - Transformowana komórka Escherichia coli oraz sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni - Google Patents
Transformowana komórka Escherichia coli oraz sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchniInfo
- Publication number
- PL233115B1 PL233115B1 PL415436A PL41543615A PL233115B1 PL 233115 B1 PL233115 B1 PL 233115B1 PL 415436 A PL415436 A PL 415436A PL 41543615 A PL41543615 A PL 41543615A PL 233115 B1 PL233115 B1 PL 233115B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- washing
- escherichia coli
- bacteria
- gfp
- protein
- Prior art date
Links
- 238000005406 washing Methods 0.000 title claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 49
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 claims description 26
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 claims description 26
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 claims description 21
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 55
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 34
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 18
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 6
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- NPURPEXKKDAKIH-UHFFFAOYSA-N iodoimino(oxo)methane Chemical group IN=C=O NPURPEXKKDAKIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 241000242764 Aequorea victoria Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- 241000580482 Acidobacteria Species 0.000 description 1
- 241001249117 Bacillus mojavensis Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001249119 Bacillus vallismortis Species 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 241000006867 Discosoma Species 0.000 description 1
- 108010074124 Escherichia coli Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241000566150 Pandion haliaetus Species 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710181197 Protein cycle Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012569 microbial contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000026447 protein localization Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102200049565 rs121913045 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób monitorowania procesu zmywania powierzchni stałych, m.in. wnętrza zmywarek, naczyń, podłóg i/lub wymiany istniejącej zanieczyszczających mikroorganizmów na gatunki bakterii, zwłaszcza obecne w probiotykach.
Shimomura in in., Journal of Cellular and Comparative Physiology 59:223-239 (1962) ujawniają izolowanie i charakterystykę bioluminescencyjnego białka akworyny oraz identyfikację Białka Zielonej Fluorescencji GFP. Białko akworyna w obecności jonów Ca2+ emituje niebieskie światło, które z kolei wzbudza Białko Zielonej Fluorescencji GFP, następnie emitujące światło zielone.
Tsien i in. ujawniają konstrukcję szeregu mutantów Białka Zielonej Fluorescencji GFP o zwiększonej wydajności emisji - Heim i in. Nature 373: 663-664 (1995) oraz analogiczne białko fluorescencyjne Discosoma sp emitujące światło w kolorze czerwonym jak również konstrukcję jego mutantów, świecących w kolorach czerwonym, pomarańczowym i żółtym - Shaneri in. Nat Biotechnol 22: 1567-1572 (2004).
Chalfie i in. Science 263, 802-805 (1994) ujawniają klonowanie w bakterii Escherichia coli i eukariotycznym nicieniu Caenorhabditis elegans oraz ekspresję genu, kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFP w formie produkującej bioaktywne białko, świecące w heterologicznych komórkach, które zostało wykorzystane do monitorowanie ekspresji genetycznej i lokalizacji białek w organizmach żywych. Ujawnili ponadto, że Białko Zielonej Fluorescencji GFP nie wymaga zewnętrznych białek wspomagających i kofaktorów do efektywnego świecenia produktu kodującego genu, klonowanego poza kontekstem genetycznym meduzy Aequorea victoria. Centrum aktywne Białko Zielonej Fluorescencji GFP formuje się spontanicznie w eksprymowanym polipeptydzie - w obecności tlenu następuje cyklizacja trzech zlokalizowanych obok siebie reszt aminokwasowych: 65 - Seryny 65, Tyrozyny 66 i glicyny 67, tworzących aktywny w procesie fluorescencji chromofor.
W roku 2008 została przyznana Nagroda Nobla dla Shimomura O., Chalfie M. i Tsien R.Y. za odkrycie i rozwój białek zielonej fluorescencji. Do chwili obecnej białka te znalazły szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych i badaniach aplikacyjnych m.in. w zakresie biologii molekularnej, medycyny, embriologii, zoologii, botaniki, rolnictwa, konstrukcji biosensorów, z ponad 10000 wydanych publikacji naukowych.
Hong i in FEMS Microbiol Rev. 29: 813-35 (2005) oraz Bader i in. Benef Microbes. 3: 67-75 (2012) ujawniają zalety stosowania probiotyków, złożonych z niektórych bakterii wytwarzających spory - głównie należących do rodzaju Bacillus sp.. Bakterie te nie stanowią stałej flory jelit człowieka i zwierząt, wykazują jednak dwa sposoby wzrostu i sporulacji - w środowisku zewnętrznym oraz w jelitach. Ponadto, nie są one patogenne, przeciwnie, są w stanie zapobiegać infekcjom i eliminować stany patologiczne jelit. Ze względu na produkcję spor, bakterie te wykazują wysoką przeżywalność w trakcie pasażu przez kwaśne środowisko żołądka oraz w trakcie przetwarzania przemysłowego żywności. Zastosowanie probiotyków do pokrywania powierzchni mających kontakt z żywnością oraz powierzchni mogących mieć kontakt z człowiekiem jest również pożądane, ze względu na konkurencyjne wypieranie znajdujących się na tych powierzchniach mikroorganizmów, które mogą być również patogenami.
