PL228718B1 - Sposób otrzymywania ergosterolu z suchej biomasy pochodzenia grzybowego - Google Patents

Description

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)228718 (13) B1 (51) Int.CI.

(21) Numer zgłoszenia: 406288 A61K 31/575 (2006.01)

A61K 36/07 (2006.01) B01D 11/00 (2006.01) (22) Data zgłoszenia: 27.11.2013 ^{B01D 29/00} (²⁰°6.°1)

B01D 9/02 (2006.01) (54) Sposób otrzymywania ergosterolu z suchej biomasy pochodzenia grzybowego

(43) Zgłoszenie ogłoszono: 08.06.2015 BUP 12/15	(73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET PRZYRODNICZY W LUBLINIE, Lublin, PL
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2018 WUP 04/18	(72) Twórca(y) wynalazku: JANUSZ KALBARCZYK, Lublin, PL ANETA SŁAWIŃSKA, Glinne, PL

oo r*.

oo

CM

CM

Q_

PL 228 718 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ergosterolu z suchej biomasy pochodzenia grzybowego.

Kalcyferole, grupa związków chemicznych o charakterze steroidów wykazujących działanie biologiczne właściwe dla witamin z grupy D. Znanych jest kilkanaście związków chemicznych o podobnym działaniu. Tylko dwa znalazły potwierdzone praktyczne zastosowanie. Są to witamina D2, określana jako ergokalcyferol oraz witamina D3 nazywana jako cholekalcyferol. Kalcyferole ujawniają swoją aktywność po biologicznej konwersji wewnątrz naszego organizmu, ukierunkowaną na poprawę przyswajalności jonów wapniowych i fosforanowych w przewodzie pokarmowym.

Witaminy z grupy D przy współdziałaniu z takimi hormonami jak parathormon i kalcytonina decydują o stężeniu jonów Ca²+ w osoczu krwi. Ma to istotne znaczenie dla prawidłowego funkcjonowania całego organizmu. Witaminy z grupy D są produktami fotoizomeryzacji właściwych prekursorów (prowitamin), zachodzącym pod wpływem działania promieni UV.

Prekursorem witaminy D2 jest ergosterol. Ergosterol należy do fitosteroli, substancji aktywnych biologicznie występujących przede wszystkim w roślinach. Bogatym źródłem ergokalcyferolu są drożdże piekarskie. Ergosterole powstają w żywych organizmach na drodze wieloetapowego procesu przemian biochemicznych prowadzących do otrzymania lanosterolu. Substancja ta jest najważniejszym związkiem chemicznym na szlaku biosyntezy steroidów. Biosynteza ergosterolu zachodząca w komórkach grzybów kapeluszowych jak taka sama jak w komórkach drożdży. Dokładna kolejność przemian nie jest znana i traktowana jest jako prawdopodobna. Różni się nieco od procesów zachodzących w komórkach roślinnych. Podstawową biologiczną funkcją witamin D jest regulacja gospodarki wapniowej w organizmie, co jest ściśle związane z regulacją gospodarki fosforanowej. Pozwala to na utrzymanie ściśle określonego, stałego w zdrowym organizmie stężenia jonów Ca²+ w osoczu krwi. Ponadto prawidłowe stężenie jonów wapnia i jonów fosforanowych w płynie pozakomórkowym, a głównie w tkance kostnej jest warunkiem prawidłowego przebiegu procesu mineralizacji kości i zębów. Ten prawidłowy przebieg wymienionych procesów zależy głównie od intensyfikacji wchłaniania wapnia zawartego w pokarmach.

Bardzo mała baza surowcowa i ważna funkcja jaką spełnia witamina D2 w organizmach ludzi i zwierząt oraz mała zawartość witamin D w dotychczas stosowanych źródłach skłania do poszukiwania innych naturalnych źródeł ergosteroli. Naturalne źródła witaminy D2 są bardzo ograniczone a surowce ubogie w składnik biologicznie czynny i w dużym stopniu uzależnione od pory roku. Ryby morskie: śledzie, łososie, dorsze, sardyny, głównie trany (tłuszcze wątrobowe tych ryb) są bogatymi źródłami cholekalcyferolu. Jednakże połowy ryb stają się coraz bardziej ograniczone. Produkty spożywcze pochodzenia zwierzęcego: jaja, mięso cielęce i wołowe, mleko, masło zawierają niewielkie ilości witamin D, przy czym jesienią i zimą te ilości są znacznie mniejsze. Rośliny zawierają znikome ilości witamin D. Owoce i orzechy są całkowicie pozbawione witamin z grupy D. Oleje roślinne charakteryzują się niską zawartością prowitamin D. Zaspokojenie niezbędnych ilości witamin z grupy D dla ludzi określane na 10-12 pg dziennie jest poważnym problemem zdrowotnym dla całej populacji kraju.

