PL196247B1 - Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), kompozycja immunologiczna i poliwalentna kompozycja immunologiczna, ich zastosowania oraz sposób wyrażania polipeptydu - Google Patents
Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), kompozycja immunologiczna i poliwalentna kompozycja immunologiczna, ich zastosowania oraz sposób wyrażania polipeptyduInfo
- Publication number
- PL196247B1 PL196247B1 PL330879A PL33087997A PL196247B1 PL 196247 B1 PL196247 B1 PL 196247B1 PL 330879 A PL330879 A PL 330879A PL 33087997 A PL33087997 A PL 33087997A PL 196247 B1 PL196247 B1 PL 196247B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- chv
- nucleotide sequence
- recombinant chv
- heterologous nucleotide
- recombinant
- Prior art date
Links
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 title claims description 145
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title abstract description 16
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 11
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 title description 4
- 241001559187 Human rubulavirus 2 Species 0.000 title description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 50
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 50
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 45
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 45
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 48
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 claims description 42
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 34
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 33
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 33
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 22
- 241000282465 Canis Species 0.000 claims description 15
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims description 12
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 claims description 12
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 8
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 claims description 7
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 7
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 claims description 6
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 claims description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 4
- 101001062679 Phocine distemper virus Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 3
- 101710136524 X polypeptide Proteins 0.000 claims description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims 2
- 101000621943 Acholeplasma phage L2 Probable integrase/recombinase Proteins 0.000 claims 1
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 claims 1
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 claims 1
- 101000618348 Allochromatium vinosum (strain ATCC 17899 / DSM 180 / NBRC 103801 / NCIMB 10441 / D) Uncharacterized protein Alvin_0065 Proteins 0.000 claims 1
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101000781117 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 12.4 kDa protein in CTL-LEF2 intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 claims 1
- 101000708323 Azospirillum brasilense Uncharacterized 28.8 kDa protein in nifR3-like 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000770311 Azotobacter chroococcum mcd 1 Uncharacterized 19.8 kDa protein in nifW 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 claims 1
- 101000748761 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized MFS-type transporter YcxA Proteins 0.000 claims 1
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 claims 1
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 claims 1
- 101000765620 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxP Proteins 0.000 claims 1
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 claims 1
- 101000916134 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqxJ Proteins 0.000 claims 1
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 claims 1
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 claims 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000754349 Bordetella pertussis (strain Tohama I / ATCC BAA-589 / NCTC 13251) UPF0065 protein BP0148 Proteins 0.000 claims 1
- 101000827633 Caldicellulosiruptor sp. (strain Rt8B.4) Uncharacterized 23.9 kDa protein in xynA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000947628 Claviceps purpurea Uncharacterized 11.8 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000686796 Clostridium perfringens Replication protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 claims 1
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 claims 1
- 101000788129 Escherichia coli Uncharacterized protein in sul1 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000788370 Escherichia phage P2 Uncharacterized 12.9 kDa protein in GpA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000787096 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in gldA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 claims 1
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 claims 1
- 101000976889 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 19.2 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000827627 Klebsiella pneumoniae Putative low molecular weight protein-tyrosine-phosphatase Proteins 0.000 claims 1
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 claims 1
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 claims 1
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 claims 1
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 claims 1
- 101001130841 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF5 Proteins 0.000 claims 1
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 claims 1
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 claims 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 claims 1
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000974028 Rhizobium leguminosarum bv. viciae (strain 3841) Putative cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 claims 1
- 101000756519 Rhodobacter capsulatus (strain ATCC BAA-309 / NBRC 16581 / SB1003) Uncharacterized protein RCAP_rcc00048 Proteins 0.000 claims 1
- 101000948219 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 11.5 kDa protein in thcD 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 claims 1
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 claims 1
- 101000936711 Streptococcus gordonii Accessory secretory protein Asp4 Proteins 0.000 claims 1
- 101000929863 Streptomyces cinnamonensis Monensin polyketide synthase putative ketoacyl reductase Proteins 0.000 claims 1
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000788468 Streptomyces coelicolor Uncharacterized protein in mprR 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 claims 1
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 claims 1
- 101000845085 Streptomyces violaceoruber Granaticin polyketide synthase putative ketoacyl reductase 1 Proteins 0.000 claims 1
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 claims 1
- 101000711771 Thiocystis violacea Uncharacterized 76.5 kDa protein in phbC 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000711318 Vibrio alginolyticus Uncharacterized 11.6 kDa protein in scrR 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 claims 1
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 claims 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 18
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 abstract description 13
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 3
- 101100328890 Arabidopsis thaliana COL3 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101100328893 Arabidopsis thaliana COL5 gene Proteins 0.000 abstract 1
- 229940124841 Herpesvirus vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 95
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 74
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 52
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 20
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 16
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 15
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 13
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 12
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 101000743335 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable terminase, endonuclease subunit Proteins 0.000 description 8
- 101000976893 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 14.1 kDa protein in cox-rep intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000786921 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 26.0 kDa protein in rep-hol intergenic region Proteins 0.000 description 8
- 101000820589 Homo sapiens Succinate-hydroxymethylglutarate CoA-transferase Proteins 0.000 description 8
- 101000790838 Klebsiella pneumoniae UPF0053 protein in cps region Proteins 0.000 description 8
- 101000770899 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Uncharacterized 24.3 kDa protein Proteins 0.000 description 8
- 101000748499 Rhodobacter capsulatus Uncharacterized 104.1 kDa protein in hypE 3'region Proteins 0.000 description 8
- 102100021652 Succinate-hydroxymethylglutarate CoA-transferase Human genes 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 101150082239 G gene Proteins 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 108700002232 Immediate-Early Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000700587 Alphaherpesvirinae Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062176 ORF5 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 1
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 1
- 108050007496 Shikimate kinase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/015—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus, human parvovirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16741—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16743—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
- C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/20011—Rhabdoviridae
- C12N2760/20111—Lyssavirus, e.g. rabies virus
- C12N2760/20122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Rekombinowany psi wirus herpes (CHV) obejmujacy i wyrazajacy co najmniej jedna hetero- logiczna sekwencje nukleotydowa kodujaca antygen wybrany z grupy skladajacej sie z antygenu HA wirusa nosówki psiej, F wirusa nosówki psiej, G wirusa wscieklizny, VP2 psiego parwowirusa, HA psiego wirusa paragrypy typu 2, F psiego wirusa paragrypy typu 2, OspA Borrelia burgdorferi i OspB Borrelia burgdorferi. PL PL PL PL
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11)196247 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 330879 (22) Data zgłoszenia: 23.06.1997 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
23.06.1997, PCT/FR97/01115 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
31.12.1997, WO97/49825 PCT Gazette nr 57/97 (51) Int.Cl.
C12N 15/86 (2006.01) C12N 15/38 (2006.01) C12N 7/01 (2006.01) A61K 39/295 (2006.01) C07K 14/015 (2006.01) C07K 14/115 (2006.01) C07K 14/13 (2006.01)
| C07K 14/145 (2006.01) | |
| (54) Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), kompozycja immunologiczna i poliwalentna (54) kompozycja immunologiczna, ich zastosowania oraz sposób wyrażania polipeptydu | |
| (30) Pierwszeństwo: 27.06.1996,FR,96/08242 | (73) Uprawniony z patentu: MERIAL,Lyon,FR |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 07.06.1999 BUP 12/99 | (72) Twórca(y) wynalazku: Jean-Christophe Audonnet,Lyon,FR Philippe Baudu,Craponne,FR |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: | (74) Pełnomocnik: Janina Kossowska, PATPOL Sp. z o.o. |
| 31.12.2007 WUP 12/07 |
(57) 1. Rekombinowany psi wirus herpes (CHV) obejmujący i wyrażający co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen wybrany z grupy składającej się z antygenu HA wirusa nosówki psiej, F wirusa nosówki psiej, G wirusa wścieklizny, VP2 psiego parwowirusa, HA psiego wirusa paragrypy typu 2, F psiego wirusa paragrypy typu 2, OspA Borrelia burgdorferi i OspB Borrelia burgdorferi.
PL 196 247B1
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany psi wirus herpes (CHV), kompozycja immunologiczna, poliwalentna kompozycja immunologiczna, zastosowanie rekombinowanego CHV, zastosowanie kompozycji immunologicznej, zastosowanie poliwalentnej kompozycji immunologicznej oraz sposób wyrażania polipeptydu.
Psia herpeswiroza spowodowana jest przez psiego wirusa herpes (CHV). Psi wirus herpes (CHV) zaklasyfikowany jest do rodziny Alphaherpesvirinae. Wirus herpes jest głównym patogenem dla nowonarodzonych szczeniąt. Psia herpeswiroza u zwierząt dorosłych objawia się głównie chorobą krwotoczną oraz łagodną chorobą górnych dróg oddechowych. Obecnie nie istnieją szczepionki chroniące szczenięta przed psią herpeswirozą.
Psy domowe narażone są na liczne inne choroby, dlatego opracowanie szczepionki opartej na wektorze zdolnym do wyrażania różnych antygenów psich czynników patogennych powinno umożliwić uproszczenie i ulepszenie programów szczepień, zwłaszcza dla szczeniąt w hodowlach (kenelach).
Wśród czynników patogennych o dużym znaczeniu dla psów można wymienić wirus choroby Carre, wirus zapalenia wątroby Rubartha, wirus wścieklizny, wirus psiej parwowirozy, psi coronawirus, wirus paragrypy typu 2, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Leptospira spp. i Leishmania infantum.
Niewiele wiadomo o genomie wirusa CHV. Budowa genomu tego wirusa została ostatnio opublikowana (Remond M. i in., J. Gen. Virol. 1996, 77:37-48), ale opisano jedynie trzy geny głównych glikoprotein gB, gC i gD, jak również gen oznaczony CHV ORF2 (Limbach K. i in., J. Gen. Virol. 1994, 75:2029-2039).