Celem wynalazku jest dostarczenie sposobu pozwalającego na łatwe monitorowanie skuteczności stosowania preparatów i technik zmywania powierzchni oraz skuteczności zastępowania istniejącej flory mikrobiologicznej przez bakterie probiotyków. Szczególnym celem wynalazku jest dostarczenie sposobu pozwalającego na zastosowanie modelowej bakterii wskaźnikowej zanieczyszczeń preferencyjnie spełniającej kryteria flory bakterii ściekowych, fekalnych, gnilnych, chorobotwórczych, która to bakteria będzie w sposób jednoznaczny, łatwy i szybki odróżnialna od dziesiątek a nawet setek gatunków pozostałych mikroorganizmów, potencjalnie bytujących na zmywanej powierzchni. Jednocześnie bakteria ta powinna spełniać kryteria stosowania bezpiecznego dla człowieka oraz nie zagrażać środowisku w wypadku przypadkowego uwolnienia do środowiska bakterii wskaźnikowej.
Nieoczekiwanie powyższy problem został rozwiązany w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest komórka Escherichia coli transformowana wektorem ekspresyjnym posiadającym sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 3, przy czym korzystnie jest ona transformowaną komórką Escherichia coli szczepu BL21(DE3), do monitorowania i oceny skuteczności preparatów i technik myjących w zmywaniu powierzchni.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób monitorowania i oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni charakteryzujący się tym, że kontaktuje się zmywaną powierzchnię z bakterią wskaźnikową, wykonuje się próbne czyszczenie zmywanej powierzchni
PL 233 115 B1 za pomocą testowanego preparatu lub techniki myjącej a następnie sprawdza obecność bakterii wskaźnikowej metodą biofluorescencyjną, przy czym stwierdzenie obecność bakterii wskaźnikowej na zmywanej powierzchni świadczy o niedostatecznej skuteczności testowanego preparatu lub techniki myjącej, przy czym jako bakterię wskaźnikową stosuje się Escherichia coli, korzystnie Escherichia coli szczepu BL21(DE3), transformowaną wektorem ekspresyjnym posiadającym sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 3. Korzystnie, bakteria wskaźnikowa stosowana jest w mieszaninie ze znanymi preparatami bakterii probiotycznych, a monitorowanie techniki myjącej obejmuje ocenę zamiany istniejącej populacji mikrobiologicznej przez bakterie probiotyczne.
Zgodnie z wynalazkiem rekombinantowa bakteria Escherichia coli, niosąca sklonowany i eksprymowany gen, kodujący Białko Zielonej Fluorescencji GFP, może być stosowana w:
- zawiesinie żywych komórek w procedurach oceny efektywności zmywania powierzchni,
- mieszaninie z preparatami bakterii probiotyków w procedurach oceny efektywności zmywania powierzchni za pomocą testu biofluorescencyjnego,
- mieszaninie z preparatami bakterii probiotyków w procedurach oceny zamiany istniejącej populacji mikroorganizmów, w tym wskaźnikowych mikrobiologicznych zanieczyszczeń chorobotwórczych i ściekowych za pomocą testu biofluorescencyjnego.
Zgodnie z wynalazkiem stosowane są szczepy bakterii Escherichia coli, oryginalnie izolowanej z przewodu pokarmowego człowieka, a które to szczepy zostały poddane zabiegom manipulacji genetycznej, w taki sposób, że nie są one zdolne do kolonizacji przewodu pokarmowego człowieka ani do przeżycia w środowisku naturalnym poza laboratorium. Dodatkowo, stosowane bakterie Escherichia coli, niosą sklonowany na plazmidzie ekspresyjnym gen izolowany z meduzy Aequorea victoria, kodujący Białko Zielonej Fluorescencji GFP. Bakterie produkujące Białko Zielonej Fluorescencji GFP podczas naświetlania światłem niebieskim, fioletowym lub ultrafioletowym emituje silną zieloną fluorescencję, która jednoznacznie pozwala na odróżnienie kolonii tych bakterii lub pojedynczych komórek na obrazie w mikroskopie fluorescencyjnym od pozostałych gatunków bakterii i innych mikroorganizmów. Uzyskane bakterie wskaźnikowe mogą znaleźć szereg zastosowań, w szczególności nadają się do monitorowania skuteczności działania preparatów i technik zmywania powierzchni oraz zamiany istniejącej populacji mikroorganizmów przez bakterie stanowiące składniki probiotyków.
Sposób według wynalazku może znaleźć szereg zastosowań, w szczególności nadaje się do testowania nowych formulacji preparatów zmywających, nowych urządzeń i technologii zmywających, badania efektywności usuwania bakterii zanieczyszczających, chorobotwórczych i ściekowych oraz zamiany tych mikroorganizmów na nieszkodliwe dla człowieka i zwierząt bakterie probiotyków, pomagając trwale utrzymać bakterie probiotyków na zmywanych powierzchniach. Postęp usuwania niepożądanych mikroorganizmów korzystnie obserwuje się, monitorując obecność wskaźnikowych mikrobiologicznych zanieczyszczeń, najczęściej używanym wskaźnikiem jest tzw. miano coli, czyli stężenie komórek bakterii Escherichia coli, naturalnie wydalanych w dużych ilościach przez człowieka i zwierzęta.
P r z y k ł a d 1. Ogólny schemat realizacji sposobu według wynalazku.
