PL197813B1

PL197813B1 - Kompozycja farmaceutycznej jednostki dawkowania zawierająca inhibitor fosfodiesterazy i jej zastosowanie

Info

Publication number: PL197813B1
Application number: PL352629A
Authority: PL
Inventors: William Ernest Pullman; John Steven Whitaker
Original assignee: Lilly Icos Llc
Priority date: 1999-04-30
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2008-04-30
Also published as: ITMI20000922A1; FI20000976A0; SK285415B6; HK1041204B; JP2000336043A; DE60005940T2; CN1292264A; ZA200002058B; AU769946C; PE20010071A1; HUP0200912A3; SV2002000055A; HRP20000243A2; EA200000355A3; CA2371684C; CA2307101A1; IL146098A0; DE60005940D1; CH1173181H1; WO2000066099A3

Abstract

1. Kompozycja farmaceutycznej jednostki dawkowania zawieraj aca inhibitor fosfodiesterazy o wzorze strukturalnym (I), znamienna tym, ze zawiera od 1 do 20 mg zwi azku o wzorze (I) i jest odpowiednia do podawania doustnego w mak- symalnej dawce ca lkowitej do 20 mg dziennie. 15. Zastosowanie jednostki dawkowania zawieraj acej od 1 do 20 mg zwi azku o wzorze do wytwarzania leku do podawania w maksymalnej ca lkowitej dawce dziennej do 20 mg, przeznaczonego do leczenia dysfunkcji seksualnych u wymagaj acego takiego leczenia pacjenta. PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej jednostki dawkowania zawierającej wysoce selektywny inhibitor enzymu fosfodiesterazy (PDE) i zastosowania terapeutycznego tej jednostki dawkowania. W szczególności wynalazek dotyczy silnego inhibitora fosfodiesterazy typu 5, specyficznego wobec cyklicznego 3',5'-monofosforanu guanozyny (PDE5), który, w postaci produktu farmaceutycznego, jest przydatny do leczenia dysfunkcji seksualnych. Opisaną jednostkę dawkowania charakteryzuje selektywność hamowania PDE5, zapewniająca korzystne skutki w obszarach terapeutycznych, w których wymagane jest hamowanie PDE5, przy minimalizowaniu lub eliminowaniu niepożądanych działań ubocznych wynikających z hamowania innych enzymów fosfodiesterazy.

Działanie biochemiczne, fizjologiczne i kliniczne inhibitorów fosfodiesterazy specyficznej wobec cyklicznego 3',5'-monofosforanu guanozyny (PDE cGMP-specyficznej) sugeruje ich przydatność w szeregu różnych stanów chorobowych, w których pożądane jest modulowanie funkcji mięśni gładkich, nerek, hemostatycznych, zapalnych i/lub endokrynologicznych. Fosfodiesteraza cGMP-specyficzna typu 5 (PDE5) stanowi główny enzym hydrolizujący cGMP w mięśniach gładkich naczyń, i obserwowano jej ekspresję w ciałach jamistych prącia (Taher i in., J. Urol., 149:285A (1993)). Zatem PDE5 stanowi atrakcyjny cel w leczeniu dysfunkcji seksualnych (Murray, DN&P 6(3):150-56 (1993)).

Produkt farmaceutyczny dostarczający inhibitora PDE5 jest aktualnie dostępny i sprzedawany pod nazwą handlową VIAGRA®. Składnik aktywny VIAGRA® stanowi sildenafil.

Produkt ten jest sprzedawany w postaci gotowego produktu zawierającego tabletki sildenafilu 25, 50 i 100 mg i ulotkę informacyjną. Ulotka zawiera informację, że siidenafii jest silniejszym inhibitorem PDE5 niż innych znanych fosfodiesteraz (ponad 80-krotnie dla hamowania PDE1, ponad 1000-krotnie dla hamowania PDE2, PDE3 i PDE4). Wartość IC₅0 sildenafilu wobec PDE5 oznaczono na 3 nM (Drugs of the Future, 22(2), str. 138-143 (1997)) i na 3,9 nM (Boolel i in., Int. J. of Impotence Res., 8, str. 47-52 (1996)). Sildenafil określa się jako posiadający 4000-krotnie wyższą selektywność wobec PDE5 w porównaniu do PDE3 i jedynie 10-krotnie wyższą selektywność wobec PDE5 w porównaniu do PDE6. Jego relatywny brak selektywności wobec PDE6 stanowi teoretyczną podstawę nieprawidłowości odnoszących się do widzenia w kolorze.

Chociaż sildenafil odniósł znaczący sukces handlowy, wkrótce zainteresowanie nim spadło z powodu znaczących niepożądanych działań ubocznych, w tym uderzeń gorąca na twarzy (częstotliwość występowania 10%). Niepożądane działania uboczne ograniczają możliwość stosowania sildenafilu przez pacjentów cierpiących na zaburzenia wzroku, nadciśnienie i przede wszystkim przez osobników stosujących azotany organiczne (Welds i in., Amer. J. of Cardiology, 83(5A), str. 21(C)-28(C) (1999)).

Stosowanie sildenafilu przez pacjentów przyjmujących azotany organiczne powoduje znaczący klinicznie spadek ciśnienia krwi, mogący doprowadzić do stanu zagrożenia pacjenta. Zgodnie z tym, opakowanie sildenafilu zawiera ścisłe oznakowanie o przeciwwskazaniach do stosowania go w połączeniu z organicznymi azotanami (na przykład nitrogliceryną, monoazotanem izosorbidu, diazotanem izosorbidu, tetraazotanem erytrytylu) i innymi donorami tlenku azotu w jakiejkolwiek formie, zarówno stale jak i okresowo, ze względu na to, że sildenafil wzmacnia hipotensyjne działanie azotanów. Patrz C.R. Conti i in., Amer. J. of Cardiology, 83(5A), str. 29(C)-34(C) (1999). Zatem, nawet przy dostępności sildenafilu, pozostaje potrzeba wprowadzenia ulepszonych produktów farmaceutycznych przydatnych do leczenia dysfunkcji seksualnych.

W opisie patentowym USA nr 5859006 Daugan ujawnił pewne pochodne tetracykliczne, będące silnymi inhibitorami PDE cGMP-specyficznej lub PDE5. Podano, że IC₅₀ związków ujawnionych w tym opisie jest zawarte w zakresie od 1 nM do 10 pM. Dawka doustna takich związków wynosi 0,58 mg dziennie dla przeciętnego dorosłego pacjenta (70 kg). Tak więc, opisano jednostki dawkowania (tabletki lub kapsułki) zawierające 0,2 do 400 mg składnika czynnego. Nie ujawniono znaczących działań ubocznych przypisywanych związkom ujawnionym w opisie patentowym USA nr 5859006.

Zgłaszający stwierdził, że jedna z takich pochodnych tetracyklicznych, (6R,12aR)-2,3,6,7,12,12a-heksahydro-2-metylo-6-(3,4-metylenodioksyfenylo)pirazyno[2',1':6,1]pirydo-[3,4-b]-indolo-1,4-dion, alternatywnie nazywana (6R-trans)-6-(1,3-benzodioksol-5-iio))2,3,6,7,12,12a-heksahydro-2-metylopirazyno[1',2':1,6]pirydo[3,4-b]indolo-1,4-dion, i określana tu jako związek (I), może być podawana w dawce jednostkowej, która zapewnia skuteczność leczenia bez działań ubocznych towarzyszących obecnie sprzedawanemu inhibitorowi PDE5, sildenafilowi.

W publikacji WO 95/19978 ujawniono wprawdzie związek o wzorze (I), ale nie ujawniono ani nie sugerowano jego zastosowania do wytwarzania leku przeznaczonego do leczenia dysfunkcji seksualnych.

PL 197 813 B1

W publikacji WO 97/03675 także ujawniono związek (I) i szeroki zakres zastosowania tego związku (od 0,2 do 400 mg do podawania kilka razy dziennie), z przykładami ujawniającymi wyłącznie dawki 50 mg. Nie ma tu jednak wzmianki ani nawet sugestii odnośnie do możliwości stosowania dawek niższych niż 50 mg. Publikacja WO 97/03675 nie zawiera pouczenia, że dawka leku mniejsza niż 50 mg mogłaby przynieść pożądany skutek terapeutyczny, a jednocześnie nie powodować przykrych, uciążliwych skutków ubocznych. Przed niniejszym wynalazkiem takie działania uboczne uważano za nieodłącznie związane z hamowaniem PDE5.