Drożdże piekarskie są aktualnie najważniejszym źródłem (surowcem) do otrzymywania ergosterolu na skalę przemysłową. Otrzymywanie metodą biologiczną polega na dokonaniu w pierwszym etapie hydrolizy alkalicznej, enzymatycznej lub kwasowej w zależności od możliwości uzyskania w trakcie trwania procesu dodatkowych produktów takich jak białko paszowe lub witaminy grupy B. Materiałem wyjściowym do hydrolizy są zmielone i wysuszone drożdże. Otrzymany po hydrolizie osad białkowy zawierający ergosterole jest suszony i poddawany ekstrakcji etanolem, zagęszczany, a następnie poddawany hydrolizie roztworem NaOH. Otrzymany koncentrat lipidowo-ergosterolowy poddawany jest krystalizacji i oczyszczaniu.

W publikacji pod tytułem „Distribution ot tree and esterified ergosterols in the medicinal fungus Ganoderma lucidum autorstwa Jian-Ping Yuan, Jiang-Hai Wang oraz Xin Liu przedstawiono wyniki badań dotyczących zawartości wolnego i związanego ergosterolu w różnych częściach grzyba Ganoderma lucidum. Materiał do badań stanowiły owocniki zebrane w lasach z rejonu Fujlan w Chinach. Autorzy jako materiał badawczy wykorzystali zarodniki, frakcję lipidową zarodników oraz owocniki, które podzielono na trzon i kapelusz (górną część kapelusza i dolną warstwę hymenialną). Zarodniki zniszczono za pomocą specjalnego urządzenia, a poszczególne części owocników poddano procesowi mielenia. Następnie wysuszono je w temperaturze 50°C. Należy zaznaczyć, że suszenie gorącym powietrzem powoduje utlenienie wielu związków, w tym ergosterolu. Tak przygotowany susz w ilości 0,5 g mieszano z 10 ml mieszaniny metanol:dichlorometan w stosunku 75:25 v/v, którą poddawano działaniu

PL 228 718 B1 ultradźwięków przez 10 min. Po tym czasie mieszaninę wirowano (10000 x przez 5 min). Krok ten powtarzano 3 razy, po czym oznaczano zawartość ergosterolu z wykorzystaniem HPLC. Otrzymany w ten sposób supernatant zawierał zarówno wolny jak i związany ergosterol.

Rosyjski patent nr RU2074711 ujawnia sposób otrzymywania ergosterolu z lipidowo-tłuszczowego koncentratu odpadów pochodzących z produkcji witamin z drożdży. Koncentrat poddaje się obróbce 1-2%-owym alkoholowym roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego. Jako alkohol stosuje się alkohol etylowy, metylowy lub izopropylowy.

Rosyjski patent nr RU2080389 ujawnia sposób otrzymywania ergosterolu z drożdży przez obróbkę drożdży mieszaniną składającą się z 25-30% NaOH, 15-50% wody i 25-50% izopropanolu. Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do 2-8°C wytrąca się osad ergosterolu, który rozpuszcza się na gorąco w izopropanolu, po czym oddestylowuje się rozpuszczalnik i suszy produkt pod próżnią.

Chińskie zgłoszenie patentowe CN1765916 ujawnia sposób otrzymywania ergosterolu z drożdży przez wytworzenie mieszaniny drożdży, zasady i roztworu chlorku sodu, a następnie ekstrakcję ergosterolu toluenem, po czym następuje oczyszczanie ekstraktu wodą, kondensacja, rafinacja i suszenie próżniowe.

Niemal te same etapy zawiera także inne chińskie zgłoszenie patentowe nr CN1733930: zmydlanie, wprowadzenie toluenu w celu ekstrakcji, ekstrakcja toluenem do otrzymania roztworu, dwa etapy zatężania, oczyszczanie na gorąco oraz doczyszczanie (rafinacja).

Chińska publikacja w China Journal of Chinese Materia Medica, 01/07/2009; 34(14): 1783-5 ujawnia sposób otrzymywania ergosterolu z owocników Ganoderma Lucidum przez ekstrakcję w płynie nadkrytycznym pod ciśnieniem 20 MPa i w temperaturze 45°C, czas ekstrakcji wynosi 1,5 godziny. Metoda ta wymaga kosztownego sprzętu z uwagi na bardzo wysokie ciśnienie ekstrakcji.