Na testowaną powierzchnię nanoszone są zawiesiny bakterii wskaźnikowych, zawierające klonowany gen kodujący GFPuv, preferencyjnie, ale nie wyłącznie, jest to bakteria Escherichia coli, posiadająca modyfikacje chromosomu, polegające na umieszczeniu w nim genu kodującego RNA polimerazę z bakteriofaga T7 pod kontrolą promotora lac, który może zostać zaindukowany do produkcji mRNA i polimerazy T7 poprzez podanie laktozy lub jej analogu izopropylotiogalaktozydu (IPTG) oraz zawierająca gen, kodujący białko fluorescencyjne, preferencyjnie Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv, umieszczony na plazmidzie-wektorze ekspresyjnym w taki sposób, że poprzedzony jest on kodonem startu translacji ATG, sekwencją rozpoznawaną przez rybosomy Shine-Delgarno oraz promotorem bakteriofaga T7, pozwalające wspólnie na wydajną i kontrolowaną biosyntezę Białka Zielonej Fluorescencji GFP lub innego białka fluorescencyjnego. Nanoszone zawiesiny bakterii wskaźnikowych mogą być w postaci homogennej mikrobiologicznie lub w mieszaninach z innymi bakteriami, m.in. bakteriami stanowiącymi komponenty probiotyku Bacilox®, należącymi preferencyjnie, ale nie wyłącznie, do rodzaju Bacillus sp.. Po naniesieniu bakterii na powierzchnię zmywaną pobierana jest próbka, zarówno przed jak i po procedurze zmywania, zgodnie z zasadami czystości mikrobiologicznej, preferencyjnie za pomocą jałowej ezy mikrobiologicznej, jałowego próbnika do pobierania wymazów lub nośnika zawierającego zestaloną, jałową pożywkę mikrobiologiczną. Obecność bakterii zawierających Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv oraz ich proporcję do pozostałych bakterii stwierdza się następnie za pomocą bezpośredniej obserwacji w mikroskopie fluorescencyjnym lub też, po odpowiednim okresie inkubacji w pożywce mikrobiologicznej w temperaturze typowo 30-37°C i indukcji ekspresji genu, ko
PL 233 115 B1 dującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv, stwierdza się za pomocą obserwacji wyhodowanych kolonii bakterii w świetle ultrafioletowym.
P r z y k ł a d 2. Klonowanie w bakterii Escherichia coli genu kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv do plazmidu-wektora ekspresyjnego.
W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 1 i 2 zaprojektowano i zrealizowano klonowanie genu kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv w bakterii Escherichia coli, znanego, komercyjnie dostępnego laboratoryjnego szczepu ekspresyjnego BL21(DE3) (pełen genom szczepu Escherichia coli BL21(DE3) jest dostępny w GenBank patrz: NCBI Reference Sequence: NC_012971.2).
Sekwencję nukleotydową genu kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv oraz eksprymowanego polipeptydu wraz z zaznaczonymi (zielone podkreślenie) resztami aminokwasowymi tworzącymi chromofor przedstawia Fig. 1. Fig. 2 przedstawia mapę genetyczną ekspresyjnego konstruktu plazmidowego pET21d(+)-GFP-7, gdzie gen kodujący Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv sklonowano do wektora pET21d(+) pod kontrolą promotora bakteriofaga T7. W oparciu o sekwencję nukleotydową genu oraz sekwencje otaczające, zaprojektowano startery do Reakcji Łańcuchowej Polimerazy (PCR):
5’-GGGGTCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGA-3’ oraz 5’-CCAGACAAGTTGGTAATGGTAGCGAC-3’, które zastosowano do powielenia genu kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv, będącego wariantem mutacyjnym Białko Zielonej Fluorescencji GFP, oznaczanego w literaturze również jako ‘GFP cycle 3’.
Ward i in. Green Fluorescent Protein, Properties, Applications and Protocols Wileyliss, New York 45-75 (1998) ujawniają, że gen ten jest znamienny tym, że koduje trzy mutacje: F99S, M153T oraz Val163A, w rezultacie których wzrasta 2-3 krotnie ekspresja GFPuv w Escherichi coli, a intensywność biofluorescencji ok. 18 razy w stosunku do naturalnego Białka Zielonej Fluorescencji GFP, tym samym taki wariant białka jest preferowany w konstrukcji układów monitorowania procesów na drodze biologicznej. Matrycą zastosowaną w Reakcji Łańcuchowej Polimerazy (PCR), niosącą zmutowany gen, był plazmid pGFPuv. Cykl powielania zawierał etap denaturacji w 97°C - 2 min 30 sec, po czym 40 cykli zmian temperatury: 94°C - 30 s, 55°C - 30 s, 72°C - 30s oraz etapy końcowe 72°C - 1 min 30 s. Reakcję prowadzono w objętości 100 gl za pomocą 1,5 jednostki mieszaniny Taq DNA polimerazy oraz Pfu DNA polimerazy. Powielony DNA, zawierający gen wariantu mutacyjnego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv, oczyszczono za pomocą wiązania do włókien szklanych w obecności soli chaotropowych, a następnie strawiono endonukleazami restrykcyjnymi BspHI oraz EcoRI, których sekwencje rozpoznawane zostały wprowadzone na zastosowanych starterach. Podobnie, zastosowano plazmid-wektor ekspresyjny pET21d(+), którego DNA zostało przecięte endonukleazami restrykcyjnymi Ncol oraz EcoRI, umożliwiając kierunkowe klonowanie segmentu DNA, niosącego gen Białka Zielonej Fluorescencji GFPuv. Zastosowano sposób łączenia DNA wektora i DNA kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv przez ligazę DNA bakteriofaga T4 w taki sposób, że nastąpiło precyzyjne połączenie sygnałów startu transkrypcji i translacji wektora pET21d(+) z odcinkiem kodującym Otwartą Ramę Odczytu ORF, kodującą polipeptyd Białka Zielonej Fluorescencji GFPuv. Uzyskaną mieszaninę ligacyjną poddano transformacji do bakterii Escherichia coli DH5a. Uzyskane klony posłużyły do izolowania plazmidowego DNA, który poddano analizie restrykcyjnej oraz sekwencjonowaniu DNA. Wybrano plazmid pET21d(+)-GFP-7 o właściwej sekwencji, zawierający niezmienione w stosunku do genetycznej bazy danych GenBank (a zatem nie zawierające niechcianych mutacji) sekwencje genu kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv oraz transformowano go do szczepu ekspresyjnego, dedykowanego do wektora pET21d(+), uzyskując klon Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7.
