PL204161B1 - Cykloheksapeptydowe analogi somatostatyny, sposób ich otrzymywania, kompozycje farmaceutyczne zawierające te związki oraz zastosowanie tych związków - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy cykloheksapeptydowych analogów (peptydomimetyków) somatostatyny, sposobu ich wytwarzania, zawierających je preparatów farmaceutycznych oraz medycznego zastosowania tych związków.

Analogi somatostatyny posiadające strukturę cykloheksapeptydową zostały opisane, na przykład w dokumencie WO-A-9701579 i J. Am. Chem. Soc, Vol. 114, 1992, 9390-9401.

Przedmiotem wynalazku jest cykloheksapeptydowy analog somatostatyny:

nazywany także cyklo[4-{NH2-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Lys-Tyr(4-Bzl)Phe] określany tu jako związek A, jak również jego diastereoizomery i mieszaniny w formie wolnej, formie soli lub kompleksu lub w formie zabezpieczonej. Phg oznacza -HN-CH(C6H5)-CO, a Bzl oznacza benzyl.

Korzystnie związek A jest w formie niezabezpieczonej, w formie soli.

W innym korzystnym wariancie związek A jest w formie mono- lub disoli.

W jeszcze innym korzystnym wariancie związek A jest w formie octanu, benzoesanu, asparaginianu lub embonianu.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób otrzymywania związku A obejmujący cyklizację liniowego peptydu w formie zabezpieczonej, związanej z polimerem lub niezabezpieczonej do uzyskania pożądanego związku, a następnie opcjonalnie usuwa się grupę (grupy) zabezpieczające do uzyskania pożądanego związku w formie wolnej lub w formie soli.

W korzystnym wariancie grupa aminowa proliny (Pro) w łańcuchu bocznym w zwią zku A jest skoniugowana ze środkiem chelatującym, opcjonalnie skompleksowanym z elementem wykrywalnym lub radioterapeutycznym.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek A lub jego farmaceutycznie akceptowalną sól w połączeniu z jednym lub większą liczbą farmaceutycznie akceptowalnych rozcieńczalników lub nośników.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest w formie o przedłużonym uwalnianiu lub w formie do stosowania miejscowego.

W innym korzystnym wariancie kombinacja farmaceutyczna jest w postaci kombinacji ze środkiem immunosupresyjnym, środkiem przeciwzapalnym, środkiem modulującym receptor pobudzający wydzielanie GH, antagonistą receptora GH, środkiem pobudzającym wydzielanie insuliny, środkiem wzmagającym wydzielanie insuliny, środkiem uwrażliwiającym na insulinę, małą dawką insuliny, środkiem posiadającym działanie anty-angiogenne lub środkiem chemioterapeutycznym.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie związku A do leczenia przetok jelitowo-skórnych lub trzustkowo-skórnych, zespołu drażliwego jelita, chorób i zaburzeń o charakterze zapalnym, torbielowatości nerek, zespołu poresekcyjnego żołądka, zespołu wodnistej biegunki, biegunki związanej z AIDS, biegunki wywołanej chemioterapią ostrego lub przewlekłego zapalenia trzustki, krwawienia z przewodu pokarmowego, guzów i nowotworów złośliwych, angiogenezy, obrzęku plamki, zaburzeń związanych z neouwaskularyzacją naczyniówki, proliferacyjnej retinopatii, chorób naczyń

PL 204 161 B1 przeszczepu, zwężenia naczyń przeszczepu, powtórnego zwężenia i/lub zamknięcia naczynia na skutek uszkodzenia naczynia.

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku A do wytwarzania leku do leczenia akromegalii.

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku A do wytwarzania leku do leczenia guzów przewodu pokarmowego wydzielających hormony.

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku A do wytwarzania leku do leczenia guzów rakowiaka.

Związek A w formie zabezpieczonej odpowiada cząsteczce wskazanej na str. 1, w której co najmniej jedna z grup aminowych jest zabezpieczona i która na skutek odbezpieczenia prowadzi do powstania związku A, korzystnie fizjologicznie usuwalnego. Odpowiednimi aminowymi grupami zabezpieczającymi są np. grupy ujawnione w Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Greene, J. Wiley & Sons NY (1981), 219-287, które to źródło załączono tu w formie odnośnika. Przykładem takiej aminowej grupy zabezpieczającej jest acetyl.

Gdy związek A występuje w formie kompleksu, może być dogodnie związkiem A posiadającym grupę chelatującą na łańcuchu bocznym grupy aminowej Pro i być zespolony z elementem wykrywalnym lub radioterapeutykiem. Związek A zawierający grupę chelatującą nazywany jest tutaj skoniugowanym związkiem A.

Przykłady grup chelatujących obejmują np. grupy otrzymane z kwasów poliaminopolikarboksylowych lub bezwodników np. otrzymane z nie-cyklicznych ligandów np. kwasu dietylenotriaminopentaoctowego (DTPA), kwasu etylenoglikolo-0,0'-bis(2-aminoetylo)-N,N,N'N'-tetraoctowego (EGTA), kwasu N,N'-bis(hydroksybenzylo)etylenodiamino-N,N,'-dioctowgo (HBED) i kwasu trietylenotetraaminoheksaoctowego (TTHA), grupy otrzymane z podstawionego DTPA np. p-izotiocjanato-benzylo-DTPA, grupy otrzymane z ligandów makrocyklicznych np. kwasu 1,4,7,10-tetra-azacyklododekano-N,N',N,N'-tetraoctowego (DOTA) i kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklotridekano-N,N',N,N'-tetraoctowego (TITRA).

Grupa chelatująca może być przyłączona bezpośrednio lub poprzez czynnik przestrzenny do grupy aminowej łańcucha bocznego Pro. Odpowiednie czynniki przestrzenne obejmują czynniki znane w stanie techniki np. ujawnione w GB-A-2,225,579 np. dwuwartoś ciową resztę kwasu aminokarboksylowego np. β-Ala lub dwuwartościową resztę otrzymaną z kwasu 6-amino-kapronowego.

Korzystnymi grupami chelatującymi są grupy otrzymane z DTPA, DOTA lub TETA. Najkorzystniejsze są grupy otrzymane z DTPA lub DOTA.

Element wykrywalny to jakikolwiek element, korzystnie jon metalu, który może być wykryty metodami diagnostycznymi in vivo np. jon metalu, który emituje wykrywalne promieniowanie lub jon metalu, który może oddziaływać na zjawisko relaksacji zachodzące podczas analizy techniką NMR. Element radioterapeutyczny to jakikolwiek element, który emituje promieniowanie mające korzystny wpływ na leczone schorzenie.

Odpowiednimi elementami są np. elementy ciężkie lub jony ziem rzadkich np. stosowane w skaningu CAT (Computer axial tomography), jony paramagnetyczne np. Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ i Cr²⁺, fluorescencyjne jony metali np. Eu³⁺ i radionuklidy np. radiolantanid, szczególnie radionuklid emitujący promieniowanie γ, radionuklid emitujący promieniowanie β radionuklid emitujący promieniowanie α,

18 86 radionuklid emitujący elektrony Augera lub radionuklid emitujący pozytrony np. ⁶⁸Ga, F¹⁸ lub ⁸⁶Y.

Odpowiednimi radionuklidami emitującymi promieniowanie γ są radionuklidy stosowane w procedurach diagnostycznych. Radionuklidy emitujące promieniowanie γ korzystnie posiadają okres półtrwania od 1 godziny do 40 dni, korzystnie od 5 godzin do 4 dni, korzystniej od 12 godzin do 3 dni. Przykładowo są to radioizotopy galu, indu, technetu, iterbu, terbu, renu, lutetu, talu i samaru np. ⁶⁷Ga, ¹¹¹In, ^99mTc, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁹Yb, ¹⁸⁶Re lub ¹⁷⁷Lu.

Do odpowiednich radionuklidów emitujących promieniowanie β należą radionuklidy stosowane w radioterapii np. ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ¹⁸⁶Re, ¹⁶⁹Er, ¹² Sn, ¹²⁷Te, ¹⁷⁷Lu, ¹⁴³Pr, ¹⁹⁸Au, ¹⁰⁹Pd, ¹⁶⁵Dy, ¹⁴²Pr lub ¹⁵³Sm.

Do odpowiednich radionuklidów emitujących promieniowanie α należą radionuklidy stosowane w lecznictwie np. ²¹¹At, ²¹²Bi lub ²⁰¹Tl.