Badania kliniczne przeprowadzone przez zgłaszającego ujawniły także, co istotne, że można dostarczyć skutecznego produktu, mającego zmniejszoną tendencję do powodowania uderzeń gorąca u podatnych osobników. Co najbardziej nieoczekiwane, produkt może być także podawany przy nieistotnych kliniczne działaniach ubocznych towarzyszących połączonemu działaniu inhibitora PDE5 i azotanu organicznego. Tak więc, przeciwwskazanie, niegdyś uważane za konieczne, dla produktu zawierającego inhibitor PDE5 nie jest konieczne kiedy związek (I) jest podawany w dawce jednostkowej od 1 mg do 20 mg, jak ujawniono w niniejszym opisie. Tak więc, niniejszy wynalazek dostarcza skutecznej terapii dysfunkcji seksualnych u osobników, których poprzednio nie można było leczyć lub którzy cierpieli z powodu działań ubocznych, w tym osobników mających chorobę sercowonaczyniową, takich jak osobników wymagający terapii azotanami organicznymi, osobników po zawale serca na więcej niż trzy miesiące przed rozpoczęciem terapii zaburzeń seksualnych, i cierpiących na zastoinową niewydolność serca klasy 1, lub osobników cierpiących na zaburzenia widzenia.

Niniejszy wynalazek dostarcza związku o wzorze (I) w postaci jednostki dawkowania. Wynalazek ten dostarcza farmaceutycznej jednostki dawkowania odpowiedniej do podawania doustnego, zawierającej od 1 do 20 mg związku (I).

Niniejszy wynalazek dostarcza farmaceutycznej postaci dawkowania, odpowiedniej do stosowania farmaceutycznego u ludzi, zawierającej od 1 do 20 mg (6R,12aR)-2,3 ,6,7,12,12a-heksahydro-2-metylo-6-(3,4-metylenodioksyfenylo)pirazyno-[2',1':6,1]pirydo[3,4-b]indolo-1,4-dionu w postaci jednostki dawkowania odpowiedniej do podawania doustnego.

Zgodnie z wynalazkiem, kompozycja farmaceutyczna jednostki dawkowania, zawierająca związek (I) o wzorze strukturalnym przedstawionym poniżej:

charakteryzuje się tym, że zawiera od 1 do 20 mg związku o wzorze (I) i jest odpowiednia do podawania doustnego w maksymalnej dawce całkowitej do 20 mg dziennie.

Korzystnie kompozycja według wynalazku zawiera od 2 do 20 mg, korzystniej od 5 do 20 mg, a jeszcze bardziej korzystnie 10 mg związku o wzorze (I) w jednostce dawkowania.

W innym wykonaniu kompozycja zawiera 20 mg związku w jednostce dawkowania.

W kolejnym wykonaniu kompozycja zawiera od 1 do 5 mg, a w szczególności 2,5 albo 5 mg związku o wzorze (I) w jednostce dawkowania.

Kompozycja według wynalazku może mieć postać wybraną z grupy obejmującej ciecz, tabletkę, kapsułkę i kapsułkę żelatynową, a w szczególności ma postać tabletki.

Kompozycja według wynalazku jest przeznaczona do stosowania w leczeniu stanu, w którym pożądane jest hamowanie PDE5. Takim stanem może być dysfunkcja seksualna, taka jak zaburzenie erekcji u mężczyzn lub zaburzenie pobudzenia u kobiet.

W zakres wynalazku wchodzi ponadto zastosowanie jednostki dawkowania zawierającej od 1 do 20 mg związku (I) o wzorze strukturalnym przedstawionym poniżej:

PL 197 813 B1

do wytwarzania leku do podawania w maksymalnej całkowitej dawce dziennej do 20 mg, przeznaczonego do leczenia dysfunkcji seksualnych u wymagającego takiego leczenia pacjenta.

W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do podawania w jednej lub więcej jednostkach dawkowania zawierających 1 do 20 mg związku, aż do maksymalnej całkowitej dawki dziennej 20 mg związku o wzorze (I).

W pewnym wykonaniu jednostkę dawkowania podaje się raz dziennie.

Korzystnie, jednostkę dawkowania podaje się jako wolny lek.

W korzystnym zastosowaniu jednostka dawkowania zawiera od 2 do 20 mg, w bardziej korzystnym od 5 do 20 mg, a w jeszcze bardziej korzystnym - 10 mg związku o wzorze (I).

W innych korzystnych zastosowaniach jednostka dawkowania zawiera 2,5 mg albo 5 mg związku o wzorze (I).

W pewnym korzystnym zastosowaniu jednostka dawkowania zawiera 10 mg związku i jest przeznaczona, do podawania raz dziennie.

W korzystnym zastosowaniu według wynalazku jednostkadawkowania ma postać wybraną z grupy obejmującej ciecz, tabletkę, kapsułkę i kapsułkę żelatynową, szczególnie ma postać tabletki. W korzystnym zastosowaniu lek jest przeznaczony do leczenia dysfunkcji seksualnej, takiej jak zaburzenie erekcji u mężczyzn albo zaburzenie pobudzenia u kobiet.

Zatem, konkretne stany, które mogą być leczone przy zastosowaniu kompozycji według wynalazku, obejmują, ale nie wyłącznie, zaburzenia erekcji u mężczyzn i dysfunkcje seksualne u kobiet, zwłaszcza zaburzenia pobudzenia u kobiet, znane także jako kobiece zaburzenia pobudzenia seksualnego.

Dla celów obecnego wynalazku ujawnionego i opisanego poniżej, stosuje się następujące określenia i skróty.

Określenie „pojemnik” oznacza dowolne naczynie i jego zamknięcie odpowiednie do składowania, ładowania, wydawania i/lub przenoszenia produktu farmaceutycznego.

Termin „IC50” stanowi miarę siły związku do hamowania określonego enzymu PDE (na przykład PDE1c, PDE5 lub PDE6). IC50 oznacza stężenie związku powodujące 50% zahamowanie enzymu w eksperymencie pojedyncza dawka - odpowiedź. Oznaczenia wartości IC50 dla związku łatwo jest przeprowadzić w oparciu o dobrze znaną metodykę in vitro, opisaną ogólnie w pracy Y. Cheng i in., Biochem. Pharmacol., 22, str.3099-3108 (1973).

Określenie „ulotka informacyjna” oznacza informację towarzyszącą produktowi, która dostarcza opisu na temat podawania produktu, jak również zawiera dane o bezpieczeństwie i skuteczności, umożliwiające lekarzowi, farmaceucie i pacjentowi powzięcie decyzji odnośnie stosowania produktu. Ulotkę informacyjną zasadniczo uważa się za „etykietę” produktu farmaceutycznego.

Określenie „doustna postać dawkowania” jest stosowane w sensie ogólnym w odniesieniu do produktów farmaceutycznych podawanych doustnie. Doustne postaci dawkowania znane specjalistom obejmują preparaty ciekłe, tabletki, kapsułki i kapsułki żelatynowe.

Określenie „zaburzenia widzenia” oznacza nienormalne widzenie charakteryzowane jako widzenie w kolorze niebieskozielonym, które uznaje się za wywołane hamowaniem PDE6.

Określenie „uderzenia gorąca” oznacza okresowe zaczerwienienie twarzy i szyi, przypisywane rozszerzeniu naczyń spowodowanemu spożyciem leku, zazwyczaj z towarzyszącym mu uczuciem ciepła na twarzy i szyi, a czasami towarzyszącym poceniem.

PL 197 813 B1

Określenie „wolny lek” oznacza stałe cząstki leku niezwiązane ściśle z polimerycznym nośnikiem.

Zastrzegana postać dawkowania korzystnie pakowana jest jako produkt farmaceutyczny do stosowania w farmacji ludzkiej, obejmujący ulotkę informacyjną, pojemnik i postać dawkowania zawierającą od około 1 do około 20 mg związku (I).