P r z y k ł a d 3. Ekspresja klonowanego w bakterii Escherichia coli BL21(DE3) genu, kodującego Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv.
Skonstruowany zgodnie z opisem podanym w przykładzie 2 klon Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 poddano przykładowej realizacji ekspresji genetycznej za pomocą eksperymentów transformacji bakterii Escherichia coli BL21(DE3), a następnie hodowli rekombinantowych bakterii w temperaturze 30°C na podłożu mikrobiologicznym TB o składzie na 1 L: trypton 12 g, ekstrakt drożdżowy 24 g, glicerol 4 ml, KH2PO4 2,31 g, K2HPO4 12,54 g. Po osiągnięciu gęstości optycznej OD=0,6 i indukcji ekspresji genu za pomocą 1 mM izopropylotiogalaktozydu (IPTG), hodowlę prowadzono przez kolejne 12 godzin, pobierając próbki w interwałach czasowych, celem analizy mającej określić zawartość Białko Zielonej Fluorescencji GFPuv w rekombinantowych bakteriach.
PL 233 115 B1
W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 3 ujawniono wynik elektroforezy białek w warunkach denaturujących (SDS-PAGE) próbek pobranych z ekspresyjnej hodowli Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7. Rozdział elektroforetyczny prowadzono w 10% żelu poliakrylamidowym, nanosząc: na ścieżkę 1, marker wielkości białek; na ścieżkę 2, zlizowane komórki Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 przed indukcją izopropylotiogalaktozydu (IPTG); ścieżki 3-10, kolejno próbki komórek po czasie: 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 12 godzinach od indukcji. Żel wybarwiany przy pomocy Coomassie Brillant Blue R wskazuje na pojawienie się w indukowanych rekombinantowych komórkach bakterii białka o oczekiwanej wielkości ok. 25 kDa, które jest nieobecne w komórkach nieindukowanych. Ewidentna jest masywna ekspresja Białka Zielonej Fluorescencji GFP. Natychmiast po dodaniu inducera izopropylotiogalaktozydu (IPTG) eksprymowane heterologiczne białko jest obecne w ilości przewyższającej każde obecne na żelu SDS-PAGE białka endogenne bakterii Escherichia coli; poziom ekspresji wzrasta jeszcze kilkukrotnie w kolejnych godzinach hodowli. Tym samym osiągnięty został maksymalny poziom biosyntezy Białka Zielonej Fluorescencji GFPuv dostępny w bakterii Escherichia coli, warunkujący wysoką czułość metody monitorowania technologii zmywania powierzchni oraz wymiany istniejącej populacji mikroorganizmów na bakterie probiotyku. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 4 ujawniono wynik biofluorescencji kolonii Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 indukowanych 1 mM izopropylotiogalaktozydem (IPTG), uzyskanych na podłożu TB zestalonym agarem i obserwowanych w świetle ultrafioletowym.
Przyk ła d 4. Zakres temperatur przeżywalności klonu Escherichia coli BL21(DE3) [pET21d(+)- GFP-7, niosącego gen Białka Zielonej Fluorescencji GFPuv w obecności bakterii probiotyku.
Celem ustalenia zakresu temperatur, przydatnych do testu efektywności zmywania powierzchni z zastosowaniem klonu Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 oraz zamiany istniejącej populacji mikrobiologicznej przez bakterie probiotyku wykonano inkubacje hodowli w/w klonu zmieszanego z hodowlą bakterii probiotyku w proporcji 1 : 1 w przeliczeniu na gęstość optyczną, w zakresie temperatur 35-60°C przez 1 godzinę. Szereg rozcieńczeń był etapem pożądanym, celem ustalenia odpowiedniej proporcji mieszanych kultur bakteryjnych, ze względu na różny stopień rozpraszania światła przez komórki Escherichia coli oraz bakterie Bacillus sp. probiotyku uzyskiwany podczas pomiarów turbidometrycznych. Czas inkubacji ustalono arbitralnie jako typowo maksymalny czas trwania procedury zmywania. Po 1-godzinnej inkubacji w w/w temperaturach, próby schłodzono do temp. 20°C, wykonano seryjne rozcieńczenia w płynnej pożywce TB w temperaturze 20°C oraz wysiano na podłoże TB zestalone agarem, zawierające 1 mM izopropylotiogalaktozyd (IPTG), i inkubowano 24 h w temperaturze 37°C. W przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 5 ujawniono wynik biofluorescencji kolonii mieszanej kultury bakteryjnej, zawierającej Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)GFP-7 oraz Bacillus sp. probiotyku, indukowanych 1 mM izopropylotiogalaktozydem (IPTG), hodowanych na podłożu TB zestalonym agarem i obserwowanych w świetle widzialnym (panel A) oraz ultrafioletowym (panel B). Fotografie oznaczone K opisują eksperyment kontrolny, gdzie mieszana kultura nie była poddana inkubacji w w/w temperaturach lecz bezpośrednio wysiana na podłoże TB.