Związek A może występować np. w formie wolnej lub w formie soli. Do soli należą sole addycyjne z kwasami np. kwasami nieorganicznymi, kwasami polimerowymi lub kwasami organicznymi np. kwasem solnym, kwasem octowym, kwasem mlekowym, kwasem asparaginowym, kwasem benzoesowym, kwasem bursztynowym lub kwasem embonowym. Sole addycyjne z kwasami mogą występować jako sole jedno- i dwuwartościowe, np. w zależności od tego, czy ekwiwalenty kwasowe 1 i 2

PL 204 161 B1 są dodane do związku A w formie wolnej zasady. Korzystne sole to mleczan, asparaginian, benzoesan, bursztynian lub embonian włączając sole mono- i di-, korzystniej di- sól asparaginianu i monosól embonianu.

Skoniugowany związek A może dodatkowo występować w formie soli otrzymywanych z grupami kwasów karboksylowych, gdy są obecne w grupach chelatujących np. soli metali alkalicznych takich, jak sodowa lub potasowa lub podstawionych lub niepodstawionych soli amonowych.

Skoniugowany związek A lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól jest użyteczna albo jako środek obrazujący np. do wizualizacji tkanek i komórek wykrywalnych przez receptor somatostatyny np. guzów i przerzutów wykrywalnych przez receptor somatostatyny, zaburzeń o charakterze zapalnym lub autoimmunologicznym wykazującym receptory somatostatyny, gruźlicy lub odrzucania narządów po transplantacji, gdy jest skompleksowany z elementem wykrywalnym, np. nuklidem emitującym γ lub pozytrony, jonem metalu fluorescencyjnego lub jonem paramagnetycznym np. ¹¹¹In, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ⁸⁶Y, ⁶⁸GaEu³⁺, Gd³⁺, Fe³⁺, Mn²⁺ lub Cr²⁺ lub jako radiofarmaceutyk do leczenia in vivo guzów i przerzutów pozytywnych dla receptora somatostatyny, reumatoidalnego zapalenia stawów i ciężkich stanów zapalnych, gdy jest skompleksowany z nuklidem emitującym α lub β lub nuklidem z kaskady elektronów Augera np. ⁹⁰Y, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ²¹¹At, ²¹³Bi lub ²⁰¹Tl, jak wykazują standardowe testy.

W szczególności zaobserwowano, że skoniugowany związek A wiąże się z receptorami somatostatyny przy wartościach pKi od około 8 do 10. Związek z przykładu 3 skompleksowany np. z ¹¹¹In, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y lub ¹⁷⁷Lu wiąże się w zakresie nM z odpowiednimi podtypami sst zgodnie z profilem wiązania związku A.

Powinowactwo skoniugowanego związku A i jego kompleksów do receptorów somatostatyny może być również wykazane w testach in vivo, zgodnie ze standardowymi metodami testowania, np. jak ujawniono w GB-A-2,225,579. Na przykład związek z przykładu 3 skompleksowany np. z ¹¹¹In, ⁸⁸Y, ⁹⁰Y lub ¹⁷⁷Lu powoduje znaczącą akumulację guza 4 godziny po iniekcji u myszy lub szczurów z nieendokrynnym nowotworem trzustki wykazującym ekspresję receptorów hsst2.

Po podaniu skoniugowanego związku A w formie kompleksu np. kompleksu związku A ze ¹¹¹ln, ¹⁷⁷Lu, ⁸⁶Y lub ¹⁶¹Tb w dawce od 1 do 5 μg/kg znakowanego 0,1 do 5 mCi radionuklidu, korzystnie 0,1 do 2 mCi, guz staje się wykrywalny.

Skoniugowany związek A, gdy jest znakowany radionuklidem emitującym α lub β lub nuklidem z kaskadami elektronów Augera wykazuje działanie antyproliferacyjne i i/lub cytotoksyczne wobec komórek guza posiadających receptory somatostatyny np. jak wykazano w testach na myszach nagich.

Myszom nagim wszczepia się komórki guza trzustki AR42J szczura lub komórki ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc NCI-H69, jak ujawniono powyżej. Gdy guzy osiągają wielkość 1 do 2 cm², zwierzęta są dzielone losowo na grupy kontrolne i grupy badane. Skoniugowany związek A w formie kompleksu jest podawany w iniekcjach i.p lub i.v. Każda mysz otrzymuje dawki do 40 mCi/kg. Wielkość guzów jest mierzona za pomocą suwmiarki, jak ujawniono powyżej. Do obliczeń statystycznych stosowany jest test t-studenta. W tym teście obserwowane jest przejściowe kurczenie guza do 50% pierwotnej wielkości po 1 tygodniu, a wzrost guza jest opóźniany przez dwa tygodnie po pojedynczym podaniu związku z przykładu 3 skompleksowanego z ⁹⁰Y. W przeciwieństwie do grupy badanej, grupy kontrolne wykazywały stały wzrost guza, a czas jego podwojenia wynosił około 7 dni.

Zgodnie z powyższym wynalazek dotyczy zastosowania skoniugowanego związku A skompleksowanego z elementem wykrywalnym w celu wykrycia in vivo u osobnika komórek i tkanek pozytywnych dla receptora somatostatyny np. guzów i przerzutów pozytywnych dla receptora somatostatyny i rejestracja lokalizacji receptorów, na które działa kompleks.

Skoniugowany związek A w formie kompleksu do stosowania jako środek obrazujący może być podawany np. dożylnie np. w formie roztworów lub zawiesin do iniekcji, korzystnie w formie pojedynczej iniekcji. Znakowanie radioaktywne może być korzystnie wykonywane na krótko przed podaniem osobnikowi.

U zwierząt zalecany zakres dawek może wynosić od 0,01 μg/kg do 1 μg/kg skoniugowanego związku A skompleksowanego z 0,02 do 0,5 mCi radionuklidu emitującego γ. U większych ssaków, na przykład ludzi, zalecany zakres dawek może wynosić od 1 do 100 μg/m skoniugowanego związku A skompleksowanego np. z 1 do 100 mCi/m² wykrywalnego elementu np. ¹¹¹In, ⁸⁶Y lub ¹⁷⁷Lu.

Wynalazek dotyczy skoniugowanego związku A według wynalazku skompleksowanego z nuklidem emitującym α lub β lub nuklidem z kaskadami elektronów Augera stosowanego do leczenia in vivo guzów i przerzutów pozytywnych dla receptora somatostatyny.

PL 204 161 B1

Wynalazek dotyczy również skoniugowanego związku A lub jego farmaceutycznie akceptowalnych soli stosowanych do wytwarzania środka obrazującego lub preparatu radiofarmaceutycznego.

Dawkowanie związku według wynalazku w zastosowaniu radioterapeutycznym będzie zróżnicowane w zależności np. od określonego schorzenia, które ma być leczone np. od znanej radiotoksyczności dla zdrowych narządów wykazujących ekspresję receptorów somatostatyny, objętości guza i pożądanej terapii. Ogólnie, dawka jest obliczana na podstawie danych na temat farmakokinetyki i dystrybucji radioaktywności uzyskanych dla zdrowych narządów i na podstawie obserwacji docelowego wychwytu. Kompleks skoniugowanego związku A, emitujący promieniowanie β, może być podawany wielokrotnie np. w czasie 1 do 3 miesięcy.

U zwierząt zalecany zakres dawek może wynosić od 20 do 100 μg/kg skoniugowanego związku A skompleksowanego z 50 do 70 mCi nuklidu emitującego β lub nuklidu z kaskadami Auger-e np. ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu lub ¹⁶¹Tb. U większych ssaków, np. ludzi, zalecany zakres dawek może wynosić od 1 do 100 μg/m² skoniugowanego związku A skompleksowanego np. z 1 do 100 mCi/m² nuklidu emitującego α lub β lub nuklidu z kaskadami Auger-e np. ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu lub ¹⁶¹Tb.

Skoniugowany związek A w formie kompleksu do stosowania jako środek radioterapeutyczny może być podawany w jakikolwiek konwencjonalny sposób np. dożylnie np. w formie roztworów do iniekcji. Może być także podawany korzystnie w infuzji np. infuzji trwającej od 15 do 60 minut. W zależności od umiejscowienia guza, może być podawany możliwie najbliżej miejsca występowania guza np. poprzez kateter. Przedmiotem wynalazku jest także preparat farmaceutyczny zawierający skoniugowany związek A w formie wolnej zasady lub formie farmaceutycznie akceptowalnej soli lub w formie kompleksu ze środkiem wykrywalnym lub radioterapeutycznym razem z jednym lub więcej farmaceutycznie akceptowalnym rozpuszczalnikiem lub nośnikiem.