W następstwie powyższych prac nad CHV twórcom niniejszego wynalazku udało się określić kilka regionów, które nie są istotne dla replikacji in vitro, które okazały się przydatne do konstruowania rekombinowanych wirusów CHV. Twórcy wynalazku po raz pierwszy wykorzystali rekombinowane wirusy CHV do wytwarzania opartych na tych wektorach szczepionek dla psów. Stwierdzono, że szczepionkowe wektory według wynalazku mają szczególne zalety jako szczepionki dla psów. Psi wirus herpes jest niezwykle swoisty gatunkowo i posiada duży genom zawierający kilka potencjalnych miejsc wprowadzenia, przez co możliwe jest równoczesne wprowadzenie kilku kaset ekspresji heterologicznych genów. Daje to możliwość szczepienia psów przeciwko różnym czynnikom patogennym w tym samym czasie przy użyciu pojedynczego rekombinowanego wirusa.
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie szczepionkowego wektora umożliwiającego ekspresję immunogenów psich patogenów w celu ochrony psów przeciwko głównym chorobom zakaźnym psów.
Celem wynalazku jest również dostarczenie wektora umożliwiającego szczepienie psów, a zwłaszcza szczeniąt posiadających przeciwciała matczyne, drogą śluzówkową, w szczególności doustną, donosową albo dospojówkową.
Celem wynalazku jest ponadto dostarczenie wektora, który umożliwia równoczesne szczepienie szczeniąt przeciwko herpeswirozie.
Według wynalazku rekombinowany psi wirus herpes (CHV) obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen wybrany z grupy składającej się z antygenu HA wirusa nosówki psiej, F wirusa nosówki psiej, G wirusa wścieklizny, VP2 psiego parwowirusa, HA psiego wirusa paragrypy typu 2, F psiego wirusa paragrypy typu 2, OspA Borrelia burgdorferi i OspB Borrelia burgdorferi.
Korzystnie sekwencja/sekwencje nukleotydowa/e jest/są wstawiona/e w co najmniej jedno miejsce wybrane z grupy składającej się z ORF5 (Id. Sekw. nr 7), ORF3 (Id. Sekw. nr 5), genu kinazy tymidynowej oraz regionu międzygenowego znajdującego się pomiędzy ORF 19 CHV a ORF 22 CHV przez prostą insercję, lub po całkowitej lub częściowej delecji.
W korzystnym rekombinowanym CHV co najmniej jedna heterologicznasekwencja nukleotydową jest wstawiona przez prostą insercję, lub po całkowitej lub częściowej delecji locus insercyjnego.
Korzystny rekombinowany CHV dodatkowo obejmuje silny promotor eukariotyczny, do którego jest funkcjonalnie podłączona co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa, który korzystnie obejmuje bezpośrednio-wczesny promotor CMV, korzystnie bezpośrednio-wczesny promotor mysiego albo ludzkiego CMV.
PL 196 247B1
W korzystnym wykonaniu wynalazku rekombinowany CHV obejmuje przynajmniej dwie heterologiczne sekwencje nukleotydowe wprowadzone w przynajmniej jednym miejscu insercji, z których każda jest pod kontrolą innego promotora eukariotycznego. Korzystnymi eukariotycznymi promotorami są bezpośrednio-wczesne promotory CMV różnego pochodzenia zwierzęcego.
Rekombinowany CHV korzystnie obejmuje pierwszą heterologiczną sekwencję nukleotydową funkcjonalnie połączoną z pierwszym promotorem i drugą heterologiczną sekwencję nukleotydową funkcjonalnie połączoną z drugim promotorem, przy czym pierwszy promotor obejmuje bezpośrednio-wczesny promotor CMV, i, pierwszy i drugi promotor sąsiadują ze sobą końcami 5'. Korzystnie heterologiczna sekwencja nukleotydowa obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z sekwencji nukleotydowych kodujących cytokiny.
Rekombinowany CHV ponadto korzystnie obejmuje co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą immunomodulujący polipeptyd.
W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku heterologiczna sekwencja nukleotydowa rekombinowanego CHV obejmuje kasetę ekspresji obejmującą od 5' do 3' promotor, dwa lub więcej regionów kodujących rozdzielonych parami przez IRES (wewnętrzne miejsca inicjacji translacji) i sygnał poliadenylacji.
Korzystny rekombinowany CHV obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA wirusa nosówki psiej.
Inny korzystny rekombinowany CHV obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen F wirusa nosówki psiej.
Kolejny korzystny rekombinowany CHV obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen G wirusa wścieklizny.
Korzystny jest również rekombinowany CHV obejmujący i wyrażający co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen VP2 psiego parwowirusa.
Korzystnie rekombinowany CHV obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA wirusa paragrypy typu 2.
Inny korzystny rekombinowany CHV obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen F wirusa paragrypy typu 2.
Następny korzystny rekombinowany CHV obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen OspA z Borrelia burgdorferi.
Rekombinowany CHV korzystnie obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen OspB z Borrelia burgdorferi.
Korzystny jest również rekombinowany CHV, w którym co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje antygen.
W innym korzystnym wykonaniu rekombinowanego CHV co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje immunomodulacyjny polipeptyd.
Twórcy wynalazku wyizolowali i przeanalizowali fragment genomu wirusa CHV, w którym scharakteryzowali 5 otwartych ramek odczytu (od ORF1 do ORF5), wśród których stwierdzono, że dwie (ORF3 i ORF5) nie są istotne dla replikacji in vitro. Ponadto stwierdzili że inne regiony genomu CHV można również stosować do wprowadzania obcych genów. Tymi miejscami wprowadzania są: gen kinazy tymidynowej (CHV TK ORF) (Remond i in., Virus Research 1995, 39:341-354) i sekwencje położone pomiędzy CHV ORF19 i CHV ORF22 (Remond i in., J. Gen. Virol. 1996, 76:37-48). Miejsca te opisano szczegółowo w części opisu dotyczącej.
Korzystnie, wprowadzona sekwencja koduje polipeptyd antygenowy, a zwłaszcza polipeptyd antygenowy psiego czynnika chorobotwórczego. Możliwe jest również wprowadzenie sekwencji kodujących białka immunomodulacyjne, takie jak cytokiny. Możliwe jest również zastosowanie kombinacji sekwencji kodującej cytokinę albo podobnej, i sekwencji kodującej antygen. Jeżeli to konieczne, można zastosować kilka cytokin w kombinacji, ewentualnie w kombinacji z jedną albo wieloma sekwencjami kodującymi antygeny.
Insercję do miejsc przeprowadza się przez proste wprowadzenie (bez delecji) albo po częściowej albo całkowitej delecji jednej albo wielu ORF zastosowanych jako miejsce insercji.
Jako wirus wyjściowy do konstruowania rekombinowanych wirusów CHV korzystnie można zastosować CHV szczep F205, który wyizolował Carmichael (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965, 120:644-650).
W celu ekspresji heterologicznych genów wprowadzonych do genomu CHV korzystne jest zastosowanie silnego promotora eukariotycznego, takiego jak, korzystnie, bezpośrednio-wczesny (IE) promotor wirusa cytomegalii (CMV). Przez określenie „promotor CMV IE rozumie się w szczególności
PL 196 247B1 fragment taki jak podano w przykładach, jak również jego podfragmenty zachowujące tę samą aktywność promotora. Promotor CMV IE może być promotorem ludzkim (MCMV IE) albo mysim (MCMV IE) albo, alternatywnie, promotorem CMV IE innego pochodzenia, przykładowo szczurzym, świnki morskiej albo świńskim.
W jedno miejsce można wprowadzić przynajmniej dwie sekwencje nukleotydowe pod kontrolą różnych promotorów. Promotory mogą być, w szczególności, promotorami CMV IE różnego pochodzenia.
Korzystnie stosuje się inny promotor w kombinacji z promotorem CMV IE w taki sposób, że końce 5' dwóch promotorów sąsiadują ze sobą, zaś transkrypcje rozpoczynające się z tych dwóch promotorów zachodzą w przeciwnych kierunkach. To szczególne ułożenie umożliwia wprowadzenie dwóch sekwencji nukleotydowych w tym samym miejscu, jednej pod kontrolą promotora CMV IE, zaś drugiej pod kontrolą promotora zastosowanego w kombinacji. Konstrukcja ta jest warta wspomnienia z uwagi na fakt, że obecność promotora CMV IE i jego części wzmacniającej może aktywować transkrypcję wywołaną przez promotor zastosowany w kombinacji. Jako promotor zastosowany w kombinacji można wymienić, przykładowo, promotor CMV innego pochodzenia niż pierwszy z promotorów. Możliwe jest również zastosowanie innych promotorów, takich jak promotor RNA1.8 wirusa choroby Marek'a (MDV) (Bradley i in., J. Virol. 1989, 63:2534-2542).
Sekwencja nukleotydowa wprowadzona do wektora CHV w celu jej wyrażenia może być dowolną sekwencją kodującą polipeptyd antygenowy psiego czynnika chorobotwórczego, zdolny po wyrażeniu go w odpowiednich warunkach, do doprowadzenia do immunizacji prowadzącej do skutecznej ochrony szczepionego zwierzęcia przed czynnikiem patogennym. Sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny będące przedmiotem zainteresowania w danej chorobie, w szczególności w wymienionych wyżej chorobach wirusowych, bakteryjnych albo pasożytniczych, można wprowadzać w warunkach opisanych w niniejszym wynalazku.
Typowym przykładem zastosowania rozwiązań według wynalazku jest wprowadzenie przynajmniej jednej sekwencji nukleotydowej kodującej odpowiednio polipeptyd wirusa choroby Carre (wirus psiej zarazy = CDV) i korzystnie polipeptyd HA CDV (Sidhu i in., Virology 1993, 193:66-72) albo polipeptyd F CDV (Barrett i in., Virus Res. 1987, 8:373-386). Możliwe jest również wprowadzenie obu tych genów do wektora CHV. Uzyskuje się w ten sposób szczepionkę chroniącą przed chorobą Carre.
W korzystnym wykonaniu wynalazku wprowadza się sekwencje nukleotydowe kodujące antygeny albo fragmenty antygenów wirusa wścieklizny genu G (patenty FR-A-2,515,685 i EP-A-162,757), wirusa psiej parwowirozy (gen VP2) (Parrish i in., J. Virol. 1991, 65:6544-6552) albo wirusa paragrypy typu 2 (gen HA i/lub F). Możliwe jest również wprowadzenie sekwencji kodujących antygeny Borrelia burgdorferi, zwłaszcza geny kodujące antygeny OspA i OspB (Bergstrom i in., Mol. Microbiol. 1989, 3:479-486).