P r z y k ł a d 5. Monitorowanie efektywności zmywania powierzchni za pomocą testu biofluorescencyjnego z zastosowaniem klonu Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 oraz efektywność zamiany istniejącej flory mikrobiologicznej przez bakterie probiotyku. BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7.
Celem weryfikacji założeń teoretycznych zastosowania biofluorescencji w procedurach monitorowania efektywności zmywania i zamiany flory bakteryjnej w przykładowej realizacji zaprezentowanej na Fig. 6 ujawniono wynik biofluorescencji kolonii mieszanej kultury bakteryjnej, zawierającej Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 oraz Bacillus sp. probiotyku, indukowanych 1 mM izopropylotiogalaktozydem (IPTG), które zostały zastosowane w cyklu zmywania w standardowej kuchennej zmywarce naczyń z zastosowaniem komercyjnie dostępnego preparatu detergentowego w saszetce wytwarzanego przez Grupę INCO. Zmywanie wykonano w temperaturze 45°C, która mieści się w zakresie żywotności bakterii Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 jak wskazano w przykładzie 4 na Fig. 5, celem oceny efektywności zmywania i zamiany flory bakteryjnej, gdzie bakteriobójczy efekt temperatury dla Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7 jest zminimalizowany. Tym samym, w przykładzie na Fig. 6 monitorowany jest głównie efekt zmywający i bakteriobójczy dla bakterii, będącej wskaźnikiem zanieczyszczeń ściekowych i chorobotwórczych zastosowanego preparatu produkowanego przez Grupę INCO. Tym samym zastosowany test jest wysoce precyzyjny, pozwalający na ocenę poszczególnych czynników, takich jak temperatura oraz kompozycje chemiczne zastosowane w zmywaniu. W przykładzie 5 przed cyklem zmywania wewnętrzna powierzchnia zmywarki została równomiernie spryskana mieszaniną bakterii, ujawnionej w przykładzie 4. Następnie
PL 233 115 B1 zastosowano cykl zmywania z zastosowaniem komercyjnie dostępnego preparatu produkowanego przez Grupę INCO. Przed i po zastosowaniu cyklu zmywania pobrano odcisk powierzchni wewnętrznej zmywarki na płytkę Petriego, zawierającą podłoże TB zestalonym agarem oraz 1 mM izopropylotiogalaktozyd (IPTG), inkubowano płytki w temperaturze 37°C przez 24 h oraz obserwowano i fotografowano w świetle widzialnym oraz ultrafioletowym. W przykładzie 5 na Fig. 6 na płytce Petriego zawierającej odcisk pobrany przed cyklem zmywania, obserwowane są w świetle widzialnym kolonie bakterii o różnej, aczkolwiek zbliżonej morfologii i kolorze, niemożliwe do zróżnicowania gatunkowego na podstawie analizy wizualnej, natomiast w świetle ultrafioletowym ewidentnie odróżnialne wizualnie są Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7, wykazujące silną zieloną fluorescencję. Największe zgrupowanie biofluoryzujących kolonii oznaczono białą strzałką. Natomiast na odcisku po cyklu zmywania nieobecne są podczas obserwacji w świetle ultrafioletowym kolonie biofluoryzujące na zielono, tym samym wskazuje to na efektywne usunięcie wskaźnikowych bakterii Escherichia coli BL21(DE3)[pET21d(+)-GFP-7. Kolonie nie wykazujące fluorescencji zarówno przed jak i po cyklu zmywania oraz kontrolnie hodowlę bakterii probiotyku ujawnionej w przykładzie 4 poddano analizie MALDI-TOF celem określenia profilu proteinowego i tym samym precyzyjnego ustalenia przynależności gatunkowej. Wyniki dla kolonii niefluoryzujących przed i po cyklu zmywania wskazały na taki sam skład gatunkowy jak w hodowli kontrolnej, ujawnionej w przykładzie 4, wykrywając 4 gatunki z rodzaju Bacillus, charakteryzujące się wysoką termostabilnością oraz produkcją endospor: Bacillus mojavensis, Bacillus vallismortis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis. Wynik ten jest zgodny z danymi producenta probiotyku BPB-100 (Osprey Biotechniques, Sarasota, FL, USA) oraz danymi literaturowymi (Jeżewska-Frąckowiak J. i in. „Microbiological characterization of mezo-thermophilic endospore-producing Bacillus species isolated from industrial probiotics.” Journal of Bioscience, w recenzjach). Tym samym wykazana została efektywność testu biofluorescencyjnego w monitorowaniu usuwania wskaźnikowej flory bakteryjnej oraz jej zamiana i kolonizacja zmywarki przez bakterie probiotyku.