Związek A lub skoniugowany związek A w formie kompleksu może być odpowiedni do obrazowania lub leczenia guzów, w których zachodzi ekspresja lub akumulacja receptora somatostatyny takich jak guz przysadki, guz żołądkowo-jelitowo-trzustkowy, rakowiak, guzy ośrodkowego układu nerwowego, guzy sutka, guzy prostaty (włącznie z zaawansowanym opornym na hormony rakiem prostaty), guzy jajnika lub okrężnicy, drobnokomórkowy rak płuc, złośliwa niedrożność jelit, przyzwojaki, rak nerki, nerwiak niedojrzały, rak skóry, nerwiak niedojrzały, guz chromochłonny, rdzeniowy rak tarczycy, szpiczaki, chłoniaki, chłoniak Hodgkins'a i chłoniak nieziarniczy, guzy kości i ich przerzuty, jak również choroby autoimmunologiczne lub o charakterze zapalnym np. reumatoidalne zapalenie stawów, choroba Graves'a lub inne zapalne choroby oczu.

Kompozycje według wynalazku mogą być wytwarzane w konwencjonalny sposób i mogą stanowić, np. do obrazowania, zestaw składający się z dwóch oddzielnych jednostek, z których jedna jest radionuklidem, a druga skoniugowanym związkiem A, z instrukcją dotyczącą ich mieszania. Do celów radioterapii, skoniugowany związek A w formie kompleksu może korzystnie mieć formę gorącego płynu.

Związek A lub skoniugowany związek A w formie kompleksu może być podawany jako pojedynczy składnik aktywny lub w połączeniu z innymi lekami np. jako adiuwant. Na przykład związek A może być stosowany w kombinacji ze środkiem immunosupresyjnym np. inhibitorem calcyneuryny, np. cyklosporyną A, lub FK 506; laktonem makrocyklicznym posiadającym właściwości immunosupresyjne, np. rapamycyną lub 40-O-(2-hydroksyetylo)-rapamycyną (RAD); askomycyną posiadającą właściwości immunosupresyjne, np. ABT-281, ASM981, etc; kortykosteroidami; cyklofosfamidem; azatioprenem; metotreksatem; leflunomidem; mizoribiną (mizoribine); kwasem mykofenolowym lub jego solą, np. Myfortic^R, mykofenolanem mofetilu (mycophenolate mofetil), 15-dezoksyspergualiną lub jej immunosupresyjnym homologiem, analogiem lub pochodną, przyspieszającym limfocytowym środkiem samokierującym, np. FTY720, immunosupresyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi, np. przeciwciałami monoklonalnymi dla receptorów leukocytów, np. MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 lub ich ligandów; innymi komponentami immunomodulacyjnymi, np. rekombinacyjną cząsteczką wiążącą posiadającą co najmniej część pozakomórkowej domeny CTLA4 lub jej mutantem, np. co najmniej pozakomórkową częścią CTLA4 lub jej mutantem przyłączonym do sekwencji białkowej nie-CTLA4, np. CTA4Ig (np. oznaczonej ATCC 68629) lub jej mutantem, np. LEA29Y; inhibitorami cząsteczki adhezyjnej, np. antagonistami LFA-1 lub 3, antagonistami VCAM-4 lub antagonistami VLA-4. Związek A może także być stosowany w kombinacji z lekiem przeciwzapalnym, środkiem modulującym receptor pobudzający wydzielanie GH, np. greliną lub heksareliną, antagonistą receptora GH, np. pegvisomant, czynnikiem pobudzającym wydzielanie insuliny, np. sulfonylomocznik, np. tolbutamid, chlorpropamid, tolazamid, acetoheksamid, 4-chloro-N-[(pirolidynyloamino)karbonylo]-benzenosulfonamid (glikopiramid), glibenklamid (gliburyd), gliklazyd, 1-butylo-3-metanililomocznik.

PL 204 161 B1 karbutamid, glibonurid, glipizyd, glikwidon, glizoksepid, glibutiazol, glibuzol, gliheksamid, glimidyna, glipinamid, fenbutamid lub tolilocyklamid, krótko działający nie-sulfonylomocznik, doustna pochodna insulinotropowa, np. krótko działający środek nasilający wydzielanie insuliny, np. meglitynid, repaglinid pochodna kwasu fenylooctowego, np. nateglinid, inhibitor DPP IV, np. dichlorowodorek 1-{2-[(5cjanopirydyno-2-ylo)amino]etyloamino}acetylo-(2S)-cjano-pirolidyny, LAF237, analog agonisty GLP-1 lub GLP-2, środek uwrażliwiający na insulinę np. agonista receptora γ aktywowany proliferatorem peroksysomu (PPAR γ) np. glitazon, np. (S)-((3,4-dihydro-2-fenylometylo)-2H-1-benzopirano-6-ylo)metylotiazolidyno-2,4-dion (englitazon), 5-{[4-(3-(5-metylo-2-fenylo-4-oksazolilo)-1-oksopropylo)fenylo]-metylo}-tiazolidyno-2,4-dion (darglitazon), 5-{[4-(1-metylo-cykloheksylo)metoksy)-fenylo]metylo}tiazolidyno-2,4-dion (ciglitazon), 5-{[4-(2-(1-indlilo)etoksy)fenylo]metylo}tiazolidyno-2,4-dion (DRF2189), 5-{4-[2-(5-metylo-2-fenylo-4-oksazolilo)etoksy)]benzylo}-tiazolidyno-2,4-dion (BM-13.1246), 5-(2-naftylosulfonylo)tiazolidyno-2,4-dion (AY-31637), bis{4-(2,4-diokso-5-tiazolidynylo)metylo]fenylo}metan (YM268), 5-{4-[2-(5-metylo-2-fenylo-4-oksazolilo)-2-hydroksyetoksy]benzylo}tiazolidyno-2,4-dion (AD-5075), 5-[4-(1-fenylo-1-cyklopropano-karbonyloamino)-benzylo]tiazolidyno-2,4-dion (DN-108), 5-{[4-(2-(2,3-dihydroindolo-1-ylo)etoksy)fenylo]metylo}tiazolidyno-2,4-dion, 5-[3-(4-chloro-fenylo])-2-propynylo]-5-fenylosulfonylo)tiazolidyno-2,4-dion, 5-[3-(4-chlorofenylo])-2-propynylo]-5-(4-fluorofenylo-sulfonylo)tiazolidyno-2,4-dion, 5-{[4-(2-(metylo-2-pirydynylo-amino)-etoksy)fenylo]metylo}-tiazolidyno-2,4-dion (rosiglita zon), 5-{[4-(2-(5-etylo-2-pirydylo)etoksy)fenylo]-metylo}tiazolidyno-2,4-dion (pioglitazon), 5-{[4-((3,4-dihydro-6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylo-2H-1-benzopirano-2-ylo)metoksy)fenylo]metylo}-tiazolidyno-2,4-dion (troglitazon), 5-[6-(2-fluoro-benzyloksy)naftaleno-2-ylometylo]-tiazolidyno-2,4-dion (MCC555), 5-{[2-(2-naftylo)-benzoksazolo-5-ylo]metylo}tiazolidyno-2,4-dion (T-174) lub 5-(2,4-dioksotiazolidyno-5-ylometylo)-2-metoksy-N-(4-trifluorometylo-benzylo)benzamid (KRP297), typ nie-glitazonowy, jak analog N-(2-benzoilofenylo)-L-tyrozyny np. GI-262570 lub oksolidynodion np. JTT501, podwójny agonista PPARY/PPARa np. DRF-554158, NC-2100 lub NN-622, agonista receptora retinoidu X lub reksinoid np. kwas 2-[1-(3,5,5,8,8-pentametylo-5,6,7,8-tetrahydo-2-naftylo)-cyklopropylo]-pirydyno-5-karboksylowy, kwas 4-[3,5,5,8,8-pentametylo-5,6,7,8-tetrahydro-2-naftylo)-2-karbonylo]-benzoesowy, kwas 9-cis retinowy lub jego analog, pochodna lub farmaceutycznie akceptowana sól, białkowa kinaza fosfatazy tyrozyny 1B, inhibitor syntazy kinazy -3 glukagonu, niepeptydylowy małocząsteczkowy związek mimetyczny insuliny np. L-783,281 lub CLX-901 lub mała dawka insuliny, inhibitor amidotransferazy glutamino:fruktozo-6-fosforanu, inhibitor glukozo-6-fosflatazy, biguanid np. Metformin, inhibitor fruktozo-1,6-bifosfatazy, inhibitor fosforylazy glikogenu np. CP-91149, antagonista receptora glukagonu np. CP-99711, NNC 92-1687, L-168,049 lub BAY27-9955, karboksykinaza fosfoenolopirogronianu, inhibitor kinazy dehydrogenazy pirogronianu, inhibitor α-glukozydazy np. 4,6-didezoksy-4[(1S)-(1,4,6/5)-4,5,6-trihydroksy-3-hydroksymetylo-2-cyklo-heksenyloamino}maltorioza lub O-4,6-didezoksy-4-{(1S,4R,5S,6S]-4,5,6-trihydroksy-3-(hydroksymetylo)-2-cyklohekseno-1-ylo]-amino}-a-D-glukopiranozylo-)1 >4)-O-a-D-glukopiranozylo-(1 >)-D-glukopiranoza (akarboza), N-(1,3-dihydroksy-2-propylo)walioloamina (voglibose) lub miglitol lub inhibitor opróżniania żołądka np. GLP-1, CCK-8 i amylina (np. Pramlitide), środek posiadający działanie anty-angiogenne np. benzoporfiryna np. verteporfin, midostaurin lub 4-pirydylometylo-ftalazyna.