W typowym wykonaniu wynalazku szczepionka obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą antygen wirusa choroby Carre pod kontrolą CMV IE oraz sekwencję nukleotydową kodującą antygen innej psiej choroby wirusowej, w szczególności wymienionych wyżej, pod kontrolą innego promotora.
Naturalnie, sekwencje heterologiczne razem ze związanymi z nimi promotorami można wprowadzać w sposób konwencjonalny w ustawieniu tandemowym w miejscu wprowadzania, tzn. w tym samym kierunku transkrypcji.
Ekspresja kilku genów heterologicznych wprowadzonych w locus insercyjne możliwa jest również przez wprowadzenie sekwencji znanych jako „IRES (wewnętrzne miejsce inicjacji translacji), pochodzących w szczególności z picornawirusów, takich jak wirus pryszczycy świń (SVDV; Chen i in., J. Virol. 1993, 67:2142-2148), wirus zapalenia mózgu i mięśnia serca (EMCV, Kaufman i in., Nucl. Acids Res. 1991, 19:4485-4490) albo wirus pryszczycy (FMDV, Luz i Beck, J. Virol. 1991, 65:6486-6494),albo innego pochodzenia. Treść tych trzech publikacji załączona jest jako odnośnik. Kaseta ekspresji dwóch genów powinna więc mieć minimalną budowę: promotor - gen 1 -IRES - gen 2 - sygnał poliadenylacji. Rekombinowana żywa szczepionka oparta na rekombinowanym CHV według wynalazku może więc obejmować wprowadzone w locus, kasetę ekspresji obejmującą kolejno: promotor, dwa albo więcej genów oddzielonych parami przez IRES oraz sygnał poliadenylacji.
Oprócz wprowadzenia sekwencji w locus, możliwe jest przeprowadzenie w genomie jednej albo więcej insercji w inne miejsce, jednej albo wielu mutacji albo jednej albo wielu delecji. We wszystkich przypadkach, wprowadzenie w locus innym niż opisane powyżej umożliwia ekspresję innych genów.
PL 196 247B1
Zastosowanie rekombinowanych wirusów według wynalazku umożliwia ochronę psów przed jedną albo wieloma wymienionymi chorobami i równocześnie przed psią herpeswirozą.
Wynalazek również dotyczy kompozycji immunologicznej obejmującej rekombinowany CHV według wynalazku.
Zakresem wynalazku jest również objęta poliwalentna kompozycja immunologiczna obejmująca jako mieszaninę albo składniki do zmieszania, przynajmniej pierwszy rekombinowany CHV i drugi rekombinowany CHV według wynalazku przy czym heterologiczna sekwencja nukleotydowa pierwszego rekombinowanego CHV różni się od heterologicznej sekwencji nukleotydowej drugiego rekombinowanego CHV.
Wynalazek również dotyczy zastosowania rekombinowanego CHV według wynalazku do wytworzenia kompozycji do podawania psu przeznaczonej do indukowania odpowiedzi immunologicznej u psa, którą korzystnie podaje się dośluzówkowo w dawce obejmującej pomiędzy 102 do 105 CCID50 rekombinowanego CHV.
Zakresem wynalazku objęte jest również zastosowanie kompozycji immunologicznej według wynalazku do wytworzenia leku do podawania psu przeznaczonego do indukowania odpowiedzi immunologicznej, który korzystnie podaje się dośluzówkowo w dawce obejmującej pomiędzy 102 do 105 CCID50 rekombinowanego CHV.
Wynalazek dotyczy również sposobu wyrażania polipeptydu, który obejmuje kontaktowanie odpowiedniej komórki z rekombinowanym CHV według wynalazku.
Stosując kompozycję obejmującą rekombinowany psi wirus według wynalazku można prowadzić szczepienia, zwłaszcza psów, podczas których skuteczną ilość szczepionki podaje się dowolną drogą pozajelitową albo śluzówkową, ale korzystnie drogą śluzówkową, w szczególności drogą doustną i/lub donosową. Dawka szczepienna korzystnie mieści się w zakresie od 102 CCID50 do 107 CCID50.
Korzystnie, dawka do podawania pozajelitowego powinna wynosić od 104 CCID50 do 107 CCID50, 25 zaś do podawania drogą doustną i/lub donosową od 102 CCID50 do 105 CCID50. Jak określono, szczepionka zwykle jest skuteczna po pojedynczym podaniu drogą doustną i/lub donosową. Jednakże, mogą być konieczne kolejne podania.
Fragmenty DNA obejmujące sekwencję określoną jako Id. Sekw. nr 1 (fig. 1) od 1do 6216, w szczególności całość albo część miejsca określonego jako ORF3 i/lub sekwencji flankujących położonych powyżej albo poniżej tego miejsca, są szczególnie przydatne jako ramiona flankujące w technice rekombinacji homologicznej z genomem wirusa CHV wybranego jako wirus rodzicielski. Naturalnie, w rozwiązaniach według wynalazku można zastosować również odmiany tych fragmentów, które odpowiadają sekwencjom zamiennym innych szczepów CHV. Specjalista w dziedzinie może dowolnie wybrać regiony służące jako ramiona otaczające w połączeniu z rodzajem wprowadzania (z delecją albo bez) albo delecji (częściowej albo całkowitej). Ogólnie, ramiona flankujące mogą mieć od 100 do 800 par zasad, ale mogą być dłuższe jeżeli to konieczne.
Wynalazek zostanie dalej opisany przez nieograniczające przykłady, w odniesieniu do następujących figur:
Figura 1: Sekwencja regionu CHV (6216 par zasad) i translacja różnych ramek odczytu (ORF) występujących w sekwencji (ORF1 do ORF5).
Figura 2: Plazmid pPB200 (plazmid donorowy do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce ORF3 CHV).
Figura 3: Budowa plazmidu pPB202 (plazmid donorowy do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce ORF5 CHV).
Figura 4: Budowa plazmidu pPB204 (plazmid donorowy do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce TK CHV).
Figura 5: Budowa plazmidu pPB206 (plazmid donorowy do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce położone pomiędzy genami ORF19 i ORF22 CHV).
Figura 6: Budowa plazmidu pPB208 (kaseta ekspresji dla genu HA CHV).
Figura 7: Budowa plazmidu pPB210 (kaseta ekspresji dla genu F CHV).
Figura 8: Budowa plazmidu pPB213 (plazmid donorowy do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce ORF3 CHV).
Figura 9: Budowa plazmidu pPB214 (plazmid donorowy do wprowadzania kasety ekspresji genu F CDV w miejsce ORF3 CHV).
Figura 10: Plazmid pPB200'
Figura 11: Budowa plazmidu pPB212 (kaseta ekspresji dla genu G wirusa wścieklizny).
PL 196 247B1
Figura 12: Budowa plazmidu pPB215 (plazmid donorowy do wprowadzania kasety ekspresji genu G wścieklizny w miejsce ORF3 CHV).
Figura 13: Budowa plazmidu pPB216 (plazmid donorowy do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce ORF5 CHV).
Figura 14: Budowa plazmidu pPB217 (plazmid donorowy do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce TK CHV).
Figura 15: Budowa plazmidu pPB218 (plazmid donorowy do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce położone pomiędzy genami ORF19 i ORF22 CHV).
Lista sekwencji Id. Sekw. do konstrukcji w miejscach wprowadzania wektora CHV:
Id. Sekw. nr 1 Całkowita sekwencja regionu ORF1®ORF5 CHV przedstawionego na figurze 1
Id. Sekw. nr 2 Sekwencja aminokwasowa ORF1 z figury 1
Id. Sekw. nr 3 Sekwencja aminokwasowa ORF2 z figury 1
Id. Sekw. nr 4 Sekwencja aminokwasowa ORF3 z figury 1
Id. Sekw. nr 5 Sekwencja aminokwasowa ORF4 z figury 1
Id. Sekw. nr 6 Sekwencja aminokwasowa (częściowa) ORF5 z figury 1
Id. Sekw. nr 7 Oligonukleotyd JCA070
Id. Sekw. nr 8 Oligonukleotyd JCA071
Id. Sekw. nr 9 Oligonukleotyd JCA072
Id. Sekw. nr 10 Oligonukleotyd JCA073
Id. Sekw. nr 11 Oligonukleotyd JCA074
Id. Sekw. nr 12 Oligonukleotyd JCA075
Id. Sekw. nr 13 Oligonukleotyd JCA076
Id. Sekw. nr 14 Oligonukleotyd JCA077
Id. Sekw. nr 15 Oligonukleotyd JCA078
Id. Sekw. nr 16 Oligonukleotyd JCA079
Id. Sekw. nr 17 Oligonukleotyd JCA080
Id. Sekw. nr 18 Oligonukleotyd JCA081
Id. Sekw. nr 19 Oligonukleotyd JCA082
Id. Sekw. nr 20 Oligonukleotyd JCA083
Id. Sekw. nr 21 Oligonukleotyd JCA084
Id. Sekw. nr 22 Oligonukleotyd JCA085
Id. Sekw. nr 23 Oligonukleotyd PB088
Id. Sekw. nr 24 Oligonukleotyd PB089
Id. Sekw. nr 25 Oligonukleotyd JCA086
Id. Sekw. nr 26 Oligonukleotyd JCA087
Id. Sekw. nr 27 Oligonukleotyd JCA088
Id. Sekw. nr 28 Oligonukleotyd JCA089
Id. Sekw. nr 29 Oligonukleotyd JCA090
Id. Sekw. nr 30 Oligonukleotyd JCA091
P r z y k ł a d y
Konstruowanie plazmidów przeprowadzono stosując techniki standardowe w biologii molekularnej opisane w Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nowy York, 1989). Wszystkie opisane fragmenty restrykcyjne wyizolowano stosując zestaw „Geneclean (BIO 101 Inc., La Jolla, CA).