Celem niniejszego zgłoszenia jest dostarczenie metody otrzymywania ergosterolu z suchej biomasy grzybów kapeluszowych, a w tym otrzymywania suchej biomasy przydatnej do tego celu.

Istota sposobu otrzymywania ergosterolu z suchej biomasy pochodzenia grzybowego na drodze wieloetapowego procesu zawierającego hydrolizę, filtrację i oczyszczanie, polega na tym, że suchą biomasę pochodzenia grzybowego stanowi liofilizat biomasy uzyskanej z grzybów z gromady podstawczaki, klasa pieczarniaki, podklasa Agaricomycetiade, rząd pieczarkowce lub rząd żagwiowce, przy czym:

a) w pierwszym etapie prowadzi się ekstrakcję lipidów i ergosterolu z liofilizatu przez zalanie go wrzącym etanolem, zaś uzyskaną mieszaninę filtruje się, po czym filtrat zagęszcza się pod próżnią,

b) w drugim etapie filtrat uzyskany w pierwszym etapie poddaję się hydrolizie przy użyciu roztworu NaOH o stężeniu od 40 do 50% w/w, a następnie tak otrzymany produkt podaje się krystalizacji w temperaturze od minus 4 do plus 2°C, po czym oddziela się cząstki surowego ergosterolu od płynu;

c) następnie surowy ergosterol poddaje się rafinacji wodnym roztworem etanolu o stężeniu od 60 do 70% obj., po czym oddestylowuje się etanol,

d) dalej rozpuszcza się ergosterol w mieszaninie składającej się z etanolu i benzenu w stosunku objętościowym odpowiednio od 3 : 1 do 5 : 1;

e) i ponownie prowadzi się krystalizację ergosterolu w temperaturze od minus 4 do plus 2°C. Osad otrzymany z pierwszego etapu poddaje się ekstrakcji wrzącym etanolem, po czy filtruje się, a uzyskany filtrat łączy się filtratem uzyskanym w pierwszym etapie.

Korzystnie, liofilizat otrzymuje się na drodze hodowli fermentorowej, na pożywce zawierającej glukozę, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 x 7H2O, NH4Cl, ekstrakt drożdżowy, w warunkach pH od 4,0 do 5,5, przez 7-21 dni, przy czym masę hodowlaną jednocześnie napowietrza się i miesza się, po czym oddziela się biomasę od płynu pohodowlanego przez odwirowanie i poddaje się liofilizacji, aż do uzyskania zawartości wody od 1,0 do 4,0% wagowych, a następnie wysuszoną biomasę miele się.

Pożywka w 1000 ml korzystnie zawiera 50 g glukozy, 0,5 g K2HPO4, 0,5 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 x 7 H2O, 0,5 g NH4CI i 1 g ekstraktu drożdżowego.

W celu przeprowadzenia liofilizacji biomasę zamraża się do temperatury od minus 30°C do minus 80°C, a następnie podgrzewa się do temperatury od plus 25°C do plus 60°C, przy ciśnieniu 100-170 Pa.

Jako grzyby wybrane z grzyby rzędu pieczarkowców, korzystnie stosuje się Agaricus bispora, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, zaś z grupy rzędu żagwiowców - Ganoderma lucidum.

PL 228 718 B1

W innym przypadku liofilizat otrzymuje się z biomasy uzyskanej z owocników grzybów z rzędu pieczarkowce, przy czym owocniki rozdrabnia się, po czym rozdrobniony materiał poddaje się hydrolizie kwasem solnym, a następnie koagulacji etanolem, filtruje się a uzyskany w ten sposób osad liofilizuje się.

Korzystnie hydrolizę prowadzi się kwasem solnym o stężeniu 30-40%, w temperaturze 100-200°C, przez co najmniej 15 minut, przy czym na 100 kg owocników korzystnie przypada 20 dm³ wody oraz 10 dm³ 36% kwasu solnego.

Natomiast koagulację prowadzi się etanolem o stężeniu 50% obj.

W celu przeprowadzenia liofilizacji biomasę zamraża się do temperatury od minus 30°C do minus 80°C, a następnie podgrzewa się do temperatury od plus 25°C do plus 60°C, przy ciśnieniu 100-170 Pa.

Jako grzyby z rzędu pieczarkowce stosuje się grzyby wybrane z grupy Agaricus bispora, Lentinula edodes (twardziak jadalny), Pleurotus ostreatus.

