PL216223B1 - Przeciwciało przeciwko integrynom α<sub>v</sub>β<sub>6</sub>, jego fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja i ich zastosowanie, komórka hybrydoma oraz sposób wykrywania α<sub>v</sub>β<sub>6</sub> in vitro - Google Patents

Przeciwciało przeciwko integrynom α<sub>v</sub>β<sub>6</sub>, jego fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja i ich zastosowanie, komórka hybrydoma oraz sposób wykrywania α<sub>v</sub>β<sub>6</sub> in vitro

Info

Publication number
PL216223B1
PL216223B1 PL372662A PL37266203A PL216223B1 PL 216223 B1 PL216223 B1 PL 216223B1 PL 372662 A PL372662 A PL 372662A PL 37266203 A PL37266203 A PL 37266203A PL 216223 B1 PL216223 B1 PL 216223B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
antibody
binding fragment
antigen
amino acid
seq
Prior art date
Application number
PL372662A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372662A1 (pl
Inventor
Shelia M. Violette
Paul H. Weinreb
Kenneth J. Simon
Dean Sheppard
Diane R. Leone
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Univ California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29586753&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL216223(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen Idec Inc, Univ California filed Critical Biogen Idec Inc
Publication of PL372662A1 publication Critical patent/PL372662A1/pl
Publication of PL216223B1 publication Critical patent/PL216223B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1027—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against receptors, cell-surface antigens or cell-surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1045—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants
    • A61K51/1066—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody against animal or human tumor cells or tumor cell determinants the tumor cell being from skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70546—Integrin superfamily, e.g. VLAs, leuCAM, GPIIb/GPIIIa, LPAM
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis

Description

Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało przeciwko integrynom o^6, jego fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja i ich zastosowanie, komórka hybrydoma oraz sposób wykrywania ανβ6 in vitro wykrywania ανβ6 in vitro. Wynalazek ten dotyczy ogólnie dziedziny biologii molekularnej.
Integryny to nadrodzina powierzchniowych receptorów komórkowych, które uczestniczą w przyleganiu komórka-komórka i komórka-macierz. Wiadomo, że białka te umożliwiają zakotwiczenie, jak również dostarczają sygnałów dla wzrostu, migracji i różnicowania komórek w czasie rozwoju i naprawy tkanek. Zakłada się również udział integryn w odróżnicowywaniu i inwazji komórek, szczególnie tam, gdzie komórki utraciły swoją wyspecjalizowaną postać i stały się przerzutującymi komórkami nowotworowymi.
Integryny to heterodimeryczne białka złożone z dwóch niekowalencyjnie związanych podjednostek, α i β. Swoistość wiązania integryn jest nadawana przez kombinację 18 różnych łańcuchów α z 8 różnymi łańcuchami β. Integryny α.β6 mogą wiązać się z wieloma ligandami, włączając w to fibronektynę, tenascynę, witronektynę i ostatnio zidentyfikowany peptyd związany z latencją (ang. latency associated peptide) „LAP”, 278-aminokwasowy peptyd syntetyzowany jako część prekursorowego białka TGF-β (Munger i wsp., Cell 96(3):319-328 (1999)). LAP jest odcinany z dojrzałej postaci TGF-β jako N-końcowy peptyd w czasie wydzielenia, ale pozostaje niekowalencyjnie związany z TGF-β w celu utrzymania go w stanie latencji. Kompleks ten nie może wiązać się z receptorem TGF-β, a zatem nie jest aktywny biologicznie. Integryna ανβ6 może wiązać się bezpośrednio z motywem RGD znajdującym się w obrębie LAP, co prowadzi do uwolnienia LAP i aktywacji TGF-β. Ponieważ wiązanie α.,β6 z LAP może być ważne dla przekształcania TGF-β w jego stan aktywny, rezultatem blokowania wiązania może być hamowanie aktywacji TGF-β za pośrednictwem ανβ6 i związana z tym patologia dotycząca zwłóknienia.
Wynalazek ten jest oparty na ujawnieniu i scharakteryzowaniu przeciwciał skierowanych przeciwko ανβ6 o wysokim powinowactwie, włączając w to identyfikację i analizę kluczowych reszt aminokwasowych w regionach determinujących dopasowanie (CDR, ang. complementary determining region) takich przeciwciał.
W ogólności rozwiązania według wynalazku dotyczą przeciwciała monoklonalnego, które (a) wiąże się swoiście z ανβ6; (b) hamuje wiązanie α.β6 z jej ligandem, takim jak LAP, fibronektyna, witronektyna i tenascyna z wartością IC50 niższą niż 10D5 (publikacja międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 99/07405); (c) blokuje aktywację TGF-β; (d) zawiera określone sekwencje aminokwasowe w CDR (np. te pokazane na Fig. 7A i 7B), które nadają ανβ6 swoistość wiązania; (e) wiąże się swoiście z podjednostką β6; i/lub (f) rozpoznaje α.β6 w procedurach immunobarwienia, takich jak immunobarwienie tkanek zatopionych w parafinie.
Stwierdzono, że przeciwciała, które wiążą się z α.β6 można pogrupować na biofizycznie odrębne klasy i podklasy. Jedna z klas przeciwciał wykazuje zdolność do blokowania wiązania liganda (np. LAP) z α.,β6 (blokery). Tę klasę przeciwciał można dalej podzielić na podklasy blokerów zależnych od kationów i blokerów niezależnych od kationów. Niektóre z blokerów zależnych od kationów zawierają sekwencję peptydową arginina-glicyna-asparaginian (RGD), podczas gdy blokery niezależne od kationów nie zawierają sekwencji RGD. Inna klasa przeciwciał wykazuje zdolność do wiązania się z α.,β6 i nie blokuje wiązania się α.β6 z ligandem (nieblokery).
Przedmiotem wynalazku jest przeciwciało monoklonalne blokujące ανβ6 lub jego fragment wiążący antygen, które (a) wiąże się swoiście z ανβ6 ale nie z innymi integrynami α. lub integrynami niespecyficznymi; (b) hamuje wiązanie ανβ6 z peptydem związanym z latencją (LAP) z wartością IC50 niższą niż 10D5; oraz (c) wiąże się z α.β6 albo w sposób niezależny od dwuwartościowego kationu albo w sposób zależny od dwuwartościowego kationu, przy czym kiedy wiązanie rozpuszczalnej α.β6 następuje w sposób zależny od dwuwartościowego kationu nie występuje różnica w przypadku zastosowania Ca2+Mg2+ i Mn2+.
W korzystnych wykonaniach przeciwciało zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 7.1G10, 7.7G5 lub 7.1C5.
W korzystnej postaci wykonania przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według wynalazku są zależne od kationów dwuwartościowych, takich jak Ca2+, Mg2+ i Mn2+.
W niektórych wykonaniach przeciwciała zawierają łańcuch ciężki, którego regiony determinujące dopasowanie (CDR) 1, 2 i 3 składają się zasadniczo (tj. z wyjątkiem niektórych konserwatywnych
PL 216 223 B1 zmian) z sekwencji SEK NR ID: 1, 4 i 7, odpowiednio, i/lub łańcuch lekki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji SEK NR ID: 10, 13 i 15, odpowiednio.
W niektórych wykonaniach przeciwciała zawierają łańcuch ciężki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji z SEK NR ID: 3, 5 i 8, odpowiednio, i/lub łańcuch lekki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji SEK NR ID: 11, 14 i 17, odpowiednio.
W niektórych wykonaniach przeciwciała zawierają łańcuch ciężki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji SEK NR ID: 3, 6 i 9, odpowiednio, i/lub łańcuch lekki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji SEK NR ID: 12, 14 i 18, odpowiednio.
W niektórych wykonaniach przeciwciała zawierają łańcuch ciężki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji SEK NR ID: 2, 46 i 47, odpowiednio i/lub łańcuch lekki, którego CDR 1, 2 i 3 składają się zasadniczo z sekwencji z SEK NR ID: 48, 13 i 16, odpowiednio.
W niektórych wykonaniach przeciwciała zawierają sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z dowolnej z SEK NR ID: 19-24.
W niektórych wykonaniach przeciwciała zawierają sekwencje domen zmiennych łańcucha ciężkiego i lekkiego z, odpowiednio,
(1) SEK NR ID: 19 i 37;
(2) SEK NR ID: 20 lub 21, i SEK NR ID: 38;
(3) SEK NR ID: 22 i 43;
(4) SEK NR ID: 23 i 44;
(5) SEK NR ID: 24 i 45;
(6) SEK NR ID: 34 lub 35, i SEK NR ID: 40;
(7) SEK NR ID: 36 i 41;
(8) SEK NR ID: 61 i 63; lub
(9) SEK NR ID: 62 i 64.
W niniejszym opisie ujawniono przeciwciała, które wiążą się swoiście z ανβ6, ale nie hamują
wiązania Ονβ6 z peptydem związanym z latencją (LAP). Co najmniej niektóre z tych przeciwciał są zdolne do wiązania z ανβ6 w skrawkach tkanki zatopionych w parafinie, a zatem mogą być stosowane dla potrzeb diagnostycznych. Przykładowe przeciwciała obejmują 6.2A1 i 6.2E5.
Wynalazek ten obejmuje również przeciwciała, które wiążą się z tym samym epitopem co opisane powyżej przeciwciała. W szczególności przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, które wiąże ten sam epitop ανβ6 co przeciwciało wytworzone przez hybrydoma zdeponowane w ATCC pod numerem dostępu PTA-3645.
Przedmiotem wynalazku jest izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, które współzawodniczy z 6.8G6 (nr dostępu ATCC PTA-3645) o wiązanie z ανβ6 i zawiera motyw FXY w CDR3 łańcucha ciężkiego.
Wynalazek obejmuje również kompozycje zawierające jedno lub więcej przeciwciał według wynalazku i dopuszczalny farmaceutycznie nośnik. W niektórych z tych kompozycji przeciwciała są skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym (tj. czynnikiem, który upośledza żywotność i/lub funkcje komórki), takim jak toksyna albo radionuklid. Przeciwciałami w tych kompozycjach mogą być przeciwciała zależne od kationów dwuwartościowych. Kompozycje można podawać osobnikowi (np. ssakowi, takiemu jak człowiek) u którego występuje choroba albo który jest narażony na wystąpienie choroby przebiegającej za pośrednictwem ανβ6, w celu leczenia (np. przynoszenia ulgi, łagodzenia, zmniejszania, zapobiegania, odwlekania wystąpienia) choroby. Przykłady takich chorób obejmują między innymi: zwłóknienie (np. twardzinę skóry, bliznowacenie, zwłóknienie wątroby, zwłóknienie płuc i zwłóknienie nerki); łuszczycę; raka (np. raka nabłonka, jamy ustnej, skóry, szyjki macicy, jajnika, gardła, przełyku, krtani, płuc, sutka, nerki lub okrężnicy i odbytnicy), zespół Alporta, ostre i przewlekłe uszkodzenie płuc, wątroby, nerki i innych narządów wewnętrznych; oraz stwardnienie płuc, wątroby, nerki i innych narządów wewnętrznych. Ryzyko wystąpienia takich chorób może być wynikiem predyspozycji genetycznej; pewnych stylów życia, takich jak palenie i alkoholizm; wystawienie na działanie zanieczyszczeń środowiskowych, takich jak azbest; stanów fizjologicznych, takich jak cukrzyca, zakażenie wirusem zapalenia wątroby (np. zakażenie wirusem zapalenia wątroby typu C), chorób autoimmunizacyjnych; oraz leczenia, takiego jak radioterapia.
Wynalazek ten obejmuje również sposoby in vitro wykrywania ανβ6 w próbce tkanki ssaka (np.
człowieka), obejmujące doprowadzenie do kontaktu próbki tkanki z przeciwciałem według wynalazku.
PL 216 223 B1
Wynalazek ten obejmuje również komórki hybrydoma 6.1A8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 7.1G10, 7.705 i 7.1C5. Niniejszym ujawniono również izolowane kwasy nukleinowe zawierające sekwencję kodującą dla dowolnej z SEK NR ID: 19-24 i 34-45 oraz izolowane polipeptydy zawierające sekwencję aminokwasową spośród dowolnej z SEK NR ID: 19-24 i 34-45.
Rozwiązania według wynalazku wykorzystują przeciwciała pełnej długości, np. przeciwciała zawierające dwa łańcuchy ciężkie i dwa łańcuchy lekkie, albo fragmenty wiążące antygen pełnych przeciwciał, takie jak fragment Fab, fragment Fab', fragment F(ab')2 lub fragment F(v). Przeciwciałem według wynalazku może być przeciwciało mysie lub jego homolog albo przeciwciało w pełni ludzkie. Przeciwciałem według wynalazku może być również przeciwciało humanizowane, przeciwciało chimerowe lub przeciwciało jednołańcuchowe. Przeciwciałem według wynalazku może być dowolny izotop i podtyp, na przykład, IgA (np. IgA1 i IgA2), IgG (np. IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgE, IgD, IgM, przy czym łańcuchy lekkie immunoglobuliny mogą być typu kappa albo lambda.
Przeciwciała tu ujawnione mogą zawierać mutację (np. delecję, podstawienie albo addycję) w jednej albo większej liczbie (np. 2, 3, 4, 5 lub 6) pewnych pozycji w łańcuchu ciężkim, tak że funkcja efektorowa przeciwciała (np. zdolność przeciwciała do wiązania z receptorem Fc albo dopełniaczem) jest zmieniona bez zmiany zdolności przeciwciała do wiązania antygenu). Przeciwciało według wynalazku może zawierać mutację w pozycji reszty aminokwasowej, która jest miejscem glikozylacji, tak że miejsce glikozylacji jest wyeliminowane. Takie przeciwciało może mieć klinicznie korzystne, zmniejszone funkcje efektorowe lub inne niepożądane funkcje, zachowując swoje powinowactwo wiązania antygenu. Mutacja miejsca glikozylacji może być również korzystna w celu obróbki (np. ekspresji i oczyszczania białka). W jeszcze innych wykonaniach, łańcuchy lekkie lub ciężkie mogą zawierać mutacje, które zwiększają powinowactwo albo siłę.
Kilka spośród hybrydoma Fuzja #6 i Fuzja #7 zdeponowano w American Type Culture Collection („ATCC”; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) zgodnie z Porozumieniem Budapeszteńskim. Klony hybrydoma 6.1A8, 6.2B10, 6.3G9, 6.8G6 i 6.2B1 zdeponowano 16 sierpnia, 2001 i mają one numery dostępu, odpowiednio, ATCC PTA-3647, -3648, -3649, -3645 i -3646. Klony hybrydoma 6.2A1, 6.2E5, 7.1G10, 7.7G5 i 7.1C5 zdeponowano 5 grudnia 2001 i mają one numery dostępu ATCC PTA-3896, -3897, -3898, -3899 i -3900, odpowiednio. Patrz Tabela 1, poniżej.
Przeciwciała według wynalazku są przydatne do leczenia dowolnego klinicznie niepożądanego stanu albo choroby (jak tutaj omówiono), w której pośredniczy wiązanie ajk z jego ligandem, takim jak LAP i fibronektyna. Przeciwciała te mogą być silniejsze przez wyższe powinowactwo albo zachłanność oraz zależność i niezależność wiązania liganda od kationu w stosunku do znanych uprzednio przeciwciał <α.β6.
Poza zastosowaniami terapeutycznymi przeciwciał według wynalazku, w szczególności blokerów, klasa przeciwciał nieblokerów może być stosowana dla celów diagnostycznych, takich jak testy wiązania antygenu, enzymatyczne testy immunosorpcyjne (ELISA, ang. enzyme-linked immunosorbent assays), immunocytochemia i tym podobne.
Krótki opis rysunków
Fig. 1A i 1B to wykresy słupkowe pokazujące wyniki testu wyłapywania komórek, który określił zdolność różnych przeciwciał monoklonalnych anty-a.jk („mAb”) do wiązania się z komórkami FDC-P1 transfekowanymi (komórki niestransfekowane jako kontrola).
Fig. 2A to wykres pokazujący wyniki testów ELISA, które określiły zdolność różnych oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych anty-a.jk „Fuzja 6” do wiązania z rozpuszczalną zrekombinowaną ludzką Ονβ6 („hsa^6”). Przeciwciała te wytworzono przez immunizację myszy β6 -/- rozpuszczalną ludzką Ονβ6. Numery w legendzie wskazują na numery klonów. Dla odpowiadających im nazw klonów, patrz Tabela 2.
Fig. 2B to wykres pokazujący wyniki testów ELISA, które określiły zdolność różnych oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych anty-a.jk „Fuzja 7” do wiązania się z rozpuszczalną zrekombinowaną hsa^6. Przeciwciała te wytworzono przez immunizację myszy β6-/- komórkami NIH 3T3 transfekowanymi β6 (Fuzja #7).
Fig. 3A-F to wykresy pokazujące zróżnicowaną zależność od kationów wiązania się różnych przeciwciał monoklonalnych anty-a.jk z hsa^6.
Fig. 4A i 48 to wykresy pokazujące, że przeciwciała monoklonalne, odpowiednio. Fuzja #6 i Fuzja #7, hamują wiązanie biotyna-hsa^6 do LAP.
Fig. 5A-E to wykresy pokazujące, że przykładowe przeciwciała monoklonalne według wynalazku hamują wiązanie się komórek FDC-P1 transfekowanych β6 do LAP.
PL 216 223 B1
Fig. 5A i 5B przedstawiają wyniki dla przeciwciał Fusion #6.
Fig. 5C-E przedstawia wyniki dla przeciwciał Fusion #7.
Fig. 6A i 6B to wykresy pokazujące, że przeciwciała, odpowiednio, Fuzja #6 i Fuzja #7, hamują aktywację TGF-β, w której pośredniczy ανβ6, przy zastosowaniu testu dla genu reporterowego Iucyferazy PAI-1 do monitorowania aktywacji TGF-β.
Fig. 7A przedstawiają sekwencje aminokwasowe domen zmiennych łańcuchów ciężkich przeciwciał monoklonalnych wobec α.,β6, 6.1A8, 6.8G6 (podklony A i B), 7.7G5, 6.2B1, 6.3G9, 6.2B10 (podklony A i B), 6.2G2, 6.2A1, 6.4B4 (podklony A, B i C), 7.10H2, 7.9H5, 7.4A3 (podklony A i B), 7.1C5 (podklony A i B) oraz 7.1G10. Przeciwciała 6.1A8, 6.8G6 i 7.7G5 są zależne od kationów w wiązaniu się do α.,β6, podczas gdy przeciwciała 6.2B1, 6.2A1, 6.3G9, 6.2B10, 6.4B4, 7.1C5 i 7.1G10 są niezależne od kationów (tutaj). Numery w nawiasach oznaczają pozycje reszt aminokwasowych. CDR są w dużych ramkach, podczas gdy małe ramki zawierające aminokwasy zapisane pochyłym drukiem reprezentują polimorfizm w różnych klonach poszczególnych przeciwciał.
Fig. 7B przedstawiają sekwencje aminokwasowe domen zmiennych łańcuchów lekkich przeciwciał monoklonalnych wobec α.,β6, 6.1A8, 6.8G6, 6.4B4, 6.2A1, 7.1C5, 7.1G10, 6.2B10, 7.7G5, 6.2B1 i 6.3G9.
Fig. 8 to wykres kropkowy pokazujący ekspresję α.,β6 w skrawkach tkanki ludzkiego raka sutka i raka płaskokomórkowego. Prawidłowe ludzkie tkanki pokazują jedynie nieistotne poziomy ekspresji ανβ6.
Fig. 9A i 9B to krzywe kwadratowe przedstawiające powinowactwa wiązania w roztworze dwóch przeciwciał anty-a^6, odpowiednio, 6.8G6 i 6.3G9, dla rozpuszczalnej α,β6.
Fig. 10A i 10B to wykresy słupkowe pokazujące zdolność oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych do współzawodniczenia, odpowiednio, z biotynylowanymi 6.3G9 i biotynylowanymi 6.8G6, o wiązanie się z ανβ6.
Fig. 11 to wykres słupkowy pokazujący procent barwienia gładkiej aktyny w nerkach ze zwierząt UUO traktowanych przeciwciałami mAb anty-a^6.
Fig. 12 pokazuje ekspresję α,β6 w liniach komórek nowotworowych przez analizę FACS (prawa strona rysunku) i hamowanie wiązania się linii komórek nowotworowych z ligandem LAP przez mAb 6.3G9 i 6.4B4 (lewa strona rysunku).
Fig. 13 to wykres słupkowy pokazujący hamowanie wiązania się linii komórek nowotworowych z ligandem LAP przez mAb anty-a^6, 6.3G9, 6.8G6 i 6.4B4. Wiązanie się mAb porównywano z całkowitym wiązaniem bez dodawania testowych mAb (TB) i niespecyficznego wiązania do samej kontroli BSA (NSB).
Fig. 14A i 148 to wykresy pokazujące efekty mAb anty-a^6, odpowiednio, 6.3G9 i 6.4B4, na przestrzeni 33-dniowych badań nad nowotworami powstającymi na skutek wszczepionych podskórnie komórek Detroit 562.
Fig. 15A-C to wykresy pokazujące efekty mAb anty-a.j/ na indukowane bleomycyną zwłóknienie płuc. (A) Traktowanie przeciwciałem przy użyciu mAb 6.3G9 rozpoczęto w dniu 0 podawania bleomycyny i śledzono na przestrzeni 30 dni; (B) Traktowanie przeciwciałem przy zastosowaniu mAb 6.3G9 rozpoczęto 15 dni po traktowaniu bleomycyną i śledzono na przestrzeni 30 dni: (C) Traktowanie przeciwciałem przy zastosowaniu mAb 6.3G9, 6.8G6 i 6.4B4 6.3G9 rozpoczęto 15 dni po traktowaniu bleomycyną i śledzono na przestrzeni 60 dni. Na obydwu, Fig. 15A i 15B, wykresy słupkowe po lewej stronie reprezentują pg hydroksyproliny/płuco, podczas gdy wykresy słupkowe po prawej stronie pokazują procent wzrostu u myszy traktowanych hydroksyproliną w stosunku do soli fizjologicznej (bez bleomycyny). Na Fig. 15C, wykresy pokazują zawartość hydroksyproliny na płuco.
Szczegółowy opis wynalazku
Wynalazek ten przedstawia klasy i podklasy przeciwciał, które są swoiste wobec integryny ανβ6. Co najmniej jedna klasa przeciwciał (blokery) jest zdolna do blokowania wiązania α,β6 z LAP albo przeciwdziałania aktywacji TGF-β.
Dalej następuje opis różnych sposobów wytwarzania przeciwciał według wynalazku. Sposoby, które są znane w tej dziedzinie, ale nie są tu szczegółowo opisane są również w zakresie tego wynalazku. Przykładowo, przeciwciała według wynalazku można również zidentyfikować przy zastosowaniu bibliotek przeciwciał prezentowanych na fagach, takich jak te opisane w Smith, Science 228:1315-7 (1985); opisy patentowe USA 5565332, 5733743, 6291650 i 6303313. Dodatkowe przeciwciała według wynalazku można wytworzyć przez połączenie zidentyfikowanych tu łańcuchów ciężkich z nie6
PL 216 223 B1 spokrewnionym łańcuchem lekkim, np. łańcuchem lekkim zidentyfikowanym przez technologię prezentacji na fagach.