Wirusem zastosowanym jako wirus rodzicielski był szczep F205 psiego wirusa herpes (znany również jako szczep Carmichael'a). Szczep ten uzyskano od Dr L. Carmichael (Cornell University, NY), który wyizolował go i opisał jego charakterystykę biologiczną (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1965, 120:644-650). Stosowano następujące warunki hodowli: komórki MDCK (komórki nerki psa Madin-Darby ATCC CCL34) hodowane w minimalnej pożywce Eagle'a (pożywka MEM) zaszczepiano szczepem F205 CHV stosując wielokrotność zakażenia równą 1. Zakażone komórki inkubowano następnie w 37°C przez około 36 godzin, dopóki nie obserwowano całkowitego efektu cytopatycznego.
P r z y k ł a d 1: Ekstrakcja DNA psiego wirusa herpes
Po hodowli, nadsącz i rozłożone komórki zbierano i wirowano całość zawiesiny wirusa przy 1000 g przez 10 minut w +4°C w celu usunięcia resztek komórkowych. Cząstki wirusowe zbierano przez ultrawirowanie przy 400000 g przez godzinę w +4°C. Osad pobierano w minimalnej objętości bufora (10 mM Tris, 1mM EDTA). Stężoną zawiesinę wirusa traktowano proteinazą K (100 mg/ml)
PL 196 247B1 w obecności soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) (0,5%) przez 2 godziny w 37°C. Wirusowy DNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform, a następnie precypitowano 2 objętościami absolutnego etanolu. Po całonocnej inkubacji w -20°C precypitowany DNA wirowano przy 10000 g przez 15 minut w +4°C. Osad DNA suszono i pobierano w minimalnej objętości sterylnej ultraczystej wody.
P r z y k ł a d 2: Klonowanie i charakterystyka regionu ORF1-ORF5 CHV
Oczyszczony genomowy DNA szczepu F205 wirusa CHV trawiono enzymami restrykcyjnymi
Scal i Xhol, i fragment ScaI-XhoI wielkości około 6200 bp klonowano do wektora pBluescript SKII+ (Stratagene, nr 212205), trawionego uprzednio Scal i Xhol, otrzymując plazmid pPB154.
Fragment XhoI-ScaI sklonowany do plazmidu pPB154 sekwencjonowano całkowicie na obu niciach otrzymując sekwencję wielkości 6216 bp pokazaną na figurze 1(Id. Sekw. nr 1).
W sekwencji tej zidentyfikowano kilka otwartych ramek odczytu większych niż 65 aminokwasów (figura 1).
Pierwsza otwarta ramka odczytu (ORF1) (pozycje 1353-157) występuje na nici komplementarnej i koduje polipeptyd długości 398 aminokwasów (Id. Sekw. nr 2).
Druga otwarta ramka odczytu (ORF2) (pozycje 1708-2970) koduje polipeptyd długości 420 aminokwasów (Id. Sekw. nr 3).
Trzecia otwarta ramka odczytu (ORF3) (pozycje 3040-4242) koduje polipeptyd długości 400 aminokwasów (Id. Sekw. nr 4).
Czwarta otwarta ramka odczytu (ORF4) (pozycje 4374-5753) koduje polipeptyd długości 459 aminokwasów (Id. Sekw. nr 5).
Piąta otwarta ramka odczytu (ORF5) (pozycje 5872-6216) jest niekompletna i koduje okrojone białko długości 115 aminokwasów (Id. Sekw. nr 6).
Różne ramki odczytu zestawiono w tabeli poniżej:
| Otwarta ramka odczytu | Początek - koniec (pozycje na fig. 1) | Długość w aminokwasach |
| ORF1 | 1353-157 | 398 aa |
| ORF2 | 1708-2970 | 420 aa |
| ORF3 | 3040-4242 | 400 aa |
| ORF4 | 4374-5753 | 459 aa |
| ORF5 | 5872-6216 | 115 aa |
P r z y k ł a d 3: Konstruowanie plazmidu pPB200 w celu wprowadzania kaset ekspresji do miejsca ORF3 CHV (figura 2)
Plazmid pPB154 (9121 bp) (przykład 2) trawiono Hindlll i Spel w celu wyizolowania fragmentu Hindlll-Spel wielkości 620 bp (fragment A). Plazmid pPB154 trawiono EcoRI i Spel w celu wyizolowania fragmentu EcoRI-Spel wielkości 659 bp (fragment B). Fragment A i B poddano ligacji w wektorze pGEM4Z (Promega, nr P2161), uprzednio trawionym EcoRI i Hindlll, otrzymując plazmid pPB199 (4096 bp). Plazmid ten trawiono Spel, traktowano fosfatazą alkaliczną i poddano ligacji w miejscu klonowania otrzymanym przez hybrydyzację następujących 2 oligonukleotydów:
JCA070 (33-mer) (Id. Sekw. nr 7)
5' CTAGTCCAGCAAGGTGGATCGATATCGGGCCCA 3'
JCA071 (33-mer) (Id. Sekw. nr 8)
5' CTAGTGGGCCCGATATCGATCCACCTTGCTGGA 3' otrzymując plazmid pPB200 (4129 bp).
P r z y k ł a d 4: Konstruowanie plazmidu pPB202 do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce ORF5 CHV (figura 3)
Sekwencję genu ORF5 CHV opisano niedawno (Limbach i in., J. Gen. Virol. 1994, 75:2029-2039). Przeprowadzono reakcję PCRz genomowym DNA szczepu F205 wirusa CHV (przykład 1) i następującymi oligonukleotydami:
JCA072 (22-mer) (Id. Sekw. nr 9)
5' CAGCTTTATGTTTTTATTGTTC 3'
JCA073 (29-mer) (Id. Sekw. nr 10)
5' AAAGAATTCTACAACTGTTTAATAAAGAC 3'
PL 196 247B1 w celu otrzymania fragmentu PCRwielkości 751 bp, zawierającego kompletny gen ORF2 CHV. Fragment ten trawiono Bglll i EcoRI w celu wyizolowania fragmentu Bglll-EcoRI wielkości 709 bp. Fragment ten poddano ligacjiz wektorem pGEM4Z (Promega, nr P2161), uprzednio trawionym EcoRI i BamHI, otrzymując plazmid pPB201 (3559 bp). Plazmid pPB201 trawiono Scal i PvuII, a następnie poddano ligacji z miejscem klonowania otrzymanym przez hybrydyzację następujących dwóch oligonukleotydów:
JCA074 (36-mer) (Id. Sekw. nr 11)
5' ACTCCAGCTACATGGGATATCGGGCCCATCGATCAG 3'
JCA075 (36-mer) (Id. Sekw. nr 12)
5' CTGATCGATGGGCCCGATATCCCATGTAGCTGGAGT 3' otrzymując plazmid pPB202 (3395 bp).
P r z y k ł a d 5: Konstruowanie plazmidu pPB204 do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce
TK CHV (figura 4)
Sekwencję genu kinazy tymidynowej (TK) CHV opisano niedawno (Remond M. i in., Virus Research 1995, 39:341-354). Reakcję PCR przeprowadzono z genomowym DNA szczepu F205 wirusa CHV (przykład 1) i następującymi oligonukleotydami:
JCA076 (35-mer) (Id. Sekw. nr 13)
5' AGCGTTAACCTCAAAAGCCAAATTTACACTTCCCG 3'
JCA077 (38-mer) (Id. Sekw. nr 14)
5' CCCAAGCTTTTCTAAAGCCCATTTATAAATAATAAATG 3' otrzymując fragment PCR wielkości 1030 bp, zawierający gen kinazy tymidynowej (TK).Fragment ten trawiono Hpal i Hindlll w celu wyizolowania fragmentu Hpal-Hindlll wielkości 1019 bp. Fragment ten poddano ligacji z wektorem pSP73 (Promega, nr P2221), uprzednio trawionym EcoRV i Hindlll, otrzymując plazmid pPB203 (3423 bp).
Plazmid pPB203 trawiono EcoRI i StyI, a następnie poddano ligacji z miejscem klonowania otrzymanym przez hybrydyzację następujących dwóch oligonukleotydów:
JCA078 (36-mer) (Id. Sekw. nr 15)
5' AATTCCCAGCTACATGGGATATCGGGCCCATCGATC 3'
JCA079 (36-mer) (Id. Sekw. nr 16)
5' CAAGGATCGATGGGCCCGATATCCCATGTAGCTGGG 3' otrzymując plazmid pPB204 (3399 bp).
P r z y k ł a d 6: Konstruowanie plazmidu pPB206 do wprowadzania kaset ekspresji w miejsce położone pomiędzy genami ORF19 i ORF22 CHV (figura 5)
Niedawno opublikowano sekwencję między-genowego regionu odpowiadającego naturalnej delecji genów kodujących podjednostkę większą (gen „PR1) i podjednostkę mniejszą (gen „PR2) reduktazy rybonukleotydowej (Remond M. i in., J. Gen. Virol. 1996, 77:37-48). Według nomenklatury zastosowanej wpublikacji Remond i in., delecja tych dwóch genów nastąpiła pomiędzy ramkami odczytu oznaczonymi CHV „orf19 i CHV „orf22 (określanymi dalej, odpowiednio, jako ORF19 i ORF22). Reakcję PCR przeprowadzono z genomowym DNA szczepu F205 wirusa CHV (przykład 1) i następującymi oligonukleotydami:
JCA080 (36-mer) (Id. Sekw. nr 17)
5' GGAGATCTAGTAAATTAAATAGTAATTCATTTAATG 3'
JCA081 (33-mer) (Id. Sekw. nr 18)
5' CAGTCGCGAAGATGAAAATAAAATCCATCGAAG 3' otrzymując fragment PCR wielkości 720 bp, zawierający między-genowy region odpowiadający naturalnej delecji genów ORF19 i ORF22. Fragment ten trawiono Spel i NruI w celu wyizolowania fragmentu Spel-NruI wielkości 709 bp. Fragment ten poddano ligacji z wektorem pGEM4Z (Promega, nr P2161), uprzednio trawionym Smal i Xbal, otrzymując plazmid pPB205 (3572 bp). Plazmid pPB205 trawiono MfeI, a następnie częściowo trawiono Sspl w celu wyizolowania fragmentu Mfel-SspI wielkości 3512 bp. Fragment ten poddano ligacji z miejscem klonowania otrzymanym przez hybrydyzację następujących dwóch oligonukleotydów:
JCA082(38-mer) (Id. Sekw. nr 19)
5' AATTGGCAGCTACATGGGATATCGGGCCCATCGATAAT 3'
JCA083 (34-mer) (Id. Sekw. nr 20)
5' ATTATCGATGGGCCCGATATCGGATGTAGCTGGC 3' otrzymując plazmid pPB206 (3548 bp).