PL233 115 Β1
Lista sekwencji
| <110> | GRUPA INCO S.A. | ||
| <120> | Transformowana komórka Escherichia coli oraz | sposób oceny | |
| skuteczności preparatów lub technik myjących powierzchni | w zmywaniu | ||
| <130> | PK/3516/RW | ||
| <160> | 3 | ||
| <170> | Patentln version 3.5 | ||
| <210> | 1 | ||
| <211> | 36 | ||
| <212> | DNA | ||
| <213> | artifi ciał | ||
| <220> <223> | starter 1 | ||
| <400> | 1 | ||
| ggggtcatga gtaaaggaga agaacttttc actgga | 36 |
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
DNA arti fi ci al starter 2 <400> 2 ccagacaagt tggtaatggt agcgac <210> 3 <211> 6122 <212> DNA <213> artifi ciał <220>
<223> pET21d(+)-GFP-7 <400> 3
| catgagtaaa | ggagaagaac | ttttcactgg | agttgtccca | attcttgttg | aattagatgg | 60 |
| tgatgttaat | gggcacaaat | tttctgtcag | tggagagggt | gaaggtgatg | caacatacgg | 120 |
| aaaacttacc | cttaaattta | tttgcactac | tggaaaacta | cctgttccat | ggccaacact | 180 |
| tgtcactact | ttctcttatg | gtgttcaatg | cttttcccgt | tatccggatc | atatgaaacg | 240 |
| gcatgacttt | ttcaagagtg | ccatgcccga | aggttatgta | caggaacgca | ctatatcttt | 300 |
| caaagatgac | gggaactaca | agacgcgtgc | tgaagtcaag | tttgaaggtg | atacccttgt | 360 |
| taatcgtatc | gagttaaaag | gtattgattt | taaagaagat | ggaaacattc | tcggacacaa | 420 |
| actcgagtac | aactataact | cacacaatgt | atacatcacg | gcagacaaac | aaaagaatgg | 480 |
| aatcaaagct | aacttcaaaa | ttcgccacaa | cattgaagat | ggatccgttc | aactagcaga | 540 |
| ccattatcaa | caaaatactc | caattggcga | tggccctgtc | cttttaccag | acaaccatta | 600 |
| cctgtcgaca | caatctgccc | tttcgaaaga | tcccaacgaa | aagcgtgacc | acatggtcct | 660 |
PL233 115 Β1 tcttgagttt aattaattcg ctgagatccg gcaataacta aggaggaact gcgggtgtgg cctttcgctt aatcgggggc cttgattagg ttgacgttgg aaccctatct ttaaaaaatg acaatttcag taaatacatt tattgaaaaa gcggcatttt gaagatcagt cttgagagtt tgtggcgcgg tattctcaga atgacagtaa ttacttctga gatcatgtaa gagcgtgaca gaactactta ej C O. CJ CJ 3 C C 3. c gccggtgagc cgtatcgtag atcgctgaga tatatacttt ctttttgata gaccccgtag tgcttgcaaa ccaactcrrt gtaactgctg agctccgtcg gctgctaaca gcataacccc atatccggat tggttacgcg tcttcccttc tccctttagg gtgatggttc agtccacgtt cggtctattc agctgattta gtggcacttt caaatatgta ggaagagtat gccttcctgt tgggtgcacg ttcgccccga tattatcccg atgacttggt gagaattatg caacgatcgg ctcgccttga ccacgatgcc ctctagcttc gtgggtctcg ttatctacac taggtgcctc agattgattt atctcargac aaaagatcaa caaaaaaacc ttccgaaggt ctgggattac acaagcttgc aagcccgaaa ttggggcctc tggcgaatgg cagcgtgacc ctttctcgcc gttccgattt acgtagtggg ctttaatagt ttttgattta acaaaaattt tcggggaaat tccgctcatg gagtattcaa ttttgctcac agtgggrtac agaacgtttt tattgacgcc tgagtactca cagtgctgcc aggaccgaag tcgttgggaa tgcagcaatg ccggcaacaa ggcccttccg cggtatcatt gacggggagt actgattaag aaaacttcat caaaarcccT aggatcttct accgctacca aactggcttc acatggcatg ggccgcactc ggaagctgag taaacgggtc gacgcgccct gctacacttg acgttcgccg agtgctttac ccatcgccct ggactcttgt taagggattt aacgcgaatt gtgcgcggaa agacaataac catttccgtg ccagaaacgc atcgaactgg ccaatgatga gggcaagagc ccagtcacag ataaccatga gagctaaccg ccggagctga gcaacaacgt ttaatagact gctggctggt gcagcactgg caggcaacta cattggtaac ttttaattta taacgrgagr tgagatcctt gcggtggttt agcagagcgc gatgagctct gagcaccacc ttggctgctg ttgaggggtt gtagcggcgc ccagcgccct gctttccccg ggcacctcga gatagacggt tccaaactgg tgccgatttc ttaacaaaat cccctatttg cctgataaat tcgcccttat tggtgaaagt atctcaacag gcacttttaa aactcggtcg aaaagcatct gtgataacac cttttttgca atgaagccat tgcgcaaact ggatggaggc ttattgctga ggccagatgg tggatgaacg tgtcagacca aaaggatcta ttrcgtrcca tttttctgcg gtttgccgga agataccaaa acaaataatg accaccacca ccaccgctga ttttgctgaa atraagcgcg agcgcccgct tcaagctcta ccccaaaaaa ftttcgccct aacaacactc ggcctattgg attaacgttt tttatttttc gcttcaataa tccctttttt aaaagatgct cggtaagatc agttctgcta ccgcatacac tacggatggc tgcggccaac caacatgggg accaaacgac attaactggc ggataaagtt taaatctgga taagccctcc aaatagacag agtttactca ggtgaagatc ctgagcgtca cgtaatctgc tcaagagcta TactgtccTt
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2100
2160
2220
2280
2340
2400
2460
2520
2580
2640
2700