Przeciwciała z hybrydoma innych niż ludzkie.
Przeciwciała monoklonalne według wynalazku można wytworzyć przez dobrze znaną technologię hybrydoma. Aby tego dokonać, zwierzęta β6-/- (np. myszy, szczury lub króliki) immunizuje się oczyszczonymi albo surowymi preparatami ανβ6, komórki transfekowane konstruktami cDNA kodującymi ov, β6 albo obydwa te antygeny, komórkami, które wyrażają konstytutywnie αβ6 i tym podobnymi. Antygen może być dostarczony jako oczyszczone białko, białko wyrażane na komórkach, fragment białka albo pochodzący z niego peptyd albo jako nagi DNA lub wektory wirusowe kodujące białko, fragment białka albo peptyd. Surowice immunizowanych zwierząt testuje się następnie pod kątem obecności przeciwciał anty-a^6. Ze zwierząt, które są dodatnie w teście izoluje się komórki B i z tych komórek B wytwarzane są hybrydoma.
Przeciwciała wydzielane przez hybrydoma przeszukuje się pod kątem ich zdolności do swoistego wiązania z αβ6 (np. wiązania się z komórkami transfekowanymi β6, ale nie z komórkami nie transfekowanymi) i pod kątem innych pożądanych właściwości, np. wykazujących pożądane sekwencje CDR o najwyższej zgodności, hamujące (lub nie hamujące w przypadku nieblokerów) wiązanie pomiędzy LAP i ανβ6 z wartością IC50 niższą niż ta dla znanego przeciwciała anty-a36 10D5 lub hamującego aktywację TGF-β.
Komórki hybrydoma, które dają dodatni wynik w teście przeszukiwania hoduje się w pożywce ze składnikami odżywczymi w warunkach, które umożliwiają komórkom wydzielanie przeciwciał monoklonalnych do pożywki hodowlanej. Następnie zbiera się kondycjonowany supernatant z hodowli hybrydoma i oczyszcza się przeciwciała zawarte w supernatancie. Alternatywnie, pożądane przeciwciało można wytworzyć przez wstrzyknięcie komórek hybrydoma do jamy otrzewnowej nieimmunizowanych zwierząt (np. myszy). Komórki hybrydoma namnażają się w jamie otrzewnej, wydzielając przeciwciało, które akumuluje się w płynie puchlinowym. Przeciwciało można następnie zebrać przez pobranie płynu puchlinowego z jamy otrzewnej przy pomocy strzykawki.
Przeciwciała monoklonalne można również wytwarzać przez izolowanie cDNA kodujących przeciwciała z pożądanych hybrydoma, transfekowanie ssaczych komórek gospodarzy (np. komórek CHO lub NSO) cDNA, hodowanie transfekowanych komórek gospodarzy i odzyskiwanie przeciwciała z pożywki hodowlanej.
Przeciwciała chimerowe
Przeciwciała monoklonalne według wynalazku można również wytwarzać przez poddanie zabiegom inżynierii genetycznej przeciwciała z pokrewnej hybrydoma (np. mysiej, szczurzej albo króliczej). Przykładowo, pokrewne przeciwciało może być zmienione przez technologię rekombinowanego DNA, tak, że część albo całe regiony zrębowe i/lub stałe łańcuchów ciężkich i/lub lekkich są zastąpione przez odpowiadające im składniki przeciwciała z innego gatunku (np. ludzkiego). W ogólności, domeny zmienne przeciwciała poddanego zabiegom inżynierii genetycznej pozostają identyczne albo zasadniczo takie w stosunku do domen zmiennych pokrewnego przeciwciała. Takie poddane zabiegom inżynierii genetycznej przeciwciało jest zwane przeciwciałem chimerowym i jest mniej antygenne niż pokrewne przeciwciało, kiedy podaje się je osobnikowi z gatunku, z którego pochodzi region zawiasowy i/lub stały (np. człowieka). Sposoby wytwarzania przeciwciał chimerowych są dobrze znane w tej dziedzinie.
Przeciwciała chimerowe objęte wynalazkiem mogą zawierać domenę zmienną łańcucha ciężkiego o sekwencji identycznej (albo zasadniczo takiej) z dowolną z SEK NR ID: 19-36 z i/lub domenę zmienną łańcucha lekkiego o sekwencji identycznej (albo zasadniczo takiej) z dowolną z SEK NR ID: 37-45.
Korzystne ludzkie regiony stałe obejmują te pochodzące z IgG1 i IgG4.
Przeciwciała w pełni ludzkie
Przeciwciała monoklonalne według wynalazku obejmują również przeciwciała w pełni ludzkie. Można je wytwarzać przy użyciu uczulanych in vitro ludzkich splenocytów, jak opisano w Boerner i wsp., J. Immunol. 147:86-95 (1991) albo przy zastosowaniu biblioteki przeciwciał prezentowanych na fagach jak opisano np. w opisie patencie, USA 6300064.
Niektóre inne sposoby wytwarzania w pełni ludzkich przeciwciał obejmują zastosowanie zwierząt oprócz człowieka, które mają inaktywowane endogenne Ioci Ig i są transgeniczne pod względem nie rearanżowanych ludzkich genów łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego. Takie transgeniczne zwierzęta można immunizować αβδ, a następnie z pochodzących z nich komórek B wytwarza się hybryPL 216 223 B1 doma. Sposoby te są opisane np. w różnych publikacjach/opisach patentowych GenPharm/Medarex (Palo Alto, CA) dotyczących transgenicznych myszy zawierających ludzkie miniloci Ig (np. patent USA 5789650 dla Lonberg); różnych publikacjach/opisach patentowych Abgenix (Fremont, CA) odnośnie XENOMICE (np.. patent USA 6075181, 6150584 i 6162963 dla Kucherlapati; Green i wsp., Nature Genetics 7:13-21 (1994) oraz Mendez i wsp., 15(2):146-56 (1997)); oraz różnych publikacjach/patentach dla Kirin (Japan) dotyczących myszy „transomicznych” (np., EP 843 961 oraz Tomizuka i wsp.. Nature Genetics 16:133-1443 (1997)).
Przeciwciała humanizowane
Przeciwciała monoklonalne według wynalazku obejmują również humanizowane wersje pokrewnych przeciwciał anty-av36 pochodzących z innych gatunków. Przeciwciałem humanizowanym jest przeciwciało wytwarzane przy zastosowaniu technologii rekombinowania DNA, w którym niektóre albo wszystkie aminokwasy łańcucha lekkiego lub ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny, które nie są wymagane do wiązania antygenu (np. regiony stałe i regiony zrębowe domen zmiennych) są użyte do zastąpienia odpowiadających im aminokwasów z łańcucha lekkiego lub ciężkiego pokrewnego przeciwciała innego niż ludzkie. Jako przykład, humanizowana wersja mysiego przeciwciała wobec danego antygenu ma na obydwu swoich łańcuchach ciężkich i lekkich (1) regiony stałe przeciwciała ludzkiego; (2) regiony zrębowe z domen zmiennych przeciwciała ludzkiego i (3) CDR z przeciwciała mysiego. Kiedy trzeba, jedna albo więcej reszt w ludzkich regionach zrębowych może być zmieniona na reszty w odpowiadających pozycjach w przeciwciele mysim, tak aby zachować powinowactwo wiązania przeciwciała humanizowanego z antygenem. Ta zmiana jest czasami nazywana „mutacją powrotną. Przeciwciała humanizowane generalnie z mniejszym prawdopodobieństwem wzbudzają reakcję immunologiczną u ludzi w porównaniu z ludzkimi przeciwciałami chimerowymi ponieważ te pierwsze zawierają znacząco mniej składników innych niż ludzkie.
Sposoby wytwarzania przeciwciał humanizowanych są opisane np. w Winter EP 239 400; Jones i wsp., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i wsp., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen i wsp., Science 239: 1534-1536 (1988); Queen i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029 (1989); patent USA 6180370 oraz Orlandi i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833 (1989). Ogólnie, przeszczepienie mysich (lub innych nie-ludzkich) CDR do przeciwciała ludzkiego uzyskuje się jak następuje. Z hybrydoma izoluje się cDNA kodujące domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego. Sekwencje DNA domen zmiennych, włączając w to CDR, ustala się przez sekwencjonowanie. DNA kodujące CDR przenosi się do odpowiadających im regionów sekwencji kodującej domenę zmienną łańcucha ciężkiego lub lekkiego przez ukierunkowaną mutagenezę. Następnie dodaje się odcinki genów dla ludzkiego regionu stałego o pożądanym izotypie (np. γ1 dla CH i κ dla CL). Humanizowane geny dla łańcucha ciężkiego lub lekkiego poddaje się jednoczesnej ekspresji w ssaczych komórkach gospodarzy (np. komórkach CHO lub NSO) w celu wytworzenia rozpuszczalnego humanizowanego przeciwciała. W celu ułatwienia wytwarzania przeciwciał na dużą skalę często pożądane jest wytwarzanie takich przeciwciał w bioreaktorach zawierających komórki wyrażające przeciwciało albo wytworzenie transgenicznych ssaków (np. kóz, krów lub owiec), które wyrażają przeciwciało w mleku (patrz np. opis patent USA 5827690).
Czasami bezpośrednie przeniesienie CDR do ludzkiego regionu zrębowego prowadzi do utraty powinowactwa wiązania antygenu uzyskanego w rezultacie przeciwciała. Jest tak ponieważ w niektórych pokrewnych przeciwciałach, pewne aminokwasy w obrębie regionów zrębowych oddziałują z CDR i wpływają zatem ogólnie na powinowactwo wiązania antygenu przeciwciała. W takich przypadkach, byłoby istotne wprowadzenie „mutacji powrotnych (jak wyżej) w regionach zrębowych przeciwciała akceptorowego w celu zachowania aktywności wiązania antygenu pokrewnego przeciwciała.
Ogólne podejście do dokonywania takich mutacji powrotnych jest znane w dziedzinie. Przykładowo, Queen i wsp. (powyżej), Co i wsp. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873 (1991) i WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) opisują podejście, które obejmuje dwa kluczowe etapy. Najpierw wybierane są regiony zrębowe V przez analizę komputerową pod kątem optymalnej homologii sekwencji z regionem zrębowym V pokrewnego przeciwciała mysiego. Następnie modeluje się komputerowo strukturę trzeciorzędową mysiego regionu V w celu uwidocznienia zrębowych reszt aminokwasowych, które prawdopodobnie będą oddziaływały z mysimi CDR i te mysie reszty aminokwasowe wprowadza się do homologicznego ludzkiego regionu zrębowego.
W przypadku tego dwuetapowego podejścia istnieje kilka kryteriów przy projektowaniu przeciwciał humanizowanych. Pierwsze kryterium to użycie jako ludzkiego akceptora regionu zrębowego z konkretnej ludzkiej immunoglobuliny, która jest zwykle homologiczna do innej niż ludzka immuno8
PL 216 223 B1 globuliny donorowej albo zastosowanie regionu zrębowego największej zgodności dla wielu ludzkich przeciwciał. Drugie kryterium to użycie aminokwasu donorowego zamiast akceptorowego jeżeli ludzka reszta akceptorowa jest niezwykła, a reszta donorowa jest typowa dla sekwencji ludzkich w przypadku konkretnej reszty regionu zrębowego. Trzecie kryterium to zastosowanie donorowej zamiast akceptorowej zrębowej reszty aminokwasowej w pozycji bezpośrednio sąsiadującej z CDR.
Można również zastosować inne podejście, jak opisano np. w Tempest, Biotechnology 9; 266-271 (1991). W tym podejściu regiony zrębowe V pochodzące z łańcuchów lekkich i ciężkich, odpowiednio, NEWM i REI używa się do przeszczepiania CDR bez radykalnego wprowadzania reszt mysich. Korzyścią zastosowania takiego podejścia jest to, że z badań krystalograficznych z użyciem promieni X znane są trójwymiarowe struktury regionów zmiennych NEWM i REI, a zatem można łatwo wymodelować specyficzne oddziaływania CDR i resztami regionu zrębowego V.
Inne reszty
Przeciwciała monoklonalne według wynalazku mogą ponadto zawierać inne reszty dla uzyskania pożądanych funkcji. Przykładowo, przeciwciało może zawierać resztę toksyny (np. anatoksynę
111 90 tężca lub rycynę) lub radionuklid (np. 111In lub 90Y) do zabijania docelowych komórek namierzanych za pośrednictwem przeciwciała (patrz np. opis patentowy USA Patent 6307026). Przeciwciała mogą zawierać resztę (np. biotynę, reszty fluorescencyjne, reszty radioaktywne, znacznik histydynowy lub inne znaczniki peptydowe) w celu łatwej izolacji lub wykrywania. Przeciwciała mogą również zawierać resztę, która przedłuża ich okres półtrwania w surowicy, na przykład resztę glikolu polietylenowego (PEG). Stany chorobowe i modele zwierzęce
Przeciwciała według wynalazku są przydatne do leczenia, włączając w to zapobieganie chorobom, w których pośredniczy a^6. Przykładowo, przeciwciała te można stosować do leczenia zwłóknienia (np. zwłóknienia płuc, ostrego uszkodzenia płuc, zwłóknienia nerki, zwłóknienia wątroby, zespołu Alporta i twardziny skóry) przez blokowanie aktywacji TGF-β albo blokowanie wiązania α„β6 do jakichkolwiek innych ligandów, takich jak fibronektyna, witronektyna i tenascyna. Nowatorstwo tego podejścia polega na tym, że: (1) blokuje się raczej aktywację TGF-β, a nie wiązanie TGF-β z jego receptorem, (2) można hamować TGF-β lokalnie (tj. w miejscu zwiększenia poziomu αβ6), a nie ogólnoustrojowo i (3) hamuje się wiązanie ανβ6 z ligandem. Poza chorobami lub stanami zwłóknieniowymi przeciwciała według wynalazku są przydatne do leczenia raka lub przerzutów raka (włączając w to wzrost i inwazję guza nowotworowego), szczególnie nowotworów nabłonkowych. Podzbiór nowotworów nabłonkowych stanowią rak płaskokomórkowy, np. głowy i szyi, jamy ustnej, sutka, płuc, prostaty, szyjki macicy, przełyku, okrężnicy, trzustki i jajnika. Nasze badania z zastosowaniem nowych przeciwciał monoklonalnych wobec α„β6 pokazały, że α„β6 jest wyrażana na wysokim poziomie w wielu rakach nabłonkowych, szczególnie na wiodącej krawędzi guzów. Nowe przeciwciała można również użyć wobec jakiejkolwiek innej choroby, zachodzącej za pośrednictwem α„β6, włączając w to łuszczycę.
Leczenie jest skuteczne zarówno u zwierząt, jak i ludzi dotkniętych tymi stanami. Zwierzęta, u których wynalazek daje się zastosować to zarówno zwierzęta domowe, jak i gospodarskie, wyhodowane bądź jako domowe, bądź dla celów komercyjnych. Przykładami są psy, koty, bydło, konie, owce, świnie i kozy.
Skuteczność przeciwciał według wynalazku można testować w różnych modelach zwierzęcych. Mysie modele zwłóknienia płuc obejmują zwłóknienie płuc indukowane przez bleomycynę (Pittet i wsp., J. Clin. Invest. 107(12):1537-1544 (2001) oraz Munger i wsp., powyżej) i promieniowaniem (Franko i wsp., Rad. Res. 140:347-355 (1994)). U myszy traktowanych bleomycyną ekspresja ανβο wzrasta w pęcherzykowych komórkach płuc. Ale myszy z nokautem β6 są chronione przed uszkodzeniem i zwłóknieniem indukowanym bleomycyną.
Mysie modele zwłóknienia nerki obejmują myszy COL4A3 -/- (patrz np. Cosgrove i wsp., Amer. J. Path. 157:1649-1659 (2000), myszy z uszkodzeniami indukowanymi przez adriamycynę (Wang i wsp., Kidney International 58: 1797-1804 (2000); Deman i wsp., Nephrol Dial Transplant 16: 147-150 (2001)), myszy db/db (Ziyadeh i wsp., PNAS USA 97:8015-8020 (2000)) oraz myszy z jednostronną niedrożnością moczowodu (Fogo i wsp.. Lab Investigation 81: 189A (2001) oraz Fogo i wsp., Journal of the American Society of Nephrology 12:819A (2001)). We wszystkich tych modelach u myszy rozwija się uszkodzenie i zwłóknienie nerek, które postępuje w stronę niewydolności nerek. Poziom α„β6 podnosi się w nabłonku wyścielającym wstępujące i zstępujące kanaliki nerkowe u myszy COL4A3 -/-, myszy traktowanych adriamycyną i myszy, u których występuje jednostronna niedrożność moczowoPL 216 223 B1 du. Jest prawdopodobne, że ekspresja ανβ6 zwiększa się również w rozmaitych modelach uszkodzenia nerki.
Przeciwciała monoklonalne anty-a.jc można również testować pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu, postępowania i przerzutowania guzów nowotworów w takich modelach zwierzęcych jak standardowe modele in vivo wzrostu i przerzutów guzów. Patrz np. Rockwell i wsp., J. Natl. Cancer Inst. 49:735 (1972); Guy i wsp., Mol. Cell Biol. 12:954 (1992); Wyckoff i wsp., Cancer Res. 60:2504 (2000) oraz Oft i wsp., Curr. Biol. 8:1243 (1998). Ważne ligandy θνβ6 w nowotworach mogą obejmować TGF-β, który uczestniczy w przerzutach (przegląd patrz Akhurst i wsp., Trends in Cell Biology 11:S44-S51 (2001)), fibronektyna i witronektyna.
Skuteczność leczenia według wynalazku można mierzyć przy zastosowaniu wielu dostępnych narzędzi diagnostycznych, włączając w to badanie fizyczne, badanie krwi, mierzenie białkomoczu, poziomy kreatyniny i usuwanie kreatyniny, testy funkcjonowania płuc, poziomy azotu mocznikowego w osoczu krwi (BUN, od ang. blood urea nitrogen), obserwacja i ocena bliznowych albo zwłóknieniowych uszkodzeń, odkładanie się substancji zewnątrzkomórkowych, takich jak kolagen, aktyna mięśni gładkich i fibronektyna, testy działania nerek, ultradźwięki, obrazowanie przy zastosowaniu rezonansu magnetycznego (MRI) i skan CT.
Kompozycje farmaceutyczne
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku zawierają jedno albo więcej przeciwciał według wynalazku albo ich farmaceutycznie dopuszczalne pochodne, ewentualnie z dowolnym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Stosowany tu termin „nośnik” obejmuje znane dopuszczalne adiuwanty i nośniki.
Według wynalazku, kompozycje farmaceutyczne mogą być w postaci jałowego preparatu, który można wstrzykiwać, na przykład jałowej wodnej albo olejowej zawiesiny do wstrzyknięć. Tę zawiesinę można wytworzyć zgodnie z technikami znanymi w dziedzinie przy zastosowaniu odpowiednich czynników rozpraszających, zwilżających i zawieszających.
Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można podawać doustnie, miejscowo, dożylnie, podskórnie, dootrzewnowo, domięśniowo, dotętniczo, doszpikowo, dostawowo, domaziówkowo, domostkowo, dooponowo, dowątrobowo lub doczaszkowo, jak trzeba albo jedynie miejscowo w miejscach zapalenia lub wzrostu guza nowotworowego. Kompozycje farmaceutyczne według wynalazku można również podawać przez inhalację z zastosowaniem np. nebulizatora, urządzenia do inhalacji suchego proszku albo urządzenia do inhalacji odmierzonych dawek.
Dawkowanie i tempo dawkowania przeciwciał według wynalazku skuteczne w celu uzyskania pożądanych efektów będzie zależało od rozmaitych czynników, takich jak natura choroby, która ma być leczona, rozmiaru osobnika, celu leczenia i konkretnej zastosowanej kompozycji farmaceutycznej oraz oceny prowadzącego lekarza. Przydatne są poziomy dawkowania pomiędzy około 0,001 i około 100 mg/kg wagi ciała na dzień, na przykład pomiędzy około 0,1 i około 50 mg/kg wagi ciała na dzień składnika aktywnego. Przykładowo, przeciwciało według wynalazku będzie podawane w dawce w zakresie od około 0,01 mg/kg wagi ciała/dzień i około 20 mg/kg wagi ciała/dzień, np., w zakresie od około 0,1 mg/kg wagi ciała/dzień i około 10 mg/kg wagi ciała/dzień i w odstępach od jednego do czternastu dni. W innym wykonaniu, przeciwciało jest podawane w dawce około 0,3 do 1 mg/kg wagi ciała, kiedy jest podawane dootrzewnowo. W jeszcze innym wykonaniu, przeciwciało jest podawane w dawce około 5 do 12,5 mg/kg wagi ciała, kiedy jest podawane dożylnie. W jednym z wykonań kompozycję przeciwciała podaje się w ilości skutecznej dla dostarczenia poziomu przeciwciała w osoczu co najmniej 1 mg/ml.
Metody diagnostyczne
Przeciwciała według wynalazku można stosować do diagnozowania stanów chorobowych związanych ze zmienionymi poziomami ekspresji a^6. Próbki tkanki od osobnika, takie jak tkanki otrzymane przez biopsję, próbki płynu ciała albo wypłuczyny (np. otrzymane podczas płukania zębodołów), można testować w teście wyłapywania antygenu, ELISA, teście immunohistochemicznym i tym podobnych przy użyciu przeciwciał. Próbkę tkanki z osobnika zdrowego stosuje się jako kontrolę.
Przy wykonywaniu niniejszego wynalazku będą wykorzystywane, o ile nie wskazano inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórki, hodowli komórek, biologii molekularnej, mikrobiologii, rekombinowania DNA, chemii białek i immunologii, które są znane w dziedzinie. Takie techniki są opisane w literaturze. Patrz na przykład Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2 (Sambrook i wsp., wyd.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, wyd.), 1984; patent USA 4683195 dla Mullis i wsp.; Nucleic Acid Hybridization, (B.D. Hames i S.J. Higgins), 1984; Transcription and Translation,
PL 216 223 B1 (B.D. Hames i S.J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, red.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, tomy 154 i 155 (Wu i wsp., red.). Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller i M.P. Calos, wyd.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, wyd.), 1987; Handbook of Experiment Immunology, tomy I-IV (D.M. Weir i C.C. Blackwell, wyd.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, 1986.
O ile nie zdefiniowano inaczej wszystkie stosowane tu terminy naukowe i techniczne mają takie samo znaczenie jak jest powszechnie rozumiane przez specjalistę w dziedzinie, której wynalazek dotyczy. Przykładowe sposoby i materiały są opisane poniżej, jakkolwiek przy wykonywaniu wynalazku można również zastosować metody i materiały podobne lub odpowiadające tym opisanym niniejszym. Wszystkie publikacje i inne wspomniane tu odnośniki są tu włączone w całości jako odniesienie. W przypadku sporu, niniejszy opis, włączając w to definicje będzie wiążący. Materiały, metody i przykłady stanowią jedynie ilustrację i nie mają być ograniczeniem. W opisie tym słowo „zawierać” albo jego odmiany takie „zawiera'' lub „zawierający” będzie rozumiane jako oznaczające włączenie wymienionych elementów albo grupy elementów, ale bez wykluczania dowolnego innego elementu albo grupy elementów.