PL 196 247B1
P r z y k ł a d 7: Izolowanie genomowego RNA szczepu Onderstepoort CDV i klonowanie komplementarnego DNA kodującego geny HA i F
Szczep Onderstepoort CDV (Mitchell i in., J. Virol. Meth. 1987, 18:121-131) hodowano na komórkach MDCK (komórki nerki psiej Madin-Darby) w pożywce DMEM (Gibco). Po oczyszczeniu wirusa, genomowy RNA wyizolowano stosując technikę ekstrakcji tiocyjanian guanidyny/fenol-chloroform (Chomczynski i Sacchi, Anal. Biochem. 1987, 162:156-159). Swoiste oligonukleotydy (zawierające miejsca restrykcyjne na końcach 5' w celu ułatwienia klonowania amplifikowanych fragmentów) syntetyzowano w taki sposób, że pokrywały całkowicie regiony kodujące genów, które miały być amplifikowane (odpowiednio, gen HA i F). Reakcję odwrotnej transkrypcji (RT) i amplifikacji łańcucha polimerazą (PCR) przeprowadzono według technik standartowych (Sambrook i in., 1989). Każdą reakcję RT-PCR przeprowadzono z użyciem pary swoistych starterów amplifikacji i ekstrahowanego wirusowego genomowego RNA jako matrycy. Amplifikowany komplementarny DNA ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform/alkohol izoamylowy (25:24:1) przed trawieniem enzymami restrykcyjnymi i klonowaniem do odpowiedniego wektora.
7.1. Konstruowanie kasety ekspresji HA CDV (pPB208) (figura 6)
Plazmid pCMVB (Clontech, nr 6177-1) trawiono EcoRI i Notl w celu wyizolowania fragmentu EcoRI-NcoI wielkości 818 bp, zawierającego region promotora genu bezpośrednio-wczesnego ludzkiego wirusa cytomegalii (fragment A).
Reakcję RT-PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego RNA wirusa CDV (szczep Onderstepoort) oraz następujących oligonukleotydów:
JCA084 (32-mer) (Id. Sekw. nr 21)
5' TTGCGGCCGCATGCTCCCCTACCAAGACAAGG 3'
JCA085 (28-mer) (Id. Sekw. nr 22)
5' TTGGTACCTTAACGGTTACATGAGAATC 3' otrzymując fragment PCR wielkości 1837 bp zawierający gen HA CDV. Fragment ten trawiono Notl i KpnI w celu wyizolowania fragmentu Notl-KpnI wielkości 1826 bp (fragment B).
Fragmenty A i B poddano ligacji z wektorem pGEM-7Zf + (Promega, nr P2251), uprzednio trawionym EcoRI i KpnI, otrzymując plazmid pPB207 (5634 bp).
Reakcję PCR przeprowadzono z plazmidem pCMVB i następującymi oligonukleotydami:
JCA088 (30-mer) (Id. Sekw. nr 23)
5' TTGGGTACCGCCTCGACTCTAGGCGGCCGC 3'
JCA089 (32-mer) (Id. Sekw. nr 24)
5' TTGGGTACCGGATCCGAAAAAACCTCCCACAC 3' otrzymując fragment PCR wielkości 244 bp zawierający sygnał poliadenylacji genu wczesnego wirusa SV40. Fragment ten trawiono KpnI w celu wyizolowania fragmentu KpnI-KpnI wielkości 233 bp. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB207, trawionym uprzednio KpnI, otrzymując plazmid pPB208 (5867 bp).
7.2. Konstruowanie kasety ekspresji genu F CDV (pPB210) (figura 7)
Plazmid pCMVB (Clontech, ref. 6177-1) trawiono EcoRI i Notl w celu wyizolowania fragmentu EcoRI-NcoI wielkości 818 bp, zawierającego region promotora genu bezpośrednio-wczesnego ludzkiego wirusa cytomegalii (fragment A).
Reakcję RT-PCR przeprowadzono przy użyciu genomowego RNA wirusa CDV (szczep Onderstepoort) oraz następujących oligonukleotydów:
JCA086 (34-mer) (Id. Sekw. nr 25)
5' TTGCGGCCGCATGCACAGGGGAATCCCCAAAAGC 3'
JCA087 (28-mer) (Id. Sekw. nr 26)
5' TTGGTACCTCAGAGTGATCTCACATAGG 3' otrzymując fragment PCR wielkości 2011 bp zawierający gen F CDV. Fragment ten trawiono
Notl i KpnI w celu wyizolowania fragmentu Notl-KpnI wielkości 2000 bp (fragment B). Fragmenty A i B poddano ligacji z wektorem pGEM-7Zf+ (Promega, nr P2251), uprzednio trawionym EcoRI i KpnI, otrzymując plazmid pPB209 (5808 bp).
Reakcję PCR przeprowadzono z plazmidem pCMVB i następującymi oligonukleotydami:
PB088 (30-mer) (Id. Sekw. nr 23)
5' TTGGGTACCGCCTCGACTCTAGGCGGCCGC 3'
PB089 (32-mer) (Id. Sekw. nr 24)
5' TTGGGTACCGGATCCGAAAAAACCTCCCACAC 3'
PL 196 247B1 otrzymując fragment PCR wielkości 244 bp zawierający sygnał poliadenylacji genu wczesnego wirusa SV40. Fragment ten trawiono KpnI w celu wyizolowania fragmentu KpnI-KpnI wielkości 233 bp. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB209, trawionym uprzednio KpnI, otrzymując plazmid pPB210 (6041 bp).
P r z y k ł a d 8: Konstruowanie plazmidu donorowego pPB213 do wprowadzania kasety ekspresji HA CDV w miejsce ORF3 CHV (figura 8)
Plazmid pPB208 (przykład 7.1.) trawiono Apal i ClaI w celu wyizolowania fragmentu Apal-Clal wielkości 2920 bp zawierającego kasetę do ekspresji genu HA wirusa CDV. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB200 (przykład 3), uprzednio trawionym Apal i ClaI, otrzymując plazmid pPB213 (7043 bp). Plazmid ten umożliwiał wprowadzenie kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce ORF3 CHV.
P r z y k ł a d 9: Konstruowanie plazmidu donorowego pPB214 do wprowadzania kasety ekspresji genu F CDV w miejsce ORF3 CHV (figura 9)
Plazmid pPB210 (przykład 7.2.) trawiono Apal i ClaI w celu wyizolowania fragmentu Apal-Clal wielkości 3100 bp zawierającego kasetę do ekspresji genu F wirusa CDV. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB200 (przykład 3), uprzednio trawionym Apal i ClaI, otrzymując plazmid pPB214 (7217 bp). Plazmid ten umożliwiał wprowadzenie kasety ekspresji genu F CDV w miejsce ORF3 CHV.
P r z y k ł a d 10: Konstruowanie plazmidu donorowego pPB215 do wprowadzania kasety ekspresji genu G wścieklizny w miejsce ORF3 CHV (figury 10, 11 i 12)
Plazmid pPB199 (przykład 3) trawiono Spel, traktowano fosfatazą alkaliczną i poddano ligacji z miejscem klonowania otrzymanym przez hybrydyzację następujących dwóch oligonukleotydów:
JCA088 (39-mer) (Id. Sekw. nr 27)
5' CTAGTCCAGCAAGGTGTCGACGGATCGATATCGGGCCCA 3'
JCA089 (39-mer) (Id. Sekw. nr 28)
5' CTAGTGGGCCCGATATCGATCCGTCGACACCTTGCTGGA 3' otrzymując plazmid pPB200' (4135 bp) (figura 10).
Plazmid pCMVB (Clontech, nr 6177-1) trawiono EcoRI i Notl w celu otrzymania fragmentu EcoRI-Notl wielkości 818 bp, zawierającego region promotora genu bezpośrednio-wczesnego ludzkiego wirusa cytomegalii (fragment A).
Według procedur opisanych już dla wirusa CDV (przykład 7), RNA szczepu ERA wirusa wścieklizny ekstrahowano i oczyszczano z hodowli komórek Vero zakażonych wirusem wścieklizny. Reakcję RT-PCR przeprowadzono (patrz, przykład 7) przy użyciu genomowego RNA wirusa wścieklizny (szczep ERA) i następujących oligonukleotydów:
JCA090 (31-mer) (Id. Sekw. nr 29)
5' TTGCGGCCGCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG 3'
JCA091 (31-mer) (Id. Sekw. nr 30)
5' TTGGTACCTCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC 3' otrzymując fragment PCR wielkości 1597 bp zawierający gen G wirusa wścieklizny (opisy FR-A-2,515,685 i EP-A-162,757). Fragment ten trawiono Notl i KpnI w celu wyizolowania fragmentu Notl-KpnI wielkości 1586 bp (fragment B). Fragmenty A i B poddano ligacji z wektorem pSP73 (Promega, nr P2221), uprzednio trawionym EcoRI i KpnI, otrzymując plazmid pPB211 (4852 bp).
Reakcję PCR przeprowadzono z plazmidem pCMVB i następującymi oligonukleotydami:
PB088 (30-mer) (Id. Sekw. nr 23)
5' TTGGGTACCGCCTCGACTCTAGGCGGCCGC 3'
PB089 (32-mer) (Id. Sekw. nr 24)
5' TTGGGTACCGGATCCGAAAAAACCTCCCACAC 3' otrzymując fragment PCR wielkości 244 bp zawierający sygnał poliadenylacji genu wczesnego wirusa SV40. Fragment ten trawiono KpnI w celu wyizolowania fragmentu KpnI-KpnI wielkości 233 bp. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB211, trawionym uprzednio KpnI, otrzymując plazmid pPB212 (5085 bp) (figura 11). Plazmid pPB212 trawiono EcoRV i Sal I w celu wyizolowania fragmentu EcoRV-SalI wielkości 2664 bp zawierającego kasetę do ekspresji genu G wirusa wścieklizny. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB200' (patrz wyżej), uprzednio trawionym EcoRV i SalI, otrzymując plazmid pPB215 (6790bp) (figura 12).