PL233 115 Β1 ctagtgtagc gctctgctaa ttggactcaa tgcacacagc ctatgagaaa agggtcggaa agtcctgtcg gggcggagcc tggccttttg accgcctttg gtgagcgagg atttcacacc gccagtatac aacacccgct tgtgaccgtc gaggcagctg ttcatccgcg gcgggccatg atttctgttc tactgatgat gatgcggcgg tgtaggtgtt gcagggcgct tgttgttgct cggtgattca caggagcacg gccgaaacgt gaataccgca aatgacccag aagtgcggcg tctcaagggc gtrgcgctca cggccaacgc ccagtgagac cgtagttagg tcctgttacc gacgatagtt ccagcttgga gcgccacgct caggagagcg ggtttcgcca tatggaaaaa ctcacatgtt agtgagctga aagcggaaga gcatatatgg actccgctat gacgcgccct tccgggagct cggtaaagct tccagctcgt ttaagggcgg atgggggtaa gaacatgccc gaccagagaa ccacagggta gacttccgcg caggtcgcag ttctgctaac atcatgcgca ttggtggcgg agcgacaggc agcgctgccg acgatagtca atcggtcgag ctgcccgcrt gcggggagag gggcaacagc ccaccacttc agtggctgct accggataag gcgaacgacc tcccgaaggg cacgagggag cctctgactt cgccagcaac cttrccrgcg taccgctcgc gcgcctgatg tgcactctca cgctacgtga gacgggcttg gcatgtgtca catcagcgtg tgagtttctc ttttttcctg tgataccgat ggttactgga aaatcactca gccagcagca tttccagact acgttttgca cagtaaggca cccgtggggc gaccagtgac cgatcatcgt gcacctgtcc tgccccgcgc atcccggtgc tccagtcggg gcggtttgcg tgattgccct aagaactctg gccagtggcg gcgcagcggt tacaccgaac agaaaggcgg cttccagggg gagcgtcgat gcggcctttt ttatcccctg cgcagccgaa cggtattttc gtacaatctg ctgggtcatg tctgctcccg gaggttttca gtcgtgaagc cagaagcgtt tttggtcact gaaacgagag acgttgtgag gggtcaatgc tcctgcgatg ttacgaaaca gcagcagtcg accccgccag cgccatgccg gaaggcttga cgcgctccag tacgagttgc ccaccggaag ctaatgagtg aaacctgrcg tattgggcgc tcaccgcctg tagcaccgcc ataagtcgtg cgggctgaac tgagatacct acaggtatcc gaaacgcctg ttttgtgatg tacggttcct artctgrgga cgaccgagcg tccttacgca ctctgatgcc gctgcgcccc gcatccgctt ccgtcatcac gattcacaga aatgtctggc gatgcctccg aggatgctca ggtaaacaac cagcgcttcg cagatccgga cggaaaccga cttcacgttc cctagccggg gcgataatgg gcgagggcgt cgaaagcggt atgataaaga gagctgactg agctaactta tgccagctgc cagggtggtt gccctgagag tacatacctc tcttaccggg ggggggttcg acagcgtgag ggtaagcggc gtatctttat ctcgtcaggg ggccttttgc taaccgtatt cagcgagtca tctgtgcggt gcatagttaa gacacccgcc acagacaagc cgaaacgcgc tgtctgcctg ttctgataaa tgtaaggggg cgatacgggt tggcggtatg ttaatacaga acataatggt agaccattca gctcgcgtat tcctcaacga cctgcttctc gcaagattcc cctcgccgaa agacagtcat ggttgaaggc cattaattgc atraargaar tttcttttca agttgcagca
2760
2820
2880
2940
3000
3060
3120
3180
3240
3300
3360
3420
3480
3540
3600
3660
3720
3780
3840
3900
3960
4020
4080
4140
4200
4260
4320
4380
4440
4500
4560
4620
4680
4740
PL233 115 Β1 agcggtccac ggatataaca cgcgcagccc ccagcatcgc acatggcact atttatgcca gcgcgatttg catgggagaa gaacattagt tgatcagccc cgccgcttcg taatcgccgc tcagcaacga ccgccatcgc ccacgcggga ctggtttcac gaaaggrrri tgcattagga ggtgcatgca acgccgaaac tcggcgatat ccggcgtaga tgtgagcgga ac gctggtttgc tgagctgtct ggactcggta agtgggaacg ccagtcgcct gccagccaga ctggtgaccc aataatactg gcaggcagct actgacgcgt ttctaccatc gacaatttgc ctgtttgccc cgcttccact aacggtctga attcaccacc gcgccattcg agcagcccag aggagatggc aagcgctcat aggcgccagc ggatcgagat taacaattcc cccagcaggc tcggtatcgt atggcgcgca atgccctcat tcccgttccg cgcagacgcg aatgcgacca ttgatgggtg tccacagcaa tgcgcgagaa gacaccacca gacggcgcgt gccagttgtt ttttcccgcg taagagacac ctgaattgac atggtgtccg tagtaggttg gcccaacagt gagcccgaag aaccgcacct ctcgatcccg cctctagaaa gaaaatcctg cgtatcccac ttgcgcccag tcagcatttg ctatcggctg ccgagacaga gatgctccac tctggtcaga tggcatcctg gattgtgcac cgctggcacc gcagggccag gtgccacgcg ttttcgcaga cggcatactc tctcttccgg ggacctcgac aggccgttga cccccggcca tggcgagccc gtggcgccgg cgaaattaat taattttgtt tttgatggtg taccgagata cgccatctga catggtttgt aatttgattg acttaatggg gcccagtcgc gacatcaaga gtcatccagc cgccgcftta cagttgatcg actggaggtg gttgggaatg aacgtggctg tgcgacatcg gcgctatcat gctctccctt gcaccgccgc cggggcctgc gatcttcccc tgatgccggc acgactcact taactttaag gttaacggcg tccgcaccaa tcgttggcaa tgaaaaccgg cgagtgagat cccgctaaca gtaccgtctt aataacgccg ggatagttaa caggcttcga gcgcgagatt gcaacgccaa taattcagct gcctggttca tataacgtta gccataccgc atgcgactcc cgcaaggaat caccataccc atcggtgatg cacgatgcgt ataggggaat aaggagatat
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5760
5820
5880
5940
6000
6060
6120
6122
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Komórka Escherichia coli transformowana wektorem ekspresyjnym posiadającym sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 3, przy czym korzystnie jest ona transformowaną komórką Escherichia coli szczepu BL21(DE3), do oceny skuteczności preparatów i technik myjących w zmywaniu powierzchni.