P r z y k ł a d y
Następujące przykłady mają służyć jako ilustracja metod i materiałów według wynalazku. Przydatne modyfikacje i adaptacje opisanych warunków i parametrów wykorzystywanych zazwyczaj w dziedzinie przeciwciał, które są oczywiste dla specjalistów w tej dziedzinie mieszczą się w duchu i zakresie niniejszego wynalazku.
W następujących przykładach, myszy β6-/- otrzymano jak opisano w Huang i wsp., J. Cell Biol. 133:921 (1996). Zrekombinowany ludzki LAP zakupiono z R & D Systems (Minneapolis. MN). Przeciwciało 10D5 zakupiono w Chemicon (Temecula, CA). Hybrydoma L230 była otrzymana w ATCC, a wydzielane przeciwciało oczyszczono z supernatantu wysyconych hodowli przez chromatografię powinowactwa na unieruchomionym białku A. Izotypowanie przeciwciał przeprowadzano przy użyciu zestawu ISOSTRIP (Roche Diagnostics) zgodnie z instrukcjami producenta. Linię komórkową SW480 transfekowaną β6 otrzymano jak opisano w Weinacker i wsp., J. Biol. Chem. 269:6940-6948 (1994).
P r z y k ł a d 1: Wytwarzanie stabilnych linii komórkowych transfekowanych β6.
Komórki NIH 3T3 i FDC-P1 transfekowane β6 wytworzono przez elektroporację linii rodzicielskich konstruktem DNA zawierającym mysi cDNA β6 pełnej długości i marker umożliwiający selekcję neomycynę. Stabilnie transfekowane komórki selekcjonowano przez pasażowanie komórek w pożywce hodowlanej zawierającej G418 przez 14 dni, a następnie sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS od ang. fluorescent activated cell sorting) w celu wyizolowania komórek wyrażających najwyższe poziomy powierzchniowej β6. Transfekowane komórki FDC-P1 hodowano w DMEM uzupełnionej 4 mM L-glutaminą i tak, aby zawierała 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 4.5 g/l glukozy i 1,0 mM pirogronianu sodu, 10% FBS, 2,5% dodatku mysiej hodowli IL-3 oraz 1,5 mg/ml aktywnego G418. Transfekowane komórki NIH 3T3 hodowano w DMEM uzupełnionej 10% FBS, 2 mM L-glutaminą, penicyliną/streptomycyną i 1 mg/ml aktywnego G418.
P r z y k ł a d 2: Oczyszczanie ludzkiej rozpuszczalnej αβ6
Białko ajk oczyszczono zasadniczo jak opisano w Weinacker, powyżej. Linię komórkową CHO wyrażającą hsαvβ6 hodowano i otrzymany supernatant zbierano przez odwirowanie. Integrynę oczyszczano przez chromatografię powinowactwa przy użyciu przeciwciała anty-av L230. Oczyszczone L230 łączono krzyżowo z aktywowaną CNBr sefarozą (CNBr-activated Sepharose 4B, Sigma) w stosunku 4,8 mg przeciwciała/ml złoża. Supernatant ανβ6 ładowano przy stężeniu 0,5 mg przeciwciała/ml złoża na kolumnę powinowactwa L230 i kolumnę przemywano 10 objętościami kolumny każdego: (1) 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 M NaCl, 1 mM MgCl2; (2) 50 mM Tris-Cl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 1 mM MgCl2 i (3) 10 mM Na3PO4, pH 7,0. Hsa^6 wymywano 100 mM glicyną, pH 2,5 w objętości 1:10 1 M Na3PO4, pH 8,0. Białko dializowano z kilkakrotnymi zmianami wobec soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, od ang. phosphate buffered saline) i przechowywano w -20°C.
P r z y k ł a d 3: Immunizacja myszy β6 -/Myszy β6 -/- immunizowano przez dootrzewnowe (IP - ang. intraperitoneal) wstrzyknięcie 25 μg oczyszczonej zrekombinowanej ludzkiej ανβ6 jako emulsji w kompletnym adiuwancie Freunda (CFA, od ang. complete Freund's adjuvant) przy stosunku objętościowym 1:1 w całkowitej objętości 200 pl.
Alternatywnie, myszy β6 -/- immunizowano przez wstrzyknięcie IP 4 x 106 komórek NIH 3T3 transfekowanych β6 zawieszonych w 100 pl PBS uzupełnionego 1 mg/ml CaCl2 i 1 mg/ml MgCl2, i tym saPL 216 223 B1 mym myszom wstrzyknięto w sąsiednim miejscu 100 μl CFA. Dwa tygodnie i cztery tygodnie po wyjściowej immunizacji myszom podawano zastrzyk wzmacniający z podobnymi odczynnikami z tą różnicą, że zamiast CFA użyto niekompletnego adiuwanta Freunda. Myszy skrwawiano 7 dni po ostatnim zastrzyku wzmacniającym i miano anty^6 ustalano przez wiązanie się surowicy z oczyszczoną zrekombinowaną ludzką ανβ6 albo z komórkami transfekowanymi β6. W przypadku myszy immunizowanych oczyszczoną zrekombinowaną ludzką ανβ6, myszy odpoczywały przez 3 miesiące po czym były reimmunizowane tym samym antygenem zmieszanym z ImmunEasy (Qiagen). Trzy dni przed izolowaniem śledzion z fuzji hybrydoma, myszy immunizowano 12,5 μg oczyszczonego zrekombinowanego ludzkiego białka ανβ6 przez zastrzyk zarówno IP, jak i dożylny. W dniu fuzji zwierzęta uśmiercano, pobierano ich śledziony i rozdrabniano na zawiesiny pojedynczych komórek. Splenocyty unieśmiertelniano przez fuzję z podlegającym selekcji antybiotykowej partnerem fuzji komórkowej.
P r z y k ł a d 4: Przeszukiwanie hybrydoma
Wytworzono dwie grupy przeciwciał przez immunizację myszy β6 -/-. Jeden zestaw przeciwciał wytworzono przez immunizację rozpuszczalną ludzką skróconą ανβ6 (Fuzja #6). Inny zestaw przeciwciał wytworzono przez immunizację mysimi komórkami NIH 3T3 transfekowanymi β6 (Fuzja #7). Przeszukiwanie pod kątem przeciwciał anty-α,β przeprowadzano przy zastosowaniu testów wiązania i funkcjonalnych, zarówno w oparciu o komórki, jak i wolnych od komórek, jak opisano poniżej. Wyjściowa selekcja klonów pozytywnych była oparta na wiązaniu się z oczyszczoną hsa^6 i ludzkimi oraz mysimi komórkami transferowanymi β6 (komórki nie transfekowane jako kontrola). Wyselekcjonowane klony namnażano i ostateczne hodowle oceniano ponownie pod kątem wiązania, zarówno z komórkami transfekowanymi β6, jak i nie transfekowanymi komórkami kontrolnymi, w testach wyłapywania komórek (Przykład 5b, tutaj) (reprezentatywne przykłady pokazane na Fig. 1A i 1B, gdzie przedrostki „6.” lub „7.” w nazwach mAb, które oznaczają, odpowiednio. Fuzję 6 i Fuzję 7, są pominięte: patrz również Tabela 2, poniżej). Niektóre przeciwciała wiążą się preferencyjnie z komórkami stransfekowanymi β6, podczas gdy inne wiążą się zarówno z komórkami stransfekowanymi, jak i nie transfekowanymi, co wskazuje, że jedynie podzbiór przeciwciał ma preferencję wobec β6 (Fig. 1A i 1B). Dalsze selekcja opierała się na zdolności przeciwciał do blokowania wiązania się zarówno biotinylowanej hsa^6. jak i mysich komórek transfekowanych β6, z LAP. Wybrane klony poddano subklonowaniu przy użyciu FACS i przechowywano zamrożone do chwili użycia.
Przeciwciała monoklonalne przeszukiwano pod kątem swoistości wiązania się z ανβ6 w oparciu o ich zdolność do wiązania się z komórkami transfekowanymi β6, ale nie z nie transfekowanymi komórkami rodzicielskimi. Następnie potwierdzano, że przeciwciała monoklonalne wiążą się swoiście z ανβ6, ale nie z innymi integrynami αν lub integrynami niespecyficznymi (tj. integrynami innymi niż αν. które wiążą się z ligandami zawierającymi RGD) w oparciu o brak zdolności wiązania się liniami komórkowymi wyrażającymi ανβ3, ανβ8, α5β1, ανβ1 lub α5β1. To obejmuje stabilnie transfekowane, jak również nie transfekowane linie komórkowe JY, K562, SW480 , NIH3T3 i FDCP1.
Niektóre przeciwciała, które zostały zdeponowane w ATCC, są zebrane poniżej w Tabeli 1.
T a b e l a 1. Zdeponowane hybrydoma
Klony hybrydoma NrATCC Data depozytu
6.1A8 PTA-3647 16 czerwca, 2001
6.2B10 PTA-3648 16 czerwca, 2001
6.3G9 PTA-3649 16 czerwca, 2001
6.8G6 PTA-3645 16 czerwca, 2001
6.2B1 PTA-3646 16 czerwca, 2001
6.2A1 PTA-3896 5 grudnia, 2001
6.2E5 PTA-3897 5 grudnia, 2001
7.1G10 PTA-3898 5 grudnia, 2001
7.7G5 PTA-3899 5 grudnia, 2001
7.1C5 PTA-390 5 grudnia, 2001
PL 216 223 B1
P r z y k ł a d 5: Testy przeszukiwania i charakteryzowania
a. ELlSA dla ανβ6
96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania (Corning COSTAR EASY-WASH) powlekano 50 μl/studzienkę 5 μg/ml hsa^6 w 4°C przez noc. Płytkę przemywano czterokrotnie buforem do przemywania (0,1% TWEEN-20 w PBS) w automatycznym urządzeniu do płukania płytek. Następnie dodawano 180 μl/studzienkę 3% BSA w TBS i inkubowano przez 1 godz. w 25°C w celu zablokowania niespecyficznego wiązania. Płytkę przemywano jak wyżej i dodawano (50 μl/studzienkę) rozcieńczeń bądź supernatantu znad hybrydoma (w testach przeszukiwania) bądź oczyszczonego przeciwciała (do charakteryzowania) w TBS zawierającym 1 mg/ml BSA, 1 mM CaCl2, i 1 mM MgCl2. Płytki inkubowano przez 1 godz. w 25°C, przemywano, a następnie inkubowano przez 1 godz. z 50 μl/studzienkę koziego przeciwciała anty-mysie IgG+A+M skoniugowanego z peroksydazą (Cappel). Związane przeciwciało wykrywano przy zastosowaniu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB). Wiązanie wykrywano przez pomiar absorbancji przy 450 nm.
b. Test wyłapywania komórek
96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania powlekano 50 μl/studzienkę drugorzędowego przeciwciała (ośle przeciwciało anty-mysia IgG (Jackson Immunoresearch); 5 μg/ml rozcieńczone w 50 mM wodorowęglanie sodu, pH 9,2) w 4°C przez noc. Płytki przemywano dwukrotnie 100 μl/studzienkę buforu do testu (RPMI + 2% BSA), a następnie blokowano 100 μl/studzienkę buforu do testu w 37°C przez 1 godz. Dla komórek FDC-P1 i komórek FDC-P1 transfekowanych β6 płytki blokowano przeciwciałem anty-mysia Ig (Jackson ImmunoResearch; 20 μg/ml) przez 10 min. w temperaturze pokojowej w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania się z receptorem Fc przez drugorzędowe przeciwciało (pominięte dla innych typów komórek). W czasie blokowania płytek, komórki znakowano 2 μΜ barwnikiem fluorescencyjnym (Calcein-AM, Molecular Probes) w buforze do próbek przy stężeniu 5 x 106 komórek/ml. Komórki inkubowano z barwnikiem w buforze do próbek z łagodnym wytrząsaniem w łaźni wodnej w 37°C przez 15 min., zbierano przez odwirowanie i zawieszano w buforze do próbek uzyskując 5 x 106 komórek/ml. Po etapie blokowania bufor odrzucano przez strzepnięcie płytki i do płytki dodawano 25 μl/studzienkę supernatantu albo oczyszczonego przeciwciała. Po 15 min. inkubacji w 37°C, dodawano 25 μl/studzienkę wyznakowanych komórek i płytkę inkubowano przez 1 godz. w 37°C. Płytkę przemywano 3-5 razy buforem do testów (100 μl/studzienkę) i zapisywano fluorescencję emitowaną przez komórki wyłapane na płytce. Procent wiązania określano przez porównywanie fluorescencji przed ostatecznym etapem przemywania (tj. wszystkie dodane komórki) do tej po przemywaniu (tj. komórki związane).
c. FACS
Komórki zbierano przez trypsynizację, przemywano jeden raz PBS, a następnie zawieszano w buforze FACS (1X PBS, 2% FBS, 0,1% NaN3, 1 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2). 0,2 x 105 komórek inkubowano następnie w lodzie przez 1 godz. w buforze FACS zawierającym supernatant znad hybrydoma w całkowitej objętości 100 pl. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie schłodzonym w lodzie buforem FACS, zawieszano w 100 pl buforu FACS zawierającego 5 pg/ml oślego przeciwciała antymysia IgG PE (Jackson ImmunoResearch) i inkubowano w lodzie przez 30 min. Komórki następnie przemywano dwukrotnie schłodzonym w lodzie buforem FACS i zawieszano w 200 pl buforu FACS. Wiązanie wyznakowanego PE drugorzędowego przeciwciała śledzono przez cytometrię przepływową.
d. Wiązanie biotyna-hsa^6 do LAP
96-studzienkowe płytki do mikromiareczkowania (Corning COSTAR EASY-WASH) powlekano 0,3 pg/ml zrekombinowanego ludzkiego LAP (R&D Systems, # kat. 246-LP) rozcieńczonego w PBS (50 pl/studzienkę) w 4°C przez noc. Po usunięciu roztworu do powlekania płytki blokowano przy użyciu 180 pl/studzienkę 3% BSA/TBS w 25°C przez 1 godz. W osobnej 96-studzienkowej okrągłodennej płytce, łączono 60 pl/studzienkę 2X roztworu podstawowego (0,5 pg/ml (1,25 nM) biotyna-a^6, 2 mM CaCl2 i 2 mM MgCl2 w TBS zawierającym 1 mg/ml BSA) z 60 pl/studzienkę 2X roztworu podstawowego bądź supernatantu znad hybrydoma (do przeszukiwania) bądź oczyszczonego przeciwciała (również w TBS zawierającym 1 mg/ml BSA) i inkubowano w 25°C przez 1 godz. Po 4-krotnym przemyciu płytek powleczonych LAP buforem do przemywania (0,1% TWEEN-20 w PBS) w automatycznym urządzeniu do przemywania płytek, 100 pl mieszaniny przeciwciało-a.j/ przenoszono do płytki i inkubowano przez 1 godz. w 25°C. Płytkę przemywano jak wyżej i inkubowano z 50 pl/studzienkę rozcieńczenia 1:1000 koniugatu ekstrawidyna-peroksydaza chrzanowa (Sigma) w TBS (120 mg/ml BSA) przez 1 godz. w 25°C. Związane białko wykrywano przy użyciu substratu TMB.
PL 216 223 B1
e. Adhezja komórek β6-FDC-P1 do LAP
96-studzienkową płytkę do mikromiareczkowania powlekano 50 μl/studzienkę zrekombinowanego ludzkiego LAP rozcieńczonego w 50 mM wodorowęglanie sodu, pH 9,2 w 4°C przez noc. Płytkę przemywano dwukrotnie PBS (100 μl/studzienkę) i blokowano 1% BSA w PBS (100 μl/studzienkę) przez 1 godz. w 25°C. Płytkę przemywano dwukrotnie 100 μl/studzienkę buforu do testu (kompletny TBS plus 1 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2). Następnie do poszczególnych studzienek płytki dodawano 25 μl supernatantu znad hybrydoma (albo oczyszczonego przeciwciała) i 25 μl komórek β6-FDC-P1 (5 x 106 komórek/ml, wyznakowanych kalceiną AM jak opisano powyżej). Płytkę inkubowano w 25°C przez 1 godz., a następnie przemywano 4-6 razy buforem do testów (100 μl/studzienkę). Fluorescencję emitowaną przez wyłapane na płytce komórki zapisywano. Procent wiązania określano przez porównywanie fluorescencji przed ostatecznym etapem przemywania (tj. wszystkie dodane komórki) do tej po przemywaniu (tj. komórki związane).
f. Test biologiczny dla TGF-β
Zastosowany tu test biologiczny był wariantem testu jednoczesnej hodowli komórek nabłonka płuc norki (MLEC. od ang. Mink Iung epithelial cell) PAI-1 Iucyferaza opisanego w Abe i wsp., Anal. Biochem. 216:276-284 (1994), w którym komórki transfekowane β6 hodowano jednocześnie z komórkami reporterowymi w celu śledzenia aktywacji TGF-β przez ανβ6 (Munger, powyżej). Jest to test ilościowy dla TGF-β w oparciu o jego zdolność do indukowania ekspresji inhibitora aktyw atora plazminogenu 1 (PAI-1, od ang. plasminogen activator inhibitor-1). W tym teście komórki MLEC transfekuje się stabilnie konstruktem ekspresyjnym zawierającym skrócony promotor PAI-1 połączony z genem reporterowym dla I ucyferazy ze świetlika. Ekspozycja transfekowanych komórek MLEC na aktywny TGF-β (0,2 do >30 pM) prowadzi do zależnego od dawki wzrostu aktywn ości I ucyferazy w lizatach komórkowych.
W celu przeprowadzenia tego testu, komórki TMLC (linia komórek nabłonka płuc norki Mv 1 Lu) transfekowano konstruktem PAI-1-lucyferaza. Transfekowane komórki hodowano w DMEM + 10% FBS z L-Gln, Pen/Strep i 200 μg/ml G418. Komórki SW480 transfekowane konstruktem integryny β6 (komórki „β6-SW480” lub „SW480 β6”) hodowano w DMEM + 10% FBS z L-Gln i Pen/Strep. Komórki podnoszono z butelek PBS + 5 mM EDTA, przemywano PBS + 0,5% BSA, liczono w przy zastosowaniu hemocytometru i wysiewano w 96-studzienkowych płytkach. Komórki SW480^6 wysiewano w liczbie 4 x 104 komórek/studzienkę w buforze do przemywania. Przeciwciała monoklonalne rozcieńczano w DMEM (wolnym od surowicy), dodawano do komórek SW480^6 i inkubowano wstępnie przez 20 min. w temperaturze pokojowej. Następnie dodawano komórki TMLC w liczbie 2 x 104 komórek/studzienkę w końcowej objętości 100 pl. Płytki inkubowano przez 20 godz. w wilgotnym, wzbogaconym w CO2 inkubatorze. Supernatant z płytek usuwano i zastępowano 100 pl PBS + 1 mM Ca2+ i 1 mM Mg2+. Komórki na płytkach poddawano następnie Iizie i poziom aktywności Iucyferazy wykrywano w reakcji typu jarzenia się z zastosowaniem zestawu Packard LUCLITE (#6016911) i luminometru mikropłytkowego TROPIX.
P r z y k ł a d 6: Oczyszczanie przeciwciała
Osiem klonów hybrydoma z Fuzji #6 (oznaczonych przedrostkiem „6.”) i czternaście klonów hybrydoma z Fuzji #7 (oznaczonych przedrostkiem „7.”) wybrano do dalszego zwiększania skali i charakteryzacji (Tabela 2).
Przygotowano hodowlę na małą skalę (150 ml) dla każdej hybrydoma i supernatant zbierano przez odwirowanie. Przeciwciała oczyszczano z tych supernatantów przy użyciu chromatografii powinowactwa z Białkiem A. W przypadku izotypu IgG2a przeciwciał supernatant nakładano bezpośrednio na złoże Protein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, AB, Uppsala, Sweden) (1 ml upakowanego złoża). Kolumnę przemywano PBS i frakcję IgG wymywano przy zastosowaniu 25 mM kwasu fosforowego, 100 mM NaCl, pH 2,8 w 1:20 objętości 0,5 M Na3PO4, pH 8,6. Dla mysich przeciwciał IgG1 supernatant doprowadzano do 1,5 M glicyny, 3 M NaCl, pH 8,9 przed nałożeniem i kolumnę przemywano 25 mM Na3PO4, 3 M NaCl, pH 8,6 przed elucją. Te preparaty zastosowano do opisanej tu charakteryzacji biochemicznej in vitro.
PL 216 223 B1
T a b e l a 2. Charakteryzacja klonów hybrydoma
Nazwa klonu Nr klonu Izotyp Bloker*
6.1A8 2 IgG2a T
6.2B10 10 IgG2a T
6.3G9 25 IgG1 T
6.4B4 30 IgG1 N
6.6B5 46 IgG1 N
6.8B4 55 IgG1 N
6.8G6 56 IgG1 T
6.2B1 85 IgG1 T
7.1C5 2 IgG2a T
7.1G10 5 IgG2a T
7.2A1 6 IgG2a T
7.2F5 11 IgG2a T
7.2H2 12 IgG2a T
7.4A3 17 IgG2a T
7.7G5 32 IgG1 T
7.8H12 39 IgG2a T
7.9D4 40 IgG2a N
7.9G8 41 IgG2a T
7.9H5 43 IgG2a T
7.10D7 44 IgG2a T
7.10H2 46 IgG2a T
*: Bloker jest zdefiniowany jako przeciwciało, które blokuje wiązanie się αβ6 z LAP co określa się przez blokowanie wiązania ligandu bądź z oczyszczoną Ι_βανβ6 bądź komórkami wyrażającymi β6·
Do zastosowania w modelach zwierzęcych, zwiększono skalę dla klonów hybrydoma do 2 I pożywki i hodowano przez 4 tygodnie w Litecell Culture Bags-PL732 (Nexell, nr kat. R4R2113). Przeciwciała z hybrydoma oczyszczono najpierw przez chromatografię powinowactwa z użyciem Białka A jak opisano powyżej, a następnie etap wymiany jonowej na złożu Q Sepharose (Amersham Pharmacia). Eluat z etapu chromatograficznego na białku A doprowadzano do pH 8,6 przy zastosowaniu 2 M zasady Tris, rozcieńczano 10-krotnie wodą i nakładano na kolumnę Q Sepharose (20 mg białka/ml złoża), które zostało zrównoważone 10 mM Na3PO4, 25 mM NaCl, pH 8,6. Kolumnę przemywano 5 objętościami kolumny buforu do równoważenia i związane białko wymywano przy zastosowaniu 25 mM Na3PO4, 150 mM NaCl, pH 7,2. Wymyte białka były sterylizowane przez filtrowanie (0,45 μm) i przechowywane w -70°C do chwili zastosowania.