Ulotka informacyjna zawiera instrukcję podawania produktu farmaceutycznego, jak również dane o bezpieczeństwie i skuteczności umożliwiające lekarzowi, farmaceucie i pacjentowi powzięcie decyzji odnośnie stosowania produktu. Ulotkę informacyjną zasadniczo uważa się za „etykietę” produktu farmaceutycznego. Ulotka informacyjna dołączona do wyrobu farmaceutycznego wskazuje na fakt, że związek (I) jest przydatny w leczeniu stanów, w których pożądane jest hamowanie PDE5. Ulotka informacyjna zawiera ponadto zalecenie podawania jednej lub więcej jednostek dawkowania, zawierających od 1 do 20 mg związku o wzorze (I), według potrzeby, do całkowitej dawki dziennej 20 mg. Korzystnie, podawana dawka wynosi od 5 do 25 mg dziennie, bardziej korzystnie od 5 do 15 mg dziennie, a najbardziej korzystnie dawka zawierająca 10 mg podawana jest raz dziennie.

Wynalazek może być korzystnie stosowany do leczenia dysfunkcji seksualnych (w tym zaburzeń erekcji u mężczyzn i zaburzeń seksualnych u kobiet, zwłaszcza zaburzeń pobudzenia seksualnego u kobiet (FAD)). Korzystnie wynalazek stosuje się w zaburzeniu erekcji u mężczyzn.

Co istotne, ulotka informacyjna popiera stosowanie produktu do leczenia zaburzeń seksualnych u pacjentów cierpiących na chorobę siatkówki, na przykład retinopatię cukrzycową lub degeneracyjną pigmentozę siatkówki lub u pacjentów stosujących azotany organiczne. Zatem ulotka informacyjna korzystnie nie zawiera przeciwwskazań związanych z tymi stanami, w szczególności z podawaniem postaci dawkowania wraz z organicznymi azotanami. Bardziej korzystnie, ulotka informacyjna nie zawiera także żadnych przestróg ani ostrzeżeń związanych zarówno z chorobą siatkówki, zwłaszcza degeneracyjną pigmentozą siatkówki, ani związanych z indywidualnymi tendencjami do zaburzeń widzenia. Korzystnie, ulotka informacyjna zawiera także informację o częstotliwości występowania uderzeń gorąca u poniżej 2%, korzystnie poniżej 1%, jeszcze bardziej korzystnie poniżej 0,5% pacjentów przyjmujących postać dawkowania. Częstotliwość występowania uderzeń gorąca dowodzi znaczących korzyści w stosunku do znanych produktów farmaceutycznych zawierających inhibitor PDE5.

Pojemnik stosowany dla produktu farmaceutycznego jest dobrze znany w farmacji. Zasadniczo, pojemnik stanowi opakowanie blistrowe, torebka foliowa, szklana lub plastikowa butelka i towarzysząca jej nakrętka lub zamknięcie lub inny taki wyrób odpowiedni do stosowania przez pacjenta lub farmaceutę. Korzystnie pojemnik ma wielkość odpowiednią do umieszczenia w nim 1 do 1000 stałych postaci dawkowania, korzystniej 1 do 500 stałych postaci dawkowania, a jeszcze bardziej korzystnie 5 do 30 stałych postaci dawkowania.

Doustne postaci dawkowania są dobrze znane specjalistom i obejmują na przykład preparaty ciekłe, tabletki, kapsułki i kapsułki żelatynowe. Korzystne postaci dawkowania stanowią stałe postaci dawkowania, w szczególności tabletki zawierające od 1 do 20 mg związku (I). Do wytwarzania takich postaci farmaceutycznych stosuje się dowolne farmaceutycznie dopuszczone do stosowania doustnego składniki pomocnicze. Odpowiednie farmaceutyczne postaci dawkowania obejmują koprecypitaty, takie jak opisane na przykład w patencie USA nr 5,985,326, udzielonym na rzecz Butlera. W korzystnej realizacji, postać jednostki dawkowania według wynalazku stanowi stałą, niezawierającą koprecypitatu postać związku (I), zawierającą natomiast stały związek (I) w postaci wolnego leku.

Korzystnie, tabletki zawierają farmaceutyczne składniki pomocnicze ogólnie przyjęte za bezpieczne, takie jak laktoza, mikrokrystaliczna celuloza, skrobia, węglan wapnia, stearynian magnezu, kwas stearynowy, talk i koloidalny ditlenek krzemu i są sporządzane za pomocą przyjętych technik farmaceutycznych, jak opisane w Remington Pharmaceutical Science, wyd. 18, Mack Publishing Co., PA (1990). Techniki te obejmują na przykład granulację na mokro, a następnie suszenie, mielenie i prasowanie w tabletki z otoczką lub bez otoczki; granulację na sucho, a następnie mielenie, prasowanie w tabletki z otoczką lub bez otoczki; wytwarzanie suchej mieszanki, a następnie prasowanie w tabletki z otoczką lub bez otoczki; tabletki wytłaczane; granulację na mokro, suszenie i napełnianie żelatynowych kapsułek; napełnianie żelatynowych kapsułek suchą mieszanką; lub napełnianie żelatynowych kapsułek zawiesiną bądź roztworem.

Stałe postaci dawkowania mają znaki identyfikacyjne uwypuklone lub nadrukowane na powierzchni.

U podłoża wynalazku leżą szczegółowe eksperymenty i badania kliniczne oraz nieoczekiwana obserwacja, że działania niepożądane przypisywane uprzednio hamowaniu PDE5 mogą być ograniczone do poziomu nieznaczącego klinicznie poprzez wybór związku i jednostki dawkowania. Ta nieoczekiwana

PL 197 813 B1 obserwacja umożliwiła opracowanie jednostki dawkowania zawierającej związek (I) w ilości od 1 do 20 mg na jednostkę dawkowania, która po podaniu doustnym minimalizuje poprzednio uważane za nieuniknione działania niepożądane. Te działania niepożądane obejmują uderzenia gorąca na twarzy, zaburzenia widzenia i znaczący spadek ciśnienia krwi, gdy związek (I) podawany jest sam lub w połączeniu z organicznymi azotanami. Minimalny wpływ związku (I), podawanego w ilości od 1 do 20 mg w dawkach jednostkowych na PDE6 pozwala również na podawanie selektywnego inhibitora PDE5 pacjentom cierpiącym na choroby siatkówki, jak retinopatia cukrzycowa lub pigmentoza zapalna siatkówki.

Związek (I) ma następujący wzór strukturalny:

Związek o wzorze (I) wykazywał w badaniach klinicznych na ludziach przy podawaniu wraz z organicznymi azotanami minimalny wpływ na skurczowe ciśnienie krwi. Przeciwnie do tego, sildenafil podawany z azotanami wykazuje aż czterokrotnie większy spadek skurczowego ciśnienia krwi w porównaniu z placebo, co prowadzi do przeciwwskazań w ulotce VIAGRA® oraz ostrzeżeń skierowanych do pewnych grup pacjentów.

Poniżej zilustrowano wartości IC50 dla PDE5 i PDE6 dla związku o wzorze strukturalnym (I), oznaczone opisaną tutaj metodą.

Związek	IC50 PDE5 (nM)	IC50 PDE6 (nM)	PDE6/PDE5
I	2,5	3400	1360

Związek o wzorze strukturalnym (I) dodatkowo wykazuje IC50 względem PDElc równe 10000 oraz stosunek PDE1c/PDE5 4000.

PREPARATYKA

Przygotowanie ludzkiej PDE5

Rekombinacyjne wytwarzanie ludzkiej PDE5 przeprowadzano zasadniczo tak jak to zostało opisane w przykładzie 7 opisu patentowego USA nr 5 702 936, z tą różnicą, że do transformacji zastosowano wektor drożdżowy, uzyskany z podstawowego plazmidu ADH2 opisanego przez V. Price i wsp. w Methods in Enzymology, 1985, str. 308-318, zawierającego drożdżowe sekwencje promotora i terminatora ADH2 a nie ADH1, a gospodarzem Saccharomyces cerevisiae był nieposiadający proteazy szczep BJ2-5 54, zdeponowany 31 sierpnia 1998r w American Type Culture Collection, Manassas, Wirginia pod numerem akcesyjnym ATCC 74465. Transformowane komórki gospodarza hodowano w pożywce 2X SC-leu przy pH 6,2 z metalami śladowymi i witaminami. Po 24 godzinach dodawano pożywkę YEP zawierającą glicerol do końcowego stężenia 2X YEP/3% glicerolu. Około 24 godzin później komórki zebrano, przemywano i przechowywano w - 70°C.