- 2. Sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni, znamienny tym, że kontaktuje się zmywaną powierzchnię z bakterią wskaźnikową, wykonuje się próbne czyszczenie zmywanej powierzchni za pomocą testowanego preparatu lub techniki myjącej a następnie sprawdza obecność bakterii wskaźnikowej metodą biofluorescencyjną, przy czym stwierdzenie obecność bakterii wskaźnikowej na zmywanej powierzchni świadczy o niedostatecznej skuteczności testowanego preparatu lub techniki myjącej, przy czym jako bakterię wskaźnikową stosuje się Escherichia coli, korzystnie Escherichia coli szczepu BL21(DE3), transformowaną wektorem ekspresyjnym posiadającym sekwencję nukleotydową przedstawioną jako Sekw. Id. Nr 3.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że bakteria wskaźnikowa stosowana jest w mieszaninie ze znanym preparatem bakterii probiotycznych, a ocena techniki myjącej obejmuje obserwowanie zamiany istniejącej populacji mikrobiologicznej przez bakterie probiotyczne.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415436A PL233115B1 (pl) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Transformowana komórka Escherichia coli oraz sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415436A PL233115B1 (pl) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Transformowana komórka Escherichia coli oraz sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415436A1 PL415436A1 (pl) | 2017-07-03 |
| PL233115B1 true PL233115B1 (pl) | 2019-09-30 |
Family
ID=59201281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415436A PL233115B1 (pl) | 2015-12-29 | 2015-12-29 | Transformowana komórka Escherichia coli oraz sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL233115B1 (pl) |
-
2015
- 2015-12-29 PL PL415436A patent/PL233115B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415436A1 (pl) | 2017-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3404716B2 (ja) | 耐熱性が向上し、かつ、プライマーエクステンションの長さと効率が向上したｄｎａポリメラーゼ | |
| IE921291A1 (en) | Improvement of the yield when disulfide-bonded proteins are secreted | |
| CN111893104B (zh) | 一种基于结构的crispr蛋白的优化设计方法 | |
| CN112553176B (zh) | 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶 | |
| CN110923183A (zh) | 产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法 | |
| CN107206096B (zh) | 碳硅烷树枝状体及用于药物递送系统的使用该树枝状体获得的可聚集载体 | |
| CN110108884A (zh) | 一种对于犬瘟热病毒及抗体的elisa检测方法 | |
| CN106755031B (zh) | 鼠李糖脂生产质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌和应用 | |
| CN112553177B (zh) | 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体 | |
| CN114317473B (zh) | 一种催化活性和热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶变体 | |
| CN112813087A (zh) | 一种SalI限制性内切酶的制备方法 | |
| RU2792132C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме | |
| CN109402109B (zh) | 一种改进的重叠延伸pcr方法 | |
| PL233115B1 (pl) | Transformowana komórka Escherichia coli oraz sposób oceny skuteczności preparatów lub technik myjących w zmywaniu powierzchni | |
| RU2774333C1 (ru) | Рекомбинантная плазмида pET-GST-3CL-GPG, обеспечивающая синтез протеазы 3CL SARS-CoV-2 в клетках E.coli в растворимой форме | |
| CN115247175A (zh) | 构建setdb1基因突变的表观遗传失调模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 | |
| CN115232793A (zh) | 用于构建sod1基因突变的als模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 | |
| CN115247153A (zh) | 用于构建hnf1a基因突变的糖尿病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 | |
| CN113234746B (zh) | 一种农药诱导蛋白互作和诱导基因表达的方法 | |
| KR100902634B1 (ko) | 재조합 ｈｍｇｂ1 펩티드를 포함하는 핵산 전달 복합체 | |
| CN107075495B (zh) | 裂解酶和编码该裂解酶的dna、含该dna的载体以及用于不对称合成(s)-苯基乙酰基甲醇的方法 | |
| CN104328136A (zh) | 鸡新城疫病毒毒株rClone30-fliC的制备及其在鸡新城疫病防治中的应用 | |
| CN113755512B (zh) | 一种制备串联重复蛋白质的方法与应用 | |
| CN115232813B (zh) | 用于构建vWF基因突变的血管性血友病模型猪核移植供体细胞的基因编辑系统及其应用 | |
| CN111748034A (zh) | 一种滑液囊支原体单克隆抗体的制备方法 |