Związek A lub skoniugowany związek A w formie kompleksu może także być stosowany w kombinacji ze środkiem antyproliferacyjnym np. chemioterapeutykiem np. paklitaksel, gemcytabina, cisplatyna, doksorubicyna, 5-fluorouracyl lub taksol, środkiem hormonalnym lub antagonistą np. antyestrogenem, jak letrozol (szczególnie w przypadku raka sutka), antymetabolitem, alkaloidem roślinnym, środkiem modyfikującym reakcję biologiczną korzystnie limfokiną lub interefronami, inhibitorem białkowej kinazy tyrozyny i/lub kinazy seryny/treoniny lub środkiem o innym lub nieznanym mechanizmie działania np. jakimkolwiek epotilonem lub pochodną epotilonu, laktonem makrocyklicznym np. rapamycyną, RAD lub CCI779.

Gdy związek A lub skoniugowany związek A w formie kompleksu jest podawany w połączeniu z innym lekiem, dawki podawanego jednocześnie leku będą oczywiście zróżnicowane w zależności od rodzaju podawanego jednocześnie leku, jego specyficzności, rodzaju leczonej choroby itd. Zastosowane terminy, t.j. jednoczesne podawanie lub skojarzone podawanie i tym podobne oznaczają podawanie wybranych środków terapeutycznych pojedynczemu pacjentowi i oznaczają sposoby leczenia, w których środki niekoniecznie są podawane tą samą drogą lub w tym samym czasie.

Kompozycja farmaceutyczna według wynalazku będzie wybrana w zależności od rodzaju prewencji lub leczenia chorób lub zaburzeń np. kompozycja środka immunosupresyjnego np. do zapobiegania lub leczenia przewlekłego odrzucania przeszczepu, kombinacja środka pobudzającego wyPL 204 161 B1 dzielanie insuliny, środka wzmagającego wydzielanie insuliny, środka uwrażliwiającego na insulinę lub małej dawki insuliny w leczeniu cukrzycy lub jej powikłań, kombinacja środka przeciwzapalnego do zapobiegania lub leczenia chorób lub zaburzeń o charakterze zapalnym, kombinacja ze środkiem posiadającym działanie anty-angiogenne do zapobiegania lub leczenia np. obrzęku lub degeneracji plamki lub raka, kombinacja z lekiem chemioterapeutycznym do stosowania w leczeniu raka.

W sposobie wytwarzania zgodnie z wynalazkiem nie jest istotne, który aminokwas zostanie wybrany do pozycji C-końcowej i rozpoczęcia łańcucha, ponieważ peptyd liniowy będzie poddany cyklizacji, pod warunkiem, że sekwencja aminokwasów w peptydzie liniowym odpowiada sekwencji w związku A. Jednakże inne czynniki mogą wpływać na to, który aminokwas początkowy będzie preferowany. Gdy związek A jest wytwarzany przez syntezę fazy stałej, pierwszy aminokwas jest korzystnie przyłączony do żywicy np. dostępnej na rynku żywicy na bazie polistyrenu, poprzez odpowiedni czynnik łączący, np. czynnik, który jest rozszczepialny w łagodnych warunkach, aby utrzymywać zabezpieczenie łańcucha bocznego w stanie nienaruszonym np. SASRIN lub opcjonalnie podstawiony czynnik na bazie tritylu np. kwas 4-(hydroksydifenylometylo)benzoesowy, w którym jedna grupa fenylowa może być opcjonalnie podstawiona np. przez Cl. Tworzenie pożądanego łańcucha peptydu może być przeprowadzone w sposób konwencjonalny np. przy użyciu jednostek aminokwasowych, w których końcowa grupa aminowa jest zabezpieczona przez Fmoc, grupy aminowe łańcucha bocznego, jeżeli są obecne, są zabezpieczone różnymi zabezpieczającymi grupami aminowymi np. Boc lub CBO. Korzystnie liniowy peptyd jest poddany cyklizacji w taki sposób, aby wytworzyć wiązanie między Tyr(4BZl)-OH i Phe np. Phe-{4-(NHRi-C2H4-NH-CO-O)Pro-}-Phg-DTrp(R2)Liz(8-NHR3)-Tyr(4-Bzl)-OH lub jego funkcjonalną pochodną w której każde R1, R2 i R3 jest aminową grupą zabezpieczającą. Etap cyklizacji a) może dogodnie być przeprowadzony zgodnie ze znanymi sposobami np. poprzez azydek, aktywny ester, mieszany bezwodnik lub karbodiimid. Następnie grupy zabezpieczające są usuwane np. poprzez rozszczepienie np. z trifluorooctanem lub przez uwodornienie.

Cyklizacja peptydu może być również przeprowadzona bezpośrednio na stałym nośniku; pierwszy aminokwas jest w formie zabezpieczonej w pozycji Na i C-końcowej i przyłączony poprzez łańcuch boczny np. funkcję ε-aminową lizyny lub przyłączenie do rdzenia łańcucha. Sekwencja liniowa jest następnie syntetyzowana zgodnie z procedurami syntezy fazy stałej (SPPS). Po rozszczepieniu zabezpieczenia C-końcowego peptyd jest poddawany cyklizacji np. w sposób opisany wyżej. Następnie cykliczny peptyd jest rozszczepiany z żywicy i odbezpieczany.

Jeżeli to pożądane, łańcuch boczny obecny na Pro może być przyłączany do aminokwasu przed lub po etapie cyklizacji a). W ten sposób, Pro jako aminokwas rozpoczynający lub rozpoczynający liniowy lub cykliczny peptyd, w którym w każdym przypadku Pro jest podstawiona pierścieniowo przez OH, może być przekształcany w celu uzyskania związku A lub pożądanej jednostki Pro lub odpowiadającego peptydu liniowego, odpowiednio, w którym Pro jest podstawiona przez NHR1-C2H4-NH-CO-O-.

Kompleksowanie skoniugowanego związku A może być przeprowadzane poprzez reakcję skoniugowanego związku A z odpowiadającym elementem wykrywalnym lub radioterapeutykiem prowadząc do powstania związku np. soli metalu, korzystnie soli rozpuszczalnej w wodzie. Reakcja może być przeprowadzana przez analogię ze znanymi sposobami np. metodami ujawnionymi w Perrin, Organic Ligand, Chemical Data Series 22. NY Pergamon Press(1982); przez Krejcarit and Tucker w Biophys. Biochem. Res. Com. 77; 581 (1977) i przez Wagnera i Welcha, J. Nucl. Med. 20: 428 (1979).

Następujące przykłady ilustrują wynalazek. Wszystkie temperatury podano w °C.