Osad komórek (29 g) rozmrażano w lodzie z równą objętością buforu do lizy (25 m M Tris-HCl, pH 8, 5 mM MgCL, 0,25 15 mM ditiotreitol, 1 mM benzamidyna i 10 μΜ ZnSO₄). Komórki poddawano lizie w mikrofluidyzerze z N2 przy ciśnieniu 137,89 MPa (20000 psi). Lizat wirowano i sączono przez jednorazowe filtry o średnicy porów 0,45 μιη. Przesącz nanoszono na 150 ml kolumnę Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia). Kolumnę przemywano 1,5 objętości Buforu A (20 mM Bis-Tris-Propane, pH 6,8, 1 mM MgCl2, 0,25 mM ditiotreitol, 10 μM ZnSO₄) i eluowano skokowym gradientem 125 mM NaCl w buforze A, a następnie liniowym gradientem 125-1000 mM NaCl w buforze A.

PL 197 813 B1

Aktywne frakcje z gradientu liniowego w buforze B 25 mM Bis-Tris-Propane (pH 6,8), 1 mM MgCl2, 0,25 mM ditiotreitolu, 10 μΜ ZnSO₄ i 250 mM KCI) naniesiono na 180 ml kolumnę hydroksyapatytową. Po napełnieniu, kolumnę przemywano 2 objętościami buforu B i eluowano liniowym gradientem 0-125 mM fosforanu potasu w buforze B. Aktywne frakcje zbierano, wytrącano 60% siarczanem amonowym i ponownie zawieszano w buforze C (20 mM Bis-Tris-Propane, pH 6,8, 125 mM NaCl, 0,5 mM ditiotreitol i 10 μM ZnSO₄). Zebrane frakcje nanoszono na 140 ml kolumnę Sephacryl S-300 HR i wymywano Buforem C. Aktywne frakcje rozcieńczano do 50% glicerolem i przechowywano w temperaturze -20°. Czystość uzyskanych preparatów, określona metodą SDS-PAGE, wynosiła 85%.

Test aktywności PDE.

Aktywność PDE5 może być oznaczana standardowymi testami z danej dziedziny. Na przykład, specyficzna aktywność jakiejkolwiek PDE może być oznaczona w następujący sposób. Testy PDE z zastosowaniem techniki separacji na węglu drzewnym przeprowadzano w sposób opisany przez Loughney i wsp. w The Journal of Biological Chemistry, 271:796-806, (1996). W teście tym aktywność PDE5 przekształca [³²P]cGMP w [³²P]5'GMP w proporcji odpowiedniej do ilości obecnej aktywności PDE5. Następnie [3²P]5'GMP, poprzez działanie 5'-nukleotydazy jadu węża, jest ilościowo przekształcany do wolnego [3²P] fosforanu i nieznakowanej adenozyny. Stąd, ilość uwolnionego L²P] fosforanu jest proporcjonalna do aktywności enzymu. Test przeprowadzano w 30°C, w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej (stężenia końcowe) 40 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 μM ZnSO4, 5 mM MgCh i 0,1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej. PDE5 jest obecna w ilości powodującej <30% całkowitej hydrolizy substratu (liniowe warunki testu). Test rozpoczynano poprzez dodanie substratu (1 mM [3²P]cGMP) i następnie mieszaninę inkubowano przez 12 minut. Następnie dodawano siedemdziesiąt pięć (75) μg jadu Crotalus atrox i inkubację kontynuowano przez 3 lub więcej minut (ogółem 15 minut). Reakcję zatrzymywano poprzez dodanie 200 ml aktywowanego węgla drzewnego (25 mg/ml zawiesiny w 0,1 M NaH2PO4, pH 4).

Po odwirowaniu (750 x g przez 3 minuty) w celu sedymentacji węgla drzewnego, pobierano próbkę supernatantu do oznaczenia radioaktywności w liczniku scyntylacyjnym i obliczano aktywność PDE5. Preparaty posiadały specyficzną aktywność około 3 μmoli cGMP hydrolizowanego na minutę na miligram białka.

Przygotowanie bydlęcej PDE6

Bydlęca PDE6 była dostarczona przez dr N. Virmaux, INSERM U338, Strasbourg. Siatkówki bydlęce były przygotowywane zgodnie z tym jak to zostało opisane przez Virmaux i wsp. w FEBS Letters, 12(6), str. 325-328 (1971), patrz także: A. Sitaramayya i wsp. Exp. Eye Res., 25, str. 163-169, (1977). Pokrótce, jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie zabiegi były przeprowadzane w zimnie i w przyćmionym czerwonym świetle.

Oczy były przechowywane w zimnie i w ciemności do czterech godzin po uboju.

Przygotowanie zewnętrznego wycinka siatkówki bydlęcej (ROS) w zasadzie było zgodne z procedurami opisanymi przez Schichi i wsp. w J. Biol. Chem., 224:529 (1969). W typowym eksperymencie, 35 siatkówek bydlęcych rozdrabniano w moździerzu z 35 ml 0,066M buforu fosforanowego o pH 7,0, dopełnionego do 40% sacharozą, a następnie homogenizowano w homogenizatorze Pottera (20 uderzeń do dołu i do góry). Zawiesinę odwirowywano przy 25000 x g przez 20 minut. Osad homogenizowano w 7,5 ml 0,006M buforu fosforanowego (40% w sacharozie) i ostrożnie wkładano do 7,5 ml buforu fosforanowego (niezawierającego sacharozy). Następnie odwirowano w wirniku zamachowym przy 45000 g przez 20 minut i otrzymano osad, który był czarny na spodzie, z czerwonym pasmem na powierzchni rozdziału 0,066M fosforan-40% sacharoza/0,006M fosforan (surowy ROS). Czerwoną substancję z powierzchni rozdziału usuwano, rozcieńczano w buforze fosforanowym, wirowano do osadu i ponownie rozprowadzano w buforowanej 40% sacharozie, jak opisano powyżej. Ta procedura była powtarzana 2- lub 3-krotnie, aż do zaniku osadu. Oczyszczony ROS przemywano w buforze fosforanowym i ostatecznie wirowano do osadu przy 25000 x g przez 20 minut. Następnie wszystkie substancje zamrażano aż do czasu zastosowania.

Hipotoniczne wyciągi przygotowywano poprzez zawieszenie izolowanych ROS w 10 mM Tris-Cl o pH 7,5, 1 mM EDTA i 1 mM ditioerytrytolu, a następnie odwirowanie przy 100000 x g przez 30 minut.

Stwierdzano, że preparaty posiadały specyficzną aktywność około 35 nmoli cGMP hydrolizowanego na minutę na miligram białka.

Przygotowywanie PDE1c z komórek Spodoptera fugiperda (Sf9)

Osad komórek (5 g) rozmrażano w lodzie z 20 ml buforu do lizy (50 mM MOPS o pH 7,4, 10 μM ZnSO₄, 0,1 mM CaCh, 1 mM DTT, 2 mM chlorowodorek benzamidyny, po 5 μg/ml pepstatyny, leupeptyny

PL 197 813 B1 i aprotyniny). Komórki poddawano lizie poprzez przepuszczenie przez francuski zgniatacz komórek (SLM-Aminco) przy temperaturze utrzymywanej poniżej 10°C. Uzyskany homogenat komórkowy wirowano przy 36000 obrotów/min w temperaturze 4°C przez 45 minut w ultrawirówce Beckmana z zastosowaniem wirnika typu TI45. Supernatant odrzucano, a uzyskany osad ponownie zawieszano w 40 ml buforu rozpuszczającego (bufor do lizy zawierający 1M NaCI, 0,1 M MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 20 pg/ml kalmoduliny i 1% Sulfobetainy SB12 (Z3-12)) z zastosowaniem ultradźwięków za pomocą tunera VibraCell z mikrogłowicą, przez 3x30 sekund. Wykonywano to w mieszaninie skruszonego lodu i soli w celu oziębienia. Po ultradźwiękowym mieszaniu, mieszaninę powoli mieszano przez 30 minut w temperaturze 4°, aby zakończyć solubilizację białek związanych z błonami. Następnie mieszaninę tę wirowano w ultrawirówce Beckmana z zastosowaniem wirnika TI45 przy 36 000 obrotach na minutę przez 45 minut. Supernatant rozcieńczano buforem do 25 lizy zawierającym 10 pg/ml inhibitora kalpainy I i II. Wytrącone białko wirowano przez 20 minut przy 9000 obrotów na minutę w wirniku JA-10 Beckmana. Odzyskany supernatant poddawano chromatografii agarozowej Mimetic Blue AP.