P r z y k ł a d 7: Charakteryzacja oczyszczonych przeciwciał
Oczyszczone przeciwciała (Tabela 2, powyżej) charakteryzowano ilościowo pod kątem ich zdolności do (1) wiązania z hsαvβ6, (2) wiązania komórek SW480 i FDC-P1 transfekowanych β6, (3) hamowania wiązania biotyny-α^ do LAP, (4) hamowania wiązania komórek FDC-P1 transfekowanych β6 do LAP i (5) blokowania aktywacji TGF-β za pośrednictwem ανβ6 w teście MLEC (powyżej). Względną siłę każdego z tych testów porównywano ze znanym przeciwciałem wobec ανβ6, 10D5 (Huang i wsp., J. Cell Sci. 111:2189 (1998)) i, w niektórych przypadkach, przeciwci ałem anty-αν, L230. Do charakteryzacji przeciwciał z Fuzji #7 jako kontrolę pozytywną zastosowano również przeciwciało z Fuzji #6, 6.8G6.
PL 216 223 B1
Wyjściowe doświadczenie z wiązaniem (Przykład 5a, powyżej), przeprowadzone w obecności 1 mM Ca2+ i 1 mM Mg2+, wykazało, że większość oczyszczonych przeciwciał wiąże się z hsa^6 (Fig. 2A i 2B). Jednakże nieoczekiwanie nie zaobserwowano wiązania dla 10D5 i klonów 7.2F5 i 7.10D7. Następne doświadczenie pokazało, że wiązanie się 10D5 (Fig. 3E), 7.2F5 i 7.10D7 było jedynie słabo wspomagane przez Ca2+/Mg2+, ale znacznie mocniej przez 1 mM MnCl2. Wśród tych nowych klonów trzy, (6.1A8 (Fig. 3A), 7.7G5, i 6.8G6 (Fig. 3C)) wykazywały wymaganie kationów dwuwartościowych, jakkolwiek nie obserwowano różnicy między stanem Ca2+/Mg2+ i stanem związania z Mn2+.
Pozostałe klony wykazywały brak wymagań dla kationów dwuwartościowych, tj. mogły wiązać się z antygenem w obecności 10 mM EDTA (Fig. 3B, 3D i 3F). Analiza FACS wiązania się przeciwciała NlH 3T3 do komórek transfekowanych β6 albo komórek SW480 wykazała podobny wzór z tą różnicą, że 10D5, w tym kontekście wiąże się tak samo w stanach z Ca2+/Mg2+ i Mn2+. Wymagania wiązania z rozpuszczalną α,β6 mogą różnić się od tych dla wiązania się z ανβ6 wyrażanej na powierzchni komórki na skutek różnicy w konformacji białka albo efektów zachłanności.
Wyniki te sugerują, że istnieją co najmniej 3 różne klasy przeciwciał blokujących β6 w tej grupie. Jedna z klas (10D5) rozróżnia warunki Ca2+/Mg2+ i Mn2+. Inna klasa (włączając w to 6.1A8, 7.7G5 i 6.8G6) wymaga kationów, ale nie odróżnia Ca2+/Mg2+ od Mn2+. Ostatnia klasa (włączając w to przeciwciało anty-α, L230, 6.2B10, 6.3G9 (Fig. 3B) i 6.2B1 (Fig. 3D), 7.1C5 oraz 7.1G10) jest zależna od kationów.
Oczyszczone przeciwciała oceniano następnie pod kątem ich zdolności do hamowania oddziaływania a^6-LAP. W teście wolnym od komórek z Przykładu 5d, powyżej, przeciwciała 6.1A8, 6.2B1, 6.3G9 i 6.8G6 wykazywały wartości IC50 niższe niż te z 10D5 (Fig. 4A; Tabela 3). 6.2B10 wykazywało wyższe IC50, ale nadal dawało całkowite hamowanie (Fig. 4A). 6.4B4 wykazywało jedynie częściowe hamowanie, podczas gdy 6.6B5 i 6.8B4 wykazywało brak hamowania (Fig. 4A). Przy zastosowaniu tego samego systemu testowego przeciwciała 7.1C5, 7.1G10, 7.2A1, 7.4A3, 7.7G5, 7.9G8, 7.9H5 i 7.10H2 wykazywały wartości IC50 niższe niż 10D5 (Fig. 4B; Tabela 3). Przeciwciała 7.2F5, 7.2H2 i 7.8H12 wykazywały prawie identyczne albo wyższe wartości IC50 i nadal dawały całkowite hamowanie (Fig. 4B).
W testach komórkowych opisanych w Przykładzie 5e, powyżej, obserwowano podobną tendencję, z wyjątkiem 6.1A8, 6.2B10 i 7.9D4, które były znacznie słabsze wobec komórek niż oczyszczonego białka (Fig. 5A-E; Tabela 3).
Razem, wyniki te wskazują, że udało nam się wytworzyć przeciwciała, które swoiście hamują oddziaływanie zarówno ludzkiej, jak i mysiej α,β6 z LAP. Niektóre z tych przeciwciał wiążą się z α,β6 z wysokim powinowactwem (widoczne Kd > 0,3 nM, jak określono przez cytometrię przepływową), hamowały wiązanie się z komórek transfekowanych β6 z LAP z IC50 > 0,05 nM (8 ng/ml), i zapobiegały aktywacji TGF-β za pośrednictwem ανβ6 IC50 > 0,58 nM (87 ng/ml).
Na koniec oczyszczone przeciwciała oceniano pod kątem ich zdolności do blokowania aktywacji TGF-β, w której pośredniczy ανβ6 w teście genu reporterowego PAI-1/Iucyferaza (Przykład 5F, powyżej). Ponownie, 6.3G9, 6.8G6, 6.2B1, 7.1G10 i 7.7G5 były zdolne do hamowania aktywacji TGF-β, w której pośredniczy ανβ6, z wartościami IC50 niższymi niż 10D5, podczas gdy pozostałe przeciwciała okazały się być znacząco mniej silne w tym teście (Fig. 6A i 6B; Tabela 3). A zatem zdolność do blokowania oddziaływania ανβ6 z LAP koreluje ze zdolnością do hamowania aktywacji TGF-β in vitro.
T a b e l a 3. Charakteryzacja klonów hybrydoma
Nazwa klonu Nr klonu ELlSA dla wiązania α,β6 EC50 (ng/ml) blokowanie a^6-LAP IC50 (ng/ml) blokowanie FDCP1-LAP IC50 (ng/ml) PAI-1 Iucyferaza IC50 (ng/ml)
1 2 3 4 5 6
6.2B1 85 34,7 225 8 87
6.3G9 25 76,7 271 17 375
6.8G6 56 17,5 169 23 312
10D5 - - 605 50 2070
6.1A8 2 3,7 179 2520 ~40000
6.2B10 10 78,9 1950 >30000 >40000
PL 216 223 B1 cd. Tabeli 3
1 2 3 4 5 6
6.4B4 30 25,4 >50000 >30000 >40000
6.6B5 46 17,1 >50000 >30000 >40000
6.8B4 55 94,4 >50000 >30000 >40000
L230 - 27,1 229 n.t.** n.t.
7.1G10 5 4,2 113 30 250
7.7G5 32 13,0 155 51 700
7.1C5 2 2,5* 80* 83 n.t.
7.2A1 6 5* 300* 101 n.t.
10D5 - 43* 377 n.t. 2,000
7.4A3 17 5,7 204 67 3500
7.10H2 46 6,6 254 63 3500
7.2H2 12 9,3 370 106 5500
7.9H5 43 7,3 230 55 7000
7.9G8 41 6,2 264 284 >20000
7.8H12 39 46,0 1140 969 >20000
7.2F5 11 >5000 529 1490 >20000
7.9D4 40 1,7 niecałkowite >10,000 >20000
7.10D7 44 >5000 3000* 1120 n.t.
*: Dane otrzymane z odrębnych doświadczeń.
**: Nie testowane.
***: Wszystkie doświadczenia zebrane w Tabeli 3 przeprowadzano w obecności 1 mM Ca2+ i 1 mM Mg2+.
****: Przeciwciała zapisane tłustym drukiem są znanymi w tej dziedzinie przeciwciałami 10D5 i L230 oraz nowymi przeciwciałami o szczególnie wysokiej sile hamowania wobec ανβ6.
Następnie, ustalono powinowactwa w roztworze dla 6.3G9 i 6.8G6 wobec rozpuszczalnej ανβ6 przy zastosowaniu kinetycznego testu wykluczania (KinExA, ang. kinetic exclusion assay). Serie rozcieńczeń rozpuszczalnej integryny (1 x 10-8 M to 2,4 x 10-12 M) inkubowano z 1 x 10-10 M przeciwciała przez 3 godz. Próbki te przepuszczono następnie przez kulki polimetylometakrylanowe powleczone integryną przy zastosowaniu urządzenia KinExA (Sapidyneinstruments, Inc., Boise, Idaho). W przypadku 6.8G6, w buforach do inkubacji i testu był obecny 1 mM CaCl2 i 1 mM MgCl2. Ilości związanego i wolnego przeciwciała ustalono przy zastosowaniu wyznakowanych Cy5 przeciwciał drugorzędowych anty-mysich. Przeprowadzono dopasowanie do krzywej kwadratowej przy zastosowaniu oprogramowania KinExA w celu otrzymania stałej dysocjacji (Kd) dla każdego oddziaływania. Kd ustalone przy zastosowaniu tej metody wynosiły 15,6 pM dla 6.3G9 i 22,8 pM dla 6.8G6 (Fig. 9A i 9B). A zatem, obydwa te przeciwciała miały bardzo wysokie powinowactwo do ανβ6.·
Zidentyfikowaliśmy ponadto klasy przeciwciał anty-a^6, które rozpoznawały „aktywowane” stany integryny. Istnieją dwa potencjalne stany aktywacji ανβ6. W pierwszym stanie aktywowana integryna jest zdefiniowana jako mająca wyższe powinowactwo dla swojego liganda. Przeciwciała swoiste dla tego stanu aktywowanego wykazywały zwiększone wiązanie się do integryny w obecności aktywujących kationów, takich jak 1 mM MnCl2. Porównanie zakresu wiązania w 1 mM MnCl2 i 1 mM MgCl2 (kationy nieaktywujące) przez cytometrię przepływową pokazało, że niektóre opisane tu przeciwciała wobec ανβ6, włączając w to 6.1A8 i 6.6G5, wykazywały znacząco zwiększone wiązanie w obecności MnCl2.
W drugim stanie aktywowanym ανβ6, integryną może aktywować ΤGF-β w stanie latencji, jak opisano powyżej. Wytworzono linię komórkową wyrażającą skróconą ανβ6 (SW480(β6-770Τ)). Linia komórkowa miała zdolność do wiązania się z LAP, ale nie mogła aktywować ΤGF-β w teście Iucyferazy TMLC (Munger i wsp., powyżej). Przeciwciała, które wiążą się z komórkami SW480 transfekowaPL 216 223 B1 nymi β6, ale nie z transfekowanymi komórkami 770T ze skróceniem, były zatem swoiste wobec formy ανβ6, która ma zdolność do aktywowania TGF-β. Przeciwciała 7.8B3 i 7.8C9 spełniają to kryterium.
P r z y k ł a d 8: Mapowanie epitopów przez współzawodnictwo z przeciwciałami
Oczyszczone przeciwciała testowano również pod kątem ich zdolności do współzawodniczenia z 6.8G6 o wiązanie się z biotynylowaną α„β6 w teście ELISA. W tym teście, 6.8G6 powlekano płytkę ELISA i dodano mieszaninę współzawodniczącego przeciwciała i biotynylowanej ανβ6 w buforze zawierającym 1 mM zarówno Ca2+ jak i Mg2+. Związaną integrynę wykrywano przy zastosowaniu koniugatu ekstrawidyna-HRP i współzawodniczące przeciwciała badano pod kątem ich zdolności do blokowania wiązania. Okazało się, że wszystkie konsensusowe blokery (Tabela 2) z wyjątkiem 6.2B10 (słaby bloker) były zdolne do współzawodniczenia z 6.8G6 do pewnego stopnia (Tabela 4). Dane te potwierdzają, że konsensusowe blokery wiążą się z tym samym lub zachodzącym epitopem, co 6.8G6.
T a b e l a 4. Mapowanie epitopów przez współzawodnictwo z przeciwciałem
Klon Konsensusowy bloker? Współzawodnictwo z 6.8G6
6.2A1 N -
6.4B4 N -
6.6B5 N -
6.8B4 N -
7.9D4 T/N -
10D5 T ++
L230 T ++
6.1A8 T ++
6.2B10 T (słaby) -
6.3G9 T +
6.8G6 T ++
6.2B1 T ++
7.1C5 T +++
7.1G10 T +++
7.2A1 T ++
7.2F5 T ++
7.2H2 T ++
7.4A3 T ++
7.7G5 T ++
7.8H12 T ++
7.9G8 T ++
7.9H5 T ++
7.10D7 T +
7.10H2 T ++
Oczyszczone przeciwciała monoklonalne testowano pod kątem ich zdolności do współzawodniczenia z biotynylowanym 6.3G9 lub biotynylowanym 6.8G6 o wiązanie się z α„β6 w teście ELISA. W tym teście, niewyznakowaną α„β6 powlekano płytkę ELISA i dodano mieszaninę współzawodniczącego przeciwciała i biotynylowanego przeciwciała w buforze zawierającym 1 mM zarówno Ca2+ jak i Mg2+. Związane biotynylowane przeciwciało wykrywano przy zastosowaniu koniugatu neutrawidyna-HRP. Dane pokazały, że większość potencjalnych przeciwciał blokujących (np., 6.2B1, 7.1C5 i 7.1G10) współzawodniczyło zarówno z 6.3G9 jak i 6.8G6 o wiązanie z ανβ6 (Tabela 4.1 oraz Fig. 10A i 10B).
PL 216 223 B1
Przeciwciała 6.1A8 i 7.7G5 wykazywały mniejsze współzawodnictwo, prawdopodobnie na skutek ich mniejszego powinowactwa z ανβ6. Żadne z przeciwciał nie blokujących ani przeciwciało anty-av L230 nie wykazywało żadnego współzawodniczenia z 6.3G9 lub 6.8G6 w tym teście. Wyniki te pokazują, że swoiste wobec ανβ6 blokujące przeciwciała wiążą się z tymi samymi lub zachodzącymi epitopami na ανβ6.·
T a b e l a 4.1. Mapowanie epitopów przez współzawodnictwo z przeciwciałem
Klon Konsensusowy bloker? Współzawodnictwo z biotynylowanym 6.8G6 Współzawodnictwo z biotynylowanym 6.8G9
6.3G9 T +++ +++
6.2B1 T +++ +++
6.8G6 T +++ ++
7.1C5 T +++ +++
7.1G10 T +++ +++
7.7G5 T ++ +
6.1A8 T ++ +
6.2A1 N - -
6.2E5 N - -
6.2G2 N - -
6.4B4 N - -
7.8B3 N - -
7.8C9 N - -
L230 T - -
P r z y k ł a d 9: Sekwencje CDR
Z niektórych oczyszczonych przeciwciał monoklonalnych wyizolowano i zsekwencjonowano cDNA przy zastosowaniu standardowych technik jak opisano w Coligan i wsp. (red.), Current Protocols in Immunology, Wiley, Media, PA (2001). Wydedukowane sekwencje aminokwasowe są pokazane na Fig. 7A i 7B.
Sekwencje aminokwasowe CDR łańcuchów ciężkich przeciwciał wiążących 6.8G6, 6.1A8, 6.2B1,6.3G9 i 6.2A1 oraz nie-blokera 6.2G2 porównano jak następuje (kreski oznaczają przerwy).
CDR1
6.8G6 6.1A8 6.2B1 6.3G9 6.2A1 6.2G2 SYTFTDYAMH SYTFTDYTMH GFTFSRYVMS GFTFSRYVMS GYDFNNDLIE GYAFTNYLIE (SEK NR ID:1) (SEK NR ID:2) (SEK NR ID:3) (SEK NR ID:3) (SEK NR ID:49) (SEK NR ID:50)
CDR2
6.8G6 VISTYYGNTNYNQKFKG (SEK NR ID: 4)
6.1A8 VIDTYYGKTNYNQKFEG (SEK NR ID:46}
6.2B1 SISSG-GSTYYPDSVKG (SEK NR ID:5)
6.3G9 SISSG-GRMYYPDTVKG (SEK NR ID:6)
6.2A1 VINPGSGRTNYNEKFKG (SEK NR ID:51)
6.2G2 VISPGSGIINYNEKFKG (SEK NR ID:52)
CDR3
6.8G6 GGLRRGDRPSLRYAMDY (SEK NR ID:7)
6.1A8 GGFRRGDRPSLRYAMDS (SEK NR ID:47)
6.2B1 GAIYDG----- -YYVFAY (SEK NR ID: 8)
6.3G9 GSIYDG----- -YYVFPY (SEK NR ID: 9)
6.2A1 IYYGPH----- -SYAMDY (SEK NR ID:53)
6.2G2 ID-YSG----- -PYAYDD (SEK NR ID:54)
PL 216 223 B1
W SEK NR ID:7, „R” pogrubionym drukiem (reszta dwunasta) oznacza, że jest ona przedmiotem polimorfizmu i może to być na przykład Q.
Sekwencje aminokwasowe CDR łańcuchów lekkich tych czterech przeciwciał wiążących o wysokiej swoistości oraz nie-blokera 6.2G2 porównano jak następuje:
CDR1
CDR2
6.8G6 6.1A8 6.2B1 6.3G9 6.2A1 6.2G2
RASQSVSTSS-YSYMY
RASQSVSIST-YSYIH
SASSSVSSS----YLY
SANSSVSSS----YLY
KASLDVRTAVA
KASQAVNTAVA
NR ID: 10)
NR ID: 48)
NR ID: 11)
NR ID: 12)
NR ID: 55)
NR ID: 56)
CDR3
6.8G6 YASNLES (SEK NR ID
6.1A8 YASNLES (SEK NR ID
6.2B1 STSNLAS (SEK NR ID
6.3G9 STSNLAS (SEK NR ID
6.2A1 SASYRYT (SEK NR ID
6.2G2 SASYQYT (SEK NR ID
6.8G6 QHNWEIPFT (SEK NR ID:15)
6.1A8 QHSWEIPYT (SEK NR ID: 16)
6.2B1 HQWSSYPPT (SEK NR ID:17)
6.3G9 HQWSTYPPT (SEK NR ID:18)
6.2A1 QQHYGIPWT (SEK NR ID:59)
6.2G2 QHHYGVPWT (SEK NR ID:60)
Jak pokazano na Fig. 7A i 7B, mAb, które należą do klasy zależnej od kationów dwuwartościowych (np. 6.1A8 i 6.8G6) wydają się zawierać bardzo podobne sekwencje aminokwasowe w obrębie CDR, podczas gdy mAb niezależne od kationów dwuwartościowych (np. 6.2B1 i 6.3G9) zawierają inny zestaw motywów w swoich CDR.
O sile i swoistości przeciwciał monoklonalnych anty-ay6 mogą decydować nieco różne reszty aminokwasowe. W przypadku 6.1A8 i 6.8G6, sekwencje aminokwasowe domen zmiennych są bardzo podobne, zawierając 10 różnic aminokwasowych w łańcuchu ciężkim, z których trzy są konserwatywne, i 11 różnic aminokwasowych w łańcuchu lekkim. Jednakże te przeciwciała wykazują z grubsza 100-krotną różnicę w aktywności w testach in vitro. Różnice aminokwasowe są rozproszone na przestrzeni domen zmiennych łańcuchów polipeptydowych i te reszty mogą funkcjonować same albo synergicznie z resztami tego samego łańcucha albo łańcucha będącego partnerem wpływając na siłę przeciwciał. W łańcuchu ciężkim, siedem reszt jest położonych tak, że są one prawdopodobnie w bardzo blisko albo odgrywają aktywną rolę w wiązaniu się z α.β6.·
Motyw RGD znajduje się w wielu białkach wiążących integryny (ligandach). Pokazano, że motyw ten pośredniczy w ich oddziaływaniach przez bezpośredni kontakt z kieszenią wiążącą na integrynie. Ponieważ sam RGD jest dość powszechny wśród białek wiążących integryny, reszty flankujące na zewnątrz motywu muszą odgrywać rolę w nadawaniu swoistości oddziaływaniu integryna-ligand. W 6.1A8 i 6.8G6, jedna z takich flankujących reszt jest w pozycji 101 w łańcuchu ciężkim, w obrębie CDR3. Te reszty aminokwasowe flankują motyw RGD i mogą być umieszczone w miejscu rozpoznawania antygenu, przyczyniając się do siły i swoistości wiązania.
Inne odmienne reszty w obrębie CDR łańcuchów ciężkich 6.1A8 i 6.8G6 obejmują te w pozycjach 33 (CDR1); pozycjach 52, 57 i 65 (CDR2) oraz pozycji 115 (CDR3). Inna różnica w łańcuchu ciężkim leży w pozycji 4 w regionie zrębowym 1, który znajduje się obok końca N. Modele krystalograficzne przewidują, że reszta ta znajduje się po sfałdowaniu w pobliżu CDR przeciwciała i może odgrywać ważną rolę w wiązaniu α.β6. Trzy pozostałe różnice pomiędzy 6.1A8 i 6.8G6 są różnicami konserwatywnymi w pozycjach 20 (region zrębowy 1), 44 (region zrębowy 2) i 82 (region zrębowy 3).
Sekwencje aminokwasowe przeciwciał niezależnych od kationów są również wysoce homologiczne. Można je podzielić na dwie klasy: te które współzawodniczą z przeciwciałem zawierającym
RGD 6.8G6 (tj. 6.2B1, 6.3G9, 7.10H2, 7.9H5. 7.1C5, 7.1G10 i 7.4A3); i tymi, które nie współzawodni20
PL 216 223 B1 czą (tj. 6.2A1, 6.2B10 i 6.4B4). Klasa współzawodnicząca z 6.8G6 zawiera motyw FXY w łańcuchu ciężkim CDR3, podczas gdy klasa nie współzawodnicząca nie. Ta różnica sugeruje, że motyw FXY jest ważny w pośredniczeniu w niezależnym od kationu wiązaniu się z αβ6. Dodatkowo, ta zawierająca FXY klasa przeciwciał prawdopodobnie wiąże się z epitopem na α.,β6, który zachodzi na, jakkolwiek jest odrębny od kieszeni wiążącej RGD. Przeciwciała 6.2B10 i 6.4B4 nie zawierają motywu FXY i są słabymi brokerami α.,β6. Pokazano, że wiążą się one częścią podobną do domeny i α.,β6 i definiują jeszcze inny epitop, do którego wiążą się przeciwciała anty-αβ^ Co interesujące przeciwciało monoklonalne 6.2A1 należy do klasy niezależnej od kationów, ale nie zawiera sekwencji RGD tak jak inne mAb niezależne od kationów.
Przeciwciało monoklonalne 7.7G5 należy do klasy zależnej od kationów. Jednakże sekwencja łańcucha lekkiego 7.7G5 jest wysoce homologiczna do niezależnego od kationów przeciwciała 6.2B10 wiążącego się z domeną I. Łańcuch ciężki 7.7G5 jest również podobny do niezależnego od kationów przeciwciał w CDR1. Jednakże ich CDR2 i CDR3 są bardziej podobne do tych z klasy zależnych od kationów. Ta obserwacja sugeruje, że specyficzne CDR nadają swoistości przeciwciału. Jest to prawdziwe w szczególności dla CDR3 łańcucha ciężkiego, prawdopodobnie na skutek wysokiego stopnia zróżnicowania w tej części przeciwciała. Faktycznie, dwa spośród trzech zależnych od kationu i siedem spośród dziewięciu niezależnych od kationu przeciwciał zawiera sekwencje CDR3 łańcucha ciężkiego, które prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w rozpoznawaniu ανβ6. Należy odnotować, że w 7.7G5 brak jest motywu RGD, ale zawiera on motyw XGD w swoim łańcuchu ciężkim CDR2. Ten motyw XGD może działać w podobny sposób co RGD i nadaje 7.7G5 powinowactwo wiązania/swoistość.
Powyższe obserwacje dotyczące sekwencji i wyciągnięte z nich wnioski dostarczają podstaw do racjonalnego projektowania sekwencji aminokwasowych specyficznych regionów zmiennych, które nadają właściwości swoistego wiązania.
P r z y k ł a d 10: Przeciwciała diagnostyczne
Przeciwciała, które mogą wykrywać ekspresję ανβ6 w skrawkach tkanki zatopionych w parafinie lub innych próbkach tkanek mogą być przydatne jako odczynniki diagnostyczne. Te narzędzia diagnostyczne można zastosować np. do wykrywania zwiększonego poziomu ανβ6 w skrawkach tkanek przy takich wskazaniach jak rak albo zwłóknienie.
W celu zidentyfikowania przeciwciał, które wykrywają ανβ6 w tkankach zatopionych w parafinie, najpierw przeszukaliśmy zestaw przeciwciał pod kątem wiązania się z podjednostką β6 oczyszczoną przez HPLC. Przeciwciała, które wiążą się z tą podjednostką prawdopodobnie rozpoznają liniowe epitopy peptydowe i należy się zatem spodziewać większego prawdopodobieństwa sukcesu w tkankach zatopionych w parafinie. Wiązanie z oczyszczoną podjednostką β6 przeprowadza się przy zastosowaniu testu ELISA identycznego z tym opisanym dla pomiaru wiązania ανβ6 (powyżej), z tą różnicą, że na płytce unieruchomiona jest oczyszczona integryna β6, a nie białko ανβ6. Przy zastosowaniu tej metody zidentyfikowano kilka przeciwciał z Fuzji 6 zdolnych do wiązania się zarówno z oczyszczonym białkiem ανβ6 jak i oczyszczoną podjednostką β6. Patrz Tabela 5, tutaj, gdzie przedrostek „6”. W nazwach klonów jest pominięty.
T a b e l a 5. Wiązanie się przeciwciała z oczyszczoną ανβ6 albo oczyszczoną podjednostką p6
Nazwa klonu Wiązanie się z ανβ6 Wiązanie się z podjednostką p6 oczyszczoną przez HPLC
1A1 + 6
1A8 + -
1A11 +
1E1 + +
1E6 + +
1H10 +/- -
2A1 + +
2A10 - -
2B8 - -
2B10 + -
PL 216 223 B1
Nazwa klonu Wiązanie się z ανβ6 Wiązanie się z podjednostką β6 oczyszczoną przez HPLC
2C4 + +
2C7 + +
2E5 + +
2G3 + -
3A6 + -
3B1 + -
3B2 + +
3B11 + +
3C2 + +
3D5 + -
3D10 + +
3F1 + -
3G3 - -
3G5 + -
3G9 + -
3H2 + -
3H11 + -
4A4 +/- +
4B2 + -
4B4 + -
4B10 + -
4D2 + -
4E4 + +
4G3 + -
4G4 + +
4H4 + +
4H12 + -
5A2 + -
5B6 + +
5D6 + +
5D8 - -
5G9 + +
5G10 + +
5H3 + +
6B1 + +
6B5 + +
6C4 + -
6D12 + +
6E6 + -
6E10 + -
6G3 +/- -
7C7 + +
7E5 + -
7F8 + -
8B4 + +
8G6 + -
PL 216 223 B1
Nazwa klonu Wiązanie się z ανβ6 Wiązanie się z podjednostką β6 oczyszczoną przez HPLC
9B5 + +
9B7 + +
9B9 + -
9810 + -
9D11 + +
9E12 + +
9F5 + +
9F7 - -
9G1 + -
9H11 + -
10A2 + -
10A3 +/- -
10A4 + -
10A8 + -
10A9 + -
10B10 + -
10D3 + -
10D11 + -
10E4 + +
10F1 + -
10F12 + -
10G1 + -
1002 - -
10H11 + +
1A7 + -
1D6 + -
1D9 + -
1F6 + -
2B1 + -
2D9 + +
202 + +
3D9 + +
3E5 + -
4C12 + -
4E6 + +
405 + -
5A3 + -
5B3 + -
5B8 + +
5B9 + -
5F7 + -
6C10 + +
6D8 + -
6F4 + -
609 + -
6H8 + +
6H9 + -
7A5 + +
PL 216 223 B1
Nazwa klonu Wiązanie się z ανβ6 Wiązanie się z podjednostką β6 oczyszczoną przez HPLC
7A11 + -
7E6 + +
7G9 - +
7H3 + -
9A2 - -
9A3 + +
9A4 - -
9A9 + -
9D2 - -
9D3 - -
9E4 - -
9F1 + -
9F12 - -
9G11 - -
10B5 + -
10B7 + -
10B9 +/- -
10C5 +/- -
10C7 +/- -
10D6 +/- -
10E12 +/- -
10F7 - -
Jak pokazano powyżej, niektóre przeciwciała wiążą się z oczyszczoną podjednostką β6.Będą one z dużym prawdopodobieństwem wiązać się ze zdenaturowaną ανβ6, a zatem będą przydatne przy wykrywaniu ανβ6 w skrawkach tkanki zatopionych w parafinie. Inne przeciwciała wiążą się z rozpuszczalną ανβ6, ale nie z podjednostką β6. Obydwa typy przeciwciał zostały zastosowane do wybarwiania zdenaturowanych zatopionych w parafinie komórek SW480 transfekowanych β6 i nietransfekowanych komórek rodzicielskich i dane są pokazane w Tabeli 6.
W celu wybarwienia tkanek lub komórek zatopionych w parafinie, ze szkiełek z próbkami najpierw usuwano parafinę przez inkubację w następujących roztworach: (1) ksylen, 5 min., dwukrotnie; (2) 100% etanol, 2 min., dwukrotnie; (3) 95% etanol, 2 min., dwukrotnie: (4) 50% etanol, 2 min., raz i (5) woda destylowana, 2 min., raz. Szkiełka inkubowano następnie w roztworze składającym się z 200 ml metanolu i 3 ml 30% H2O2 przez 15 min. w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Szkiełka płukano dwukrotnie w PBS, każdorazowo przez 2 min. Skrawki parafinowe na szkiełkach udostępniano przy użyciu pepsyny (Zymed 00-3009) przez 5 min. w 37°C. Szkiełka przemywano ponownie dwukrotnie w PBS, każdorazowo przez 2 min. Następnie szkiełka inkubowano awidyną, a potem biotyną (Vector SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, CA), każdorazowo przez 10 min. w temperaturze pokojowej z przemywaniem pomiędzy każdą inkubacją jak opisano powyżej. Po usunięciu ze szkiełek roztworu blokującego na szkiełka nakładano pierwszorzędowe przeciwciało (supernatant hodowli hybrydoma) rozcieńczone w PBS/0,1% BSA i inkubowano przez noc w 4°C.
Następnego dnia szkiełka płukano w PBS jak opisano powyżej. W międzyczasie przygotowywano roztwór: kompleks awidyna-biotyna-peroksydaza chrzanowa (odczynnik ABC) jak następuje: 1 ml PBS zmieszano z 20 μl roztworu A (1:50) i 20 μl roztworu B (1:50) z zestawu Vector Kit PK-6102 i mieszaninę inkubowano przez 30 min. w temperaturze pokojowej przed użyciem. W tym czasie szkiełka inkubowano przez 30 min. w temperaturze pokojowej z biotynylowanym przeciwciałem antymysz (1:200) z zestawu Vector Kit z 15 μ^ normalnej surowicy. Szkiełka płukano następnie dwukrotnie w PBS, każdorazowo przez 2 min. Następnie, na szkiełka nakładano opisany powyżej odczynnik ABC i inkubowano przez 30 min. w temperaturze pokojowej. Szkiełka płukano ponownie jak opisano powyżej. Następnie, na szkiełka nakładano substrat (Vector SK-4100), 100 μl DAB (3,3'-diaminobenzydyna) i inkubowano przez 5 min. w temperaturze pokojowej. DAB przygotowano jak następuje: do 5 ml H2O dodać 2 krople buforu Buffer Stock Solution, dobrze zmieszać; następnie dodać 4 krople 4 drops roztworu DAB, dobrze zmieszać; po czym dodać 2 krople roztworu H2O2, dobrze
PL 216 223 B1 zmieszać. Następnie szkiełka płukano bieżącą wodą przez 2 min. Następnie sygnał DAB wzmacniano dla wszystkich szkiełek jak następuje: przepłukać skrawki parafinowe w 0,05 M wodorowęglanem sodu, pH 9,6, przez 10 min.; osuszyć bibułą nadmiar buforu; nałożyć roztwór wzmacniający DAB przez 15 sekund; a następnie szybko przepłukać wodą przez 1 min. w celu zatrzymania reakcji. Szkiełka barwiono następnie hematoksyliną Mayera (wybarwienie jądra) przez 1 min. Szkiełka płukano bieżącą wodą przez 1 min., a następnie zanurzano w PBS na 1 min., tak że hematoksylina stawała się niebieska. Szkiełka następnie ponownie płukano bieżącą wodą przez 1 min. i odwadniano i klarowano jak następuje: zanurzyć w (1) 95% etanolu na 1 min., dwukrotnie; (2) 100% etanol przez 1 min., dwukrotnie; i (3) ksylen przez 2 min., dwukrotnie. Następnie na szkiełka nakładano szkiełka nakrywkowe przy zastosowaniu odczynnika permount.
Wyniki sugerują, że przeciwciała z Fuzji 6, 1A1, 2C4, 3B2, 3B11, 5D6, 5G9, 5H3, 6D12, 7C7, 9B5, 9B7, 9D11, 9F5, 10E4, 10H11, 6H8, 7A5, 7G9, 9A3, 2A1, 2E5, 4E4, 4H4, 8B4, 2G2 i 4E6, z których każde mogłoby wiązać się z oczyszczoną podjednostką β6 (Tabela 5). rzeczywiście silnie barwiły zatopione w parafinie komórki SW480 transfekowane β6, nie barwiąc jednocześnie nietransfekowanych komórek rodzicielskich (Tabela 6).
T a b e l a 6. Wiązanie się przeciwciała z zatopionymi w parafinie komórkami SW480
ID# Nazwa klonu Wiązanie się z SW480/|J>6+ Wiązanie się z SW480
1 1A1 +++ -
2 1A8 + +
3 1A11 ++ -
4 1E1 + -
5 1E6 ++ +
7 2A1 +++ -
10 2B10 - -
11 2C4 +++ -
12 2C7 - -
13 2E5 +++ -
17 3B2 +++ -
18 3B11 ++ -
25 309 - -
30 4B4 + +
33 4E4 +++ -
35 404 - -
36 4H4 +++ -
39 5B6 + -
40 5D6 +++ -
42 509 +++ -
43 5010 - -
44 5H3 +++ -
46 6B5 - -
48 6D12 +++ -
52 7C7 ++ -
54 7F8 - -
55 8B4 +++ -
56 806 - -
57 9B5 ++ -
58 9B7 ++ -
61 9D11 ++ -
PL 216 223 B1
ID# Nazwa klonu Wiązanie się z SW480/p6+ Wiązanie się z SW480
62 9E12 + -
63 9F5 ++ -
68 10A3 - -
75 10E4 +++ -
80 10H11 ++ -
85 2B1 + +
87 2G2 +++ -
91 4E6 +++ -
95 5B8 - -
98 6C10 + -
102 6H8 ++ -
104 7A5 +++ -
107 7G9 +++ -
110 9A3 +++ -
P r z y k ł a d 11: Diagnozowanie raka ανβ6 jest normalnie wyrażana na niskich poziomach w zdrowych tkankach dorosłych. Jednakże, ekspresja ανβ6 jest podwyższona przy uszkodzeniach, zwłóknieniu i raku (patrz np. Thomas i wsp. J. Invest. Dermatology 117:67-73 (2001); Brunton i wsp., Neoplasia 3; 215-226 (2001); Agrez i wsp., Int. J. Cancer 81:90-97 (1999); Breuss, J. Cell Science 108:2241-2251 (1995)). A zatem przeciwciała, które wiążą się swoiście z ανβ6 wyrażaną na tkankach zatopionych w parafinie można zastosować w standardowych technikach immunohistochemicznych do wykrycia ekspresji ανβ6 w celu zdiagnozowania zwłóknienia, raka i innych chorób, w których zwiększony jest poziom ανβ6.·
Jak opisano powyżej, pewne przeciwciała według wynalazku wiążą się z integryną β6 oczyszczoną przez HPLC i zatopionymi w parafinie i utrwalonymi komórkami transfekowanymi β6. Pokazano również, że przeciwciała te wiążą się z reprezentatywnymi tkankami raka płaskokomórkowego i sutka w immunobarwieniu. Patrz np. Fig. 8, gdzie przeciwciało monoklonalne 6.2A1 zastosowano aby pokazać względne barwienie zatopionych w parafinie nowotworów płaskokomórkowych i sutka. A zatem te nowe przeciwciała są przydatne jako narzędzia diagnostyczne.
P r z y k ł a d 12: Efekty blokujących mAb anty-ave6 u myszy Alport
Wyprowadzono myszy z nokautem kolagenu 4A3 (COL4A3) (Alport) jako model in vivo zwłóknienia nerki i zastosowano w celu przetestowania efektów terapeutycznych czynnika farmakologicznego (powyżej). Testowaliśmy mAb 6.8G6 (zależne od kationów) i 6.3G9 (niezależne od kationów) u myszy Alport w celu ustalenia, czy będą one hamować zwłóknienie normalnie obserwowane u siedmiotygodniowych myszy Alport. Jak pokazano powyżej, stwierdzono, że te dwa przeciwciała hamują wiązanie się ανβ6 z LAP i hamują aktywację TGF-β w teście biologicznym. Przeciwciało 1E6 użyto jako kontrolę negatywną.
Trzytygodniowym myszom Alport podano dootrzewnowo 3 razy w tygodniu dootrzewnowe zastrzyki z następującymi przeciwciałami: (1) 6.8G6, 4 mg/kg (7 myszy); (2) 6,3G9, 4 mg/kg (4 myszy) i (3) 1E6, 1 mg/kg (6 myszy). Zastrzyki kontynuowano przez 4 tygodnie. Myszy następnie uśmiercano i pobierano ich nerki.
Przygotowano skrawki nerki zatopione w parafinie jak opisano powyżej, a następnie barwiono je w celu wykrycia aktyny mięśni gładkich, markera dla mioblastów i depozytu substancji międzykomórkowej w zwłóknieniu nerki. Stwierdziliśmy znaczące zmniejszenie barwienia aktyny mięśni gładkich zarówno w regionach śródmiąższowych jak i kłębuszkowych nerki z myszy Alport traktowanych mAb 6.8G6 lub 6.3G9, w porównaniu z myszami traktowanymi 1E6.
Fig. 11A i 11B pokazują wykres kropkowy barwienia wykrycia aktyny mięśni gładkich w regionach śródmiąższowych i kłębuszkowych nerki z myszy Alport traktowanych 6.8G6 i 6.3G9, w porównaniu z kontrolą negatywną - myszami traktowanymi 1E6.
PL 216 223 B1
P r z y k ł a d 13: Skuteczność mAb anty-avp6 w zapobieganiu stwardnienia nerki indukowanego jednostronną niedrożnością moczowodu.
Zastosowaliśmy inny mysi model rozwoju zwłóknienia nerek w celu przetestowania skuteczności przeciwzwłóknieniowej 6.8G6 i 6.3G9. W tym mysim modelu moczowód zwierzęcia jest podwiązany, co prowadzi do jednostronnej niedrożności moczowodu (UUO od ang. unilateral ureteral obstruction). UUO powoduje postępujące stwardnienie nerki bez zbliżonego zjawiska - niewydolności nerek u myszy, ponieważ niezablokowana nerka może utrzymywać stosunkowo prawidłową funkcję nerkową. Podczas gdy niedrożna nerka podlega szybkiemu globalnemu zwłóknieniu, drożna nerka ulega adaptacyjnemu przerostowi.
To badanie oceniało ilościowo morfometrycznie efekt leczenia przy użyciu anty-avp6 indukowanego UUO zwłóknienia nerki. Użyte zostały samce w wieku 8-12 tygodni wolnych od antygenu wirusowego myszy C57BL o wadze 25,5±0,2 g (Jackson Laboratories, Bar Harbor. ME). Myszom umożliwiono przystosowanie się przez siedem dni przed rozpoczęciem badania. Myszy miały swobodny dostęp do poddanej napromieniowaniu standardowej mysiej karmy i jałowej wody w czasie okresu adaptacyjnego i doświadczalnego. Wagę ciała mierzono w odstępach czasu jako część śledzenia zdrowia zwierzęcia. Wyniki pokazały, że pasujące wiekiem nieoperowane myszy zyskiwały około 10% wagi ciała na przestrzeni dwutygodniowego badania. Myszy UUO utraciły około 9% wagi ciała przed dniem 2, ale stopniowo zyskiwały utraconą wagę ciała przez dniem 14. Ta zmiana wzoru wagi miała miejsce niezależnie od traktowania terapeutycznego.
W celu zaindukowania zwłóknienia nerki, wyizolowano aseptycznie lewy moczowód przez lewostronną laparoskopię pod znieczuleniem przy użyciu ketaminy:ksylazyny (100:10 mg/kg s.c.). Na moczowodzie umieszczono dwie mocne, zamykające jedwabne podwiązki 6-0 na poziomie niższego bieguna nerki i moczowód przecięto pomiędzy podwiązkami. Ścianę brzuszną zamknięto wikrylowym szwem 4-0 i skórę zamknięto nylonem 4-0. Zwierzętom umożliwiono dojście do siebie na ogrzewanej podkładce i podawano 0,05 mg/kg s.c. buprenorfiny dwa razy dziennie w dniach 0 i 1. Procedura była adaptacją z Ma i wsp., Kidney Int. 53 (4):937-944 (1998).
Myszy podzielono na następujące grupy badawcze:
Grupa Traktowanie Dawka (mg/kg, i.p.) n*
1 6.8G6 (zależne od kationów mAb anty-^Pe 4 9
2 6.3G9 (niezależne od kationów mAb anty-avp6 4 8
3 1E6 (mAb - kontrola negatywna) 4 10
4 Kontrola - nośnik PBS (100 pl) 8
5 Nieoperowana, nie traktowana kontrola - - 8
* Liczba zwierząt
Wszystkim zwierzętom z wyjątkiem tych w Grupie 5 podawano dawki dwa razy w tygodniu rozpoczynając dzień przez operacją.
Zwierzęta uśmiercano następnie przy użyciu dwutlenku węgla w dniu 10 po podwiązaniu i poddano sekcji. U myszy UUO miedniczki nerkowe i moczowód były znacząco obrzmiałe i wypełnione płynem powyżej zamykającej podwiązki. Stopień obrzmienia i zasięg pozostającej masy tkankowej różnił się pomiędzy traktowanymi grupami. Grupa 2 wykazywała połowę obrzęku w porównaniu z grupą kontroli negatywnej. Podwiązana nerka miała blady kolor. Przeciwległe nerki były jaskrawo czerwone i powiększone o około jedną trzecią.
Następnie, obydwie nerki (lewa podwiązana, prawa nie podwiązana) zwierząt pobierano i dzielono na pół wzdłuż przez środek miedniczek nerkowych. Połowę każdej nerki umieszczano w 10% obojętnej zbuforowanej formalinie w celu barwienia utrwalonej tkanki. Połowę każdej nerki umieszczano w 15% sacharozie, a następnie 30% sacharozie w celu barwienia immunohistochemicznego.
Skrawki nerki utrwalonej w formalinie poddano immunobarwieniu pod kątem miofibroblastów (aktyna mięśni gładkich), jako markera zwłóknienia. Zdjęcia robiono stosując wystandaryzowane warunki oświetlenia i ustawienia ekspozycji w aparacie cyfrowym z korektą na tło i skalibrowanych dla standardów odległości. Zdjęcia ciągłych pól, pokrywające skrawki całej nerki robiono dla każdego zwierzęcia dla oceny ilościowej.
PL 216 223 B1
Aktyna mięśni gładkich była wyrażana jako procent całkowitej powierzchni tkanki w obrębie mierzonych pól. To obejmowało całą tkankę korową i rdzeniową z wyjątkiem brodawki nerkowej.
Konkludując, myszy traktowane 6.3G9 i 6.8G6 wykazują znaczące zmniejszenie zwłóknienia.
P r z y k ł a d 14: Skuteczność blokujących mAb anty-α^ wobec indukowanego bleomycyną zwłóknienia płuc u myszy.
Indukowane bleomycyną zwłóknienie płuc u myszy uzyskano jako model in vivo dla zwłóknienia płuc i zastosowano do przetestowania efektów terapeutycznych środków farmakologicznych. Zapalenie jest zwykle widoczne 5-15 dni po traktowaniu bleomycyną. W szczepie myszy 129, stopień zwłóknienia płuc zwiększał się stopniowo do 60 dni po traktowaniu bleomycyną. Akumulacja substancji międzykomórkowej stawała się wykrywalna około 15 dnia. W tym przykładzie mAb 6.3G9 wstrzykiwano dootrzewnowo w stężeniu 4 mg/kg/dawkę myszom z indukowanym bleomycyną zwłóknieniem płuc rozpoczynając od dnia 0 lub dnia 15, trzy razy w tygodniu. Zwłóknienie płuc indukowano w dniu 0 przez podanie pojedynczej dooskrzelowej dawki bleomycyny w stężeniu 0,03 jednostek/kg w 50 μl jałowej soli fizjologicznej. Zwierzęta uśmiercano w dniu 30 i badano zakres zwłóknienia. Przeciwciało 1E6 użyto jako kontrolę negatywną.
Płuca pobierano od każdego zwierzęcia i mierzono zawartość hydroksyproliny jako wskaźnik odkładania się kolagenu w płucach, jak opisano w Munger i wsp., powyżej. Jak pokazano na Fig. 15A, traktowanie 6,3G9 rozpoczynające się w dniu 0 znacząco hamowało indukowany bleomycyną wzrost zawartości hydroksyproliny w płucach. Co ważne, traktowanie 6.3G9 było co najmniej tak samo skuteczne, kiedy rozpoczynało się 15 dni po podaniu bleomycyny, w czasie kiedy odkładanie kolagenu już się rozpoczęło.
Badaliśmy również efekty 6.3G9, zależnego od kationów 6.8G6 i nie blokującego przeciwciała 6.4B4 na hamowanie bardziej zaawansowanego stopnia zwłóknienia płuc w protokole rozległego indukowanego bleomycyną zwłóknienia płuc (trwającego 60 dni). Aby tego dokonać, rozpoczęliśmy traktowanie przeciwciałem 15 dni po podaniu bleomycyny (dzień 15). Płuca pobierano następnie w dniu 60 w celu ustalenia zawartości hydroksyproliny. Jak pokazano na Fig. 15C, traktowanie 6.8G6 znacząco hamowało indukowane bleomycyną zwłóknienie (ponad 70% zmniejszania zawartości hydroksyproliny w porównaniu ze zwierzętami traktowanymi bleomycyną i solą fizjologiczną). Traktowanie 6.3G9 pokazało również tendencję w kierunku ochrony, ale te wyniki nie były znaczące statystycznie (Fig. 15C).
Wniosek jest taki, że zarówno zależne od kationów, jak i niezależne od kationów blokujące mAb anty-αβ:' zmniejszały zwłóknienia płuc u myszy traktowanych bleomycyną. Ponadto, ta interwencja była skuteczna nawet wówczas, kiedy traktowanie przeciwciałem nie było rozpoczynane przed wystąpieniem zwłóknienia.
P r z y k ł a d 15: Zwiększanie się poziomu ανβ6 w ludzkich zmianach łuszczycowych
W celu ustalenia, czy ανβ6 ma udział w łuszczycy, badano ekspresję αβ6 w biopsjach skóry ze zmianami i bez zmian od pięciu pacjentów z łuszczycą i czterech osobników zdrowych. Stosując immunobarwienie z użyciem mAb 6.2A1 stwierdziliśmy znaczący wzrost ekspresji ανβ6 w zmianach łuszczycowych w porównaniu ze skórą bez zmian od pacjentów z łuszczycą i zdrowych kontroli. A zatem podniesienie poziomu ανβ6 w zmianach łuszczycowych sugeruje zarówno diagnostyczne, jak i terapeutyczne możliwości stosowania przeciwciał anty- ανβ6.
P r z y k ł a d 16. Zwiększenie poziomu ανβ6 w wątrobie mysiej i ludzkiej z chorobą przewodów żółciowych
Jak omówiono uprzednio, postuluje się udział ekspresji ανβ6 w uszkodzeniach tkanki. W tych doświadczeniach badano ekspresję αβ6 w wątrobie mysiej i ludzkiej uszkodzonej przez chorobę przewodów żółciowych.
Uszkodzenie wątroby u myszy indukowano przez podwiązanie przewodu żółciowego. Patrz, np. George i wsp.. PNAS 96:12719-24 (1999); George i wsp., Am J Pathol 156:115-24 (2000). Stosując mAb 6.2G2, stwierdziliśmy, że ekspresja αγβό była znacząco podniesiona w dniach 9, 14 i 16 po podwiązaniu przewodu żółciowego.
Podobnie, skrawki wątroby od pacjentów z chorobą przewodu żółciowego wykazywały zwiększoną ekspresję ανβ6, co ustalono przez immunohistochemię z użyciem mAb 6.2G2. Podniesioną ekspresję ανβ6 obserwowano na przykład w próbkach wątroby od 44-letniego mężczyzny z ostrą cholestazą, 59-letniego mężczyzny po przeszczepie z ostrą niedrożnością przewodu żółciowego, 22-letniego mężczyzny z atrezją dróg żółciowych i 24-letniego mężczyzny z przewlekłą niedrożnością przewodu żółciowego.
PL 216 223 B1
W sumie nowe przeciwciała anty-avp6 są przydatne jako narzędzia diagnostyczne i terapeutyczne dla chorób wątroby.
P r z y k ł a d 17. Zwiększenie poziomu avp6 w różnych ludzkich nowotworach
Integryna avp6 jest normalnie wyrażana na nieznacznych do niskich poziomach w zdrowych dorosłych tkankach. Rozmaite ludzkie tkanki nowotworowe oceniano pod kątem ekspresji avp6 przy użyciu przeciwciała 6.2A1 i metod ogólnie tu opisanych. Wyniki pokazały, że ekspresja integryny avp6 była znacząco zwiększona w kilku ludzkich nowotworach nabłonkowych. Co istotne, immunohistologia pokazała, że avp6 była wyrażana szczególnie silnie na brzegach wysepek nowotworowych w wielu nowotworach nabłonkowych. W celu dalszego zbadania ekspresji avp6 w nabłonkowych komórkach nowotworach, komórki Detroit 562 (rak gardła) i komórki SCC-14 (płaskokomórkowy rak języka) jak również komórki SW480p6 (powyżej) barwiono 6.3G9 i 6.4B4 i analizowano przez cytometrię przepływową.
Prawa strona Fig. 12 pokazuje ekspresję avp6 w różnych liniach komórek nowotworowych ukazaną przez wiązanie się 6.3G9 przy zastosowaniu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Zaciemniony pik reprezentuje wiązanie się 6.3G9, podczas gdy niezaciemniony pik reprezentuje tło wiązania samego mAb drugorzędowego. Wykres liniowy po lewej stronie Fig. 12 pokazuje hamowanie wiązania się linii komórek nowotworowych z ligandem LAP przez wzrastające stężenia 6.3G9 lub 6.4B4. 6.4B4 było znacząco mniej silnym inhibitorem wiązania się avp6 z LAP, w porównaniu z 6.3G9 ( >10-krotne IC50 dla Detroit 562, >30- krotne IC50 dla SW480B6 i >100-krotne IC50 dla SCC-14). Jest to zgodne z wcześniejszymi wynikami in vitro wskazującymi, że 6.3G9 jest silnym blokującym mAb, a 6.4B4 jest słabym blokującym mAb. Dane te są również zgodne z nieznaczną aktywnością inhibitorową 6.4B4 w modelu ksenoprzeszczepu Detroit (Fig. 14B). Fig. 13 pokazuje ponadto względne hamowanie wiązania się linii komórek nowotworowych z ligandem LAP przez mAb anty-avp6. Obydwa, 6.3G9 i 6.8G6, wykazują taką samą aktywność inhibitorową (zgodnie ze wszystkimi wcześniejszymi danymi), podczas gdy 6.4B4 były znacząco mniej silnym inhibitorem wiązania się avp6 z LAP.
P r z y k ł a d 18. Wpływ blokujących mAb anty-avp6 w ludzkim modelu ksenoprzeszczepu nowotworu
Zwierzęta z niedoborem odporności (np. myszy nagie i myszy SCID mice) po transplantacji ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworów otrzymano jako przydatny system modelowy in vivo w celu przetestowania efektów terapeutycznych czynników przeciwnowotworowych (patrz np. van Weerden i wsp., Prostate 43(4):263-71 (2000); Bankert i wsp., Front Biosci 7:c44-62 (2002)). A zatem blokujące przeciwciała monoklonalne anty-avp6 według niniejszego wynalazku można testować in vivo w modelu ksenoprzeszczepu nowotworu pod kątem ich zdolności do hamowania wzrostu guza nowotworowego. W tym doświadczeniu testowaliśmy zdolność niektórych spośród nowych przeciwciał wobec avp6 do hamowania wzrostu guza nowotworowego u bezgrasiczej samicy nagiej myszy po transplantacji ksenoprzeszczepu ludzkiego raka przełyka (linia komórkowa Detroit 562).
Aby tego dokonać komórki Detroit 562 (ATCC) pasażowano in vitro w pożywce minimalnej z niezbędnymi składnikami (Eagle) z 2 mM L-glutaminą i BSS Earle uzupełnionej tak, aby zawierała 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 0,1 mM nie niezbędnych i 1,0 mM pirogronianu sodu oraz 10% płodowej surowicy bydlęcej, bez antybiotyków. Około 5 x 106 komórek/0.2 ml pożywki (bez surowicy) wszczepiano podskórnie nagim myszom w prawy bok. Trzy do czterech dni później, rozpoczynano pomiar rozmiarów guza nowotworowego i kontynuowano aż guzy osiągnęły wielkość około 5 mm (długości) na 5 mm (szerokość). Myszy podzielono następnie losowo na grupy i wstrzyknięto im dootrzewnowo testowane przeciwciała albo roztwór kontrolny w dniu 1, a następnie wykonano trzy zastrzyki na tydzień przez okres 33 dni. Testowanymi przeciwciałami i roztworem kontrolnym były: (1) 6.3G9, 1 mg/kg, 10 myszy; (2) 6.3G9. 4 mg/kg, 10 myszy; (3) 6.3G9, 10 mg/kg, 10 myszy; (4) 6.4B4, I mg/kg, 10 myszy; (5) 6.4B4, 4 mg/kg, 10 myszy; (6) 6.4B4, 10 mg/kg, 10 myszy i (7) kontrola-nośnik (PBS), 0,2 ml/na mysz, 30 myszy. Dodatkowo, 10 myszom wstrzyknięto podskórnie cis-platynę w ilości 2 mg/kg jako kontrolę chemoterapeutyczną. Zastrzyki cis-platyny wykonywano w dniu 1, a następnie co 2 dni, w sumie 6 razy. Na koniec 33dniowego okresu, zwierzęta mierzono wagę zwierząt i rozmiar guzów nowotworowych, badano ekspresję ανβ6 przez immunohistologię i mierzono poziomy anty-avp6 w surowicy.
Barwienie immunohistologiczne pokazało, że wszczepione komórki nowotworowe silnie wyrażały avp6 in vivo. Dane dla wagi guzów nowotworowych pokazały ponadto, że blokujące mAb 6.3G9 skutecznie hamowały wzrost guza nowotworowego we wszystkich trzech testowanych stężeniach
PL 216 223 B1 (Fig. 14A). W przeciwieństwie do tego, słabo blokujące mAb 6.4B4 nie hamowały wzrostu guza nowotworowego (Fig. 14B).
Podsumowując, przeciwciała blokujące hamowały wzrost guza nowotworowego o około 40-50% u traktowanych myszy. W przeciwieństwie do tego słabo blokujące przeciwciało anty-ave6 nie hamowało wzrostu guza nowotworowego.
P r z y k ł a d 19 Internalizacja przeciwciała wobec ανβ6
Przeciwciała, które są internalizowane przez komórki oferują korzyść dla pewnych wskazań klinicznych, takich jak rak, ponieważ przeciwciała można następnie połączyć z toksynami, związkami radioaktywnymi lub innymi czynnikami przeciwnowotworowymi w celu wybiórczego nakierowania na cel i hamowania wzrostu komórek nowotworowych. Zdolność przeciwciał anty-ave6 do podlegania internalizacji badano w komórkach SW480p6 (powyżej) i SCC-14.
Komórki rozdzielano 1:5 wysiewano na 4-komorowe szkiełka szklane do inkubacji przez noc w 37°C, 5% CO2. Następnego dnia mAbs 6.806. 6.1A8, 6.3G9. 7.1C5, 6.4B4, 10D5 i 8B3 rozcieńczano do stężenia końcowego 20 μg/ml. mAbs lub samą pożywkę dodawano do odpowiednich studzienek. Przebieg czasowy internalizacji wynosił od 0 godz. do 48 godz. Zastosowane punkty czasowe to 0, 5, 10 i 30 min. oraz 1, 4, 24 i 48 godz. Drugorzędowe przeciwciało (anty-mysie-Alexa 594) dodawano jako kontrolę negatywną. Internalizację zatrzymywano w każdym punkcie czasowym przez usunięcie przeciwciała i przepłukanie warstwy komórek buforem. Aglutyninę z zarodków pszenicy Wheat Germ Agglutinin-Alexa-488 dodawano na 20 min. w 18°C w celu wybarwienia zewnętrznych brzegów komórek przez zieloną fluorescencję. Po przemyciu komórek, dodano roztwór Cytofix/Cytoperm na 20 min. w 18°C w celu utrwalenia i permeabilizacji komórek. Komórki ponownie przemywano i dodano drugorzędowych przeciwciał anty-mysie-Alexa 594 (czerwona fluorescencja) na 20 min. w 18°C w celu wyznakowania związanego albo internalizowanego mysiego przeciwciała wobec ανβ6. Komórki następnie przemywano i utrwalano przez dodanie 2% paraformaldehydu i badano przy zastosowaniu mikroskopii konfokalnej. Następnie zrobiono zdjęcia przy użyciu obiektywu Leitz Plan-Apochromatic 63x (1,32 cyfrowa apertura, olejek immersyjny) (Leica) z cyfrową zmiennoogniskową 2x. Każda ramka reprezentuje jeden przekrój optyczny ze środkowego przekroju komórek obserwowanych pod kątem internalizacji we wszystkich warunkach. Nie obserwowano barwienia w jądrze.
Internalizację obserwowano dla zależnych od kationów mAbs (mimetyki ligandów zawierających RGD), takich jak 6.8G6 i 6.1A8. Żadnej internalizacji nie obserwowano dla mAb niezależnych od kationów, takich jak 6.3G9, 7.1C5 i 6.4B4.
PL 216 223 B1
Lista sekwencji <110> BIOGEN, INC.
THE REGENTS OF THE UNIYERSITY OF CALIFORNIA <120> przeciwciała wobec ανββ <130> A136PCT <140> PCT/US03/08048.
<14ł> 2003-03-13 <150> 60/364,991 <151> 2002-03-13 <150> 60/426,286 <151> 2002-11-13 <160> 64 <170> patentln wer. 2.1 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ala Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Ser Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met His 1 5 io <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3
Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Val Met Ser 1 5 io <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 216 223 B1 <400» 4
Val Ile Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210» 5 <211» 16 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 5
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly 15 10 15 <210» 6 <211> 16 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 6
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Arg Met Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly 15 10 15 <210» 7 <211» 17 <212> PRT <213» Homo sapiens <220>
<221» MOD__RES <222» (12>
<223» Arg or Gin <400» 7
Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Xaa Tyr Ala Ket Asp 15 10 15
Tyr <210» 8 <211» 12 <212» PRT <213> Homo sapiens <400» 8
Gly Ala Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Ala Tyr 15 10 <210» 9 <211» 12
PL 216 223 B1 <212> PRT <213» Homo sapiens <400» 9
Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Tyr Val Phe Pro Tyr 15 10 <210» 10 <211» 15 <212» PRT <213» Homo sapiens <400> 10
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met Tyr 15 10 15 <210» 11 <211» 12 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 11
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 1 5 io <210» 12 <211» 12 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 12
Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr 15 10 <210» 13 <211> 7 <212» PRT <213» Homo sapiens <400> 13
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210» 14 <211» 7 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 14
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
PL 216 223 B1 <210» 15 <211> 9 <212» PRT <213> Homo sapiens <400» 15
Gin His Asn Trp Glu Ile Pro Phe Thr 1 5 <210» 16 <211» 9 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 16
Gin His Ser Trp Glu Ile Pro Tyr Thr 1 5 <210» 17 <211» 9 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 17
His Gin Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210» 13 <211» 9 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 18
His Gin Trp Ser Thr Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210» 19 <211» 126 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 19
Gin 1 Val Gin Phe Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu Wal Arg Pro Gly 15 Val
Ser Wal Lys Leu 20 Ser Cys Lys Gly Ser 25 Ser Tyr Thr Phe Thr Asp 30 Tyr
Thr Met His 35 Trp Wal Lys Leu Ser 40 His Ala Lys Thr Leu 45 Glu. Trp Ile
Gly Val 50 Ile Asp Thr Tyr Tyr 55 Gly Lys Thr Asn Tyr 60 Asn Gin Lys Phe
PL 216 223 B1
Glu Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Asp Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 35 90 95
Ala Arg Gly Gły Phe Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala 100 105 HO
Ket Asp Ser Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser U5 120 125 <210> 20 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu Val Arg Pro Gly 15 Vał
Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Gly Ser 25 Ser Tyr Thr Phe Thr 30 Asp Tyr
Ala Met His 35 Trp Val Lys Leu Ser 40 His Ala Lys Ser Leu 45 Glu Trp Ile
Gly val 50 Ile Ser Thr Tyr Tyr 55 Gly Asn Thr Asn Tyr 60 Asn Gin Lys Ph®
Lys 65 Gly Lys Ala Thr Met 70 Thr Val Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80
Met Glu Leu Ala Arg 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Gly Gly 100 Leu Arg Arg Gly Asp 105 Arg Pro Ser Leu Arg 110 Tyr Ala
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 120 Ser Val Thr val Ser 125 Ser
<210> 21 <211> 126 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 21
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu Val Arg Pro Gly 15 Val
Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Gly Ser 25 Ser Tyr Thr Phe Thr 30 Asp Tyr
Ala Met His 35 Trp Val Lys Leu Ser 40 His Ala Lys Ser Leu 45 Glu Trp Ile
PL 216 223 B1
Gly Val Ile 50 Ser Thr Tyr Tyr Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe
55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Vał Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ala Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Leu Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Gin Tyr Ala
100 105 110
Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210 22
<211> 119
<212» PRT
<213> Homo i sapiens
<400» 22
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Phe Met Asa Trp Val Met Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Pro Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Met Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val His
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Tyr Gly Thr Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gły Gin Gly
100 105 HO
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210» 23
<211» 120
<212» PRT
<213» Homo sapiens
<400 23
Glu Val Lys Leu Va| Glu Ser > Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
10 15
PL 216 223 B1
Ser Leu Lys Leu 20 Cys Ala Ala Ser 25 Giy Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Val Met Ser 35 Trp Wal Arg Gin Thr 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Wal
Ala Ser 50 Ile Ser Ser Gly Gly 55 Ser Thr Tyr Tyr Pro 60 Asp Ser Val Lys
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Ser Ala Arg 75 Asn Ile Leu Tyr Leu 80
Gin Met Ser Ser Leu 85 Arg ser Glu Asp Thr 90 Ala Met Tyr Tyr Cys 95 Ala
Arg Gly Ala Ile 100 Tyr Asp Gly Tyr Tyr 105 Wal Phe Ala Tyr Trp 110 Gly Gin
Gly Thr Leu 115 Wal Thr Wał Ser Ala 120
<210> 24 <2łl> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 24
Glu 1 Wal Met Leu Val 5 Glu Ser Gly Gly Gly 10 Leu Wal Lys Pro Gly Gly 15
Ser Leu Lys Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Thr Phe Ser 30 Arg Tyr
Wal Met Ser 35 Trp Val Arg Gin Thr 40 Pro Glu Lys Arg Leu 45 Glu Trp Vał
Ala Ser 50 Ile Ser Ser Gly Giy 55 Arg Met Tyr Tyr Pro 60 Asp Thr Wal Lys
Gly 65 Arg Phe Thr Ile Ser 70 Arg Asp Ser Ala Arg 75 Asn Ile Leu Tyr Leu 80
Gin Met Ser Ser Leu 85 Arg Ser Glu Asp Thr 90 Ala Met Tyr Tyr Cys 95 Ala
Arg Gly Ser Ile 100 Tyr Asp Gly Tyr Tyr 105 Wal Phe Pro Tyr Trp 110 Gly Gin
Gly Thr Leu Wał Thr Wal Ser Ala 115 no <210> 25 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 216 223 B1 <400> 25
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Pro Gly Ala Glu 10 Leu Val Arg Pro Gly 15 Thr
Ser Val Lys Łeu 20 Ser Cys Lys Ala Ser 2 5 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Ser Tyr
Trp Met Asn 35 Trp Val Lys Gin Arg 40 Pro Gly Głn Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Met 50 Ile His Pro ser Ile 55 Ser Glu Thr Arg Leu 60 Asn Pro Lys Phe
Łys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Val Asp Thr Ser 75 Ser Ser Thr Val Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Pro Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Tyr Leu 100 Gly Tyr Tyr Thr Tyr 105 Tyr Gly Ser Asp Cys 110 Trp Gly
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120 <210> 26 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Gin ' 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Pro Gly Ala Glu 10 Leu Val Gly Pro Gly 15 Thr
Ser Val Lys Leu 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Ser Tyr
Trp Met Asn 35 Trp Val Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Głu Trp Ile
Gly Met Ile 50 His Pro Ser Ile 55 Ser Glu Thr Arg Leu 60 Asn Pro Lys Phe
Lyś Asp Lys 65 Ala Thr Leu 70 Thr Val Asp Thr Ser 75 Ser Ser Thr Val Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Pro Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Tyr 95 Cys
Ala Arg Tyr Leu 100 Gly Tyr Tyr Thr Tyr 105 Tyr Gly Leu Asp Tyr 110 Trp Gly
Gin Gly Thr 115 Ser Val Thr Val Ser 120 Ser
PL 216 223 B1 <210» 27 <211» 119 <212» PRT <213> Homo sapiens <400» 27
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Ala Val 10 Leu Met Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Ala Thr 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Asn Tyr
Trp Ile Asp 35 Trp Ile Lys Gin Arg 40 Pro Gly His Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Glu 50 Asn Leu Pro Gly Thr 55 Arg Asn Asn Tyr Asn 60 Glu Asn Phe Lys
Gly 65 Lys Ala Thr Phe Thr 70 Ala Asp Pro· Ser Ser 75 Asn Thr Ala Tyr Ile 80
Gin Łeu Asn Ser Leu 85 Thr Ser Asp Asp Ser 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala
Arg Glu Ala Leu 100 Gly Gly Asp Tyr Gly 105 Leu Asp Tyr Trp Gly 110 Gin Gly
Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 <210» 28 <211» 119 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 28
Gin 1 Vał Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Ala Val 10 Leu Met Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Lys Ile 20 Ser Cys Lys Ala Thr 25 Gly Tyr Ser Phe Thr 30 Asn Tyr
Trp Ile Asp 35 Trp Ile Lys Gin Arg 40 Pro Gly His Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Glu 50 Asn Leu Pro Gly Thr 55 Arg Asn Asn Tyr Asn 60 Glu Asn Phe Lys
Gly 65 Lys Ala Thr Phe Thr 70 Ala Asp Pro Ser Ser 75 Asn Thr Ala Tyr Ile 80
Gin Leu Asn Ser Leu 85 Thr Ser Asp Asp Ser 90 Ala Val Tyr Tyr Cys 95 Ala
Arg Glu Ala Leu Gly Gly Asp Tyr Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly
100 105 110
PL 216 223 B1
Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Val Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ket Asp Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gły Glu Asn Leu Pro Gly Thr Arg Asn Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
50 55 60
Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Pro Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Ile
65 70 75 80
Gin Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val *Pyx· Tyr Cys Ala
85 30 95
Arg Glu Ala Leu Gly Gly Asp Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp dy Gin Gly
100 105 110
Thr Ser Leu Thr Val Ser Ser
115 <210> 30 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu 10 Leu Val Lys Pro Gly Ala 15
Ser Val Arg Ile 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Ile Phe Thr 30 Ser Tyr
Tyr Ile His 35 Trp Val Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Trp Ile 50 Tyr Pro Gly Asn 55 Val Asn Thr Lys Tyr 60 Asn Glu Lys Phe
Lys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Ala Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val SJlyj. Phe 95 Cys
PL 216 223 B1
Ala Arg His Wal Leu Ser Gly Asn 100
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 110 <210> 31 <211» 118 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 31
Gla Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly
1 5
Ser Wal Arg Ile 20 Ser Cys Lys Ala
Tyr Ile His 35 Trp Vał Lys Gin Arg 40
Gly Trp 50 Ile Tyr Pro Gly Asn 55 Wal
Lys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Ala
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser
Ala Arg His Wal 100 Leu Ser Gly Asn
Thr Leu Thr Wal Ser Ser
XX 5
Pro Glu 10 Leu Wal Lys Pro Gly Ala 15
Ser 25 Gly Tyr Ile Phe Thr 30 Ser Tyr
Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 75 80
Glu Asp Ser Ala Wal Tyr Phe Cys 90 95
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 HO <210» 32 <211» 118 <212» PRT <213> Homo sapiens <400» 32
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Arg
Ser Wal Arg Ile 20 Ser Cys Lys Ala
Tyr Leu His 35 Trp Wal Lys Gin Arg 40
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly
55
Pro Glu Leu Val Łys Pro Gly Ala 10 15
Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 25 30
Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 45
Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 60
PL 216 223 B1
Lys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Ser Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Phe 95 Cys
Ala Arg His Val 100 Leu Ser Gly Asn Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 <210> 33 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <40 0> 33
Gin Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Arg Pro Glu 10 Leu Val Lys Pro Gly 15 Ala
Ser Val Arg Ile 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr tle Phe Thr 30 Ser Tyr
Tyr Leu His 35 Trp Val Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Qiy Leu 45 Glu Trp He
Gly Trp 50 Ile Tyr Pro Gly Asn 55 Gly Asn Thr Lys Tyr 60 Ser Glu Lys Phe
Lys 65 Asp Lys Ala Thr Leu 70 Thr Ser Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Alei Val Tyr Phe 95 Cys
Ala Arg His Val 100 Leu Ser Gly Asn Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin HO Gly Thr
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 118 <212 > PRT <213> Homo sapiens <400> 34
Gin 1 Leu Gin Val Gin 5 Leu Gin Gin Ser Gly 10 Pro Glu Leu Val Lys Pro 15
Gly Ala Ser Leu 20 Arg Ile Ser Cys Lys 25 Ala Ser Gly Tyr Thr 30 Phe Lys
Ser Tyr Tyr 35 Ile His Trp Val Arg 40 Gin Arg Pro Gly Gin 45 Gly Leu Glu
PL 216 223 B1
Trp Ile 50 aiy Trp Ile Tyr Pro 55 Gly Asn Leu Asn Thr 60 Lys Tyr Asn Glu
Lys 65 Phe Lys Gly Lys Ala 70 Thr Leu Thr Ala Asp 75 Lys Ser Ser Ser Thr 80
Val Tyr Met Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Phe 95 Cys
Ala Arg His Glu 100 Leu Asn Gly Asn Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210» 35 «211» 118 «212» PRT <213» Homo sapiens «400» 35
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly Pro Glu, 10 Leu Val Lys Pro Gly Ala 15
Ser Leu Arg Ile 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Tyr Thr Glu Lys 30 Ser Tyr
Tyr Ile His 35 Trp Val Arg Gin Arg 40 Pro eiy Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Trp 50 Ile Tyr Pro Gly Asn 55 Pro Asn Thr Lys Tyr 60 Asn Glu Lys Phe
Lys 65 Gly Lys Ala Thr Leu 70 Thr Ala Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Val Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Val Tyr Phe 95 Cys
Ala Arg His Glu 100 Leu Asn Gly Asn Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Giń 110 Gly Thr
Thr Leu Thr 115 Vał Ser Ser
<210» 36 <211» 118 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 36
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 io 15
PL 216 223 B1
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His 35 Trp Val Lys Gin Arg 40 Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Gly Trp 50 Leu Tyr Pro Gly Lys 55 Ile Asn Thr Arg Tyr 60 Asn Glu Lys Phe
Lys 65 Gly Lys Ala Thr Leu 70 Ile Ala Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser Glu Asp 90 Ser Ala Wal Tyr Phe 95 Cys
Ala Arg His Wal 100 Leu Asn Giy Asn Phe 105 Asp Tyr Trp Gly Gin 110 Gly Thr
Thr Leu Thr Wal Ser Ser
115 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 37 Asp Ile Wal Leu 1 Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Wal Ser Leu Gly
5 10 15
Gin Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Wal Ser Ile Ser
20 25 30
Thr Tyr Ser Tyr Ile His Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Wal Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gły Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Wal Glu Glu Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Giń Mis Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Wal Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400 38
Asp Ile Wal Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Wal Ser Leu Gly
1 5 10 15
PL 216 223 B1
Gin Arg Ala Ile 20 Ile Ser Cys Arg Ala 25 Ser Gin Ser Val Ser 30 Thr Ser
Ser Tyr Ser 35 Tyr Met Tyr Trp Tyr 40 Gin Gin Lys Pro Gly 45 Gin Ser Pro
Lys Phe 50 Leu Ile Lys Ala 55 Ser Asn Leu Glu Ser 60 Gly Val Pro Ala
Arg 65 Phe Ser Gly Ser Gły 70 Ser Gly Thr Asp Phe 75 Thr Leu Asn Ile His 80
Pro Val Glu Glu Glu 85 Asp Thr Ala Thr Tyr 90 Tyr Cys Gin His Asn 95 Trp
Glu Ile Pro Phe 100 Thr Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Leu Glu Ile 110 Lys
<210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Arg Ser Leu Pro Val Ser Leu Gły 15 10 15
Asp Gin Ala Ser Męt Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Lys His Ser 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Asn 50 Leu Leu Ile Tyr Lys 55 Vał Ser Asn Arg Phe 60 Ser Gly Val Pro
Asp 65 Arg Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Gly Thr Glu 75 Phe Thr Phe Lys Ile 80
Ser Arg Val Glu Ala 85 Glu Asp Leu Gly Val 90 Tyr Phe Cys Ser Gin 95 Ser
Thr His Val Pro 100 Tyr Thr Phe Gly Gly 105 Gly Thr Arg Leu Glu 110 Ile Lys
<210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 216 223 B1
<400» 40
Asp 1 Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 15 Gly
5 10
Glu Arg Val Asn Leu Thr Cys 20 Arg Ala Ser Gin 25 Glu Ile Ser Gly 30 Tyr
Leu Ser Trp 35 Leu Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr 40 Ile Lys Arg Leu 45 11 cj
Tyr Ala Ala 50 Ser Thr Leu Asp 55 Ser Gly Wal Pro Lys Arg Phe Ser 60 Gly
Ser 65 Arg Ser Gly Ser Asp Tyr 70 Ser Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Glu Ser 80
Glu Thr Asp Phe Gly Asp Tyr Tyr 85 Phe Gly Gly Gly Ala Lys Cys Leu Gin Tyr 90 Leu Glu Ile Lys Ala Ser Tyr Pro 95 Tyr
100 105 <210» 41 <211» 107 <212» PRT <213> Homo sapiens
<400» 41
Asp 1 Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 15 Gly
5 10
Glu Arg Wal Ser Leu Thr Cys 20 Arg Ala Ser Gin Glu 25 Ile Ser 30 Gly Tyr
Leu Ser Trp 35 Leu Gin Gin Lys Pro Asp Gly Ser Ile 40 Lys 45 Arg Leu Ile
Tyr Ala Ala 50 Ser Thr Leu Asp 55 Ser Gly Val Pro Lys 60 Arg Phe Ser Gly
Ser 65 Arg Ser Gly Ala Asp Tyr 70 Ser Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Glu Ser 80
Glu Thr Asp Phe Phe Gly Ala Asp Tyr Tyr 85 Gly Gly Thr Lys Cys Leu Gin Tyr Ala 90 Leu Glu Ile Lys Thr Tyr Pro 95 Tyr
100 105 <210» 42 <211» 106 <212» PRT <213» Homo sapiens
PL 216 223 B1
<400> 42
Gin 1 Ile Val Leu Thr Gin Ser pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
5 10
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Głn Lys Ser Gly Thr Ser Pro Arg Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Val
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Ser Asn Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys
100 105 <210> 43 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400 43
Gin 1 Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
5 10
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Ph© Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser His Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 <210 44 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 216 223 B1
<400» 44 Gin Ile Val 1 Leu Thr 5 Gin Ser Pro Ala Ile 10 Met Ser Ala Ser Pro 15 Gly
Glu Lys Val Thr 20 Leu Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Ser Val Ser 30 Ser Ser
Tyr Łeu Tyr 35 Trp Tyr Gin Gin Lys 40 Pro Gly Ser Ser Pro 45 Lys Leu Trp
Ile Tyr 50 Ser Thr Ser Asn Leu 55 Ala Ser Arg Val Pro 60 Ala Arg Phe Ser
Gly 65 Ser Gly Ser Gly Thr 70 Ser Tyr Ser Leu Thr 75 ile Ser Ser Met Glu 80
Ala Glu Asp Ala Ala 85 Ser Tyr Phe Cys His 90 Gin Trp Ser Ser Tyr 95 Pro
Pro Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu 105 Glu Ile Lys
<210» 45 <2łl> 108 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 45
Gin Ile Val Leu Thr Głn Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Łeu Thr Cys Ser Ala Asn Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 . 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gin Trp Ser Thr Tyr Pro
85 90 95
Prb Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210» 46 <211» 17 <212» PRT <213» Homo sapiens
PL 216 223 B1 <400» 46
Val Ile Asp Thr Tyr Tyr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Glu 1 5 10 15
Gly <210» 47 <211» 17 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 47
Gly Gly phe Arg Arg Gly Asp Arg Pro Ser Leu Arg Tyr Ala Mat Asp 15 10 is
Ser <210» 48 <211» 15 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 48
Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ile Ser Thr Tyr Ser Tyr Ile His 15 10 15 <210» 43 <211» 10 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 49
Gly Tyr Asp Phe Asn Asn Asp Leu Ile Glu 1 5 io <210» 50 <211» 10 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 50
Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu 1 5 io <210» 51 <211» 17 <212» PRT <213» Homo sapiens
PL 216 223 B1 <400» 51
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gły Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 5 iq
Gly <210» 52 <211» 17 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 52
Val Ile Ser Pro Gly Ser Gly He Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 5 10 15
Gly <210» 53 <211» 12 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 53
He Tyr Tyr Gly Pro His Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210» 54 <211» 11 <212» PRT <213> Homo sapiens <400» 54
Ile Asp Tyr Ser Gly Pro Tyr Ala Val Asp Asp 1 5 10 <210» 55 <211» H <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 55
Lys Ala Ser Leu Asp Val Arg Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210» 56 <211> 11 <212» prt <213» Homo sapiens
PL 216 223 B1 <400» 56
Lys Ala Ser Gin Ala Val Asn Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210» 57 <211> 7 <212» PRT <213> Homo sapiens <400> 57
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213» Homo sapiens <400» 58
Ser Ala Ser Tyr Gin Tyr Thr 1 5 <210» 59 <211» 9 <212» PRT <213» Komo sapiens <400» 59
Gin Gin His Tyr Gly Ile Pro Trp Thr 1 5 <210» 60 <211» 9 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 60
Gin His His Tyr Gly Val Pro Trp Thr 1 5 <210» 61 <211» 120 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 61
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Thr 1 5 io 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
25 30
PL 216 223 B1
Leu Ile Glu 35 Trp Val Lys Gin Arg 40
Gly Val 50 Ile Ser Pro Gly Ser 55 Gly
Lys 6 5 Gły Lys Ala Thr Leu 70 Thr Ala
Met G1 u Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser
Ala Ala Ile Asp 100 Tyr Ser Gly Pro
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
Pro Gły Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Ile Ile Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe
Asp Lys Ser 75 Ser Ser Thr Ala Tyr 80
Asp Asp 90 Ser Ala Val Tyr Phe 95 Cys
Tyx 105 Ala Val Asp Asp Trp 110 Gly Gin
<210> 62 <211> 121 <212» PRT <213> Homo sapiens
<400> 62
Gin 1 Val Gin Leu Gin 5 Gin Ser Gly
Ser Val Lys Val Ser 20 Cys Lys Ala
Leu Ile Glu Trp Val 35 Lys Gin Arg 40
Ala Val 50 Ile Asn Pro Gly Ser Gly 55
Lys 65 Gły Lys Ala Thr Leu Thr Ala 70
Met Gin Leu Ser Ser 85 Leu Thr Ser
Ala Met He Tyr Tyr 100 Gly Pro His
Gin Gly Thr Ser Val 115 <210» 63 <211» 107 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 63 Thr Val Ser 120
Asp Ile Val Met Thr Gin Ser His
5
Ala Glu 10 Leu .Val Arg Pro Gly 15 Thr
Ser 25 Gly Asp Phe Asn 30 Asn Asp
Pro Gly Gin Gly Leu 45 Glu Trp Ile
Arg Thr Asn Tyr 60 Asn Glu Lys Phe
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
eo
Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 90 95
Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 105 no
Ser
Lys Phe Met Ser Thr Val Val Gly 10 Ig
PL 216 223 B1
.Asp Arg Val Ser 20 Ile Thr Cys Lys Ala 25 Ser Leu Asp Wal Arg 30 Thr Ala
wal Al a TEp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin Ser Pro Lys 45 Leu Leu Ile
Tyr Ser 50 Ala Ser Tyr Arg Tyr 55 Thr Gly Val Pro Asp Arg 60 Phe Thr Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Phe Asn Ile 75 Arg Ser Wal Gin Ala 80
Glu Asp Leu Ala Val 85 Tyr Tyr Cys Gin Gin 90 His Tyr Gly Ile Pro 95 Trp
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Łys Leu Glu Ile Lys
100 105 <210» 64 <211» 107 <212» PRT <213» Homo sapiens <400» 64
Asp 1 Ile Wal Met Thr 5 Gin Ser His Lys Phe 10 Met Ser Thr Ser Wal 15 Gly
Asp Arg Wal Ser 20 Val Thr Cys Lys Ala 25 Ser Gin Ala Wal Asn 30 Thr Ala
Wal Ala Trp 35 Tyr Gin Gin Lys Pro 40 Gly Gin Ser Pro Lys 45 Leu Leu Ile
Tyr Ser 50 Ala Ser Gly Tyr 55 Thr Gly Wal Pro Asp 60 Arg Phe Thr Gly
Ser 65 Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Wal Gin Ala 80
Gltt Asp Leu Ala Wal 85 Tyr Tyr Cys Gin His 90 His Tyr Gly Wal Pro 95 Trp
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105

Claims (81)

1. Przeciwciało monoklonalne blokujące ανβ6 lub jego fragment wiążący antygen, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen (a) wiąże się swoiście z α.,β6, ale nie z innymi integrynami α, lub integrynami niespecyficznymi; (b) hamuje wiązanie α.,β6 z peptydem związanym z Iatencją (LAP) z wartością IC50 niższą niż 10D5; oraz (c) wiąże się z ανβ6 albo w sposób niezależny od dwuwartościowego kationu albo w sposób zależny od dwuwartościowego kationu, przy czym kiedy wiązanie rozpuszczalnej ανβ6 następuje w sposób zależny od dwuwartościowego kationu nie występuje różnica w przypadku zastosowania Ca2+/Mg2+ i Mn2+.
2. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 6.1A8 (numer dostępu ATCC PTA-3647).
3. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 6.3G9 (numer dostępu ATCC PTA-3649).
4. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 6.8G6 (numer dostępu ATCC PTA-3645).
5. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 6.2B1 (numer dostępu ATCC PTA-3646).
6. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 7.1G10 (numer dostępu ATCC PTA-3898).
7. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 7.7G5 (numer dostępu ATCC PTA-3899).
8. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera te same sekwencje polipeptydowe łańcucha ciężkiego i lekkiego co przeciwciało wytwarzane przez hybrydoma 7.1C5 (numer dostępu ATCC PTA-3900).
9. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że wiązanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen z α,β6 jest zależne od kationów dwuwartościowych.
10. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego wybraną spośród dowolnej z SEK NR ID: 19-24.
11. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 19 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 37.
12. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 20 albo 21 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 38.
13. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 22 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 43.
14. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 23 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 44.
15. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 24 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 45.
16. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 34 albo 35 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 40.
PL 216 223 B1
17. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera sekwencję domeny zmiennej łańcucha ciężkiego z SEK NR ID: 36 i sekwencję domeny zmiennej łańcucha lekkiego z SEK NR ID: 41.
18. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego i CDR 1, 2 i 3 łańcucha lekkiego, przy czym CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego zawierają sekwencje aminokwasowe przedstawione w SEK NR ID: 3, 6 i 9, odpowiednio, a CDR łańcucha lekkiego zawierają sekwencje aminokwasowe przedstawione SEK NR ID: 12, 14 i 18, odpowiednio.
19. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen wiąże rozpuszczalną ιαβ6, ale nie wiąże podjednostki β6.
20. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zapobiega aktywacji TGF-β.
21. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 9, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego i CDR 1, 2 i 3 łańcucha lekkiego, przy czym przeciwciało współzawodniczy z 6.8G6 (nr dostępu ATCC ΡΤΑ-3645) ο wiązanie ιαβ6, oraz zawiera motyw FXY w CDR3 łańcucha ciężkiego.
22. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zawiera mutację w reszcie aminokwasowej stanowiącej miejsce glikozylacji, tak że miejsce glikozylacji jest wyeliminowane.
23. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 6.1A8 (numer dostępu ATCC PTA-3647).
24. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 6.3G9 (numer dostępu ATCC PTA-3649).
25. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 6.8G6 (numer dostępu ATCC PTA-3645).
26. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 6.2B1 (numer dostępu ATCC PTA-3646).
27. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 7.1G10 (numer dostępu ATCC PTA-3898).
28. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 7.7G5 (numer dostępu ATCC PTA-3899).
29. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest wytwarzane przez hybrydoma 7.1C5 (numer dostępu ATCC PTA-3900).
30. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, związkiem radioaktywnym lub czynnikiem przeciwnowotworowym.
31. Przeciwciało Iub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z glikolem polietylenowym.
32. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z ugrupowaniem fluorescencyjnym.
33. Przeciwciało które wiąże się z ιαβ6 lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen obejmuje:
(a) CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego, przy czym CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 1 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 1 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 4 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 4 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 7
PL 216 223 B1
Iub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 7 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej; oraz (b) CDR 1, 2 i 3 łańcucha lekkiego, przy czym CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 10 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 10 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 13 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 13 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 15 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 15 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej.
34. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 33, znamienne tym, że
CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 1, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 4, a
CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 7.
35. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 33, znamienne tym, że
CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 10,
CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 13, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 15.
36. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 33, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, związkiem radioaktywnym lub czynnikiem przeciwnowotworowym.
37. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 33, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z glikolem polietylenowym.
38. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 33, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z ugrupowaniem fluorescencyjnym.
39. Przeciwciało które wiąże się z ανβ6 lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen obejmuje:
(a) CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego, przy czym CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 3 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 3 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 5 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 5 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 8 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 8 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej; oraz (b) CDR 1, 2 i 3 łańcucha lekkiego, przy czym CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 11 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 11 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 17 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 17 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej.
40. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 39, znamienne tym, że CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 3, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 5, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 8.
41. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 39, znamienne tym, że CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 11, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 17.
42. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 39, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, związkiem radioaktywnym lub czynnikiem przeciwnowotworowym.
43. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 39, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z glikolem polietylenowym.
44. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 39, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z ugrupowaniem fluorescencyjnym.
PL 216 223 B1
45. Przeciwciało, które wiąże się z ανβ6, lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen obejmuje:
(a) CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego, przy czym CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 3 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 3 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 6 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 6 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 9 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 9 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej; oraz (b) CDR 1, 2 i 3 łańcucha lekkiego, przy czym CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 12 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 12 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 18 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 18 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej.
46. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienne tym, że CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 3, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 6, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 9.
47. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienne tym, że CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 12, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 14, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 18.
48. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, związkiem radioaktywnym lub czynnikiem przeciwnowotworowym.
49. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z glikolem polietylenowym.
50. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 45, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z ugrupowaniem fluorescencyjnym.
51. Przeciwciało które wiąże się z ανβ6 lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen obejmuje:
(a) CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego, przy czym CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 2 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 2 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 46 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 46 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 47 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 47 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej; oraz (b) CDR 1, 2 i 3 łańcucha lekkiego, przy czym CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 48 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 48 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 13 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 13 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 16 lub sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 16 z podstawieniem w jednej pozycji aminokwasowej.
52. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 51, znamienne tym, że CDR 1 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 2, CDR 2 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 46, a CDR 3 łańcucha ciężkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 47.
53. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 51, znamienne tym, że CDR 1 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 48, CDR 2 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 13, a CDR 3 łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w SEK NR ID: 16.
PL 216 223 B1
54. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 51, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z czynnikiem cytotoksycznym, związkiem radioaktywnym lub czynnikiem przeciwnowotworowym.
55. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 51, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z glikolem polietylenowym.
56. Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 51, znamienne tym, że przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest skoniugowane z ugrupowaniem fluorescencyjnym.
57. Izolowane przeciwciało, które wiąże ανβ6, lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen obejmuje sekwencje z SEK NR ID: 3, 6 i 9, odpowiednio.
58. Izolowane przeciwciało, które wiąże ανβ6, lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen obejmuje sekwencje z SEK NR ID: 1, 4 i 7, odpowiednio.
59. Izolowane przeciwciało, które wiąże ανβ6, lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że CDR 1, 2 i 3 łańcucha ciężkiego przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen obejmuje sekwencje z SEK NR ID: 2, 46 i 47, odpowiednio.
60. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że obejmuje CDR 1, 2 i 3 domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przedstawione w SEK NR ID: 21.
61. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że współzawodniczy z 6.8G6 (nr dostępu ATCC PTA-3645) o wiązanie z ανβ6 i zawiera motyw FXY w CDR3 łańcucha ciężkiego.
62. Izolowane przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen według zastrz. 1, znamienne tym, że wiąże ten sam epitop ανβ6 co przeciwciało wytworzone przez hybrydoma zdeponow ane w ATCC pod numerem dostępu PTA-3645.
63. Kompozycja do zapobiegania albo leczenia choroby przebiegającej za pośrednictwem ανβ6 u ssaka, znamienna tym, że zawiera przeciwciało lub jego fragment wiążący ant ygen określone w dowolnym z zastrz. od 1 do 62 i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
64. Kompozycja według zastrz. 63, znamienna tym, że przeciwciało jest koniugowane z czynnikiem cytotoksycznym.
65. Komórka hybrydoma 6.1A8 (numer dostępu ATCC PTA-3647).
66. Komórka hybrydoma 6.3G9 (numer dostępu ATCC PTA-3649).
67. Komórka hybrydoma 6.8G6 (numer dostępu ATCC PTA-3645).
68. Komórka hybrydoma 6.2B1 (numer dostępu ATCC PTA-3646).
69. Komórka hybrydoma 7.1G10 (numer dostępu ATCC PTA-3898).
70. Komórka hybrydoma 7.7G5 (numer dostępu ATCC PTA-3899).
71. Komórka hybrydoma 7.1C5 (numer dostępu ATCC PTA-3900).
72. Zastosowanie przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen określonego w dowolnym z zastrz. od 1 do 62 do wytwarzania leku do leczenia osobnika z chorobą albo narażonego na wystąpienie choroby przebiegającej za pośrednictwem α„β6, przy czym choroba jest wybrana z grupy składającej się ze zwłóknienia, łuszczycy, stwardnienia, raka, ostrego uszkodzenia płuc, uszkodzenia nerki, uszkodzenia wątroby lub zespołu Alporta.
73. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że osobnikiem jest człowiek.
74. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że chorobą jest zwłóknienie.
75. Zastosowanie według zastrz. 74, znamienne tym, że zwłóknieniem jest zwłóknienie płuc.
76. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że chorobą jest ostre uszkodzenie płuc.
77. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że chorobą jest rak.
78. Zastosowanie według zastrz. 77, znamienne tym, że rakiem jest raka nabłonkowy.
79. Zastosowanie według zastrz. 77, znamienne tym, że rakiem jest rak jamy ustnej, skóry, szyjki macicy, jajnika, gardła, przełyku, krtani, płuc, sutka, nerki lub okrężnicy i odbytnicy.
80. Zastosowanie według zastrz. 72, znamienne tym, że chorobą jest zespół Alporta.
81. Sposób wykrywania in vitro α„β6, w próbce tkanki ssaka, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu próbki tkanki z przeciwciałem określonym w dowolnym z zastrz. od 1 do 62.
PL372662A 2002-03-13 2003-03-13 Przeciwciało przeciwko integrynom α<sub>v</sub>β<sub>6</sub>, jego fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja i ich zastosowanie, komórka hybrydoma oraz sposób wykrywania α<sub>v</sub>β<sub>6</sub> in vitro PL216223B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36499102P 2002-03-13 2002-03-13
US42628602P 2002-11-13 2002-11-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372662A1 PL372662A1 (pl) 2005-07-25
PL216223B1 true PL216223B1 (pl) 2014-03-31

Family

ID=29586753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372662A PL216223B1 (pl) 2002-03-13 2003-03-13 Przeciwciało przeciwko integrynom α<sub>v</sub>β<sub>6</sub>, jego fragment wiążący antygen, zawierająca je kompozycja i ich zastosowanie, komórka hybrydoma oraz sposób wykrywania α<sub>v</sub>β<sub>6</sub> in vitro

Country Status (23)

Country Link
US (4) US7465449B2 (pl)
EP (4) EP1490110B1 (pl)
JP (6) JP4473117B2 (pl)
KR (1) KR101098109B1 (pl)
CN (4) CN104805090A (pl)
AR (1) AR038970A1 (pl)
AU (1) AU2003261071C1 (pl)
BR (1) BRPI0308585B8 (pl)
CA (1) CA2478833C (pl)
CL (8) CL2010000786A1 (pl)
EA (1) EA011853B1 (pl)
ES (1) ES2389037T3 (pl)
HK (2) HK1074381A1 (pl)
IL (4) IL164021A0 (pl)
IS (1) IS7443A (pl)
ME (1) ME00804B (pl)
MX (1) MXPA04008870A (pl)
MY (2) MY154009A (pl)
NO (1) NO334834B1 (pl)
NZ (2) NZ535425A (pl)
PL (1) PL216223B1 (pl)
RS (1) RS52488B (pl)
WO (1) WO2003100033A2 (pl)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0308585B8 (pt) 2002-03-13 2021-05-25 Biogen Idec Inc anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfavbeta6, composição, método de detecção in vitro de alfavbeta6 e construção de dna
US20090028853A1 (en) * 2006-10-19 2009-01-29 The Regents Of The University Of California, A California Corporation TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC ASTHMA USING ANTAGONISTS OF INTEGRIN ALPHAvBETA6
AU2003230929A1 (en) * 2002-04-12 2003-10-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
CA2434668A1 (en) * 2003-07-04 2005-01-04 Laurence Mulard Novel approach to design glycopeptides based on o-specific polysaccharide of shigella flexneri serotype 2a
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
AU2012258386B2 (en) * 2005-07-08 2014-08-07 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
WO2007084570A2 (en) * 2006-01-17 2007-07-26 Biosite Incorporated High sensitivity secretagogin assays and their uses for diagnosis and/or prognosis
JP2009542810A (ja) 2006-07-10 2009-12-03 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｍａｄ４欠損癌の増殖を阻害するための組成物および方法
CN103524619B (zh) * 2006-08-03 2016-10-05 阿斯利康(瑞典)有限公司 针对αVβ6的抗体及其应用
US20110064744A1 (en) * 2007-05-30 2011-03-17 Sabbadini Roger A Prevention and treatment of pain using antibodies to lysophosphatidic acid
US9163091B2 (en) * 2007-05-30 2015-10-20 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
WO2008150841A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Lpath, Inc. Compositions and methods for binding lysophosphatidic acid
EP2207568B1 (en) 2007-11-16 2017-05-31 The Rockefeller University Antibodies specific for the protofibril form of beta-amyloid protein
MX2010012052A (es) 2008-05-07 2010-12-14 Novo Nordisk As Anticuerpos humanizados contra interferon-alfa humano.
EP2279209A2 (en) * 2008-05-09 2011-02-02 Ablynx NV Amino acid sequences directed against integrins and uses thereof
JP2011523551A (ja) * 2008-05-15 2011-08-18 ザ・ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル 血管形成の調節の新規ターゲット
KR102097887B1 (ko) 2008-09-26 2020-04-06 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인간 항-ｐｄ-１, ｐｄ-ｌ１, 및 ｐｄ-ｌ2 항체 및 그의 용도
JP5734978B2 (ja) 2009-08-19 2015-06-17 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ Ｆｆｐｅ材料におけるインテグリン複合体検出のための抗体
WO2011119524A1 (en) * 2010-03-22 2011-09-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Novel targets for regulation of angiogenesis
ES2552954T3 (es) * 2010-04-30 2015-12-03 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos anti-C5a y métodos para el uso de los anticuerpos
CA2833477A1 (en) 2011-04-21 2012-10-26 Seattle Genetics, Inc. Novel binder-drug conjugates (adcs) and their use
US8852592B2 (en) 2011-05-10 2014-10-07 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-PAX8 antibodies
WO2013123152A2 (en) * 2012-02-17 2013-08-22 Seattle Genetics, Inc. ANTIBODIES TO INTEGRIN αVβ6 AND USE OF SAME TO TREAT CANCER
US10316103B1 (en) 2012-03-30 2019-06-11 Biocare Medical, Llc Systems and methods for anti-Uroplakin III antibodies
ES2682345T3 (es) 2012-09-27 2018-09-20 Biocare Medical, Llc Sistemas y procedimientos de anticuerpos antiuroplaquina II
CA2886772C (en) * 2012-10-03 2021-01-12 Livtech, Inc. Anti-hdlk-1 antibody having an anti-tumor activity in vivo
LT2839860T (lt) 2012-10-12 2019-07-10 Medimmune Limited Pirolobenzodiazepinai ir jų konjugatai
WO2014100220A2 (en) 2012-12-18 2014-06-26 Biocare Medical, Llc Antibody cocktail systems and methods for classification of histologic subtypes in lung cancer
DK2962113T3 (da) 2013-02-28 2019-07-01 Biocare Medical Llc Systemer og fremgangsmåder med anti-p40-antistoffer
CA2905181C (en) 2013-03-13 2020-06-02 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof for providing targeted therapy
US10035859B2 (en) 2013-03-15 2018-07-31 Biogen Ma Inc. Anti-alpha V beta 6 antibodies and uses thereof
WO2014143739A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Anti-alpha v beta 6 antibodies and uses thereof
GB201305668D0 (en) 2013-03-28 2013-05-15 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Avs6 Integrin Antagonists
HUE055856T2 (hu) 2013-08-30 2021-12-28 Immunogen Inc Antitestek és vizsgálatok a folsavreceptor 1 kimutatására
KR102150616B1 (ko) 2013-09-12 2020-09-03 삼성전자주식회사 c-Met 표적 화합물-생체활성 물질 접합체 및 그 용도
CA2925057A1 (en) * 2013-10-01 2015-04-09 Simon T. BARRY Methods of treating and diagnosing alpha-v-beta-6 overexpressing cancer
DK3052522T3 (da) 2013-10-03 2020-02-24 Biocare Medical Llc Anti-sox 10 antistofsystemer og -fremgangsmåder
CN104721225A (zh) 2013-12-19 2015-06-24 高露洁-棕榄公司 口腔护理组合物
BR112016014830A2 (pt) 2013-12-23 2017-09-19 Bayer Pharma AG Conjugados de fármaco de anticorpo (adcs) com inibidores de ksp
WO2015113169A1 (en) * 2014-02-03 2015-08-06 Cnj Holdings, Inc. Humanized beta-amyloid binding molecules and uses thereof
US10647768B2 (en) 2014-05-29 2020-05-12 Macrogenics, Inc. Multi-chain polypeptide-containing tri-specific binding molecules
WO2016037644A1 (en) 2014-09-10 2016-03-17 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201417002D0 (en) 2014-09-26 2014-11-12 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Novel compound
AU2016282723B2 (en) 2015-06-22 2021-09-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antibody drug conjugates (ADCs) and antibody prodrug conjugates (APDCs) with enzymatically cleavable groups
PE20180452A1 (es) 2015-06-23 2018-03-05 Bayer Pharma AG Conjugados homogeneos especificos de sitio con inhibidores de ksp
WO2017027685A2 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 New York University Antibody-based molecules specific for the truncated asp421 epitope of tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
JP6880006B2 (ja) 2015-09-17 2021-06-02 イミュノジェン， インコーポレイテッド 抗ｆｏｌｒ１免疫複合体を含む治療組み合わせ
WO2017060322A2 (en) 2015-10-10 2017-04-13 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Ptefb-inhibitor-adc
GB201604680D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
GB201604681D0 (en) 2016-03-21 2016-05-04 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical Compounds
JP7251981B2 (ja) 2016-03-24 2023-04-04 バイエル ファーマ アクチエンゲゼルシャフト 酵素開裂基を有する細胞毒性活性剤のプロドラッグ
EP3471776B1 (en) 2016-06-15 2022-05-04 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Specific antibody-drug-conjugates with ksp inhibitors and anti-cd123-antibodies
US20190284259A1 (en) * 2016-07-22 2019-09-19 Georgia State University Research Foundation Monoclonal Antibodies to B Virus And Their Use For Identification Of B Virus Specific Reactive Peptides
CN109862919A (zh) 2016-10-11 2019-06-07 免疫医疗有限公司 抗体-药物缀合物联合免疫介导的治疗剂
WO2018089539A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Reata Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating alport syndrome using bardoxolone methyl or analogs thereof
US10610104B2 (en) 2016-12-07 2020-04-07 Progenity, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
CA3045931A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
US20190351066A1 (en) 2016-12-21 2019-11-21 Bayer Aktiengesellschaft Prodrugs of cytotoxic active agents having enzymatically cleavable groups
JP7066714B2 (ja) 2016-12-21 2022-05-13 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト 酵素的に切断可能な基を有する抗体薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
JP7030811B2 (ja) 2016-12-21 2022-03-07 バイエル・ファルマ・アクティエンゲゼルシャフト Ｋｓｐ阻害剤を有する特異的抗体－薬物コンジュゲート（ａｄｃ）
GB201720989D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Chemical compounds
EP3790871B1 (en) 2018-05-11 2024-01-24 GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited Furin inhibitors
WO2019224275A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
US20230033021A1 (en) 2018-06-20 2023-02-02 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an integrin inhibitor
WO2020106750A1 (en) 2018-11-19 2020-05-28 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
GB201908536D0 (en) 2019-06-13 2019-07-31 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Compounds
US20230002510A1 (en) * 2019-11-26 2023-01-05 Children's Hospital Medical Center Cela-1 inhibition for treatment of lung disease
EP4069297A4 (en) 2019-12-05 2024-02-14 Seagen Inc ANTI-AVB6 ANTIBODIES AND ANTIBODY-DRUG CONJUGATES
CN115666704A (zh) 2019-12-13 2023-01-31 比奥拉治疗股份有限公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
JP2024505001A (ja) * 2021-01-26 2024-02-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ａｖｂ８インテグリンに関連する疾患を処置および予防するための組成物および方法
CA3205921A1 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Sheng CUI Formulation of furin inhibitor for inhalation
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2023194895A1 (en) 2022-04-06 2023-10-12 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Pyrrol derivatives as inhibitors of apolipoprotein l-1

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US5223493A (en) 1984-12-28 1993-06-29 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory compounds for ophthalmic use
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
NZ222509A (en) 1986-11-19 1993-03-26 Oncogen Hybridoma cell line producing antibodies binding to tumour-associated mucin antigen
US5019368A (en) * 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5804381A (en) * 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
AU7247191A (en) * 1990-01-11 1991-08-05 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
DE69133566T2 (de) 1990-01-12 2007-12-06 Amgen Fremont Inc. Bildung von xenogenen Antikörpern
US6075181A (en) * 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) * 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
GB9009549D0 (en) * 1990-04-27 1990-06-20 Celltech Ltd Recombinant antibody and method
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5871907A (en) * 1991-05-15 1999-02-16 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DE122004000008I1 (de) 1991-06-14 2005-06-09 Genentech Inc Humanisierter Heregulin Antikörper.
US5962643A (en) 1991-07-11 1999-10-05 The Regents Of The University Of California Integrin β subunit and uses thereof
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
US5714350A (en) * 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
PT752248E (pt) 1992-11-13 2001-01-31 Idec Pharma Corp Aplicacao terapeutica de anticorpos quimericos e marcados radioactivamente contra antigenios de diferenciacao restrita de linfocitos b humanos para o tratamento do linfoma de celulas b
US6307026B1 (en) 1992-12-10 2001-10-23 Celltech Limited Humanized antibodies directed against A33 antigen
US5420120A (en) 1993-12-17 1995-05-30 Alcon Laboratories, Inc. Anti-inflammatory glucocorticoid compounds for topical ophthalmic use
US5827690A (en) * 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6417324B1 (en) * 2000-04-21 2002-07-09 Tripep Ab Synthetic peptides that bind to the hepatitis B virus core and e antigens
DE69531187T2 (de) * 1994-12-20 2004-04-22 Merck Patent Gmbh Monoklonaler Antikörper gegen das Alpha-V-Integrin
US5688960A (en) 1995-05-02 1997-11-18 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins useful as neurokinin antagonists
US5696267A (en) 1995-05-02 1997-12-09 Schering Corporation Substituted oximes, hydrazones and olefins as neurokinin antagonists
US5719156A (en) 1995-05-02 1998-02-17 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinin antagonists
US5795894A (en) 1995-05-02 1998-08-18 Schering Corporation Piperazino derivatives as neurokinn antagonists
US5654316A (en) 1995-06-06 1997-08-05 Schering Corporation Piperidine derivatives as neurokinin antagonists
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
HUP9901673A3 (en) 1995-08-17 2001-06-28 Scil Biomedicals Gmbh Anti-selectin antibodies for prevention of multiple organ failure and acute organ damage
AU725609C (en) 1995-08-18 2002-01-03 Morphosys Ag Protein/(poly)peptide libraries
CN101333516A (zh) 1995-08-29 2008-12-31 麒麟医药株式会社 嵌合体动物及其制备方法
US5691362A (en) 1996-06-05 1997-11-25 Schering-Plough Corporation Substituted benzene-fused hetero- and carbocyclics as nuerokinin antagonists
CA2257357C (en) * 1996-06-07 2010-04-13 Neorx Corporation Humanized antibodies with modified glycosylation
AU6721696A (en) 1996-07-15 1998-03-06 Human Genome Sciences, Inc. Cd44-like protein
US5789422A (en) 1996-10-28 1998-08-04 Schering Corporation Substituted arylalkylamines as neurokinin antagonists
US5783579A (en) 1996-12-20 1998-07-21 Schering Corporation Spiro-substituted azacyclic-substituted piperazino derivatives as neurokinin antagonists
ES2311131T3 (es) * 1997-08-08 2009-02-01 The Regents Of The University Of California Tratamiento de la fibrosis hepatico con anticuerpos contra la integrina alfa-v-beta6.
JP2002501086A (ja) * 1998-01-23 2002-01-15 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 抗−αｖインテグリンモノクローナル抗体および、フィブロネクチンへのαｖβ６インテグリンの付着を阻害するためのその使用
CN1335853A (zh) 1998-12-19 2002-02-13 默克专利股份公司 整联蛋白αvβb的抑制剂
US7163681B2 (en) 2000-08-07 2007-01-16 Centocor, Inc. Anti-integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7288390B2 (en) 2000-08-07 2007-10-30 Centocor, Inc. Anti-dual integrin antibodies, compositions, methods and uses
US7776315B2 (en) 2000-10-31 2010-08-17 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and additional active ingredients
DE10063173A1 (de) 2000-12-18 2002-06-20 Merck Patent Gmbh Harnstoff- und Urethanderivate
UA83791C2 (ru) 2001-04-13 2008-08-26 Байоджен Айдек Ма Инк. Антитело против vla-1, фармацевтическая композиция, которая его содержит, и из применение для лечения индивидуума с иммунологическим расстройством, опосредованным vla-1
DE10118550A1 (de) 2001-04-14 2002-10-17 Merck Patent Gmbh Liganden des Integrins alpha¶nu¶beta¶6¶
GB2380127A (en) 2001-09-26 2003-04-02 Isis Innovation Treatment of chronic joint inflammation
BR0307975A (pt) 2002-02-25 2005-01-11 Elan Pharm Inc Métodos para reduzir cronicamente a inflamação patológica em um paciente e para determinar a eficácia de um regime de administração crÈnica para tratar inflamação patológica em um indivìduo, composição e terapia combinada para tratamento crÈnico de inflamação patológica em um paciente e uso de um inibidor de alfa-4-integrina
US20090028853A1 (en) 2006-10-19 2009-01-29 The Regents Of The University Of California, A California Corporation TREATMENT AND PREVENTION OF CHRONIC ASTHMA USING ANTAGONISTS OF INTEGRIN ALPHAvBETA6
BRPI0308585B8 (pt) 2002-03-13 2021-05-25 Biogen Idec Inc anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo que se liga à alfavbeta6, composição, método de detecção in vitro de alfavbeta6 e construção de dna
AU2003230929A1 (en) 2002-04-12 2003-10-27 Raven Biotechnologies, Inc. Antibodies that bind to integrin alpha-v-beta-6 and methods of use thereof
WO2003097615A1 (en) 2002-05-17 2003-11-27 Scios, Inc. TREATMENT OF FIBROPROLIFERATIVE DISORDERS USING TGF-β INHIBITORS
AU2003298783B2 (en) 2002-11-26 2010-11-04 Abbvie Biotherapeutics Inc. Chimeric and humanized antibodies to alpha5beta1 integrin that modulate angiogenesis
US20040253311A1 (en) 2002-12-18 2004-12-16 Roger Berlin Multi-layer tablet comprising non-steroidal anti-inflammatory drugs, decongestants and non-sedating antihist amines
WO2005039547A1 (en) 2003-10-01 2005-05-06 Merck Patent Gmbh Alfavbeta3 and alfavbeta6 integrin antagonists as antifibrotic agents
CA2544855A1 (en) 2003-11-04 2005-05-19 Bayer Pharmaceuticals Corporation Immunohistochemical methods
CN102875681A (zh) 2005-07-08 2013-01-16 拜奥根Idec马萨诸塞公司 抗-αvβ6抗体及其用途
JP2009542810A (ja) 2006-07-10 2009-12-03 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド Ｓｍａｄ４欠損癌の増殖を阻害するための組成物および方法
GB0803192D0 (en) 2008-02-22 2008-04-02 Mubio Products Bv SCLC biomarker panel
CA2747937C (en) 2008-12-23 2019-02-26 Merck Patent Gmbh Biomarkers for inhibitors with anti-angiogenic activity
US20140045915A1 (en) 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
ES2875535T3 (es) 2012-03-29 2021-11-10 Biogen Ma Inc Biomarcadores para su uso en aplicaciones de terapia de integrina

Also Published As

Publication number Publication date
US20120251532A1 (en) 2012-10-04
BR0308585A (pt) 2005-02-01
JP2009100763A (ja) 2009-05-14
US20090186036A1 (en) 2009-07-23
PL372662A1 (pl) 2005-07-25
EP1490110B1 (en) 2012-06-13
IS7443A (is) 2004-09-09
JP5616932B2 (ja) 2014-10-29
CA2478833C (en) 2015-11-10
AU2003261071A1 (en) 2003-12-12
EP1490110A4 (en) 2006-12-27
CL2010000792A1 (es) 2011-02-18
MXPA04008870A (es) 2005-06-17
US9745376B2 (en) 2017-08-29
AU2003261071C1 (en) 2008-12-11
CL2010000786A1 (es) 2011-02-18
ME00804B (me) 2012-03-20
HK1213007A1 (zh) 2016-06-24
US8153126B2 (en) 2012-04-10
MY147019A (en) 2012-10-15
JP2015091807A (ja) 2015-05-14
JP2005528099A (ja) 2005-09-22
CL2010000785A1 (es) 2011-02-18
AU2003261071B2 (en) 2008-05-15
IL225633B (en) 2021-12-01
EP2287198A3 (en) 2011-05-25
IL164021A (en) 2013-04-30
WO2003100033A3 (en) 2004-07-15
KR20040095281A (ko) 2004-11-12
RS80704A (en) 2006-12-15
US20150140609A1 (en) 2015-05-21
IL164021A0 (en) 2005-12-18
CL2010000787A1 (es) 2011-02-11
CN102659946A (zh) 2012-09-12
CL2010000789A1 (es) 2011-02-18
CL2010000790A1 (es) 2011-02-18
BRPI0308585B8 (pt) 2021-05-25
CN102924598B (zh) 2014-12-31
JP2012228269A (ja) 2012-11-22
AR038970A1 (es) 2005-02-02
CL2010000791A1 (es) 2011-02-18
EP2287198A2 (en) 2011-02-23
KR101098109B1 (ko) 2011-12-26
RS52488B (en) 2013-02-28
EA200401198A1 (ru) 2005-04-28
EP2336185A1 (en) 2011-06-22
CN1646160A (zh) 2005-07-27
NO334834B1 (no) 2014-06-16
JP2013014592A (ja) 2013-01-24
IL225633A0 (en) 2014-03-31
EP2287199B1 (en) 2017-08-02
EP2287199A3 (en) 2011-05-25
EP1490110A2 (en) 2004-12-29
WO2003100033A2 (en) 2003-12-04
EA011853B1 (ru) 2009-06-30
MY154009A (en) 2015-04-30
US7465449B2 (en) 2008-12-16
JP4473117B2 (ja) 2010-06-02
NZ563951A (en) 2009-04-30
BRPI0308585B1 (pt) 2019-10-15
CA2478833A1 (en) 2003-12-04
CN104805090A (zh) 2015-07-29
EP2287199A2 (en) 2011-02-23
US20050255102A1 (en) 2005-11-17
ES2389037T3 (es) 2012-10-22
NO20044347L (no) 2004-12-13
CL2010000788A1 (es) 2011-02-18
HK1074381A1 (en) 2005-11-11
NZ535425A (en) 2008-05-30
CN102924598A (zh) 2013-02-13
JP2015126743A (ja) 2015-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9745376B2 (en) Anti-ανβ6 antibodies
KR101531317B1 (ko) 항-ανβ6 항체 및 이의 용도
Violette et al. Anti-α ν β 6 antibodies
ZA200407336B (en) Anti-?v?6 antibodies