Skróty:

AcOH = kwas octowy

Boc = tert. - butoksy-karbonyl

Bzl = benzyl

CBO - karbobenzoksy

DIPCI = N,N'-diizopropylokarbodiimid

DIPEA = diizopropyloetyloamina

DMF = dimetyloformamid

DPPA = difenylofosforyloazydek

Fmoc = fluoroenylometoksykarbonyl

HOBT = 1-hydroksybenzotriazol

Osu = N-hydroksysukcynimid

PL 204 161 B1

TFA = kwas trifluorooctowy

THF = tetrahydrofuran

P r z y k ł a d 1. Cyklo[{4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Liz-Tyr(4-BzL)-Phe]

a) synteza Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH₂CH₂-NH-Boc)-OH

Chlorowodorek estru metylowego L-hydroksyproliny reaguje z Fmoc-OSu w wodnym 1,0 N węglanie sodu/THF w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji Fmoc-Pro(4-OH)-OMe jest izolowany przez strącanie. Fmoc-Pro(4-OH)-OMe jest następnie dodawany kroplami do roztworu trifosgenu (0,6 ekw.) w THF w celu uzyskania chlorowęglanowego związku pośredniego. Po 1 godzinie dodawana jest dimetyloaminopirydyna (1,0 ekw.) i N-Boc-diaminoetan (6,0 ekw.), a odczynniki mieszane w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik jest usuwany in vacuo, a powstały Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OMe jest ekstrahowany z dwufazowego układu octan etylu/0,1 M HCl w celu otrzymania surowego produktu (MH⁺ = 554), który jest oczyszczany przez krystalizację z octanu etylu. Ester metylowy jest następnie rozszczepiany do wolnego kwasu poprzez reakcję z 1N NaOH w dioksanie/wodzie, a produkt Fmoc-Pro-(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH jest oczyszczany na żelu krzemionkowym, [(M+Na)]⁺ = 562).

b) H-Phe-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-Phg-DTrp(Boc)-Liz(Boc)-Tyr(Bzl)-OH

Dostępna na rynku żywica Fmoc-Tyr(BZl)-O-CH2-Ph(3-OCH3)-O-CH2-polistyren (żywica SASRIN, 2,4 mM) stosowana jest jako materiał wstępny i używana zgodnie ze standardowym protokołem składającym się z powtarzanych cyklów odbezpieczania Na (piperydyna/DMF, 2:8), powtarzanego przemywania za pomocą DMF i sprzęgania (DIPCI: 4:8 mM/HOBT: 6 mM, DMF). Następujące pochodne aminokwasowe są kolejno sprzęgane: Fmoc-Liz(Boc)-OH, Fmoc-DTrp(Boc)-OH, Fmoc-Phg-OH,

Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-OH, Fmoc-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)OH, FmocPhe-OH. Sprzęganie (aminokwasy - 2 ekw.) jest kontynuowane lub powtarzane do końca, tj. do całkowitego zniknięcia resztkowych grup aminowych, co jest monitorowane za pomocą negatywnego testu ninhydrynowego Kaisera. Przed odłączeniem gotowego zabezpieczonego peptydu liniowego od nośnika żywicowego, usuwane jest zabezpieczenie Na-Fmoc z ostatniej reszty.

c) H-Phe-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH-Boc)-Phg-DTrp(Boc)-Liz-Tyr(Bzl)-OH

Po przemyciu za pomocą CH2Cl2, żywica z peptydem jest przenoszona na kolumnę lub mieszany filtr próżniowy i fragment peptydu jest rozszczepiany i wymywany za pomocą krótkiego działania 2% TFA w CH2Cl2 w ciągu godziny. Eluat jest natychmiast neutralizowany za pomocą nasyconego roztworu NaHCO3. Roztwór organiczny jest wyizolowany i odparowywany, a prekursor o zabezpieczonym łańcuchu bocznym (MH⁺ = 1366) poddawany jest cyklizacji bez dalszego oczyszczania.

d) cyklo[-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)Phg-DTrp-Liz-Tyr(Bzl)-Phe-], trifluorooctan

Powyższy liniowy fragment jest rozpuszczany w DMF (4 mM), oziębiany do minus 5°C i poddawany działaniu 2 ekw. DIPEA, następnie 1,5 ekw. DPPA i mieszany aż do zakończenia (około 20 godzin) w 0-4°C. Rozpuszczalnik został prawie całkowicie usunięty in vacuo; koncentrat jest rozcieńczany za pomocą octanu etylu, przemywany NaHCO3, wodą, suszony i odparowywany in vacuo.

W celu odbezpieczenia, reszta jest rozpuszczana w 0°C w TFA/H2O 95:5 (około 50 mM) i mieszana na zimno przez 30 minut. Produkt jest następnie poddawany strącaniu za pomocą eteru zawierającego około 10 ekw. HCl, filtrowany, przemywany eterem i suszony. W celu całkowitego rozłożenia pozostałego kwasu indolo-N-karbaminowego, produkt jest rozpuszczany w 5% AcOH i liofilizowany po 15 godzinach w około 5°C. Preparatywna RP-HPLC jest przeprowadzana na kolumnie STAGROMA C-18 10 μm (5-25 cm) przy użyciu gradientu 0,5% TFA do 0,5% TFA w 70% acetonitrylu. Frakcje zawierające czysty związek tytułowy są łączone, rozcieńczane wodą i liofilizowane. Liofilizat jest rozpuszczany w wodzie, następnie przeprowadzane jest strącanie za pomocą 10% Na2CO3 w wodzie. Stała wolna zasada jest filtrowana, przemywana wodą i suszona w próżni w temperaturze pokojowej. Powstały biały proszek jest bezpośrednio używany do różnych soli.

P r z y k ł a d 2. Cyklo[{4-(NH₂-C₂H₄-NH-CO-O-)-Pro}-Phg-DTrp-Liz-Tyr(4-Bzl)-Phe] w formie soli

a) Octan

Konwersja do formy soli octanowej jest przeprowadzana przy użyciu żywicy jonowymiennej (np. AG 3-X4). MS(ESI): m/z 524.5[M+2H]²+ [a]_D ²⁰ = -42°, c = 0,26 w AcOH 95%.

b) Asparaginian

Konwersja do mono- lub di-asparaginianu uzyskiwana jest na drodze reakcji 1 ekwiwalentu związku z przykładu 1 z 1 lub 2 ekwiwalentami kwasu asparaginowego w mieszaninie acetonitryl/woda 1:3. Powstała mieszanina jest zamrażana i liofilizowana. Di-asparaginian może być również uzyskany poprzez rozpuszczenie związku z przykładu 1 w wodzie/acetonitrylu 4:1, filtrowanie, załaPL 204 161 B1 dowanie na żywicy jono-wymiennej np. kolumnie BioRad AGX4, wymywanie za pomocą wody/acetonitrylu 4:1. Eluat jest koncentrowany, zamrażany i liofilizowany. [a]D²⁰ = -47,5°, c = 2,5 mg/ml w metanolu.

c) Benzoesan

Konwersja do benzoesanu może być uzyskana przez rozpuszczenie związku z przykładu 1 za pomocą 2 ekwiwalentów kwasu benzoesowego w mieszaninie acetonitryl/woda 1:2. Powstała mieszanina jest zamrażana i liofilizowana.

d) Embonian ekwiwalent związku z przykładu 1 jest rozpuszczany za pomocą 1 ekwiwalentu kwasu embonowego w mieszaninie acetonitryl/THF/woda 2:2:1. Powstała mieszanina jest zamrażana i liofilizowana.

P r z y k ł a d 3. Cyklo[{4-(DOTA-NH-C2H4-NH-CO-O-)Pro}-Phg-DTrp-Liz-Tyr(4-Blz)-Phe

a) cyklo[Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)-Phg-DTrp-Liz(Cbo)-Tyr(Bzl)-Phe-], trifluorooctan

Związek jest syntetyzowany w ten sam sposób, jak cyklo[-Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)-Phg-DTrp-Liz(Cbo)-Tyr(Bzl)-Phe-], trifluorooctan przy użyciu Fmoc-Liz(Cbo)-OH zamiast Fmoc-Liz(Boc)-OH.

b) 400 mg dostępnego na rynku DOTA x 2H2O (SYMAFEX, Francja) jest rozpuszczane w 20 ml wody. Po dodaniu 20 ml DMF, dodawane jest 170 mg cyklo[Pro(4-OCO-NH-CH2-CH2-NH2)-Phg-DTrpLiz(CBO)-Tyr(Bzl)-Phe-] razem z 190 mg DCCI i 60 mg N-hydroksysukcynoimidu. Powstała zawiesina jest trzymana w temperaturze pokojowej przez 72 godziny. Po filtracji rozpuszczalnik jest usuwany pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostały surowy produkt jest oczyszczany na żelu krzemionkowym (DCM/MeOH/HOA_C50%8/2/0,25 >7/3/1 jako faza ruchoma.

c) W celu odbezpieczenia powyższego DOTA - koniugat jest poddawany działaniu 5 ml kwasu trifluorooctowego/tioanizolu (9/1) przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór jest wlewany do mieszaniny 100 ml dietyloeteru + 5 ml 3N HCl/dietyloeteru i powstały precypitat jest izolowany przez filtrację. Oczyszczanie jest przeprowadzane na żelu krzemionkowym przy użyciu DCM/MeOH/HOAC50%7/4/2>7/5/4 jako faza ruchoma. Analitycznie czysty produkt końcowy jest otrzymywany po etapie odsolenia przy użyciu 0,1% TFA do 0,1% TFA w 90% gradiencie CH3CN na kolumnie RP18-HPLC (Spherisorb 250 x 4,6 mm). MH⁺: 1434.7

Związek A w wolnej formie lub w formie farmaceutycznie akceptowalnych soli i kompleksów wykazuje wartościowe właściwości farmakologiczne, co wykazano w testach in vitro i in vivo i dlatego jest wskazany do stosowania w terapii.

W szczególności, związek A wykazuje interesujący profil wiązania z ludzkimi receptorami somatostatyny (hsst), szczególnie w odniesieniu do hsst1, hsst2, hsst3 i hsst5. 5 podtypów receptora somatostatyny, sst1, sst2, sst4 i sst5 sklonowano i scharakteryzowano, hsst1, hsst2 i hsst3 i ich sekwencje zostały ujawnione przez Y.Yamada i wsp. W Proc. Nat. Acad. Sci., 89, 251-255(1992). hsst4 i jego sekwencje zostały ujawnione przez L.Rohrera i wsp. W Proc. Acad. Sci. 90, 4196-4200 (1993). hsst5 i jego sekwencja została opisana przez R. Panetta i wsp. W Mol. Pharmacol. 45, 417-427, 1993.

Testy wiązania mogą być przeprowadzone jak ujawniono poniżej przy użyciu membran linii komórkowych, w których zachodzi selektywna i stabilna ekspresja hsst1, hsst2, hsst3, hsst4 lub hsst5 np. komórkach CHO lub COS.

Błony są przygotowywane według znanych sposobów np. jak sposoby ujawnione przez C. Burns i wsp. W Biochem, J. 1990, 65 str. 39-44. Błony przygotowane z linii komórkowych selektywnych względem hsst np. komórek CHO lub COS, w których zachodzi stabilna ekspresja hsst1 lub hsst2 lub hsst3 lub hsst4 lub hsst5 są inkubowane w trzech powtórzeniach, w całkowitej ilości 300 μl w 22°C przez 30 minut przy wzrastających stężeniach [¹²⁵I-Tyr¹¹]-SRIF-14 w 10 mmol/l buforu Hepes (pH 7,6) zawierającego 0,5% BSA. Inkubacja jest przerywana przez gwałtowną filtrację i filtry są liczone za pomocą licznika. Wiązanie specyficzne to wiązanie całkowite minus wiązanie niespecyficzne w obecności 1 gmol/l somatostatyny-14. Eksperymenty są przeprowadzane potrójnie. Stała powinowactwa (KD) i liczba miejsc wiązania obliczana jest przy użyciu odpowiednich programów statystycznych i graficznych.

Związek A wykazuje wartości IC50 w powyższych testach wiązania hsst1, hsst2, hsst3 i /lub hsst5 w zakresie nanomolowym, korzystnie IC50 od 0,1 do 10 nM (IC50 = stężenie połowy maksymalnego zahamowania w teście wiązania kompetycyjnego przy użyciu [¹²⁵I-Tyr¹¹]-SRIF-14 jako ligandu znakowanego izotopowo specyficznego dla hsst-5.

PL 204 161 B1

IC50

	Hsst1	hsst2	hsst3	hsst4	hsst5
Związek A	9,3 nM±0,1	1,0 nM±0,1	1,5nM±0,3	>100 nM	1,16nM±0,1

Związek A również wiąże się z receptorami pobudzającymi wydzielanie hormonu wzrostu. Receptory takie zostały ujawnione przez G. Muccioli i wsp., J.Endocrinol. 1998, 157, 99-106, przez H. Ong i wsp. w Endocrinology 1998, 139, 432-435 i przez R.G. Smith i wsp., Horm. Res., 1999, 3), 1-8. Test wiązania do tych receptorów może być przeprowadzony sposobem ujawnionym w J. Endocrinol. Invest, 24: RC1-RC3, 2001. W tym teście związek A wypiera ¹²⁵I-Tyr-Ala-heksarelinę. Związek jest zgodnie z tym użyteczny w modulowaniu aktywności receptorów pobudzających wydzielanie hormonu wzrostu, co wskazuje na jego możliwą rolę w zwiększaniu masy ciała lub regulacji metabolicznej.

Co więcej, związek A wykazuje aktywność hamującą uwalnianie GH, na co wskazuje hamowanie uwalniania GH in vitro z hodowanych komórek przysadki. Na przykład przednie gruczoły przysadkowe dorosłych samców szczurów tnie się na małe kawałki i sporządza zawiesinę przy użyciu 0,1% trypsyny w 20 mM buforu HEPES. Rozproszone komórki są hodowane przez 4 dni w MEM (GIBCO) uzupełnionym 5% surowicą płodów cieląt, 5% surowicą końską 1 mM NaHCO3, 2,5 nM deksametazonu, 2,5 mg/ml insuliny i 20 j/ml Pen/Strep. W dniu eksperymentu dołączone komórki są przemywane dwa razy roztworem Krebsa-Ringera zbuforowanym 20 mM HEPES i uzupełnione 5 mM glukozy -10 i 0,2% BSA. Następnie komórki są inkubowane przez 3 godziny ze związkiem A w obecności 3x10^-10 czynnika uwalniającego hormon wzrostu. Ilość hormonu wzrostu uwolnionego do podłoża jest mierzona za pomocą RIA. IC50 związku A w tym teście wynosi 0,4 nM.

Związek A hamuje uwalnianie hormonu wzrostu (GH) u szczurów. Związek A jest podawany podskórnie znieczulonym szczurom. Krew jest pobierana po dekapitacji w godzinę po podaniu związku. Czas działania jest oceniany na podstawie hamowania podstawowego wydzielania GH w sześć godzin po podaniu leku. Poziomy hormonu są mierzone za pomocą RIA po 1 i 6 godzinach po podaniu leku. Wartość ID50 dla hamowania wydzielania hormonu jest określana graficznie (log-probit) dla każdego eksperymentu i otrzymane wartości są uśredniane logarytmicznie. W tym modelu in vivo związek A znacząco hamuje uwalnianie hormonu wzrostu wykazując długotrwałe działanie (średnie podstawowe ID₅₀ = 5,5 μg/kg podskórnie po 6 godz.). W podobnym teście badającym wpływ na insulinę, związek A hamuje wydzielanie insuliny.

Silne i skuteczne hamowanie GH było również potwierdzone w badaniach na małpach. Co więcej, badania metaboliczne u małp chorych na cukrzycę wykazały silne działanie przeciwcukrzycowe/uwrażliwiające na insulinę związku A.

Co więcej, związek A hamuje poziom IGF-1 w osoczu in vivo, co wykazały standardowe testy na samcach szczurów. W skrócie, związek A był podawany za pomocą pompy osmotycznej wszczepionej podskórnie samcom szczurów szczepu Lewis. Próbki krwi były pobierane ze splotu pozaopuszkowego przy zastosowaniu krótkotrwałego znieczulenia za pomocą izofluranu. W tym teście związek A znacząco obniża poziom IGF-1 w osoczu wykazując długotrwałe działanie: np. ponad 60% efektu hamującego obserwowane jest po 14 dniach stosowania 10 μg/kg/godz. związku A. W szczególności, nie obserwuje się efektu ucieczki po ciągłym leczeniu szczurów, które otrzymały alloprzeszczepy aorty lub nerki i ciągłe wlewy związku A w dawce 10 μg/kg/godz. przez okres do 126 dni, co wywoływało znaczące i trwałe obniżenie poziomu IGF-1 w osoczu.