Zaletą sposobu otrzymywania ergosterolu według wynalazku jest umożliwienie otrzymywania ergosterolu z surowca dostępnego w dużych ilościach (Polska jest największym producentem grzybów w Unii Europejskiej) niezależnie od pory roku - z upraw grzybów w pomieszczeniu, takich jak owocniki pieczarki, boczniaka i twardziaka jadalnego. Surowiec ten jest o wiele tańszy niż stosowane obecnie ryby morskie, krewetki, kraby i tłuszcz wieloryba. Natomiast rozwój produkcji witamin D z owocników grzybów przyczyni się zapewne do dalszego rozwoju produkcji grzybów w Polsce.

Sposób otrzymywania biomasy grzybni przeznaczonej do wytwarzania ergosterolu oraz sposób otrzymywania ergosterolu z tak przygotowanej biomasy są przedstawione w poniższych przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1

1. Świeże lub zamrożone owocniki grzybów rozdrabnia się przy pomocy homogenizatora.

2. Rozdrobniony materiał poddaje się hydrolizie kwasowej w temperaturze 110°C w czasie 30 minut. Na 100 kg owocników stosuje się 20 dm³ wody i 10 dm³ 36% kwasu solnego.

3. Koagulacja białek wodnym roztworem etanolu o stężeniu 50%. Na 100 kg mieszaniny z owocników stosuje się 85 l rektyfikatu.

4. Filtracja przy użyciu bębnowego filtra próżniowego. Otrzymuje się osad składający się z białka i ergosterolu.

5. Liofilizacja do zawartości wody 2%.

6. Rozdrabnianie liofilizatu na młynku kulowym.

7. Otrzymany proszek zalewa się wrzącym etanolem. Na 1 kg mączki grzybowej stosuje się 3 dcm³ rektyfikatu.

8. Ekstrakt etanolowy filtruje się na filtrze próżniowym. Otrzymuje się Filtrat I i osad.

9. Osad poddawany jest ponownie ekstrakcji etanolowej jak w pkt. 7, i po filtrowaniu otrzymuje się Filtrat II.

10. Filtrat II łączy się z Filtratem I, po czym zagęszcza się na wyparce próżniowej. Otrzymuje się koncentrat lipidowo-ergosterolowy.

11. Koncentrat lipidowo-ergosterolowy poddawany jest hydrolizie przy użyciu 45% roztworu NaOH.

12. Zmydlony koncentrat poddaje się krystalizacji w temperaturze 0°C.

13. Otrzymaną zawiesinę filtruje się przez wirowanie.

14. Kryształy surowego ergosterolu poddaje się rafinacji 65% wodnym roztworem etanolu.

15. Otrzymaną mieszaninę filtruje się.

15.A Z otrzymanego przesączu usuwa się etanol przez destylację.

15. B Otrzymuje się odpad produkcyjny.

16. Kryształy częściowo oczyszczonego ergosterolu rozpuszcza się w mieszaninie etanolu i benzenu w proporcji 4 : 1 obj.

17. Rekrystalizacja ergosterolu z roztworu w wyniku jego oziębienia do temp. -2°C.

18. W ten sposób otrzymano kryształy czystego ergosterolu.

P r z y k ł a d 2

I. Maszyny i urządzenia:

1. Fermentor: BioFlo 415, 5-10 l

2. Liofilizator: FreeZone 18 l Skład pożywki głównej:

a) glukoza - 50 g

PL 228 718 B1

b) K2HPO4 - 0,5 g

c) KH2PO4 - 0,5 g

d) MgSO4 x 7H2O - 0,5 g

e) NH4CI - 4 g

f) ekstrakt drożdżowy - 1 g

II. Wszystkie składniki w odniesieniu do 1000 ml.

Kwasowość pożywki ustala się w dostosowaniu do gatunku użytego do hodowli i wynosi dla Agaricus bispora lub Lentinula edodes - pH 5,0-5,5, zaś dla Pleurotus ostreatus, pH 4,0-4,5.

III. Warunki hodowli

a) Temperatura dla Agaricus bispora 25-28°C, Lentinula edodes - 24-28°C, zaś dla Pleurotus ostreatus - 25-30°C, Ganoderma lucidum - 27-30°C

b) Napowietrzanie

c) Intensywność mieszania 70 obr/min

d) Czas hodowli: Lentinula edodes i inne pieczarniaki 15-21 dni, Ganoderma lucidum - 10 dni

IV. Otrzymywanie biomasy

a) Po skończonej hodowli kuleczki grzybni oddziela się od płynu pohodowlanego poprzez wirowanie (4000 g /15 min)

b) Biomasę grzybni o zawartości wilgoci 94% poddaje się liofilizacji

V. Warunki liofilizacji

1. Odwirowana biomasa grzybni jest zamrażana w temperaturze minus 30°C i przechowywana do czasu sublimacji.

2. Zamrożona biomasa grzybni jest umieszczana na półkach liofilizatora podgrzanych do temperatury +60°C.

3. Sublimację przeprowadza się przy ciśnieniu 130 Pa do uzyskania zawartości wody na poziomie 2,2%. Kontrolę zawartości wilgoci wykonuje się w laboratorium.