W celu uruchomienia kolumny agarozowej Mimetic Blue AP żywicę osłaniano początkowo poprzez nałożenie 10 objętości złoża 1% poliwinylopirolidonu (masa cząsteczkowa 40000), aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania. Luźno związany PVP-40 usuwano poprzez przemycie 10 objętościami złoża 2M NaCl i 10 mM cytrynianu sodu o pH 3,4. Tuż przed dodaniem próbki solubilizowanej PDE1c, kolumnę równoważono za pomocą 5 objętości złoża buforu kolumnowego A (50 mM MOPS pH 7,4, 10 pM ZnSO4, 5 mM MgCl₂, 0,1 mM CaCl₂, 1 mM DTT, 2 mM chlorowodorek benzamidyny).

Solubilizowaną próbkę nanoszono na kolumnę z szybkością przepływu 2 ml/min, stosując recyrkulację, tak że cała próbka była nanoszona na kolumnę 4 do 5 razy w ciągu 12 godzin. Po zakończeniu załadowania, kolumnę przemywano 10 objętościami równymi objętości kolumny buforu kolumnowego A, a następnie 5 objętościami kolumny buforu kolumnowego B (bufor kolumnowy A zawierający 20 mM 5'-AMP), a następnie 5 objętościami kolumny buforu kolumnowego C (50mM MOPS, pH 7,4, 10 pM ZnSO4, 0,1 mM CaCl₂, 1 mM ditiotreitol i 2 mM chlorowodorek benzamidyny). Enzym eluowano do trzech kolejnych pul. Pierwsza pula zawierała enzym pochodzący z pięciu objętości złoża po przemyciu buforem kolumnowym C zawierającym 1 mM cAMP. Druga pula zawierała enzym z 10 objętości złoża po przemyciu buforem kolumnowym C zawierającym 1 M NaCl.

Końcowa pula enzymu składała się z 5 objętości złoża z buforem kolumnowym C zawierającym 1M NaCl i 20 mM cAMP.

Zebrano aktywne frakcje enzymu. Cykliczne nukleotydy usunięto za pomocą konwencjonalnej chromatografii żelowej lub chromatografii na żywicach hydroksyapatytowych. Po usunięciu cyklicznych nukleotydów, pule enzymu dializowano na buforze dializacyjnym zawierającym 25 mM MOPS pH 7,4, 10 pM ZnSO4, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM ditiotreitol, 1 mM chlorowodorek benzamidyny. Następnie następowała dializa na buforze dializacyjnym zawierającym 50% glicerol. Następnie enzym szybko zamrażano za pomocą suchego lodu i przechowywano w temperaturze -70°.

Uzyskane w ten sposób preparaty miały czystość oznaczoną metodą SDS-PAGE > około 90%. Posiadały one specyficzną aktywność rzędu 0,1 do 1,0 pmola cAMP hydrolizowanego na minutę na miligram białka.

Wyznaczanie wartości IC₅₀.

Parametrem, który jest obiektem zainteresowania przy oznaczaniu siły kompetycyjnego enzymatycznego inhibitora PDE5 i/lub PDE1c i PDE6 jest stała hamowania tj. Kj. Parametr ten może być oznaczony w przybliżeniu poprzez określenie wartości IC₅₀, która jest stężeniem inhibitora powodującym hamowanie 50% enzymu w eksperymencie oceniającym odpowiedź na pojedynczą dawkę w następujących warunkach.

Stężenie inhibitora jest zawsze znacznie wyższe niż stężenie enzymu. Tak więc stężenie wolnego inhibitora (które jest nieznane) może zostać ocenione w przybliżeniu poprzez całkowite stężenie inhibitora (które jest znane).

Wybierany jest odpowiedni zakres stężeń inhibitora (tj. stężenia inhibitora są co najmniej kilka razy większe i kilka razy mniejsze niż K w danym eksperymencie). Typowo, stężenia inhibitora mieszczą się w zakresie od 10 nM do 10 pM.

Stężenia enzymu i substratu są dobierane w taki sposób, że w nieobecności inhibitora zużywane jest mniej niż 20% substratu (dostarczając np. maksymalnej hydrolizy substratu od 10 do 15%). Tak więc w trakcie eksperymentu aktywność enzymu jest w przybliżeniu stała.

PL 197 813 B1

Stężenie substratu jest mniejsze niż jedna dziesiąta stałej Michaelisa (K_m). W tych warunkach, wartość IC₅0 będzie bardzo zbliżona do K|. Wynika to z równania Cheng-Prusoffa, które wiąże te dwa parametry: IC₅o = K|(1 + S/Km), gdzie (1 + S/Km) jest w przybliżeniu równe 1 przy niskich wartościach S/Km.

Wartość IC₅o jest oszacowana z danych liczbowych, poprzez dopasowanie danych do odpowiedniego modelu interakcji pomiędzy enzymem a inhibitorem. Jeśli wiadomo jest, że interakcja ta obejmuje prostą kompetycję inhibitora z substratem, może być zastosowany model dwuparametrowy:

Y = A/(1 + x/B) gdzie y jest aktywnością enzymu przy stężeniu inhibitora wynoszącym x, A jest aktywnością w nieobecności inhibitora a B jest wartością IC₅o. Patrz Y. Cheng i wsp., Biochem. Pharmacol., 22:3099-3108 (1973).

Działanie inhibitorów według niniejszego wynalazku na aktywność enzymatyczną preparatów PDE5 i PDE6, opisanych powyżej, określano w każdym z dwóch testów, które różniły się między sobą głównie pod względem skali i dostarczały zasadniczo tych samych wyników wartości IC50. Oba testy stanowiły modyfikacje procedury Wellsa i wsp., Biochim. Biophys. Acta, 384:430 (1975). Pierwszy z testów przeprowadzano w całkowitej objętości 200 pl zawierającej 50 mM Tris, pH 7,5, 3 mM octan Mg, 1 mM EDTA, 50 gg/mL nukleotydazy jadu węża i 50 nM [³H]-cGMP (Amersham). Związek według wynalazku rozpuszczano w DMSO i jego ostateczne stężenie w teście wynosiło 2%. Przeprowadzono inkubację przez 30 minut w 30°C i zatrzymano poprzez dodanie objętości 800 gl o składzie: 10 mM Tris o pH 7,5, 10 mM EDTA, 10 mM teofilina, 0,1 mM adenozyna i 0,1 mM guanozyna. Mieszaniny nanoszono na 0,5 ml kolumny QAE Sephadex i eluowano 2 ml 0,1M mrówczanu (pH 7,4). Eluowaną radioaktywność mierzono poprzez zliczanie scyntylacji w OptiphaseHisafe3.

Drugi, mikropłytkowy test PDE był wykonywany z zastosowaniem płytek Multiscreen i próżniowej rozgałęzionej rury. Próbka (100 gl) zawierała 50 mM Tris o pH 7,5, 5 mM octan, 1 mM EDTA i 250 gg/ml nukleotydazy jadu węża. Inne komponenty mieszaniny reakcyjnej były takie jak opisano powyżej. Na końcu inkubacji, całkowite objętości próbek nakładano na płytkę mikrokolumny QAE Sephadex przez filtrację. Wolną radioaktywność eluowano 200 gl wody i analizowano próbki o objętości 50 gl poprzez zliczanie scyntylacji, jak to zostało opisane powyżej.

W celu dalszej ilustracji preparatów według wynalazku przedstawiono następujące przykłady. Zakres niniejszego wynalazku nie powinien być interpretowany jako obejmujący jedynie następujące przykłady.

P r z y k ł a d 1

Związek (I) wytworzono w sposób opisany w opisie patentowym USA 5859006 i spreparowano w tabletki z zastosowaniem granulacji na mokro. Powidon rozpuszczono w wodzie z wytworzeniem 10% roztworu. Do wysokoobrotowego miksera dodano: związek aktywny, mikrokrystaliczną celulozę, sól sodową kroskarmelozy, laurylosiarczan sodu i miksowano przez 2 minuty. Proszek granulowano na mokro roztworem powidonu i dodatkową ilością wody potrzebnej do ukończenia granulacji. Uzyskaną mieszaninę suszono w suszarce fluidalnej z wlotem powietrza o temperaturze 70°C ± 5°C do chwili aż ubytek przy suszeniu wynosił poniżej 2,5%. Osad przepuszczano przez Comil z odpowiednim przesiewaczem (lub sitem) i dodawano do odpowiedniego miksera. Pozagranularne składniki: sól sodową kroskarmelozy, laurylosiarczan sodu oraz bezwodną krzemionkę koloidalną, przepuszczano przez odpowiednie sito (np. 500 gm), dodawano do miksera i mieszano przez 5 minut. Następnie dodawano stearynian magnezu i mieszano przez 2 minuty. Mieszankę prasowano na tabletki 250 mg za pomocą zwykłego 9 mm okrągłego, wklęsłego oprzyrządowania.

Rdzenie tabletek powlekano wodną zawiesiną Opadry OY-S-7322 za pomocą Accelacota (lub podobnej kadzi powlekającej), z zastosowaniem wlotu powietrza w temperaturze od 50°C do 70°C, aż do chwili, gdy waga tabletki wzrosła w przybliżeniu o 8 mg. Opadry OY-S-7322 zawiera metylohydroksypropylocelulozę wg. Farmakopei Eur., ditlenek tytanu wg. Farmakopei Eur., triacetynę wg. USP. Opadry zwiększa masę każdej tabletki do około 258 mg. Ilość warstwy powlekającej nałożonej na każdą tabletkę może być mniejsza niż podano, zależnie od wydajności procesu.

Tabletki pakowano w blistry i zaopatrywano w ulotki opisujące bezpieczeństwo i skuteczność związku.

PL 197 813 B1

Składnik	Receptura (mg na tabletkę)
^Se^le^kt^ywn^y mNtdtor PD^E51)	1	5
Ftalan hydroksypropylometylocelulozy	1	5
Celuloza mikrokrystaliczna	221,87	213,87
Sól sodowa kroskarmelozy	5,00	5,00
Laurylosiarczan sodu	2,50	2,50
Powidon K30	9,38	9,38
Oczyszczona woda USP (woda do przemywania)	q.s	q.s
Sól sodowa kroskarmelozy	5,00	5,00
Laurylosiarczan sodu	2,50	2,50
Koloidalna bezwodna krzemionka	0,50	0,50
Stearynian magnezu	1,25	1,25
Całkowita waga rdzenia	250,0	250,0
(Warstwa powlekająca Opadry OY-S-7322)	ok. 8 mg	ok. 8 mg

¹⁾ związek (I).

P r z y k ł a d 2

W przygotowywaniu gotowej postaci dawkowania zawierającej 10 mg związku (I) zastosowano następującą recepturę.

Składnik	Ilość (mg)
Granulacja
^Se^le^kt^ywn^y mtitortor ^PDE51)	10,00
Monohydrat laktozy	153,80
Monohydrat laktozy (wysuszony rozpyłowo)	25,00
Hydroksypropyloceluloza	4,00
Sól sodowa kroskarmelozy	9,00
Hydroksypropyloceluloza (EF)	1,75
Laurylosiarczan sodu	0,70

Zewnętrzne proszki
Celuloza mikrokrystaliczna (ziarnista 102)	37,50
Sól sodowa kroskarmelozy	7,00
Stearynian magnezu (roślinny)	1,25
Razem	250 mg
Warstwa powlekająca (w przybliżeniu) 11,25

Przy wytwarzaniu tabletek używano oczyszczoną wodę wg. USP. Jest ona usuwana podczas przetwarzania i w gotowym produkcie pozostają jej minimalne ilości.

Tabletki wytwarzano z zastosowaniem procesu granulacji na mokro. Opis, krok po kroku, procesu wytwarzania jest następujący. Lek i zaróbki które mają ulec granulacji, są ostrożnie przesiewane. Selektywny inhibitor PDE5 miesza się na sucho z monohydratem laktozy (suszonym rozpyłowo), hydroksypropylocelulozą, solą sodową kroskarmelozy i monohydratem laktozy. Powstałą mieszankę

PL 197 813 B1 proszków poddaje się granulacji z wodnym roztworem hydroksypropylocelulozy i laurylosiarczanu sodu za pomocą Powrexu lub innego odpowiedniego wysokoobrotowego granulatora. W celu uzyskania pożądanego efektu końcowego może być dodana dodatkowa ilość wody. Aby zniwelować zbrylanie podczas mokrej granulacji i ułatwić suszenie może być zastosowany młynek. Otrzymany mokry granulat można wysuszyć zarówno za pomocą suszarki fluidalnej jak i suszarki piecowej. Kiedy materiał jest już wysuszony, może być on przesiany według wymiarów, aby wyeliminować wielkie aglomeraty. Mikrokrystaliczną celulozę, sól sodową kroskarmelozy i stearynian magnezu starannie przesiewa się i dodaje do suchych, posortowanych według rozmiarów granulek. Zarobki te i suchy granulat następnie miesza się aż do uzyskania jednorodności za pomocą przechylnego pojemnika, mieszarki spiralnej lub innego odpowiedniego sprzętu mieszającego. Proces mieszania może być podzielony na dwie fazy. Podczas pierwszej fazy do miksera dodaje się i miesza celulozę mikrokrystaliczną, sól sodową kroskarmelozy i suchy granulat. Następnie dodaje się stearynian magnezu i następuje druga faza mieszania.

Zmieszany granulat prasuje się następnie w tabletki za pomocą tabletkarki rotacyjnej. Rdzenie tabletek powleka się warstwą wodnej zawiesiny odpowiedniej barwnej mieszanki w kadzi powlekającej (np. Accela Cota). Powleczone tabletki mogą być cienko opylone talkiem, aby polepszyć łatwość manipulowania nimi.

Tabletki są pakowane w plastikowe pojemniki (30 tabletek/pojemnik). Do opakowania dołączana jest ulotka opisująca bezpieczeństwo i skuteczność związku.

P r z y k ł a d 3

W przygotowywaniu gotowej postaci dawkowania zawierającej 5 mg związku (I) jest stosowana następująca receptura.

Składnik	Ilość (mg)
Granulacja
^Se^le^ktywn^y mMbrtor ^PDE51)	2,50
Monohydrat laktozy	79,395
Monohydrat laktozy (wysuszony rozpyłowo)	12,50
Hydroksypropyloceluloza	2,00
Sól sodowa kroskarmelozy	4,50
Hydroksypropyloceluloza (EF)	0,875
Laurylosiarczan sodu	0,35

Zewnętrzne proszki
Celuloza mikrokrystaliczna (ziarnista - 102)	18,75
Sól sodowa kroskarmelozy	3,50
Stearynian magnezu (roślinny)	0,63
Razem	125 mg
Warstwa powlekająca (w przybliżeniu) 6,875

Postać dawkowania z przykładu 3 była przygotowywana w identyczny sposób jak postać dawkowania z przykładu 2.

P r z y k ł a d 4

Kapsułka wypełniona roztworem
Składnik	mg/kapsułkę	Procent (%)
^Se^le^ktywn^y rntnbrtor ^PDE51)	10	2
PEG400 NF	490	98
Waga wypełnienia	500	100

PL 197 813 B1

Żelatynowe kapsułki precyzyjnie wypełniano poprzez wpompowanie dokładnej objętości wypełniającej, uprzednio rozpuszczonej postaci leku, do częściowo zatopionej jamy kapsułki. Natychmiast po wstrzyknięciu wypełniającego roztworu leku kapsułkę całkowicie zatapiano za pomocą ciepła.