P r z y k ł a d 11: Konstruowanie plazmidu donorowego pPB216 do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce ORF5 CHV (figura 13)
Plazmid pPB208 (przykład 7.1.) trawiono Smal i Apal w celu wyizolowania fragmentu Smal-Apal wielkości 2909 bp zawierającego kasetę do ekspresji genu HA wirusa CDV. Fragment ten poddano
PL 196 247B1 ligacji z plazmidem pPB202 (przykład 4), uprzednio trawionym EcoRV i Apal, otrzymując plazmid pPB216 (6291 bp). Plazmid ten umożliwiał wprowadzenie kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce ORF5 CHV.
P r z y k ł a d 12: Konstruowanie plazmidu donorowego pPB217 do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce TK CHV (figura 14)
Plazmid pPB208 (przykład 7.1.) trawiono Apal i ClaIw celu wyizolowania fragmentu Apal-Clal wielkości 2920 bp zawierającego kasetę do ekspresji genu HA wirusa CDV. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB204 (przykład 5), uprzednio trawionym Apal i ClaI, otrzymując plazmid pPB217 (6316 bp). Plazmid ten umożliwiał wprowadzenie kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce TK CHV.
P r z y k ł a d 13: Konstruowanie plazmidu donorowego pPB218 do wprowadzania kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce położone pomiędzy genami ORF19 i ORF22 CHV (figura 15)
Plazmid pPB208 (przykład 7.1.) trawiono Apal i ClaI w celu wyizolowania fragmentu Apal-Clal wielkości 2920 bp zawierającego kasetę do ekspresji genu HA wirusa CDV. Fragment ten poddano ligacji z plazmidem pPB206 (przykład 6), uprzednio trawionym Apal i ClaI, otrzymując plazmid pPB218 (6462 bp). Plazmid ten umożliwiał wprowadzenie kasety ekspresji genu HA CDV w miejsce położone pomiędzy genami ORF19 i ORF22 CHV.
P r z y k ł a d 14: Izolowanie rekombinowanego wirusa vCHV01, zawierającego kasetę do ekspresji genu HA CDV w miejscu ORF3 CHV
Plazmid pPB213 (przykład 8) linearyzowano przez trawienie Hindlll, ekstrahowano mieszaniną fenol-chloroform, precypitowano absolutnym etanolem i rozpuszczano w sterylnej wodzie.
Komórki MDCK tworzące dobrze ustaloną warstwę komórek w szalce Petri'ego (Corning, średnica 4,5 cm) transfekowano następującą mieszaniną:
mg linearyzowanego plazmidu pPB213 + 5 m g DNA wirusa CHV w 300 ml pożywki MEM i 100 m g LipofectAMINE (Gibco-BRL, nr kat. 18324-012) rozcieńczonej w 300 ml pożywki (objętość końcowa mieszaniny = 600 ml). Te 600 ml rozcieńczono w 3 ml (objętość końcowa) pożywki MEM i wylano na 3x106 komórek MDCK. Mieszaninę pozostawiono w kontakcie z komórkami przez 5 godzin, następnie usunięto i zastąpiono 5 ml pożywki hodowlanej. Komórki pozostawiono w hodowli przez 24 godziny w 37°C. Po 24-48 godzinach hodowli pobrano 1 ml nadsączu hodowli i kilka rozcieńczeń tego nadsączu zastosowano do zakażenia innych komórek MDCK (hodowanych w szalkach Petri'ego (Corning, średnica 4,5 cm))w taki sposób żeby uzyskać wyizolowane łysinki każdą szalkę zakażano 1ml rozcieńczonego początkowego nadsączu. Po pozostawieniu w kontakcie z komórkami przez godzinę w 37°C, pożywkę zakażającą usunięto i zastąpiono 5 ml pożywki MEM zawierającej 1% agarozę, utrzymywaną w stanie przechłodzonym w 42°C. Po stwardnieniu agarozy, szalki inkubowano przez 48 godzin w 37°C w inkubatorze CO2, dopóki łysinki nie stały się widoczne. Następnie warstwę agarozy usunięto i przeprowadzono przeniesienie łysinek wirusowych na sterylną membranę nitrocelulozową o tej samej średnicy co szalka Petri'ego zastosowana do hodowli. Membranę tę przeniesiono na drugą membranę nitrocelulozową w taki sposób, by uzyskać odwróconą kopię pierwszej membrany. Łysinki przeniesione na tę drugą kopię poddano hybrydyzacji, standartowymi procedurami znanymi specjalistom, z fragmentem Notl-Notl genu HA CDV, otrzymanym przez trawienie plazmidu pPB208 (przykład 7.1.), znakowanym digoksygeniną (zestaw do znakowania DNA, Boehringer Mannheim, nr kat. 1175033). Po hybrydyzacji, płukaniu i kontaktowaniu z substratem do obrazowania, membranę nitrocelulozową umieszczono w kontakcie z kliszą do autoradiografii. Obrazy pozytywnej hybrydyzacji na tej membranie wskazywały, które łysinki zawierały rekombinowane wirusy CHV, zawierające kasetę HA CDV. Łysinki odpowiadające tym pozytywnym łysinkom wycięto w sterylnych warunkach z pierwszej membrany nitrocelulozowej, umieszczono w probówkach Eppendorfa zawierających 0,5 ml pożywki MEM i poddano sonikacji w celu uwolnienia wirionów z membrany. Pożywkę zawartą w probówkach rozcieńczono pożywką MEM i uzyskanymi w ten sposób rozcieńczeniami zakażono dalsze hodowle komórek MDCK. Po 3 cyklach oczyszczania otrzymano w 100% czystego rekombinowanego wirusa zawierającego kasetę HCMV-IE/CDV HA/poliA, wprowadzoną w miejsce ORF3, i nazwano go vCHV01. Homologię rekombinacji potwierdzono przez PCRz użyciem oligonukleotydów położonych po obu stronach miejsca wprowadzania. Brak reorganizacji genomu rekombinowanego wirusa vCHV01, innej niż w regionie rekombinacji, potwierdzono techniką hybrydyzacji typu Southerna.
PL 196 247B1
P r z y k ł a d 15: Izolowanie rekombinowanych wirusów CHV wyrażających inne obce geny
Według procedury opisanej w przykładzie 14, przeprowadzono konstruowanie innych różnych rekombinowanych wirusów CHV, z użyciem plazmidów donorowych opisanych w przykładach od 9 do 13.
P r z y k ł a d 16: Wytwarzanie szczepionek
W celu wytworzenia szczepionki, rekombinowane wirusy otrzymane według przykładów 14 i 15 hoduje się na komórkach MDCK. Gdy efekt cytopatyczny jest całkowity zbiera się rekombinowane wirusy. Zbiera się zniszczone komórki i nadsącz hodowlany. Po sklarowaniu nadsączu w celu usunięcia resztek komórkowych, miareczkuje się zawiesinę wirusa. Zawiesinę wirusa rozcieńcza się w roztworze 27 stabilizującym do liofilizacji, dzieli się po jednej dawce szczepiennej (od 102 CCID50 do 107 CCID50) na fiolkę i liofilizuje. Następnie, jeżeli to konieczne, zawiesinę wirusa zamraża się.
P r z y k ł a d 17: Sposoby szczepienia
Według najkorzystniejszego sposobu szczepienia, szczepionkę otrzymaną według wynalazku rozcieńcza się albo rozmraża, a następnie podaje się drogą pozajelitową albo śluzówkową, ale korzystnie drogą śluzówkową, w szczególności drogą doustną i/lub donosową. Dawka szczepienna korzystnie zawiera się pomiędzy 102 CCID50 i 107 CCID50. Korzystnie, dawka do podawania pozajelitowego powinna wynosić od 104 CCID50 do 107 CCID50, zaś do podawania drogą doustną i/lub donosową pomiędzy 102 CCID50 i 105 CCID50. Jak określono, szczepionka zwykle jest skuteczna po pojedynczym podaniu drogą doustną i/lub donosową. Jednakże, mogą być konieczne kolejne podania.
Claims (31)
- Zastrzeżenia patentowe1. Rekombinowany psi wirus herpes (CHV) obejmujący i wyrażający co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen wybrany z grupy składającej się z antygenu HA wirusa nosówki psiej, F wirusa nosówki psiej, G wirusa wścieklizny, VP2 psiego parwowirusa, HA psiego wirusa paragrypy typu 2, F psiego wirusa paragrypy typu 2, OspA Borrelia burgdorferi i OspB Borrelia burgdorferi.
- 2. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja/sekwencje nukleotydową/e jest/są wstawiona/e w co najmniej jedno miejsce wybrane z grupy składającej się z ORF5 (Id. Sekw. nr 7), ORF3 (Id. Sekw. nr 5), genu kinazy tymidynowej oraz regionu międzygenowego znajdującego się pomiędzy ORF 19 CHV a ORF 22 CHV przez prostą insercję, lub po całkowitej lub częściowej delecji.
- 3. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa jest wstawiona przez prostą insercję, lub po całkowitej lub częściowej delecji locus insercyjnego.
- 4. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje silny promotor eukariotyczny, do którego jest funkcjonalnie podłączona co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa.
- 5. Rekombinowany CHV według zastrz. 4, znamienny tym, że silny promotor eukariotyczny obejmuje bezpośredni-wczesny promotor CMV.
- 6. Rekombinowany CHV według zastrz. 5, znamienny tym, że bezpośrednio-wczesny promotor CMV obejmuje bezpośrednio-wczesny promotor mysiego albo ludzkiego CMV.
- 7. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje przynajmniej dwie heterologiczne sekwencje nukleotydowe wprowadzone przynajmniej w jednym miejscu insercji, z których każda jest pod kontrolą innego promotora eukariotycznego.
- 8. Rekombinowany CHV według zastrz. 7, znamienny tym, że eukariotycznymi promotorami są bezpośrednie-wczesne promotory CMV różnego pochodzenia zwierzęcego.
- 9. Rekombinowany CHV według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje pierwszą heterologiczna sekwencję nukleotydowa funkcjonalnie połączoną z pierwszym promotorem i drugą heterologiczna sekwencję nukleotydowa funkcjonalnie połączoną z drugim promotorem, przy czym pierwszy promotor obejmuje bezpośrednio-wczesny promotor CMV, i, pierwszy i drugi promotor sąsiadują ze sobą końcami 5'.PL 196 247B1
- 10. Rekombinowany CHV według zastrz. 2, znamienny tym, że dalej obejmuje co najmniej jedną heterologiczna sekwencję nukleotydową kodującą immunomodulujący polipeptyd.