Zgodnie z tym, związek A jest użyteczny w zapobieganiu lub leczeniu zaburzeń, których etiologia obejmuje lub ma związek z nadmiernym wydzielaniem GH i/lub nadmiarem IGF-1 np. w leczeniu akromegalii, jak również w leczeniu cukrzycy typu I i II, szczególnie ich komplikacji, np. angiopatii, cukrzycowej proliferacyjnej retinopatii, cukrzycowego obrzęku plamki żółtej, nefropatii, neuropatii i nocnego lub porannego wzrostu poziomu glukozy we krwi (dawn phenomenon) i innych zaburzeń metabolicznych związanych z uwalnianiem insuliny lub glukagonu np. otyłości, np. chorobliwej otyłości lub podwzgórzowej lub hiperinsulinemicznej otyłości. Związek A jest również użyteczny w leczeniu przetok jelitowo-skórnych i trzustkowo-skórnych, zespołu drażliwego jelita, chorób o podłożu zapalnym np. choroby Grave'sa, zapalenia jelit, łuszczycy lub reumatoidalnego zapalenia stawów, torbielowatości nerek, zespołu poresekcyjnego żołądka, zespołu wodnistej biegunki, biegunki związanej z AIDS, biegunki wywołanej chemioterapią ostrego lub przewlekłego zapalenia trzustki i guzów przewodu pokarmowego wydzielających hormony (np. guzy GEP, na przykład guzy wewnątrzwydzielnicze trzustki,

PL 204 161 B1 guzy trzustki wydzielające glukagon, gruczolaki wysepkowatokomórkowe, rakowiaki i tym podobne), nowotwory limfocytów np. chłoniaki i białaczki, rak komórek wątrobowych, jak również krwawienia z przewodu pokarmowego np. krwawienia żylaków przełyku.

Związek A jest również użyteczny w leczeniu guzów, które są pozytywne dla receptora somatostatyny np. guzów z hsst1, hsst2, hsst3 i/lub hsst5, jak wykazują różne testy proliferacji z różnymi kliniami komórek nowotworowych posiadających takie receptory somatostatyny.

Linia komórek guza trzustki szczurów AR42J otrzymywana jest z wewnątrzwydzielniczego guza trzustki indukowanego azaseryną (Jessop i Hay, 1980). Kultury komórkowe wolne od mykoplazm są reprodukowane w DMEM uzupełnionym 10% bydlęcą surowicą płodową (FCS) w 5% CO2. Komórki są hodowane bez antybiotyków lub środków przeciwgrzybiczych. Zrastające się komórki AR42J są poddawane działaniu trypsyny, rozcieńczane w DMEM +2,5% FCS i wysiewane na niepokryte szalki z 96 studzienkami. Po 48 godzinach inkubacji (dzień 0) liczba komórek w oddzielnej szalce kontrolnej jest ustalana zarówno przez liczenie komórek licznikiem Coultera, jak i przez test kolorymetryczny SRB. Komórki są następnie poddawane działaniu związku A przez 2 do 5 dni w różnych stężeniach i potem liczone. Związek A hamuje proliferację komórek guza w stężeniach w zakresie od 10^-12 do 10^-6 M.

Badania wzrostu guza in vivo.

Samice myszy nagich ważące 19-22 g są trzymane w grupach po 5 osobników i mają swobodny dostęp do wody i wolnej od patogenów karmy dla gryzoni. Podskórne guzy są inicjowane hodowanymi komórkami AR42J. Leczenie rozpoczyna się po 2-4 dniach po wszczepieniu komórek guza, związek A jest podawany w formie ciągłej infuzji np. w dawce 10 do 50 μg/kg/godz. Wielkość guza mierzona jest suwmiarką. Obliczenia statystyczne wykonywane są przy pomocy testu t - Studenta. W tym teście związek A hamuje wzrost guza w dniu 11 o 51% w porównaniu kontrolą (podanie soli).

Związek A jest użyteczny w leczeniu złośliwych chorób związanych z proliferacją komórek np. złośliwych guzów nowotworowych, szczególnie guzów posiadających receptory typu receptorów somatostatyny, do których posiada powinowactwo wiązania np. jak ujawniono tu dla kompleksowego skoniugowanego związku A.

Związek A wpływa również hamująco na angiogenezę, co wykazano w standardowych testach np. u myszy nagich. W skrócie, komórki guza (0,1 do 10 x 10⁶ w 0,1 ml) (komórki SiHa i komórki MDA MB-231 przygotowane jak ujawniono w Angiogenesis, Ed. by R. Steiner, P.B. Weisz I R. Langer, 1992, Szwajcaria) są wszczepiane podskórnie. Zazwyczaj iniekcje są wykonywane w dwa środkowobrzuszne miejsca u każdej myszy umiejscowione daleko od głównych naczyń skórnych tak, że liczba naczyń w podłożu jest mała. Grupy kontrolne otrzymują 0,1 ml 0,02% błękitu trypanu w PBS. W 10 dni po iniekcji, znieczulone myszy są uśmiercane za pomocą inhalacji CO2. Skóra jest umieszczana na plastikowej obręczy (40 mm średnicy) w celu oceny pod mikroskopem inwersyjnym (Zeiss IM) w powiększeniu 12,5 i 25 razy. W celu oceny angiogenezy, fotografowane i liczone są tylko te naczynia, które są bezpośrednio połączone z guzem. U zwierząt kontrolnych liczone są naczynia, które są połączone z określoną powierzchnią wokół miejsca iniekcji. Ta powierzchnia odpowiada średniej powierzchni guzów skórnych i mierzona za pomocą suwmiarki zgodnie z równaniem 3,14 x r². Związek A jest podawany podskórnie albo w dniu wszczepienia guza, albo 3 dni później. Zwierzęta kontrolne otrzymują zaróbkę. W tym teście związek A hamuje formowanie naczyń, gdy jest podawany np. w dawce 0,01 do 1000 μg/kg podskórnie.

Związek A jest użyteczny w zapobieganiu lub leczeniu angiogenezy, chorób o podłożu zapalnym, jak wskazano powyżej włącznie z zapalnymi chorobami oka, obrzękiem plamki żółtej np. torbielowatym obrzękiem plamki żółtej, idiopatycznym torbielowatym obrzękiem plamki żółtej, wysiękową związaną z wiekiem degeneracją plamki żółtej, chorobami związanymi z neounaczynieniem naczyniówki i retinopatie proliferacyjną.

Związek A wywiera również wpływ hamujący na proliferację i migrację komórek mięśni gładkich, co wykazano w następujących testach.

Przewlekłe odrzucenie alloprzeszczepu.

Nerka samca szczura DA (RT1^a) jest ortotopowo przeszczepiana samcowi Lewis (RT1¹). W sumie transplantacji poddawane są 24 zwierzęta. Wszystkim zwierzętom podawana jest cyklosporyna A w dawce 7,5 mg/kg/dziennie doustnie przez 14 dni licząc od dnia przeszczepu w celu prewencji ostrego odrzucenia komórkowego. Nie usuwa się drugiej nerki. Każda grupa eksperymentalna otrzymująca dawkę związku A lub placebo zawiera 6 zwierząt. Po 14 dniach od przeszczepu zwierzęta otrzymują przez okres do 112 dni związek A w infuzji lub placebo. Po 14 dniach od przeszczepu badana jest perfuzja narządów za pomocą MRI. Jest to powtarzane w dniach 53-64 po przeszczepie

PL 204 161 B1 i na końcu eksperymentu. Zwierzęta są następnie poddawane autopsji. Podanie związku A w dawce 10 μg/kg/godz. w tym modelu alloprzeszczepu nerki u szczurów powoduje poprawienie perfuzji, jak również zmniejszenie związanej z przewlekłym odrzuceniem przebudowy naczyń i infiltracji przeszczepu (odrzucenie komórkowe). Stwierdzono również znaczący i trwały spadek poziomu IGF-1. Te wyniki zostały potwierdzone w drugim zestawie eksperymentów przy użyciu modelu heterotopowego przeszczepienia serca u myszy, które wykazały korzystny wpływ na przebudowę naczyń, jak również infiltrację przeszczepu.

Związek A badano także na modelu przeszczepienia pętli tętnicy szyjnej przy użyciu myszy B10.A(2R)(H-2h²) jako dawcy i myszy B10.BR(H-2^k) jako dawcy. W skrócie, tętnica szyjna dawcy jest przeszczepiana paratopowo jako pętla do tętnicy szyjnej dawcy poprzez wytworzenie zespolenia końcowo-bocznego. Mini-pompa jest umieszczana podskórnie natychmiast po przeszczepie; dostarcza ona związek A z szybkością 50 μg/kg/godz. Przeszczepy tętnicy szyjnej są pobierane po 30 dniach po transplantacji w celu analizy przebudowy naczyń np. morfometrycznej analizy wycinków parafinowych barwionych elastyną Verhoeff'a przy użyciu systemów komputerowych. W tym modelu związek A hamuje formowanie nowej błony wewnętrznej naczynia w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, u których formowana jest masywna nowa wewnętrzna błona naczyniowa.