4. Substancje po suszeniu sublimacyjnym rozdrabnia się przez mielenie.

Otrzymany proszek stosowany jest do otrzymywania ergosterolu zgodnie z procedurą opisaną w Przykładzie 1, pkt 7 i następne.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania ergosterolu z suchej biomasy pochodzenia grzybowego, na drodze wieloetapowego procesu zawierającego hydrolizę, filtrację i oczyszczanie, znamienny tym, że suchą biomasę pochodzenia grzybowego stanowi liofilizat biomasy uzyskanej z grzybów z gromady podstawczaki, klasa pieczarniaki, podklasa Agaricomycetiade, rząd pieczarkowce lub rząd żagwiowce, przy czym:

   a) w pierwszym etapie prowadzi się ekstrakcję lipidów i ergosterolu z liofilizatu przez zalanie go wrzącym etanolem, zaś uzyskaną mieszaninę filtruje się, po czym filtrat zagęszcza się pod próżnią;

   b) w drugim etapie filtrat uzyskany w pierwszym etapie poddaje się hydrolizie przy użyciu roztworu NaOH o stężeniu od 40 do 50% w/w, a następnie tak otrzymany produkt poddaje się krystalizacji w temperaturze od minus 4 do plus 2°C, po czym oddziela się cząstki surowego ergosterolu od płynu;

   c) następnie surowy ergosterol poddaje się rafinacji wodnym roztworem etanolu o stężeniu od 60 do 70% objętościowo, po czym oddestylowuje się etanol;

   d) dalej rozpuszcza się ergosterol w mieszaninie składającej się z etanolu i benzenu w stosunku objętościowym odpowiednio od 3 : 1 do 5 : 1;

   e) i ponownie prowadzi się krystalizację ergosterolu w temperaturze od minus 4 do plus 2°C.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że osad otrzymany z pierwszego etapu poddaje się ekstrakcji wrzącym etanolem, po czym filtruje się, a uzyskany filtrat łączy się filtratem uzyskanym w pierwszym etapie.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biomasę otrzymuje się na drodze hodowli fermentorowej grzybów, na pożywce zawierającej glukozę, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4 x 7H2O, NH4CI, ekstrakt drożdżowy, w warunkach pH 4,0-5,5, przez 7-21 dni, przy czym masę hodowlaną jednocześnie napowietrza się i miesza się, po czym oddziela się biomasę od płynu

   PL 228 718 B1 pohodowlanego przez odwirowanie i poddaje się liofilizacji, aż do uzyskania zawartości wody od 1,0 do 4,0% wagowych, a następnie wysuszoną biomasę miele się.
4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że 1000 ml pożywki zawiera 50 g glukozy, 0,5 g K2HPO4, 0,5 g KH2PO4, 0,5 g MgSO4 x 7 H2O, 0,5 g NH4CI i 1 g ekstraktu drożdżowego.
5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że biomasę zamraża się do temperatury od minus 30°C do minus 80°C, a następnie podgrzewa się do temperatury od plus 25°C do plus 60°C, przy ciśnieniu 100-170 Pa.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako grzyby wybrane z grupy rzędu pieczarkowców stosuje się Agaricus bispora, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako grzyby wybrane z grupy rzędu żagwiowców stosuje się Ganoderma lucidum.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że biomasę otrzymuje się z owocników grzybów z rzędu pieczarkowce, przy czym owocniki rozdrabnia się, po czym rozdrobniony materiał poddaje się hydrolizie kwasem solnym, a następnie koagulacji etanolem, filtruje się, a uzyskany w ten sposób osad liofilizuje się.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że hydrolizę prowadzi się kwasem solnym o stężeniu 30-40%, w temperaturze 100-120°C, przez co najmniej 15 minut.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że na 100 kg owocników przypada 20 dm³ wody oraz 10 dm³ 36% kwasu solnego,
11. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że koagulację prowadzi się etanolem o stężeniu 50% objętościowo.
12. 12. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że osad zamraża się do temperatury od minus 30°C do minus 80°C, a następnie podgrzewa się do temperatury od plus 25°C do plus 60°C, przy ciśnieniu 100-170 Pa.
13. 13. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako grzyby z rzędu pieczarkowce stosuje się grzyby wybrane z grupy Agaricus bispora, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus.

    Departament Wydawnictw UPRP