- 11. Rekombinowany CHV według zastrz. 9, znamienny tym, że heterologiczna sekwencja nukleotydowa obejmuje sekwencję nukleotydową wybraną z grupy składającej się z sekwencji nukleotydowych kodujących cytokiny.
- 12. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że heterologiczna sekwencja nukleotydowa obejmuje kasetę ekspresji obejmującą od 5' do 3' promotor, dwa lub więcej regionów kodujących rozdzielonych parami przez IRES (wewnętrzne miejsca inicjacji translacji) i sygnał poliadenylacji.
- 13. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA wirusa nosówki psiej.
- 14. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen F wirusa nosówki psiej.
- 15. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen G wirusa wścieklizny.
- 16. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen VP2 psiego parwowirusa.
- 17. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen HA wirusa paragrypy typu 2.
- 18. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen F wirusa paragrypy typu 2.
- 19. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen OspA z Borrelia burgdorferi.
- 20. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje i wyraża co najmniej jedną heterologiczną sekwencję nukleotydową kodującą antygen OspB z Borrelia burgdorferi.
- 21. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje antygen.
- 22. Rekombinowany CHV według zastrz. 1, znamienny tym, że co najmniej jedna heterologiczna sekwencja nukleotydowa koduje immunomodulacyjny polipeptyd.
- 23. Kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że obejmuje rekombinowany CHV jak określony w zastrz. 1 do 20 lub 21 lub 22.
- 24. Poliwalentna kompozycja immunologiczna, znamienna tym, że obejmuje jako mieszaninę albo składniki do zmieszania, przynajmniej pierwszy rekombinowany CHV i drugi rekombinowany CHV, które są określone w zastrz. od 1 do 20lub 21 lub 22, a heterologiczna sekwencja nukleotydowa pierwszego rekombinowanego CHV różni się od heterologicznej sekwencji nukleotydowej drugiego rekombinowanego CHV.
- 25. Zastosowanie rekombinowanego CHV określonego w zastrz. 1 do 20 lub 21 lub 22 do wytwarzania kompozycji do podawania psu przeznaczonej do indukowania odpowiedzi immunologicznej u psa.
- 26. Zastosowanie kompozycji immunologicznej określonej w zastrz. 23 do wytwarzania leku do podawania psu przeznaczonego do indukowania odpowiedzi immunologicznej.
- 27. Zastosowanie poliwalentnej kompozycji immunologicznej określonej w zastrz. 24 do wytwarzania leku do podawania psu przeznaczonego do indukowania odpowiedzi immunologicznej u psa.
- 28. Zastosowanie według zastrz. 25, znamienne tym, że lek podaje się dośluzówkowo w dawce obejmującej od 102 do 105 CCID50 rekombinowanego CHV.
- 29. Zastosowanie według zastrz. 26, znamienne tym, że lek podaje się dośluzówkowo w dawce obejmującej od 102 do 105 CCID50 rekombinowanego CHV.
- 30. Zastosowanie według zastrz. 27, znamienne tym, że lek podaje się dośluzówkowo w dawce obejmującej od 102 do 105 CCID50 rekombinowanego CHV.
- 31. Sposób wyrażania polipeptydu, znamienny tym, że obejmuje kontaktowanie odpowiedniej komórki z rekombinowanym CHV określonym w zastrz. 1 do 20 lub 21 lub 22.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9608242A FR2750865B1 (fr) | 1996-06-27 | 1996-06-27 | Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus canin, notamment contre la maladie de carre, la rage ou le virus parainfluenza de type 2 |
| PCT/FR1997/001115 WO1997049825A1 (fr) | 1996-06-27 | 1997-06-23 | Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus canin, notamment contre la maladie de carre, la rage ou le virus parainfluenza de type 2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL330879A1 PL330879A1 (en) | 1999-06-07 |
| PL196247B1 true PL196247B1 (pl) | 2007-12-31 |
Family
ID=9493648
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL380134A PL196530B1 (pl) | 1996-06-27 | 1997-06-23 | Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), szczepionka lub kompozycja immunologiczna, poliwalentna szczepionka, ich zastosowanie oraz sposób wyrażania białka G wirusa wścieklizny |
| PL330879A PL196247B1 (pl) | 1996-06-27 | 1997-06-23 | Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), kompozycja immunologiczna i poliwalentna kompozycja immunologiczna, ich zastosowania oraz sposób wyrażania polipeptydu |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL380134A PL196530B1 (pl) | 1996-06-27 | 1997-06-23 | Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), szczepionka lub kompozycja immunologiczna, poliwalentna szczepionka, ich zastosowanie oraz sposób wyrażania białka G wirusa wścieklizny |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6159477A (pl) |
| EP (1) | EP0910657B1 (pl) |
| JP (1) | JP2000512264A (pl) |
| KR (1) | KR20000022213A (pl) |
| AU (1) | AU737583B2 (pl) |
| BR (1) | BR9710012B1 (pl) |
| CA (1) | CA2258735C (pl) |
| CZ (1) | CZ297022B6 (pl) |
| FR (1) | FR2750865B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ333546A (pl) |
| PL (2) | PL196530B1 (pl) |
| WO (1) | WO1997049825A1 (pl) |
| ZA (1) | ZA975619B (pl) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2750865B1 (fr) * | 1996-06-27 | 1998-12-04 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus canin, notamment contre la maladie de carre, la rage ou le virus parainfluenza de type 2 |
| FR2775601B1 (fr) * | 1998-03-03 | 2001-09-21 | Merial Sas | Vaccins vivants recombines et adjuves |
| US7906311B2 (en) | 2002-03-20 | 2011-03-15 | Merial Limited | Cotton rat lung cells for virus culture |
| EP1545575A4 (en) | 2002-09-19 | 2006-04-05 | Us Gov Health & Human Serv | P. ARIASI POLYPEPTIDE, P. PERNICIOSUS POLYPEPTIDES AND METHOD OF USE |
| ES2447843T3 (es) | 2002-10-29 | 2014-03-13 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Polip�ptidos de Lutzomyia longipalpis y m�todos de uso |
| CA2510189A1 (en) * | 2002-12-19 | 2004-07-08 | Thomas Gore | Trivalent vaccine with maternal antibody transfer via the milk |
| EP1606419A1 (en) | 2003-03-18 | 2005-12-21 | Quantum Genetics Ireland Limited | Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds |
| US7468273B2 (en) | 2003-05-01 | 2008-12-23 | Meial Limited | Canine GHRH gene, polypeptides and methods of use |
| US8541003B2 (en) | 2003-06-20 | 2013-09-24 | Protein Sciences Corporation | Vectors expressing SARS immunogens, compositions containing such vectors or expression products thereof, methods and assays for making and using |
| WO2005049794A2 (en) | 2003-11-13 | 2005-06-02 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Methods of characterizing infectious bursal disease virus |
| WO2005112544A2 (en) | 2004-02-19 | 2005-12-01 | The Governors Of The University Of Alberta | Leptin promoter polymorphisms and uses thereof |
| RS51324B (sr) | 2005-04-25 | 2010-12-31 | Merial Ltd. | Vakcine protiv nipah virusa |
| US20080241184A1 (en) | 2005-08-25 | 2008-10-02 | Jules Maarten Minke | Canine influenza vaccines |
| EP1954308B1 (en) * | 2005-09-16 | 2011-09-07 | Merial Ltd. | Stabilizers for freeze-dried vaccines |
| CN101563361B (zh) * | 2005-10-19 | 2014-01-29 | 佛罗里达大学研究基金公司 | 能够感染犬科动物的流感病毒及其用途 |
| EP3147296A1 (en) | 2005-11-14 | 2017-03-29 | Merial, Inc. | Gene therapy for renal failure |
| US7771995B2 (en) | 2005-11-14 | 2010-08-10 | Merial Limited | Plasmid encoding human BMP-7 |
| US7682619B2 (en) | 2006-04-06 | 2010-03-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Canine influenza virus |
| US7862821B2 (en) | 2006-06-01 | 2011-01-04 | Merial Limited | Recombinant vaccine against bluetongue virus |
| MX2010012069A (es) | 2008-05-08 | 2010-12-14 | Merial Ltd | Vacuna de la leishmaniasis con el uso del inmunogeno salival de la mosca de la arena. |
| EP2414386B1 (en) | 2009-04-03 | 2016-01-27 | Merial Limited | Newcastle disease virus vectored avian vaccines |
| US20130197612A1 (en) | 2010-02-26 | 2013-08-01 | Jack W. Lasersohn | Electromagnetic Radiation Therapy |
| EP2611460B1 (en) | 2010-08-31 | 2016-10-05 | Merial, Inc. | Newcastle disease virus vectored herpesvirus vaccines |
| WO2012090073A2 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | The Netherlands Cancer Institute | Methods and compositions for predicting chemotherapy sensitivity |
| US20140296248A1 (en) | 2011-04-04 | 2014-10-02 | Stichting het Nederlands Kanker Instiuut-Antoni van Leeuwenhoek ziekenhuis | Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment |
| EP2694678A2 (en) | 2011-04-04 | 2014-02-12 | Netherland Cancer Institute | Methods and compositions for predicting resistance to anticancer treatment |
| US9216213B2 (en) | 2011-04-20 | 2015-12-22 | Merial, Inc. | Adjuvanted rabies vaccine with improved viscosity profile |
| WO2012149038A1 (en) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | Advanced Bioscience Laboratories, Inc. | Truncated hiv envelope proteins (env), methods and compositions related thereto |
| CA2837375C (en) | 2011-06-01 | 2019-07-16 | Merial Limited | Needle-free administration of prrsv vaccines |
| MX350096B (es) | 2011-08-12 | 2017-08-25 | Merial Inc | Preservación asistida con vacío de productos biológicos, en particular de vacunas. |
| WO2013093629A2 (en) | 2011-12-20 | 2013-06-27 | Netherlands Cancer Institute | Modular vaccines, methods and compositions related thereto |