Kapsułki pakowano do plastikowych pojemników, do których dołączano ulotkę.

P r z y k ł a d 5

Badanie to było randomizowanym, podwójnie skrzyżowanym projektem badania interakcji leków z zastosowaniem podwójnie ślepej próby i placebo. Oceniało ono efekty hemodynamiczne jednoczesnego podawania leku testowanego selektywnego inhibitora PDE5 (tzn. związku (I)) i krótko działających azotanów u zdrowych, męskich ochotników. W badaniu tym ochotnicy otrzymywali albo związek (I) w dawce 10 mg albo placebo raz dziennie przez 7 dni. Szóstego lub siódmego dnia ochotnicy, leżąc na plecach na przechylnym stole, otrzymywali podjęzykowo nitroglicerynę (0,4 mg). Nitroglicerynę podawano 3 godziny po podaniu związku (I) i wszyscy ochotnicy trzymali tabletkę nitrogliceryny pod językiem aż do zupełnego rozpuszczenia. Następnie ochotnicy byli przechylani do kąta 70°, z głową uniesioną do góry, co 5 minut przez całkowity czas 30 minut. Przeprowadzano pomiary ciśnienia tętniczego i częstości akcji serca. Wśród 22 zdrowych męskich ochotników, którzy brali udział w próbie (w wieku 19 do 60 lat), nie było konieczności przerwania testu.

We wstępnej analizie tego badania związek (I) był dobrze tolerowany i nie obserwowano poważnych działań niepożądanych. Nie obserwowano związanych ze związkiem (I) zmian w przeprowadzanych dla bezpieczeństwa oznaczeniach laboratoryjnych lub w 12-odprowadzeniowym EKG. Najczęściej obserwowanymi działaniami niepożądanymi były ból głowy, niestrawność i ból pleców. Badanie wykazało minimalny, jeśli obecny w ogóle, wpływ związku (I) na średnie skurczowe ciśnienie krwi i na średnie maksymalne obniżenie ciśnienia skurczowego, spowodowane nitrogliceryną.

P r z y k ł a d 6

W dwóch randomizowanych badaniach z podwójną ślepą próbą i placebo związek (I) podawano potrzebującym go pacjentom w warunkach domowych, w różnych dawkach, zarówno w trybie codziennego dawkowania jak i w leczeniu na żądanie dla celów kontaktów seksualnych i stosunków płciowych. Dawki od 5 do 20 mg związku (I) były skuteczne i stwierdzono mniej niż 1% napadów gorąca oraz nie stwierdzono zaburzeń widzenia. Stwierdzono, że dawka 10 mg związku (I) była w pełni skuteczna i powodowała minimalne objawy uboczne.

Funkcję erekcji oceniano za pomocą Międzynarodowego Indeksu Zdolności do Erekcji (IIEF) (Rosen i wsp., Urology, 49, str. 822-830 (1997)), dzienników prób seksualnych i ogólnych pytań dotyczących osiąganej satysfakcji. Związek (I) znacznie poprawiał funkcję erekcji ocenianą we wszystkich punktach końcowych, w tym funkcję erekcji, zarówno przy dawkowaniu „na żądanie” jak i przy dawkowaniu codziennym.

P r z y k ł a d 7

Trzecie badanie kliniczne było randomizowanym badaniem związku (I), z użyciem podwójnie ślepej próby i placebo. Związek (I) podawano „na żądanie” pacjentom z zaburzeniami erekcji (ED). Jako zaburzenia erekcji (ED) określa się utrzymującą się niezdolność do osiągnięcia i/lub utrzymania erekcji pozwalającej na satysfakcjonujące zachowanie seksualne. Dawkowanie „na żądanie” określa się jako podawanie związku (I) przed oczekiwaną aktywnością seksualną.

Badana populacja składała się z 212 mężczyzn w wieku co najmniej 18 lat z zaburzeniami erekcji od stopnia łagodnego do ciężkiego. Związek (I) podawano doustnie w postaci tabletek koprecypitatu wykonanych zgodnie z patentem Butlera USA nr 5 985 326. Związek (I) podawano w dawkach 2 mg, 5 mg, 10 mg i 25 mg, „na żądanie” i nie częściej niż raz na 24 godziny. W całym czasie trwania badania było zabronione leczenie jakimikolwiek azotanami, azolowymi lekami przeciwgrzybiczymi (np. ketokonazolem lub itrakonazolem), warfaryną, erytromycyną lub antyandrogenami. Nie wolno było także stosować zatwierdzonych lub eksperymentalnych leków, metod leczenia lub urządzeń stosowanych do leczenia ED. 41 osób otrzymywało placebo.

Dwoma głównymi parametrami skuteczności były zdolność danej osoby do penetracji partnera i zdolność do utrzymania erekcji podczas stosunku. Były one mierzone za pomocą Międzynarodowego Indeksu Zdolności do Erekcji (IIEF). Kwestionariusz IIEF zawiera piętnaście pytań i jest krótką, wiarygodną miarą zdolności do erekcji. Patrz R.C. Rosen i wsp., Urology, 49, str. 822-830 (1997).

Wtórnymi parametrami skuteczności były punktowe oceny IIEF w dziedzinie funkcji erekcyjnej, funkcji szczytowania, pożądania seksualnego, satysfakcji ze stosunku i ogólnej satysfakcji; zdolności pacjenta do osiągnięcia erekcji, zdolności do włożenia penisa do pochwy partnerki, zakończenia stosunku ejakulacją, zadowolenia z twardości erekcji i całkowitej satysfakcji. Wszystkie te funkcje były mierzone

PL 197 813 B1 za pomocą dziennika Profilu Kontaktów Seksualnych (SEP) i ogólnego pytania oceniającego zadawanego na końcu okresu leczenia. SEP jest dziennikiem pacjenta dokumentującym każdy kontakt seksualny podczas trwania badania.

U wszystkich osób biorących udział w eksperymencie prowadzono analizę bezpieczeństwa, poprzez ocenę wszystkich zgłaszanych działań ubocznych, zmian w wartościach badań laboratoryjnych, zmian czynności życiowych, wyników badań fizykalnych i badań elektrokardiograficznych.

W końcowym momencie badania proporcje pacjentów, którzy ocenili swoją zdolność do penetracji (IIEF pytanie 3) jako „prawie zawsze lub zawsze” wynosiły jak następuje: 17,5% w grupie placebo, 38,1% w grupie otrzymującej 2 mg leku, 48,8% w grupie otrzymującej 5 mg, 51,2% w grupie otrzymującej 10 mg i 83,7% w grupie otrzymującej 25 mg. Porównania wykazały statystycznie znaczące różnice w zmianach zdolności penetracji pomiędzy grupą placebo i wszystkimi grupami otrzymującymi lek testowany na każdym poziomie dawkowania.

W końcowym momencie badania proporcje pacjentów, którzy określili swoją zdolność do utrzymania erekcji (IIEF pytanie 4) podczas stosunku jako „prawie zawsze lub zawsze”, były następujące: 10,0% w grupie placebo, 19,5% w grupie otrzymującej 2 mg leku, 32,6% w grupie otrzymującej 5 mg, 39,0% w grupie otrzymującej 10 mg i 69,0% w grupie otrzymującej 25 mg. Porównanie ujawniło statystycznie znaczące różnice w zmianach zdolności penetracji pomiędzy grupą placebo i grupami otrzymującymi trzy wyższe dawki związku (I).

Badanie to obejmowało ocenę bezpieczeństwa. Jako skutek uboczny pojawiający się w trakcie leczenia określony jest stan nieobecny w punkcie wyjściowym, który pojawia się w trakcie leczenia albo stan, który występuje w punkcie wyjściowym i nasila się w trakcie leczenia. Najczęściej występującymi skutkami ubocznymi były ból głowy, niestrawność i ból pleców. Okazało się, że nasilenie tych skutków ubocznych związane jest z dawką.

Podsumowując, badanie wykazało, że wszystkie cztery dawki związku (I), tj. dawka 2 mg, 5 mg, 10 mg i 25 mg, przyjmowane „na żądanie”, powodowały znaczącą poprawę, względem placebo, sprawności seksualnej mężczyzn z zaburzeniami erekcji, ocenianej poprzez IIEF, dzienniki pacjentów oceniające częstość zakończonych sukcesem stosunków, satysfakcję ze stosunków i ogólną ocenę.

Łączne wyniki badań klinicznych wykazały, że podawanie związku (I) skutecznie leczy męskie zaburzenia erekcji, co ilustruje poniższa tabela.

DZIEDZINA FUNKCJI EREKCYJNEJ IIEF (Zmiany od poziomu odniesienia)
Dawka jednostkowa związku (I)	n	Średnia ± SD	p
placebo	131	0,8 ± 5,3
2 mg	75	3,9 ± 6,1	< 0,001
⁵ mg	79	6,6 ± 7,1	< 0,001
10 mg	135	7,9 ± 6,7	< 0,001
25 mg	132	9,4 ± 7,0	< 0,001
50 mg	52	9,8 ± 5,5	< 0,001
100 mg	49	8,4 ± 6,1	< 0,001

n jest liczbą badanych osób, SD - odchylenie standardowe

Jednakże, podczas połączonych badań klinicznych zaobserwowano także, że odsetek pojawiających się w trakcie leczenia działań niepożądanych zwiększał się wraz ze zwiększaniem dawki jednostkowej związku (I), co ilustruje poniższa tabela.

PL 197 813 B1

Efekty niepożądane pojawiające się w trakcie leczenia (%)
Dawka jednostkowa związku (I) (mg)
Efekt	Placebo	2	5	10	25	50	100
Ból głowy	10	12	10	23	29	34	46
Niestrawność	6	3	14	13	19	20	25
Ból pleców	5	3	3	15	18	24	22
Ból mięśni	3	0	3	9	16	20	29
Katar	3	7	3	4	4	0	2
Zapalenie spojówek	1	0	1	1	0	2	5
Obrzęk powiek	0	0	0	1	1	2	3
Uderzenia gorąca	0	0	0	0	0	3	7
Zaburzenia widzenia	0	0	0	0	0	0	0

Powyższa tabela wskazuje na wzrost działań niepożądanych przy dawkach jednostkowych od 25 do 100 mg. Stosownie do tego, chociaż przy dawkach 25 do 100 mg obserwowano skuteczność leczenia ED, muszą być brane pod uwagę działania niepożądane obserwowane przy stosowaniu takich dawek.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dawki jednostkowe związku (I) od 1 mg do 20 mg, korzystnie od 2 mg do 20 mg, bardziej korzystnie od 5 mg do 20 mg i najbardziej korzystnie od 5 do 15 mg, podawane do maksymalnej dawki wynoszącej 20 mg na dobę, zarówno skutecznie leczą ED jak i minimalizują lub eliminują pojawianie się niepożądanych działań ubocznych. Co ważne, nie relacjonowano zaburzeń widzenia, a napady gorąca były zasadniczo wyeliminowane. Zaskakująco, poza leczeniem zaburzeń erekcji dawką jednostkową od 1 do 20 mg związku (I), przy minimalnych niepożądanych działaniach ubocznych, osoby leczone azotanami mogą także być leczone z powodu zaburzeń erekcji przy użyciu kompozycji według wynalazku.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kompozycja farmaceutycznej jednostki dawkowania zawierająca inhibitor fosfodiesterazy znamienna tym, że zawiera od 1 do 20 mg związku o wzorze (I) i jest odpowiednia do podawania doustnego w maksymalnej dawce całkowitej do 20 mg dziennie.
2. według zastrz. 1, znamienna tym, ze zawiera od 2 do 20 mg związku w j ednostce dawkowania.
3. według zas^z. 2, znamienna tym, że zawiera od 5 do 20 mg związku w j ednostce dawkowania.

PL 197 813 B1
4. Kompozycjawedługzastrz.3 ,z namiennatym. że tym, że zawierał O mg związkuw jednostce dawkowania.
5. Kompozycja według zasrrz. 3, znamienna tym, że zawiera 20 mg związku w jedno-Scc dawkowania.
6. Kompozacjaweeługzastrz.1 , ż.namiienaatymi. że zka/ieraomł dn5 mg związku w jednostce dawkowania.
7. Kompozycja widług zaarrz. 6, znamienaa tym. że zawierz 2,5 mg związku w jedno-Scc dawkowania.
8. Komgozacjawedługzastrz.6, znamiienaatymi. że zaa/jeraS mg za/iązkk w jedrłoztccddwkowania.
9. Komgozacjawedługzasrrz. 2, znamienaatyrn. że tadnozrkk ddwekmesia mg zooSta wwbzanz a gzupc zbdjmgjącdj cidca, tabldtkę, kapsułkę i kapsułkę edlowz.

O0. Komooaccja wddług aastza. O, namminaam tym, ed jddnostka dawkowania ma postać tabldtki. OO. Kzmozaccja wddług aastza. O, namminaam tym, ed jdst ozadanacazna do stosowania w ldcadniu stanu, w któzcg poezdand jdst hamzwanid PDE5.

O0. Kzmozaccja wddług aastzk. OO, namminaam tym, ed takig standg jdst dcsfunkcja sdksualna. O3. Kzmozaccja wddług aastza. O0, namminaam tym, ed dcsfunkcjz sdksualnz jdst aabuzadnid dzdkcji u męecacan.

O4. Komgozacjawedługzasrrz. 2 O, znamienaatyrn. że ddsruuOcjaseekuglnąj eds zaaurzaeie oobudadnia u kobidt.

O5. Zastosowanid jddnostki dawkowania aawidzającdj od O do 00 gg awizaku o wkozad do wctwazaania ldku do podawania w makscmalndj całkowitdj dawcd daidnndj do 00 gg, pzadanacazndgz do ldcadnia dcsfunkcji sdksualncch u wcmagającdgz takidgo ldcadnia pacjdnta.

O6. Zzsrozomesiewedług ζ.ιΤζ. 2O,znamienaatyrn. że I edj eds zrzadkoacazodd zPZdwesia w jddndj lub więcdj jddnostkach dawkowania aawidzajzccch O do 00 gg awizaku, ae do makscmalndj całkowitdj dawki daidnndj 00 gg awizaku.

O7. Zastozoz/esiewedług zaas-Za 1 O a Ibb1 O,, namiienaatyrn. żetednoztkkd nwekz/esioppZnja się zaa daidnnid.

O8. Zastozomesiezjedług zaas-Za . O a IbbO O,, namιienaatym. żetednoztkkd nwekmesioppZnja się jako wolnc ldk.

O9. Zzsrozomesiewedługzasrrz.1 O albbO O, znamιienaatym. że tednoztkkd nwekmesiazkwiet za 0 do 00 gg awizaku.

00. Zzsrozomesiewedług ζ.ιΤζ. 1 O, znamiienaa tyrn, żetednoztkk ddwekmesia zawiera5 dd20 gg awizaku.

0O. Zzsrozomesiewedług O,znamiienaa nyy^, że tednoztkk d nwekmesio zawiera 2,5mg awizaku.

00. Zzsrozomesiewedługzasrrz.1O, znam^ienaatym. że d ednoztkkddwekmesiazawiera5 mg awizaku.

03. Zzsrozomesie według zaatrz. . O, znamιienaatym. żetednoztkkd nwekmesioakwierał Omg awizaku.

PL 197 813 B1

24. Zastosowaniewedługzatrz.1 5, z namiennetym, że jednostkadawkowaniazawieral Omg związku i jrot praraoscasos ds psaswsois rsa łaidooid.

25. ZastosowaNe według zas^z. 15 albo 15, znamiennetym, że jednostka dnwakwania mg psotsć wyOrsoą z grupy sOdjmującdj cidca, tsOldtkę, kspoułkę i kspoułkę żdlswą.

26. Zsotsoswsoid wdłług asotra. 25, nemmineen tym, żd jdaosotks aswkswsois ms psotsć tsOldtki.

27. Zsotsoswsoid wdłług asotra. 15, nemmineen tym, żd ayofuokcją odkousloą jdot asOuradoid drdkcji u mężcayao.

28. Zantosowaniowadługzantrz.1 5, znemιieneetym^. że d ayfuuokjąs okkoglnąjest zaSOrzanie psOunadois u ksOidt.