Angioplastyka

Badania nad angioplastyką są wykonywane na modelu uszkodzenia kateterem balonikowym u szczurów. Kateteryzacja przy wykorzystaniu cewnika balonikowego wykonywana jest w dniu 0, zasadniczo jak opisano przez Powell i wsp. (1989). W znieczuleniu izofluranem kateter Fogarty 2F wprowadzany jest do lewej tętnicy szyjnej wspólnej w celu uzyskania jednorodnego uszkodzenia śródbłonka. Następnie kateter jest usuwany, wokół zewnętrznej tętnicy szyjnej założony jest szew w celu zapobieżenia krwawieniu, a zwierzęta pozostawia się do wyzdrowienia. Dwie grupy 12 szczurów RoRo (400 g, wiek około 24 tygodni) są używane w badaniu: jedna grupa kontrolna i jedna grupa otrzymująca związek A, a szczury są całkowicie randomizowane. Związek A jest podawany w ciągłej infuzji przy użyciu mini-pomp w tempie 10 μg/kg godz. począwszy od 2 dnia przed wprowadzeniem kateteru (dzień 3) do końca badania, 14 dni po wprowadzeniu kateteru. Następnie szczury są znieczulane izofluranem i perfundowane za pomocą 0,1 M roztworu soli buforowanej fosforanem (PBS, pH

7.4) i następnie przez 15 minut za pomocą 2,5% aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym (pH

7.4) . Następnie tętnice szyjne są wycinane, separowane od otaczających tkanek i zanurzane w 0,1 M buforze kakodylanowym (pH 7,4) zawierającym 7% sacharozę i inkubowane przez noc w 4°C. Następnego dnia tętnice szyjne są zanurzane w Technovit 7100 zgodnie z zaleceniami producenta. Przekroje powierzchni błony środkowej, nowej błony wewnętrznej naczynia i światła naczynia są oceniane morfometrycznie za pomocą systemu analizy obrazu (MCID, Toronto, Kanada). W tym teście związek A znacząco hamuje pogrubianie nowej błony wewnętrznej naczynia.

Związek A jest również użyteczny w zapobieganiu lub zwalczaniu chorób naczyń przeszczepów np. chorób naczyń alo- lub ksenoprzeszczepów np. miażdżycy naczyń przeszczepów np. w przeszczepie narządu np. serca, płuc, łącznie serca i płuc, wątroby, nerki lub trzustki lub w zapobieganiu lub leczeniu zwężenia żył przeszczepu, nawrotu zwężenia i/lub zamknięcia naczyń na skutek ich zranienia np. spowodowanego procedurami kateteryzacji lub inwazyjnymi procedurami, jak przezskórna angioplastyka, leczenie laserem lub innymi inwazyjnymi procedurami, które zaburzają integralność błony wewnętrznej naczyń lub śródbłonka.

Związek A posiada korzystny okres półtrwania w osoczu. Posiada on okres połowicznej eliminacji pomiędzy 15 a 30 godzin.

Oczywiście dla wszystkich powyższych wskazań wymagane dawkowanie będzie zróżnicowane w zależności np. od biorcy, sposobu podawania i nasilenia leczonego schorzenia. Jednak ogólnie, zadawalające wyniki uzyskiwane są przez podanie od 1 μg do 0,7 mg/kg/dziennie związku A. Zalecana dzienna dawka dla pacjentów znajduje się w granicach od około 2 μg do około 50 μg, korzystnie około 0,01 do około 40 mg, np. około 0,01 do około 3 mg podskórnie związku dogodnie podawanego w dawkach podzielonych do 3 razy dziennie w jednostkowej formie dawkowania zwierającej np. od około 0,5 μg do około 25 mg, np. od około 2 μg do 20 mg, np. od 2 μg do 1,5 mg związku A.

Związek A może być podawany w formie wolnej lub w formie farmaceutycznie akceptowalnych soli lub kompleksów. Takie sole i kompleksy mogą być przygotowywane w sposób konwencjonalny i wykazywać taką samą aktywność, jak wolny związek. Przedmiotem wynalazku jest również preparat farmaceutyczny zawierający związek A w formie wolnej zasady lub farmaceutycznie akceptowanej soli lub kompleksu razem z jednym lub więcej farmaceutycznie akceptowalnymi rozcieńczalnikami lub

PL 204 161 B1 nośnikiem. Takie preparaty mogą być tworzone w sposób konwencjonalny. Związek A może także być podawany w formie o przedłużonym uwalnianiu np. w formie implantów, mikrokapsułek, mikrosfer lub nanosfer zawierających np. biodegradowalny polimer lub kopolimer, w formie liposomowej lub w formie autożelu np. preparatu stałego lub półstałego zdolnego do tworzenia żelu na skutek interakcji z płynami ustrojowymi pacjenta.

Związek A lub jego farmaceutycznie akceptowalna sól lub kompleks może być podawany w jakikolwiek konwencjonalny sposób np. pozajelitowo np. w formie roztworów lub zawiesin do wstrzykiwań (włącznie np. z formą o przedłużonym uwalnianiu, jak wskazano powyżej), doustnie przy użyciu konwencjonalnego środka nasilającego absorpcję, w formie donosowej lub w formie czopka lub miejscowo np. w formie płynu do oczu, żelu, maści lub zawiesiny np. preparatu liposomowego, mikrosfer lub nanosfer np. do wkraplania lub podawania podspojówkowego, wewnątrz- lub okołogałkowego.

Claims (13)

1. Cykloheksapeptydowy analog somatostatyny o wzorze:

w którym jedna z grup aminowych jest opcjonalnie w formie zabezpieczonej, lub jego sól lub kompleks.

2. Związek według zastrz. 1 w formie niezabezpieczonej, w formie soli.

3. Związek według zastrz. 2 jako mono- lub disól.

4. Związek według zastrz. 3 w formie octanu, benzoesanu, asparaginianu lub embonianu.

5. Związek według zastrz. 1, w którym grupa aminowa proliny w łańcuchu bocznym jest skoniugowana ze środkiem chelatującym, opcjonalnie skompleksowanym z elementem wykrywalnym lub radioterapeutycznym.

6. Sposób otrzymywania związku określonego w zastrz. 1 obejmujący cyklizację liniowego peptydu w formie zabezpieczonej, związanej z polimerem lub niezabezpieczonej do uzyskania pożądanego związku, a następnie opcjonalnie usuwa się grupę (grupy) zabezpieczające do uzyskania pożądanego związku w formie wolnej lub w formie soli.

7. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca związek określony w zastrz. 1 lub jego farmaceutycznie akceptowaną sól w połączeniu z jednym lub większą liczbą farmaceutycznie akceptowalnych rozcieńczalników lub nośników.

8. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7 w formie o przedłużonym uwalnianiu lub formie do stosowania miejscowego.

9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 7 do stosowania w kombinacji ze środkiem immunosupresyjnym, środkiem przeciwzapalnym, środkiem modulującym receptor pobudzający wydzielanie GH, antagonistą receptora GH, środkiem pobudzającym wydzielanie insuliny, środkiem wzmagającym wydzielanie insuliny, środkiem uwrażliwiającym na insulinę, małą dawką insuliny, środkiem posiadającym działanie anty-angiogenne lub środkiem chemioterapeutycznym.

10. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do leczenia przetok jelitowo-skórnych lub trzustkowo-skórnych, zespołu drażliwego jelita, chorób i zaburzeń o charakterze zapalnym, torbielowatości nerek, zespołu poresekcyjnego żołądka, zespołu wodnistej biegunki, biegunki związanej z AIDS,

PL 204 161 B1 biegunki wywołanej chemioterapią, ostrego lub przewlekłego zapalenia trzustki, krwawienia z przewodu pokarmowego, guzów i nowotworów złośliwych, angiogenezy, obrzęku plamki, zaburzeń związanych z neouwaskularyzacją naczyniówki, proliferacyjnej retinopatii, chorób naczyń przeszczepu, zwężenia naczyń przeszczepu, powtórnego zwężenia i/lub zamknięcia naczynia na skutek uszkodzenia naczynia.

11. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia akromegalii.

12. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1 do wytwarzania leku do leczenia guzów przewodu pokarmowego wydzielających hormony.

13. Zastosowanie według zastrzeżenia 12 gdzie guzem przewodu pokarmowego wydzielającym hormony jest guz rakowiaka.