| WO2013138776A1 (en) | 2012-03-16 | 2013-09-19 | Merial Limited | Novel methods for providing long-term protective immunity against rabies in animals, based upon administration of replication-deficient flavivirus expressing rabies g |
| HK1216006A1 (zh) | 2013-03-12 | 2016-10-07 | Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. | 反向遺傳學施馬倫貝格病毒疫苗組合物，和其使用方法 |
| WO2015077717A1 (en) | 2013-11-25 | 2015-05-28 | The Broad Institute Inc. | Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status |
| WO2015085147A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | The Broad Institute Inc. | Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data |
| KR20230076867A (ko) | 2013-12-20 | 2023-05-31 | 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 | 신생항원 백신과의 병용 요법 |
| WO2016073410A1 (en) | 2014-11-03 | 2016-05-12 | Merial, Inc. | Methods of using microneedle vaccine formulations to elicit in animals protective immunity against rabies virus |
| US10975442B2 (en) | 2014-12-19 | 2021-04-13 | Massachusetts Institute Of Technology | Molecular biomarkers for cancer immunotherapy |
| EP3234130B1 (en) | 2014-12-19 | 2020-11-25 | The Broad Institute, Inc. | Methods for profiling the t-cell- receptor repertoire |
| IL294183B2 (en) | 2015-05-20 | 2023-10-01 | Dana Farber Cancer Inst Inc | shared neoantigens |
| TW202241500A (zh) | 2015-06-09 | 2022-11-01 | 美商博德研究所有限公司 | 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法 |
| ES3050936T3 (en) | 2015-06-23 | 2025-12-23 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prrsv minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof |
| AU2017254477A1 (en) | 2016-04-18 | 2018-11-01 | Jennifer G. ABELIN | Improved HLA epitope prediction |
| AU2017290082A1 (en) * | 2016-06-30 | 2018-12-13 | Next Science IP Holdings Pty Ltd | Antimicrobial compositions and methods employing same |
| US11549149B2 (en) | 2017-01-24 | 2023-01-10 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide |
| WO2020072700A1 (en) | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Hla single allele lines |
| US20220062394A1 (en) | 2018-12-17 | 2022-03-03 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identifying neoantigens |
| CN110302374B (zh) * | 2019-08-09 | 2023-04-14 | 黑龙江八一农垦大学 | 犬用疫苗及其制备方法和应用 |
| US12394502B2 (en) | 2019-10-02 | 2025-08-19 | The General Hospital Corporation | Method for predicting HLA-binding peptides using protein structural features |
| CN114790229B (zh) * | 2022-04-12 | 2024-07-12 | 北京慧德易科技有限责任公司 | 一种重组蛋白及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4213965A (en) * | 1979-01-23 | 1980-07-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Small-plaque variant canine herpesvirus vaccine |
| US5777095A (en) * | 1988-10-24 | 1998-07-07 | Symbicom Aktiebolag | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 |
| FR2659349B1 (fr) * | 1990-03-12 | 1993-12-24 | Rhone Merieux | Virus herpes recombinants notamment pour la realisation de vaccins, leur procede de preparation, les plasmides realises au cours de ce procede et les vaccins obtenus. |
| US5639876A (en) * | 1991-02-12 | 1997-06-17 | Heska Corporation | Nucleic acid molecules encoding novel parasitic helminth proteins |
| US5795768A (en) * | 1991-02-12 | 1998-08-18 | Heska Corporation | Filariid nematode cysteine protease proteins, nucleic acid molecules and uses thereof |
| AU1423792A (en) * | 1991-02-12 | 1992-09-07 | Colorado State University Research Foundation | Reagents and methods for identification of vaccines |
| US5843456A (en) * | 1991-03-07 | 1998-12-01 | Virogenetics Corporation | Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses |
| US5418137A (en) * | 1991-09-26 | 1995-05-23 | Paravax, Inc. | Flea membrane binding site proteins as screening tools |
| JPH07501219A (ja) * | 1991-11-12 | 1995-02-09 | ザ・コロラド・ステイト・ユニバーシティ・リサーチ・ファンデーション | 心糸状虫に対するプロテアーゼワクチン |
| US5356622A (en) * | 1991-12-13 | 1994-10-18 | Paravax, Inc. | Flea midgut-supernatant vaccines |
| WO1996011706A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | Heska Corporation | Use of flea proteases and protease inhibitors to protect animals from flea infestation |
| US5399485A (en) * | 1992-01-17 | 1995-03-21 | United States Of America | Methods and compositions for diagnosing cat scratch disease and bacillary angiomatosis caused by Rochalimaea henselae |
| US5492695A (en) * | 1992-05-14 | 1996-02-20 | Colorado State University Research Foundation | Vaccinating cats against Dirofilaria immitis with an L4 homogenate |
| US5707817A (en) * | 1993-02-05 | 1998-01-13 | Colorado State University Research Foundation | Carbohydrate-based vaccine and diagnostic reagent for trichinosis |
| US5541075A (en) * | 1993-02-05 | 1996-07-30 | Heska Corporation | Carbohydrate-based vaccine and diagnostic reagent for trichinosis |
| WO1994017813A1 (en) * | 1993-02-08 | 1994-08-18 | Paravax, Inc. | Defective sindbis virus vectors that express toxoplasma gondii p30 antigens |
| US5569603A (en) * | 1994-03-08 | 1996-10-29 | Heska Corporation | Dirofilaria immitis GP29 proteins, nucleic acid molecules and uses thereof |
| WO1995026751A1 (en) * | 1994-03-30 | 1995-10-12 | Virogenetics Corporation | NUCLEOTIDE AND AMINO ACID SEQUENCES OF CANINE HERPESVIRUS gB, gC and gD AND USES THEREFOR |
| JPH10500854A (ja) * | 1994-05-26 | 1998-01-27 | ヘスカ コーポレイション | 新規な寄生虫プロテアーゼの遺伝子およびタンパク質 |
| WO1996011271A1 (en) * | 1994-10-07 | 1996-04-18 | Heska Corporation | Novel ectoparasite saliva proteins and apparatus to collect such proteins |
| CN1117081A (zh) * | 1995-03-16 | 1996-02-21 | 高云 | 犬瘟热狂犬病细小病毒三联活疫苗、毒种及制造方法 |
| US5789194A (en) * | 1995-05-23 | 1998-08-04 | Heska Corporation | Parasitic helminth venom allergen antigen 5-like genes and proteins |
| US5681724A (en) * | 1995-11-16 | 1997-10-28 | Heska Corporation | Parasitic helminth macrophage inhibitory factor nucleic acid molecules and uses thereof |
| US5753235A (en) * | 1996-02-15 | 1998-05-19 | Heska Corporation | Recombinant canine herpesviruses |
| FR2750865B1 (fr) * | 1996-06-27 | 1998-12-04 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus canin, notamment contre la maladie de carre, la rage ou le virus parainfluenza de type 2 |
-
1996
- 1996-06-27 FR FR9608242A patent/FR2750865B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-06-23 PL PL380134A patent/PL196530B1/pl unknown
- 1997-06-23 KR KR1019980710632A patent/KR20000022213A/ko not_active Withdrawn
- 1997-06-23 AU AU34474/97A patent/AU737583B2/en not_active Expired
- 1997-06-23 EP EP97930568A patent/EP0910657B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-23 WO PCT/FR1997/001115 patent/WO1997049825A1/fr not_active Ceased
- 1997-06-23 CA CA2258735A patent/CA2258735C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-23 JP JP09532942A patent/JP2000512264A/ja active Pending
- 1997-06-23 BR BRPI9710012-9A patent/BR9710012B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-06-23 CZ CZ0428198A patent/CZ297022B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-06-23 PL PL330879A patent/PL196247B1/pl unknown
- 1997-06-23 NZ NZ333546A patent/NZ333546A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-06-25 ZA ZA975619A patent/ZA975619B/xx unknown
-
1998
- 1998-12-16 US US09/213,053 patent/US6159477A/en not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-09-07 US US10/935,494 patent/US20060024329A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA975619B (en) | 1998-12-28 |
| NZ333546A (en) | 2001-06-29 |
| JP2000512264A (ja) | 2000-09-19 |
| BR9710012A (pt) | 1999-08-10 |
| AU737583B2 (en) | 2001-08-23 |
| WO1997049825A1 (fr) | 1997-12-31 |
| CZ428198A3 (cs) | 1999-04-14 |
| FR2750865A1 (fr) | 1998-01-16 |
| CA2258735C (en) | 2011-06-21 |
| AU3447497A (en) | 1998-01-14 |
| EP0910657A1 (fr) | 1999-04-28 |
| BR9710012B1 (pt) | 2011-10-18 |
| PL196530B1 (pl) | 2008-01-31 |
| CZ297022B6 (cs) | 2006-08-16 |
| US6159477A (en) | 2000-12-12 |
| CA2258735A1 (en) | 1997-12-31 |
| FR2750865B1 (fr) | 1998-12-04 |
| EP0910657B1 (fr) | 2013-02-27 |
| US20060024329A1 (en) | 2006-02-02 |
| KR20000022213A (ko) | 2000-04-25 |
| PL330879A1 (en) | 1999-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL196247B1 (pl) | Rekombinowany psi wirus herpes (CHV), kompozycja immunologiczna i poliwalentna kompozycja immunologiczna, ich zastosowania oraz sposób wyrażania polipeptydu | |
| US6153199A (en) | Avian recombinant live vaccine using, as vector, the avian infectious laryngotracheitis virus | |
| EP0776361B1 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof | |
| CA2239072C (en) | Recombinant live vaccine containing feline herpes virus type 1, particularly for treating feline infectious peritonitis | |
| AU735265B2 (en) | Avian recombinant live vaccine using, as vector, the avian infectious laryngotracheitis virus | |
| JP4440347B2 (ja) | 組換えキメラウイルスとその使用 | |
| EP0644931A1 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof | |
| CA2166371A1 (en) | Avian herpesvirus-based live recombinant avian vaccine, in particular against gumboro disease | |
| EP0720654A1 (en) | Novel proteins/polypeptides and cotransfection plasmids and live recombinant carriers therefor | |
| JPH09505726A (ja) | 組換え感染性喉頭気管炎ウイルス及びそれらの使用 | |
| CA2626498C (en) | Recombinant chimeric virus | |
| AU750084B2 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof II | |
| AU684046C (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |