CZ428198A3

CZ428198A3 - Živá rekombinantní vakcina na podkladu psího herpes-viru, zvláště proti nemoci Carré-ho, vzteklině a viru parachřipky typu 2

Info

Publication number: CZ428198A3
Application number: CZ984281A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Christophe Audonnet; Philippe Baudu
Original assignee: Merial
Priority date: 1996-06-27
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 1999-04-14
Also published as: JP2000512264A; PL330879A1; KR20000022213A; BR9710012A; CA2258735C; WO1997049825A1; EP0910657A1; CA2258735A1; PL196247B1; NZ333546A; US6159477A; AU3447497A; EP0910657B1; US20060024329A1; AU737583B2; BR9710012B1; ZA975619B; PL196530B1; FR2750865A1; FR2750865B1

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká vakcín, s výhodou pro psy, to jako produkty z rekombinantních psích herpes-virů, dále způsobů jejich získávání a přípravy těchto rekombinantních virů. Tento vynález se obzvláště týká rekombinantních psích herpes-virů, obsahujících expresní kasetku pro jeden cizí gén nebo pro cizí geny vůbec.

Dosavadní stav techniky

Příčinou psí herpes-virosy je psí herpes-virus (v angličtině Canine Herpes Virus, zpráceně CHV). Týž je klasifikován ve skupině ^-Herpesvirinae. Sento herpes-virus je vyšším pathogénem pro rodící se štěňata. Psí herpes-virus v

se přenáší hlavně u štěňat hemorrhagickým onemocněním a benigním onemocněním cest dýchacích s nebezpečí vyšším, než pro psy dospěléo Ve skutečnosti neexistuje žádná vakcina, jež by chránila psyl štěňata proti psí herpesvirose.

Konečně domácí psi jsou vystaveni nebezpečí četných jiných onemocnění a mělo by své výhody mít k dispozici vakcinální vektor s expresí různých antigenů proti pathogenním psím činidlům, což by dovolilo zjednodušit a 'vylepšit programy vakcinování psů, zvláště štěňat v době jejich vývoje a chovu. Mezi důležitými pathogenními činidly pro,psy lze uvést zvláště virus nemoci Carré-ho, virus hepatitidy Rubarth-a, virus vztekliny, virus psí parvovirosy,,psí koronavirus a virus parachřipky typu 2, Bordetella bronchiseptica, Borrelia burgdorferi, Leptospira spp., Leishmania infantům.

Jest známo skutečně málo podrobnosti o genomu viru CHV. Genomická sestava tohoto viru byla publikována teprve • 9 *

9

• · 9 ·

C · fl fl · ♦ « ® · · 9 • · · <>·

-2nedávno, viz Rémond M. a spol., J.Gen.Virol 77, 37-48 (1996). Byly popsány geny třech větších glykoproteinů gB, gC a gD, jakož i gén s označením CHV 0RP2, viz Limbách K. a spol., JoGen.Virol 21» 2029-2039 (1994).

V průběhu svých prací v oboru CHV se podařilo původcům zjistit větší počet oblastí, které nejsou podstatné pro replikaci in vitro, ale,které se ukázaly být užitečnými při konstrukci rekombinovaných virů CHV. Původci jsou tedy schopni jako prví navrhnout virus CHV ve formě vektoru pro vakcinování psů. Bylo zjištěno, že vakcinační vektory dle tohoto vynálezu jsou spojeny s výhodami zvláště pro vakcinování psů. Ve skutečnosti psí herpesvirus je velmi specifický a zahrnuje génom dlouhé délky, obsahující více potenciálních míst pro různá vsunutí a dovolující současné vsunutí většího počtu expresních kajsetek pro cizí gény. Tím je dána možnost vakcinovat psy současně proti různých psím pathogenním vlivům za použití jediného rekombinantního viru.

Podstata vynálezu

Hlavním předmětem tohoto vynálezu je zjištění vakcinálního vektoru, dovolujícího expresi imunogenů psích pathogenů s přihlédnutím k ochraně psů proti hlavním infekčním psím nemocem.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zjištění takového vektoru, který by dovolil vakcinování psů, zvláště pak štěňat s mateřskými protilátkami, a to cestou využití slizu, zvláště pak orální, nasální nebo spojením obou těchto,

A je ještě dalším předmětem tohoto vynálezu zjistit onen vektor, který dovoluje současně vakcinování štěňat proti herpes-virose.

Je tedy předmětem tohoto vynálezu živá rekombinantní vakcina, využívající jako vektor psí herpes-virus, obsahující a exprimující nejméně jednu nukleotidovou sekvenci, zakodovávající polypeptid s tím, že tato sekvence je vsunuta v místě, jež není významné pro replikaci in vitro.

•4 · · « » ·· • 4 ♦ · *·····* » · · · · _ *

4444 4444 444 4444 ♦*

-3Původci izolovali a analyzovali genomický fragment viru CHV, na kterém charakterizovali 5 otevřených míst k> vázání : (COLI až COL5), a z těch dvě (COL3 a COL5) jsou pokládána za nepodstatná pro replikaci in vitro. Jinak původci zjistili, že i jiné oblasti génomu CHV by se mohly právě tak využít pro vsunutí cizích génů. Tato místo pro vsunutí jsou: genová thymidinová kinasa (COL CHV TK), viz Rémond M. a spol., Virus Research 39. 341-354 (1995), a sekvence umístěná mezi COL CHV orf 19 (nebo COL19) a COL CHV orf22 (nebo COL22), viz Rémond M. a spol., J.Gen.

Virol 76« 37-48 (1996)<, Tato místa byla přesněji popsána v příkladech dle tohoto vynálezu.

S výhodou je důsledkem vsunutých sekvencí antigenní polypeptid a - s výhodou - polypeptid antigenní vůči psímu pathogenu. Právě tak lze zasunout sekvence kódující pro vznik imunomodulatričních proteinů, jako jsou cytokiny.

Podle jednoho z výhodných provedení lze spojit sekvenci kódující cytokin či podobnou složku a sekvenci kódující antigen. Pokud je to třeba, pak většé počet cytokinových sekvencí lze spojit mezi sebou, případně v kombinaci s jednou či více sekvencemi se zakódovaným antigenem či antigeny.

Vsunutí do vhodných míst se provede jednoduchým vsunutím (bez odkladu), nebo po částečném či totálním odkladu jednotky či jednotek COL, používaných k vsunutí.

Jako parenterální virus pro konstrukci rekombinovaného viru či virů použít, a to zvláště kmen P205, který izoloval Carmichael L., Proc.Doc.Exp_eBiol.Med. 120, 644-650 (1965).

Pro expresi cizích génů, vsunovaných do génomu CHV podle tohoto vynálezu, se využívá s výhodou eukaryotický promotor, a to silný, jako je s výhodou promotor cytomegaloviru (CMV) bezprostředně čerstvý (IE). Promotorem CMV IE se míní obzvláště takový fragment,,jak je uveden v příkladech • · .1 .«%.·♦, .1 Ζ·_: <9 '♦ 99 9 9 9

9 9.9

9999 #4 · »

-4jakož i jeho odpovídající podfragmenty, zachovávající si tutéž promotriční aktivitu. Promotorem CMV IE může být promotor lidský (HCMV IE) nebo promotor myší (MCMV IE) nebo i dokonce promotor CMV IE jiného původu, například CMV krysí, morčecí nebo prasečí.

Bylo by možno vsunout nejméně dvě nukleotidové sekvence na jedno místo, to pod kontrolou líčících se prornotorů_e Zvláště pak by šlo o promotory CMV IE lišících se původů.

Podle výhodného provedení tohoto vynálezu se spojí s promotorem CMV IE jiný promotor takovým spůfeobem, že tyto dna promotory mají sousedící své koncovky 5'a transkripce, iniciované těmito dvěma promotory se provedou ve smyslu opačném. Tyto zvláštní dispozice dovolují vsunout na totéž místo dvě nukleotidové sekvence, jednu v závislosti na promotoru CMV IE, druhou v závislosti na asociovaném promotoru. Tato konstrukce je pozoruhodná tím, že přítomnosti promotoru CMV IE, zvláště pak jeho aktivizující části může aktivovat transkripci, zavednou napojeným promotorem. Jako napojený promotor se dá uvést například promotor CMV s lišícími se oblastmi od promotoru prvého. Právě tak lze zapojit jiné promotory, než je promotor RH.Al_e8 viru nemoci Marek-a (MDV), viz Bradley a spol., J.Virol 63, 2534-254-2 (1989).

Nukleotidovou sekvencí,vsunutou do vektoru CHV pro expri mování, může být celá sekvence, kódující antigenový polypeptid činidla pathologického zárodku, jednou již exprimovaný za podmínek vhodných dle tohoto vynálezu k zajištění imunizování, vedoucího k účinnému chránění vakcinovaného zvířete proti pathogennímu činidlu. Mohlyjby se tedy vsunout za podmínek, popisovaných tímto vynálezem, nukleotidové sekvence kódující antigény se zřetelem na předpokládanou nemoc, zvláště pak onemocnění virová, bakterální nebo způsobená parazity, jak to bylo zde již dříve uvedeno,

Typickým případem dle tohoto vynálezu je vsunutí nejméně jedné sekvence nukleotidové, kódující vhodným způsobem • fc fcfc · fc fc fc • fc fcfc • · fc · • fc fc fcfc • · »· fcfc fcfc · • fcfc • fcfcfc · fcfc · fcfc

-5pro polypeptid viru onemocnění Carré-ho (virus psinky =

CDV), a s výhodou pro polypeptid CDV HA, viz Sidhu M. a spol., Virology 193, 66-72 (1993) nebo pro polypeptid CDV P, viz Barrett a spol., Virus Research 8, 373-386 (1987). Lze rovněž vsunout tyto dva gény pohromadě do vektoru CHV. Získá se tak živá vakcina rekombinantní, zajištující ochranu pro onemocnění Carré-ho.

Jinými výhodnými případy tohoto vynálezu je vsunutí nukleotidových sekvencí kódujících antigeny nebo fragmenty antigénů. viru vztekliny, zvláště pak genu G, viz Brevets PR-A—2 5L5 685 a EP-A- 162 757, viru psí parvovirosy (gén VP2), viz Parrish a spol., J.Virol 65. 5644-6552 (1991) a viru p_ara-chřípky typu 2 (gény HA a/nebo P). Rovněž tak lze vsunout sekvence kódující antigeny Borrelia burgdorferi, zvláště pak gény kódující pro antigeny OspA a OspB, viz Bergstrom S. a spol., Mol.Microbiol.

2, 479-486 (1989).

Typickým jbřípadem tohoto vynálezu je vakcina, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující pro antigen viru nemoci Carré-ho pod kontrolou CMV IE a nukleotidové sekvence, kódující pro antigen jiného virového onemocnění psů, zvláště těch, jak zde byla výše uvedena, to pod kontrolou jiného promotoru.

Přesněji řečeno lze heterologní sekvence a jejich promotory příbuzné navázat klasičtěji do tandemu v místě vsunutí, tj. za sledování stejného smyslu transkripce.

Je také možná exprese většího počtu heterologních génů, vsunutých do místa vsunutí, a to použitím sekvence nazývané ”IRES” (Internal Ribosome Entry Site), pocházejících zvláště z virů, jako je virus vesikulárního o^eniocnění prasete (swine vesicular Disease virus, SVDV), viz Chen B.P. a spol., JeVirology 67. 2142-2148 (1993), vir encefalomyokarditu (EMCV), viz Kaufman R.J. a spol., Hucleic Acids Research, 19, 4485-4490 (1991), vir aftové horečky (PMDV), viz Luz N.

Μ *0 » 9 9 · • · ♦ 0 4

« · · ♦ • « · · 9 9

9 9

9 9 9

-6a Beok B., J.Virology 65. 6486-6494 (1991), nebo nějakého jiného původu. Na obsah těchto tří uvedených článků se odkazuje citací. Expresní kasetka dvou génů by měla mít minimálně tuto dále uvedenou strukturu: promotor - gén 1 - ±RBS gén 2 - polyadenylační signál. Živá rekombinantní vakcina dle tohoto vynálezu by měla obsahovat vsunuté v místě vsunutí expresní kazetku,, obsahující následně promotor, dva či více génů oddělených vždy dva a dva jednotkou IŘBS a pólyadenylační signál.

Navíc kromě vsunutí do místa dle tohoto vynálezu, lze realizovat jedno či více dalších vsunutí, jednu či více mutací, nebo jedno či více opomenutí v genomu. Ve všech případech vsunutí do jiného místa, než jak se to popisuje v tomto vynálezu, dovoluje exprimovat jiné gény.

Použití rekombinantních virů dle tohoto vy nálezu dovoluje chránit psy proti jedné či více nemocí, jak byly uvedeny zde výše, a to současně i proti herpes-virose psů.

Předmětem tohoto vynálezu je také formulování multivalentní vakciny, obsahující, to ve směsi nebo v úpravě pro smíchání nejméně dvě živé rekombinantní vakciny, jak byly zde výše definovány s tím, že tyto vakciny obsahují různé vsunuté sekvence, izolované zvláště z různých pathogénů. Tato formulování vakcin obsahují dávkování a/nebo nosiče, uzpůsobené pro cestu podávání.

Předmětem·.tohoto vynálezu jsou také viry CHV, modifikované nejméně v jednom z uvedených míst.

Předmětem vynálezu je rovněž způsob vakcinování, zvláště psů, při kterém se podává cestou parenterální nebo mukosální, ale s výhodou mukosální, zvláště orální a/nebo nasální účinné množství vakciny, jak byla definována zde výše. Dávka 2 k vakcinování by měla činit s výhodou mezi mezi 10 DiCC5O a 10⁷ DIGC50. Dávka pro podávání pstenterální se má pohybovat mezi 10^ DICC50 až 10⁷ DICC50, pro podávání cestou orální a/nebo nasální mezi 10^ DICC50 a 10^ DICC50.

Jak to zde již bylo uvedena, vakcina je obvykle obecně účinná po jednom podání cestou orální a/nebo nasální. Je-li to třeba, lze takové podávání opakovat.

Tento vynález se rovněž týká fragmentů ADN, obsahují.· <

.· < β a 4 9 ·· ·* ► · · « ► · ·· « · · · 4 « · 4 «· «»

7celou sekvenci nebo její část, jak je definována polohami 1 až 6216 na SEQ ID č.l (viz vyobr.č.l), zvláště pak celou část, nebo její část definovaného místa CDL3 a/nebo vlající sekvence, a to proti a po proudu od tohoto místa, fragmenty,které by mohly být užitečné jako volně vlající ručičky pro postupy rekombinování homologická s genomem viru GHV, který byl vyvolen jako virus parentální. Vynález se rovněž týká variant takových fragmentů, které odpovídají ekvivalentních sekvencím odtatních základů CHV. Odborník má veškerou volnost pro volbu regionů, sloužících jako vlající ručičky na vazbách se vsunovaným typem (s nebo bez opomenutí), nebo opomenutí (částečných nebo totálních). Obecně řečeno, vlající ručičky mohou mít od 100 do 800 párů bází, ale mohou mít mnohem větší vlající část, je-li to třeba.

Předmětem tohoto vynálezu je rovněž příprava vektorů a vakcin dle tohoto vynálezu, jak to plyne z popisu vakcin, a to vsunutím génu, který je předmětem zájmu, do místa vsunutí.

Vynález bude dále detailněji popsán formou příkladů, realizojících, nikoli však jakkoli omezujících, na které se zde odkazuje s použitím vyobrazení, kde

Vyobr.1 je sekvence oblasti CHV (6216 párů bází) a přenos různých otevřených článků popisu (ORP) na tyto sekvence (COLI až C0L5),

Vyobr.2 je plasmid pPB200 (donor plasmidu pro vsunutí do expresních kaZetek v místě CHV COLj,

Vyobr.3 je konstrukce plasmidu pPB2O2 (donor plasmidu pro vsunutá expresních kaZetek do místa CHV C0L5),

Vyobr.4 je konstrukce plasmidu pPB204 (donor plasmidu pro vsunutí expresních kaZetek do místa CJÍV TK),

Vyobr.5 je konstrukce plasmidu pPB2O6 (donor plasmidu pro vsunutí expresních kagetek do místa situovaného mezi gény CHV orfk9 a CHV orf22),

Vyobr.6 je konstrukce plasmidu pPB208 ( expresní ka^etka pro gén CDV HA), « ·

• · t » · * « · I · 9 • · ·

4« · ·

-8Vyobr<>7 je konstrukce plasmidu pPB2lO (expresní kagetka pro gén CDV P),

Vyobr.8 je konstrukce plasmidu pBB213 ( plasmidový donor pro vsunutí expresní ka^etky gemu CDV HA do místa CHV COL3),

Vyobr.9 je konstrukce plasmidu pPB2l4 (plasmidový donor pro vsunutí expresní kagetky génu CDV P do místa CHV COL3),

Vyobr.10 je plasmid PB200^z

Vyobr.ll je konstrukce plasmidu pPB2l2 (expresní kagetks genu G viru vztekliny),

Vyobr.l2 je konstrukce plasmidu pPB2l5 (donor plasmidu pro vsunutí expresní kagetky genu G viru vztekliny do místa CHV C0L3),

Vyobr.13 je konstrukce plasmidu pPB2l6 (donor plasmidu pro vsunutí expresní ka^etky genu CDV HA do místa CHV C0L5),

Vyobr.14 je konstrukce plasmidu pPB217 (donor plasmidu pro vsunutí expresní kagsetky genu CDV HA do místa CHV TK),

Vyobr.15 je konstrukce plasmidu pPB2l8 (donor plasmidu pro vsunutí expresní kagetky genu CDV HA do místa situovaného mezi gény CHV orfl9 a CHV orf22).

Přehled sekvencí SEQ ID pro konstruování v místech vsunutí do vektoru CHV

Sekvence	ID	č.l
Sekvence	ID	č.2
Sekvence	ID	č.3
Sekvence	ID	č.4
Sekvence	ID	č.5
Sekvence	ID	c _o6

Kompletní sekvence oblasti CHV C0L1 až C0L5, viz vyobr.l

Sekvence aminokyselin C0L1 z vyobr.l Sekvence aminokyselin C0L2 z vyobr.l Sekvence aminokyseliny C0L3 dle vyobr.l Sekvence aminokyseliny C0L4 z vyobr.l Částečná sekvence aminokyselin C0L5 z vyobr.l

ID χ

Sekvence'č₀7 Sekvence ID č„8 Sekvence ID č.9 Sekvence ID č.10 Sekvence ID č.ll • Φ 99

9 4 4 Φ Φ » Φ Φ ·· * φ φ Φ ΦΦΦΦΦ φ ΦΦ Φ ΦΦΦΦΦΦ»

Φ Φ Φ Φ ΦΦΦ

ΦΦΦΦΦΦΦΦ «ΦΦΦΦΦΦ ♦♦ ··

-9Oligonukleotid JCA070 Oligonukleotid LCAO71 Oligonukleotid LGAO72 Oligonukleotid LCA073 Oligonukleotid JCA074 Sekvence ID č.12 Oligonukleotid JCAO75 Sekvence ID č.13 Oligonukleotid JCAO76 Sekvence ID č.14 Oligonukleotid JCAO77 Sekvence ID č,15 Oligonukleotid JCAO78 Sekvence ID č.l6 Oligonukleotid JCAO79 Sekvence ID 6.17 Oligonukleotid JCA080 Sekvence ID č.18 Oligonukleotid JCA081 Sekvence ID č.19 Oligonukleotid JCA082 Sekvence ID č.20 Oligonukleotid JCA083 Sekvence IDČč.21 Oligonukleotid JCA084 Sekvence ID č.22 Oligonukleotid JCAO85

Sekvence ID č.23 Oligonukleotid PB088

Sekvence ID č.24 Oligonukleotid P3089

Sekvence ID č.25 Oligonukleotid JCA086

Sekvence ID č.26 Oligonukleotid JCA087

Sekvence ID č.27 Oligonukleotid JCA088

Sekvence ID č.28,Oligonukleotid JCAO89 Sekvence ID č.29 Oligonukleotid JCAO9O

Sekvence ID č_o30 Oligonukleotid JCAO91

Příklady provedení vynálezu

Všechna konstruování plasmidl byla provedena za použití standardizovaných postupů molekulární biologie, jak to popsal Sombrook J a spol., Molevular Cloning_ A Laboratory Manual, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 1989. Všechny restrikční fragmenty použité v tomto vynálezu byly izolovány za použití kitu Geneclean” (BI0101 lne., La Jolla, CA).

Vir, který byl použit jako vir parenterální je původní vir P2O5 (nazývaný rovněž Carmichael) 3 psího nerpes-viru. Byl získán od Dr.L.Carmichael-a (Oornell Universiry, ΝΪ), který tento zdroj izoloval a popsal jeho charakteristické • ft ft ft ft ft ftftftft • ftft · ft·····* • · · · · · ft •••••••ft ft···*·· *· ··

-10— vlastnosti biologické, viz Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 120,

644-650 (1965). Podmínky vultivování uvedeného viru jsou tyto: buňky MDCK (Madin Darbey Canine Kidney ATCC CCL34) se kultivují na prostředí minimálně totožném s Eagle-ovým (prostředí MEM), očkují se kmenem CHV P2O5 za použití mnohonásobného infikování použitím 1. Infikované buňky se pak inkubují při 37°C po asi 36 hodin, až do chvíle, kdy je patrný cytopathický účinek

Příklad 1 Extrakce ADN ze psího herpes-viru

Po kultivování se kapalina nad. lysovanými buňkami spolu s nimi jako celková virová suspense odstředuje při lOOOg 10 minut za teploty + 4° C, aby se tak odstranily buněčné zbytky. Virové částečky se sklidí ultraodstředěním při 400 000 g po dobu hodiny při + 4° C. čSedlinka se přepraví do minimálního objemu pufru (10 mM Tris, 1 mM kyseliny ethylendiamůntetraoctové a na tuto koncentrovanou suspenzi se působí proteinasou K (100 ug/ml nejvýše) za přítomnosti sodné soli kyseliny dodecylsírové (SDS, nejvýše 0,5% po dobu dvou hodin při 37° C. Virová ADN se posléze extrahuje směsí fenolu a chloroformu, a dále se vysráží přidáním dojnásobného objemu absolutního alkoholu. Po stání při -20° C přes noc se vysrážná ADN odcentrifujuje při 10 000 g po dobu 15 minut za teploty + 4°C. Sedlina ADN se vysuší a vezme se do minimálního objemu ultračisté sterilní vody.

Příklad 2 Klonování a charakterizování oblasti CHV COL 1COL 5

Vyčištěná genomická ADN z kmene P2O5 viru CHV se digeruje s restrikčními enzymy Seal a XhoO a fragment Scal-Xhol asi o 6200 pb se klonuje do vektoru pBlueScript SKII+ (Stratagene Ref. 212205), předtím digerovaného s Seal a Xhol pro získání plasmidu pPB154. Fragment Xhol-S&ál klonovaný do plasmidu pPB154 má celkově sekvence na obou dvou pramenech pro generování sekvence 6216 pb z vyobr.l (SEQ ID č.l).

Více míst otevřených pro vazbu postranního chvostu nad 65 aminokyselin bylo identifikováno pro tuto sekvenci (vyobr.l).

Prvá vazební postavení (COLI, polohy 1353-157) se na-11-

cházejí na komplementárním pramenu s kódováním pro polypeptid o 398 aminokyselinách (SEQ ID č.2).

Druhé vazebné postavení (C0L2, polohy 1708-2970) kóduji pro polypeptid o 420 aminokyselánách (SEQ ID č.3)

Třetí vazebné postavení (CDL3, polohy 3040-4242) kóduje pro polypeptid o 400 aminokyselinách (SEQ ID č.4) ©vrte vazebné postavení (CDL4) polohy 4374-5753) kóduje pro polypeptid o 459 aminokyselinách (SEQ ID č.5),

Páté vazebné postavení (CDL5, polohy 5872-6216) je

nekompletní a selinách (SEQ	kóduje pro zkomolený protein o 115 ID č_o6).	aminoky-
Různá volná vazebná postavení jsou shrnuta jící tabulce	v následu-
Volné vazebné postavení	Začátek - konec Chvost (postavení dle vyobr.l)	aminokyselin
COL 1	1353-Ů57	398
2	1708-2970	420
3	3040-4242	400
4	4374-5753	459
5	5872-6216	115
Příklad 3	Konstruování plasmidu pPB200 pro vsunutí expresních kazetek do místa CHV C0L3 (vyobr.2)

Plasmid pPB154 (9121 pb), viz příklad 2, se digeruje pomocí Hindlll a Spěl se zřetelem na izolování fragmentu HlmdlII-Spel (620 pb, fragment A). Plasmid pPB154 se digeruje pomocí EcoR a Spěl pro isolování fragmentu BcoRI-Spel (659 pb, fragment B). Fragmenty A a B se spojí dohromady s vektorem pGEM4T (Promega Ref. P2l6l), předtím digerovaným s EcoR a Hindlll pro získání plasmidu pPB199 (4O96pb). Plasmid pBB199 se posléze digeruje s Spěl, dalším působením alkalické fosfatasy, další ligaturou s více místy klonování se získají hybridizováním 2 následující oligonukleotidy:

• 9 9 · · »

9« 9 >999999

9 9 9 9 9 • 99·· 9999*99 ·♦ · ·

-12JAC070 (33 mer) (SEQ ID č.7) *CTAGTCCAGCAAGGTGGATCGATATCGGGCCCA 3'

JCA071 (33 mer) (SEQ ID č.8) * CTAGTGGGCCCGATATCGATCCACCTTGCTGGA 3 ' a tím se získá plasmid pPB200 (4129 pb).

Příklad 4 Konstruování plasmidu pPB2O2 pro vsunutí expresních kazetek do místa CHV COL5 (vyobr.5).

Sekvence genu CHV'COL5 byla již nedávno publikována, viz Limbách L. a spol., J.Gen.Vol. 75.» 2029-2039 (1994).

Jedna reakce PCR byla provedeny s genomickou ADN viru CHV, kmen P205 (příklad l) a byly isolovány tyto oligonukleotidy:

JCA072 (22mer) (SEQ ID, c.9 'CAGCTTTAT GTTTTTATTGTTC 3 '

JCAO73 (25 met) (SEQ ID, č.10) 'AAAGAATTCTACAACGTTTTAATAAAGAC 3 * to pro získání fragmentu PCR (751 ob) obsahujícího kompletní gén CHV 0RP2. Tento fragment byl digerován s BglII a EQoRI (709 pb). Tento fragmeht byl spojen s vektorem pGEMAZ (Promega Ref. P2l6l, předtím digerovaným’s EcoRI a BamH pro získání plasmidu pPB2El (3559 pb). Plasmid pPB201 byl pak digerován s Soal a PvuII, potom spojen s násobným místem klonování, jak bylo získáno hybridizováním dvou následujících oligonukleotidů:

JCA074 (36 mer) (SEQ ID c.ll) ' ACTCCAGCTACATGGGATATCGGGCCCATCGATCAAG 3 '

JCAO75 (36 mer) (SEQ ID č.12) 'CTGATCGATGGGCCCCGATATCCCATGTAGCTGGAGT 3' aby se tak získal plasmid pPB202 (3395 pb).

• ♦

-13Příklad 5 Konstruování plasmidu pPB2O4 pro vsunutí expresní kazetky do strany CHV TK (vyobr.4)

Sekvence genu CHV thymidin-kinasy byla nedávno zveřejněna, viz Rémond a spol., Virus Research 39. 341-354 (1935). Jedna reakce PCR byla provedena s génomickou ADN viru CHV kmen P2O5 (příklad 1) s těmito dalšími nukleotidy:

JCAO76 (35 mer) (Seq. ID, č.13

5/GCGTTAACCTCAAAAGCCAAATTTACACTTTCCCG 3 '

JCAO77 (38 mer) (SBQ ID č.14)

5'CCCAAGCTTTTCTAAAGCCCATTTATAAATAATAAATG 3 ' pro získání fragmentu (1030 pb) s obsahem génu thymidin-kinasy (TK). Tento fragment byl digerován s Hpsl a Hindlll pro isolování fragmentu HpsI-HindlII (1919 pb). Tento fragment byl navázán na vektor pSP73 (Promega Ref. P2221), předtím digerovaným s EcoRV a HinlII pro získání plasmidu pPB203 (3423 pb)

Plasmid pPB203 byl potom digerován s EcoRl a Styl, dále navázán ná násobné místo klonování, získaného hydrodizováním dvou dále uvedených oligonukleotidů

JCA078 (36 mer) (SEQ ID č.15)

JCA078 (36 mer) (SEQ ID č.15) 'AATTCCCAGCTACATC-GGATATCGGGCCCATCGATC 3 '

JCA079 (36 mer) (SEQ ID č.l6) 'CAAGGATCGATGGGCCGGATATCCCATGTAGCTGGG 3' získá se tak plasmid pPB204 (3399pb)

Příklad 6 Konstruování plasmidu pPB20'6 pro vsunutí expresních kazetekdo místa, situovaného mezi gény CHV orf!9 a orf22 (vyobr.5)

Srkvence intergénové oblasti, odpovídající přírodnímu vypuštění génů, kódujících velkou ped-jednotku (gén RRl”) a malou podjednotku (gén ”RR2”) ^CLbonukleotidové reduktasy • ·

99 » 9 9 ♦ • ·

99 99

9 9 9 9 9

9 9 99

9 9999 9

9 9 9

9999 99 99

-14byla publikována před krátkou dobou, viz Rémond M. a spol., J.Gen.Vitorl 77. 37-48 (1996). Podle nomenklatury Rémonda a spol. k opomenutí těchto dvou genů dochází mezi otevřenými částmi vazby, označenými CHV ”orfl9” a CHV ”orf22). Jedna reakce PCR byla realizována s genomickou ADR viru CHV kmen P205 (příklad 1) a s těmito dalšímo oligonukleotidy:

JCA080 (36 mer) (SEQ ID č.17) 'GGAGATCTAGTAAATTAAAATAíÍTAATTCATTTAATG 3 '

JCA081 (33 met) (SEQ ID č.18) ' CAGTCGCGAAGATGAAAATAAAATCCATCGAAD 3 ' se zřetelem na získábí fragmentu PCR (720 pb) obsahujícího intergénovou oblast s přírodním opomenutím genů CHV ”orf 19 a ’/orf22. Tento fragment byl digerován s Spěl a Nrul pro izolování fragmentu Spel-Nrul (709 pb). Tento fragment byl navázán na vektor pGEMAZ (Promega Ref. P2l6l), předtím digerovaným s Směl a Xbal se zřetelem na získání plasmidu pPB2O5 (3572 pb). Pl_ssmid pPB2O5 byl pak digerován s Mfel, pak částečně digerován s SspI s konečným izolováním fragmentu Mfel-SSpI (3512 pb). Tento fragment byl navázán ne vícenásobné místo klonování, získané hybridizováním dvou dále uvedených oligonukleotidů:

JCA082 (38 mer) (SEQ ID č.19) 'AATTGGCAGCTACATGGGATATCGGGCCCATCGATAAT 3 '

JCA083 (34 mer) (SEQ č_o 20) *ATTATCGATGGGCCCGATATCGGATGTAGCTGGC '3 ' aby se tak zídkal plasmid pPB206 (3548 pb)

Příklad 7 Izolování genomické ADN z kmene CDV Onderstepport a klonování komplementární ADN kódující gény HA a P

Kmen CDV Onderstepport, viz Mitohell W a spol.,,J.

Virol Meth. 18, 121-131 (1987) byl kultivován na buňkách MDCK (Madin Darbey Canine Kidney) v prostředí DMEM (Gibco).

-15Po vyčistění viru byla izolována genomická ARB za použití techniky extrahování směsí guanidiuathiokynát/fenol-chloroform, viz Chomczynski P. a Sacchi H., Anal.Biochem. 162, 156-159 (1987). Specifické oligonukleotidy (mající na svých extremních polohách 5 'restrikční místa pro usnadnění klonování rozšířených fragmentů) byly syntetizovány takovým způsobem, že otevřely dokonale kódující oblasti génů před ampflikací (totiž gény HA a P). Transkripční inverzní reakce (RT) a amplifikování řetězce polymerasou (PCR) byly provedeny stahdardizovanými technickými postupy, viz Sambrook J. a spol., 1989. Každá reakce RT-PCR byla provedena s dvojicí specifických amplimerů s tím, že jako matrice byl použit virální extrakt genomické ARN. Dodatečně amplifikovaná

Λ

ADN byla extrahována směsí fenol/chloroform/isoamylalkohol (25 : 24 : 1) předtím, než byla digerována restrikČními enzymy a klonována do vhodného vektoru.

7.1» Konstruování expresních kazetek CDV HA (pPB20S) (vyobr.6)

Plasmid pCMVB (Clontech Ref. 6177-1) byl digerován s EcoRI a Notl se zřetelem na izolování fragmentu BcoRI-Notl (818 pb), obsahujícího promující oblast génu, nezprostředně časného, lidského cytomegaloviru (fragment A).

Jedna reakce RT-PCR byla realizována v genomickou ARN viru CDV (kmen Onderstepoort) a za použití dále uvedených oligonukleotidů

JCA084 (32 mer) (SEQ ID Č.21) 'TTGCGGCCGCATGCTCCCCTA'.(ÍCAAGACAAGG 3 '

JCAO85 (28 mer) (SEQ ID č. 22) 'TTGGTACCTTAACGGTTACATGAGAATC 3' to prozískání fragnebtu PCR (1837 pb) s obsahem génu HA z

CDV. Tento fragment byl digerován s Notl a KpnI pro izolování fragmentu Notl-Kpnl (1826 pb (fragment B).

t 00 • 0 0 0

0 • 0 • ·

00

0 0 0

Φ 0 00

4 0 ·

0 0

00

-16Fragmenty A a B byly navázány dohromady na vektor pGBM-72f + (Promega Cat P2251), předtím digerovaný s EcoRI a KpnI za získání plasmidu pPB207 (5634 pb).

Jedna reakce PCR byla provedena s plasmidem pOMVB a za použití dále uvedených oligonukleotidů PB0088 (30 mer) (SEQ ID č.23) ' TTGGGTACCGCCTCGACTCTAGGCGGCCGC 3'

PBOO89 (32 mer) (SEQ ID č.24) 'TTGGGTACCGGATCCGáAAAAACCTCGOACAC 3 ' pro' získání fragmentu PCR (244 pb) s obsahem polyadenylačního signálu předčasného génu viru SV40. Tento fragment byl digerován s KpnI se zřetelem na izolování fragmentu EpnI-KpnI (233 pb). Tento fragment byl posléze navázán na plasmid pPB207, předtím digerovaný s KpnI, aby se tak získal plasmid pPB208 (5867 pb).

7o2 Konstruování expresní, kazetly CDV P (pPB2lO (vyobr.7)

Plasmid pCMVB (Clontech Ref. 6177-1 byl digerován s EcoRI a Notl se zřetelem na izolování fragmentu EcoRI-Notl (818 pb), obsahujíhíxpromotriční oblast bezprostředně Časného génu lidského cytomegaloviru (fragment A).

Jedna reakce RT-PCR byla provedena za použití genomické ARN viru CDV (kmen Gnderstepoort) a s dále uvedenými oligonukleotidy

JCA086 (34 mer) (SEQ ID č.25) . ’ 'TTGCGGCCGCATGCACAGGGGAATCCCCAAAAGC·3 '

JCA087 (28 mer) (SEQ ID č.26) ^ZTTGGTACCTCAGAGTGATCTCACATAGG 3 ' pro získání fragmentu PCR (2011 pb), obsahujícího gén P z CDV Tento fragment byl digerován s Koti a KppI se zřetelem na izo lování Notl-KpnI (2000 pb) (fragment B). Fragmenty A a B b_vly společně navázány na vektor pGEIví-7Zf + (Promega Ref. P2251), předtím digerovaný s EcoRI a KpnI pro získání plasmidu pPB209 (8808 pb).

* ·

··

4 4 <

4 ··

4 4 ·

4 4

44

-17Jedna reakce PCR byla provedena s plasmidem pCMVB a s dále uvedenými oligonukleotidy:

PB088 (30 mer) (SEQ ID č.23) 'ttgggtaccgcctcgáctctaggcggccgc 3 '

PB089 (32 mer)(CEQ ID č. 24) 'ttgggtaccggatccgaaaaaacctcccaca 3 ' pro získání fragmentu PCR (244 pb) s obsahem polyaaenylačního signálu vyspělého génu viru SV40. Tento fragment byl digerováh s KpnI se zřetelem na izolování fragmentu KpnI-KpnI (233 pfe). Pragment nyl posléze navázán na plasmid pPB2O9, předtím digerováný s KpnI k získání plasmidu pPB210 (6041 pb).

Příklad 8 Konstruování donorového plasmidu pPB2l3 pr vsunutí kazetky s expresí CDV KA do místa CHV C0L3 (vyobr.8)

Plasmid pPB208 (příklad 7.1.) byl digerován s Apal a

Clal pro izolování fragmentu Apal-CIal (2920 pb) s obsahem extresní kazetky génu HA viru CDV. Tento fragment byl posléze navázán na plasmid pPB200 (příklad 3), předtím digerováný s Apal a Clal pro získání plasmidu pPB213 (7043 pb). Tento plasmid umožňuje zasunutí kazetky s expresí génu CDV HA do místa CHV C0L3.

Příklad 9 Konstruování donorového plasmidu pPB2l4 pro zasunutí kazetky s expresí CDV P do místa CHV C013 (vyobr.9).

Plasmid pPB2lO (příklad 7.2) byl digerován s Apal a

Clal se zřetelem na izolování fragmentu Apal-CIai (3100 pb), obsahujícího kazetku s expresí génu P viru CDV. Tento fragment byl potom navázán na plasmid 'pPB200 (příklad 3), předtím digerováný s Apal a Clal pro získání plasmidu pPB2l4 (7217 pb). Získaný plasmid dovoluje zasunutí kazetky s expresí génu CDV P do místa CHV COL 3.

-18fe fefe fefe fefe • fefe · · fefe · • fe fefe··

Příklad 10 Konstruování donorového plasmidu PB215 pro zasunutí kazetky s expresí genu G do viru vztekliny v miste GHV C0L3 (vyobr.

10,,11 a 12)

Plasmid pPBl99 (příklad 3) byl digerován a Spěj a po působení alkalické fosfatasy byl navázán na větší počet míst klonování, získaných hy bridizováním těchto dvou oligonukleotidů

JCA088 (39 mer) (SEQ ID č.27) 'CTAGTCCAGCAAGGIGTCGACGGATCGATATCGGGCCCA 3'

JCA089 (39 mer) (SEQ ID č.28) 'CTAGTGGGCCCGATATCGATCCGTCGACACCTTGCCTGGA 3' se zřetelem na získání plasmidu pPB2OO^z(4135 pb (vyobr.10).

Plasmid pCMVB (Clontech Ref. 6177-1) byl digerován působením EcoRI a Notl se zřetelem na izolování fragmentu EcoRI-Noil (818 pb) s obsahem promotriční oblasti bezprostředně časného genu lidského cytomegaloviru (fragment A).

Podle technických podrobností, které.již zde byly popsány pro virus CDV (příklad 7), byla extrahována a čištěna ARN ze zdroje ERA viru vztekliny za použití buněk Věro, infikovaných virem vztekliny. Jedna reakce RT-PCR byla již zde realizována (viz příklad 7) za použití genomické ARN viru vztekliny (kmen ERA) a za použití dále uvedených oligonukleotidů:

JCA090 (31 mer) (SEQ ID č.29) ' TTGCGGCCGCATGGTTCCTCAGGCTCTCCTG 3 '

JGA091 (31 mer) (SEQ ID č.30) 'TTGGTACCTCACAGTCTGGTCTCACCCCCAC 3 ' aby se tak získal fragment PCR (1597 pb), obsahující gén viru vztekliny (spisy . ER-A-2 515 685 ..a EP-A-162 757). fragment byl digerován s Noří a KpnI pro izolování fragmentu Notl-PknI (1586 pb) (fragment B). Fragmenty A a B byly společně navázány na vektor pSP73 (Promega Ref. P2221), předtím digerovsný s EcoRI a KpnI, aby se tak získal plasmid pPB2ll (4852 pb).

·· ·· « ·· ·· ·· • · · · ·· · i ί Ϊ • · · · · · ·· . . . · ··«···· . » · · · · · ········ .·»···· ·· ··

-19Jedna reakce PCR byla realizována s plasraidem pCMVB a se dvěma, dále uvedenými oligonukleotidy PB088 (30 mer) (SEQ ID č.23) 'ttgggtaccgcctc'gactctaggcggccgc 3 '

PBO 89 (32 mer) (SEQ IB č₀24)

5ÍTGGGTACCGGATCCGAAAAAACCTCCCACAC 3 ' pro získání fragmentu PCR (244 pb) s obsahem polyadenyladního signálu časného viru 3V40. Tento fragment byl digerován s Kp-nl se zřetelem na izolování fragmentu ΈρηΙ-$ρηΙ (233 pb).

A tento fragment byl posléze navázán na plasmid pPB2ll předtím digerovaný s KpnI pro získání plesmidu pPB2l2 (5085 pb) (feyobr.11). Plasmid pPB2l2 byl digerován s EcoRV a Sáli pro izolování fragmentu EooRV-SalI (2664 pb) s obsahem k,o zetky s expresí génu C- viru vztekliny. Tento fragment byl posléze vázán na plasmid pPB200(viz výše), předtím digerovaný s EcoRV a Sáli pro získání plasmidu pPB2l5 (6790 pb) (vyobr.12).

Příklad 11 Konstruování donorového plasmidu pPB2l6 pro zasunutí kazetky s expresí CDV do místa CHV 2OL5 (vyobr.13)

Plasmid pPB2O8 (příklad 7.1«) se digeruje s Smál a Apal v* s přihlédnutím k izolování fragmentu Smal-Apal (2909 pg) s obsahem kafcetky s expresí génu CDV HA. Tento fragment byl pak navázán na plasmid pPB202 (příklad 4), předtím digerovaný s EcoRV a Apal za vzniku plasmidu pPB2o6 (6291 pb). Tento v* plasmid umožňuje zasunutí kazetky s expresí génu CDV HA do místa CHV C0L3.

Příklad 12 Konstrukování donorového plasmidu pPB2l7 pro zasunutí kazetky s expresí CDV HA do místa CHV TK (vyobr.14)

Plasmid pPB208 (příklad 7.1.) se digeruje s Apal a

Clal se zřetelem na izolování fragmentu (2920 pb) s obsahem kazetky s expresí génu CDV HA. Tenio fragment se naváže na • · » 4 · « ► 4 44

4 4 I ♦ · <

·· fc·

-20na plasmid pPB204 (příklad 5), předtím digerovaný s Apal a Clal za získání plasmidu pPB2o7 (6316 pb). Takto získaný plasmid dovoluje vsunutí kazetky s expresí genu CDV HA do místa CHV TK.

Příklad 13 Konstruování donorového plasmidu pPB2l8 pro vsunutí kazetky §s expresí CDV HA do místa, situovaného mezi gény CHV orf!9 a CHV orf22 (vyobr.15)

Plasmid pPB 208 (příklad 7.1.) se digeruje s Apal a Clal pro získání fragmentu (2920 pb) obsahujícího kazetku s expresí genu CDV HA. Tento fragment se naváže na plasmid pPB206 (příklad 6), předtím digerovaý s Apal a Clal za vzniku plasmidu pPB218 (6462 pb) Plasmid takto získaný dovoluje vsunutí kazetky s expresí génu CDV HA do místa, situovaného mezi gény CHV orfl9 a DHV orf 22.

Příklad 14 Izolování rekombinantního viru vCHVOl s obsahem kazetky s expresí génu CDV HA vo místa CHV C0L3.

Plasmid pPB2l3 (příklad 8) se i^iUsarizuje s HindlII, následuje extrakce směsí fenolu a chloroformu, vysrážení absolutním ethanolem a rozpuštění ve sterilní vodě»

Buňky MDCK, tvořící buněčný bubínek dobře vyvinatý v Petri-ho misce (4,5 cm průměru)mše potom transfikují s dále uvedenou směsí:

pg plasmidu pPB213 linearizovaného + 5 pg virální ADR z CHV v 300 pl prostředí ΜΞΜ a 100 ^ig LipofectAMIHS (Gibco-BRL Cat// 18324-012 se zředí přidáním 300 pl prostředí (komečný objem směsi ± 600 ul)„Těchto 600 ul se nakonec vnese do 3 ml (konečný objem) ^prostředí ΜΞΜ s pomnožením na 3.10 buněk MDCK. Směs se ponechá ve styku s buňkami po 5 hodin, poté se odstraní a nahradí použitím 5 ml prostředí kultury. Cuňky se potom ponechají v kultůře po 24 hodin za teploty + 37°C. Po M až 48 hodinách kultivování se odebere

-211 ml kapaliny nad kulturou a větší počet zředění tohoto podílu nad kulturou se využije pro infikování nových buněk 5IDCK (kultivovaných v Petri-ho mističce, průběr 4,5 cm) takovým způsobem, že se izolují oddělené destičky, přičemž každá Petri-ho mistička byla infikována použitím 1 ml roztoku původní kapaliny nad sedlinou. Po hodinovém kontaktu za teploty 37° C se odstraní prostředíminfikování a nahradí se použitím 5 ml prostředí MEM s 1% agarosy za udržování ve styku při 42° C. Jakmile a&arosa ztuhne, inkubují se Petri-ho Matičky 48 hodin za teploty 37° C v uzavřeném prostoru pod oxidem uhličitým až se objeví destičky.

Překryv agarosy se potom odstrací a přenos virových destiček se provede přenosem na sterilní nitrocelulosovou membránu téhož průměru, jako měla. Petri-ho mistička, použitá při kultivování. Tato membrána se potom přenese na jinou membránu z nitrocelulosy takovým způsobem, že se tím získá obrácená kopie” prvého přenosu. Tímto způsobem přenesené kopie destiček se dále hybridizují postupem, odborníkům známým za použití fragmentu Notl-Notl 1842.hbj génu CDV HA, získaného digescí plasmidu pPB208 (příklad 7.1), značeného digoxigeninem (DNA Labelling Kit, Boehringer Mannheim, CAT 1175033).

Po hy bridizování, promytí a styku s vývojovým substrátem se nitrocelulosová membrána dostane do styku s autoradiografickým filmem. Hybridizačně pozitivní obrazy na této membráně značí ty destičky, které obsahovaly rekombinantní viry CHV, vsunuté do kazetky CDV HA. Destičky odpovídající pozitivním, se sterilně odstřihnou na prvé nitrocelulosové membráně, umístí se v Eppendorf-ově trubičce s obsahem 0,5 ml prostředí MEM a ultrazvukem se uvolní virionty z membrány. Prostředí v Eppendorf-ově trubičce se potom zředí přidáním prostřeí MEM a takto připravená zředění se použijí pro infikování nových kultůr buněk MDCK. Takto byl izolován rekombinantní virus, obsahující kazetku HCMV-IE/CDV HA/polyA vsunutou do místa C0L3 o čistotě 100% po 3 cyklech čistění, označen jako vCHVOl.

• 0 • 0 ··· · · » 0 0 0 »00 ·· *·

-22Homologie rekombinace byla ověřena pomocí PCR za použití oligonukleotidů, situovaných na jedné i na druhé straně vsunutí. Nepřítomnost přepracování genomu rekombinantního viru vCHVOl, právě tak jako rekombinancní oblast byly prověřeny použitím postupu Southern blct.

Příklad 15 Izolování rekombinantních virů CHV exprimujících různé cizí gény

Podle postupů, popsaných v příkladu 14 se realizuje konstruování různých rekombinantních virů CHV za použití donorových plasmidů, popsaných v příkladech 9 až 13.

Příklad 16 Příprava vakciny

Pro přípravu vakciny se rekombinantní viry, získané dle příkladů 14 a 15, kultivují na buňkách MDCK. Rekombinantní virus se odebere jakmile je cytopathický efekt skonče. Odeberou se lyžované buňky a kapalina kultury nad pevnými podíly. Po vyěeření buněčného lyzátu (aby se odstranily zbytky buněčných trosek) se virový roztok titruje. Potom se virový roztok zředí do roztoku, stabilizujícího jej ^ro lyofilizování, vychází se při tom z dávky vakcinové 10 DICC50 až 10 DICG50 na lahvičku s následným lyofilizováním. Virový roztok se potom může zmrazit, je-li to třeba

Příklad 17 Způsoby vakcinování

Podle výhodného způsobu vakcinování se vakcina, připravená podle tohoto vynálezu rozpustí nebo se roztok rozmrazí, načež se podává způsobem parenterálním nebo muko.sálním, s výhodou pak mukosálním, zvláště orálně a/nebo nasálně.Dávkovaná vakcina ma obsahovat s výhodou mezi 10 DICC50 až 10 DICC50.

S výhodou pak činí dávka pro podávání patenterální mezi IO²* DICC50 až 10? DICC50, pro podávání orální a/nébo n_asální mezi 10² DICC50 až 10^ BICC50. Tak, je to bylo právě definováno, je vakcina účinná obecně po jediném podání cestou orální a/nebp nasální. Podávání lze pochopitelně opakovat, je-li to třeba.

WO 97/49825

-23• · ·' · • •er 0000 »0 ·· ··

0 0 0 «

0 0 00

0 000 0 « | 0 0 4 • 00 ·· 0·

PCT/FR97/01115

Vy obr «,1/1

Xhol

CTCGAGGAAATTGTTTGTTTGTATCTACAAAACTTCAAAATATCTTTGTTTATTGTCTCTTCGATGGATT 71 TTATTTTCATCTTCGCGATTGATTCTTCCTTGGTTACCGTAAITTATAAATAAACACAATAAAAATTAAG 141 TTTAAAAACAATTTTATTAAACCC ATCGTCTTGATTTACTATCATCCCAGTAGGAAATTAGAACTAGATT 3994·· ·ν8ΐΤτοΑταΑιχ>8βτΏν55βτΑ3ΡΑ5ρΤτρΤ7Γ5<»τΙ1«^Ιχιΐϊν«ΊΤ<»ι.&^η

211 ATAATCTATCGGTATAGAAATATGTTTCCAAAATAAATTAGTTAAATTTTTAGCCTTTTCTTTATCATCT 3 81 ◄ TyrAspIleProIle£erIleHisLysTrpPhfiI/juAsnThrLeuAsnLysAl^ysGluLysAspAspI

Hindlll

281 ATAAAGCTTAAAAGTGTTTCATAAACAAGATTTATATCAAACTTTTCTTGGATAATTGGAACTCTTTTAA 357 4 lePheSerLeuI/e^zOiixGlxiTyťVáJJLeuAsraieAspPhfiJjysGliiGlriIlelleProValArgLysIl 351 ΤΓ ATAGATAAATmCACCCCTATATTCTGGGGTTATC ATATTTGTTAGATGTTTAATAAATTTTCTCTC 334 4 elleSerljeuAsnGluGlyArgTyrGluProTtirlleMatAsiťllirLeuHisLysIlePheLysArgGlu 421 CAAC ACTTCGTGTTTGGTTTGGGGTGCCGGAAGCATCATTAAAGAACGGGATATCGTTTTCATTATTGGT 3114 LeuValGliJKísLysThrGliiProAlaProLeuMatMetLeuSerArgSerlleThrLysMatlleProP 491 GGAAATCTTGATGTATATTTTAAATTTAAACTATTCTCATCAACAGCTGTTACGCGCTTTGATTGTCCTT 287 4 roPheArgSerTlxťryrLysI^xiAsiiLeuSeiAsiXSluAspValAlaalixValArgLysSexXxliXSlYlÍy 561 TATTTGATGG AGAGTTTATrrTrGATAAAATTTTAAATCCATTTTGATTTTTTGGTATACCAAATGAATC 2644 sAsaaSerProSejAsalleLysSerLeuIleLysPheGlyAsDfilxiAsiiLysPxoXleGlyPheSerAsp 631 GGTATCACTACTTTCACTACTGGTAATATTTGAGGATrCTTCGGATGATGAAACTATATTTGTAGAAACA 2414 liirAspSerSerGluSerSerTlirlleAsnSerSeEGluGluSerSerSerValIleAsnfffarSexValS 701 GAATC ACTTATTCTCCATGAGTTTGATATTTGATCTAAATATTTTTCATGATGTTGTATTTCTCCTG ATT 217 4 exAspSerlleArgTrpSeiAsnSerlleGlnAspLeuTyrLysGluSisHisGlnlleGlufilySexGl 771 CTTCAGATGAATCTCCACTATCAGAATrATATTCCTTTTTACTATrTTTATATTTATrTTTAATAATTGA 1944 uGluSerSerAspGlySexAspSerAsnTyxGluLysLysSexAsnLysayrLysAsnLysIlelleSer 841 TTGAAC AGATTTTAAAATAGGGGCTTGGTGCAAGTCTGTATGACAGCGAACAAACGTACATAAAAACTCA

911 GGATATGATACATTTAAAGAAGCAAGTATATCCCTACATCGGAGGGTGGGTGGAAAAAGAGGTACAACAT 147 4 roTyrSexVaJA^nLeuSerAlaljeiiTleAspArgCysArgT^xfllxrProProPheieuProValValAs 981 CCAATATAATATC ACAACCC ATTAATATTAGATCAGTATCCGTTGTATATATTTGAGCGGCTGTATTAGT 124 4 pl£^le!leAspCysGlyMetIjeuXleIjeuAspThrAspa23xaaixTyrIleGloAlaAlaaaiiAsnIhr 1051 ATGATAAAGATTAGCACAAACATCATCAGCTTCCATATCAGATACATTAACATATGGAAAACCCAAATGG 1014 HisTyzTjenjAsmAlaCysVálAspAspAlaGluMatAspSexValAsnV^lTyrPzoPheGlyXeuHisA 1121 CGTATTAAATTAACACATAATTTATAACATAACTTAGGAGTATTTACAAGTGAGCTCCATCGTGCTGATA

4 ggllpr^uAmValOvHT^iLvsTyrCy^ljeuLvsProThrA^VaTTjRiiSai-S&gTrpA-njRTaqA-rTť» 1191 AAATATTrATAGGTrCACATrrTTCCAATTTrTTGTAAGTTTTTAAAATTTCCCCAC ATACATTATCCTT

4xxileAsi3XleProGltJCysLysGlti3jeuLysLysTy3SteLysIeuIleGluGlyCysSV'alAsnAspLys 1261 AATGGAATTTCTCCAAGTCTTCCAGATCCTCCTTGATGACACATAGTTTGTGTGGCGATACGTTTGCTCC

314 :QeSerAsziArgTl3?T±trLysTrplleArgArgSerSeiA/^TyxAsr!TiirHisArgTyrThrGlnGluV <—-COL1 ‘ * Bglll

1331 ACGTTTAACATGTCCATCACCATTTATACCACGATCTGAAACAAAAATTGGAAAATAAGATCTTTTTTGG 7 4 al AgnT^iiMňt-AspMaťValMat

1401 AGTAATTTAAGTAAAGAAAAAAAACATTCAGCTGTTACAGTGGGACTATCCGTTTGAGTATCATTTTCTA 1471 TACAAAATTTTTCCATCAACGTATACATTACATTCCATAAGTCAATTGCGATTGGTGTACAATACCAGGT

Spěl

1541 GGTGTTGCTATCGCATCGTGTTTAACTAGTCTACGACTATAAGCATATTTCAAAAGTCCAAAAAGAGCCA Spěl

1611 TTTTAATAAAATACCAAACAGAACCTTTTCGACAAACTAAATGAATAAAACTAGTTTTTAAGTATTAAAT • »

WO 97/49825 •24

PCT/FR97/01115

Vyobr o1/2, pokračování COL2—>

1681 ATAACCTTTAACTAAATTAATTAAATAATG ATTAATTTAAAAACCGAAATACAAATATTTTrTAGTCAAG 1 ► MetlleAsnLeuLysTfarGluIleGliiIlePhePbeSexGliiA.

1751 ATTTTATGAAATCAATCAAAATCACCACAATTATGCAAATGAACCCACCTACCAACGTCATCAAAACTAA 15 ► spPhfifrfetLysSerlleLysIleaSii^&irlleMetGlrMetAsnProPraThrAsaVaJLlleLysrhEAs

1821 TTTAGTCTATAAAAAGAAATOGTTAACATTTAGTTTAAATrTAAACTTTTATTTCTTAAAATTTTTATTA 38 ► !JLewValTyrLysLysLysIeul£u3toPhfiSerl<euAsi3l^uAsnPhfiTyrPheLeuLysPheI<euLeu

1891 TTrTGCTTAGTTTTTAAGGCGATGGCGTGTTTTCGTCCTAAAACTGAATTTAAGATAACCAACCATCCAT 62 ► PheCysIieuValPheLysAlaMatJQaCysPheArgPinLygfltirGluPheLygTT aThy&gnW-i

1961 CTCAGATTATAAATAACGAAGAAAATATAAACTCTGAAGAAGGAAAATTTATATCTGGTCGTGCTGTTTT 85 ► erGlxiIlelleAsnAsnGluGluAsnlleAsiiSerGluGluGlyLysPiialleSerGlyAEgAlaValle

Hindlll

2031 GGAAG ATCAAAAGCTTCGTGATGTGATAAGTATGCTAACACCCTTTTCAACTAGCTTGAAAAACTCTTTT

108>xiGluAspGlxmysLeuArgAspVarrieSerMatLeiťIhrProPhfiSerT33rSerLsuLysAsriSexPhu2

Spěl

2101 ATAGTTTTTAGTG ACTATGGGATG ATG ATCC ATACTAGTATTTGTGGAGAAC AAATTTACATTCCTATTT

2171 CTAAAAACC AATTTTCTTCTTATTTTTGGGGATATAGCGACCCTGCGGTATTTTTGGCAAATGTTGATAG

5 ► erLysAsr^lnPhfiSerSerTyrPhfiT±p31yTyrSerAspProAlaValPhaLeuAlaAsn.ValAspSe

2241 TAAAAGGGG ATTGTTGG ATGTTTTTAAATCAAC AAGTAAAATGTCTAAAGTATTCTTTGAAATAAGTAAC 178 ► rLysArgGlyljeuLeuAspValPheX,ysSerlíirSerLysMetSerLysValPhePbfiGluIleSexAsn

2311 CCTTCCC AACATAGAATGTTAAAAC AAGTTATTTTTACTATAAGTGATAGTAATATAAAATGCTCTACAC 202 ► PixsSerGliiHisArgMetJjsuLysGlxiValIlePhfiTfarXleSerAspSerAsnlleLysCysSez^SirL

2381 TTCTAAAAGCTGAATTTAGTAACTATTGTATTATGCTTCCATCAAGAAATCCGGACTTTAGTCTTGAACT 225 ► ^iT/^iUyr^QAGluPh^ftiAgaayrt^IleMatJ^uPžťk^ÍťArgAfinPrnAjÍpPhPLCÍ.r-r^iTninT/a 2451 . TAATAAATATCAATTAAATAAAATACTCGAACTAAACAřiAAAACAAAATTCATTGTTAAAATTTGAATCT

2521 AATGAAAATAATGTTGTGATTTC ATCTGAAAGTGGAAGTGTTTC ATTGAATTTGGATAGAAGCGATTCTG 272 ► AsriGlxiAsnAsn.ValValIleSerSerGluSerGlySerValSerLeuAsnLesjAspArgSerAspSerG 2591 AAGGAGAAGATAGCGCATCGATTTTAAAATCTGCTACAAAAAAAGTAAATCCTTATCTAGTTAAACACTC 2 9 5 ► luGlyGluAspSex^Ú^SexIleleuLysSerAlaTtaLysLySValAsnProTyrLeuValLysHisSe 2661 AGAAAATTTCAAACGTTTAAAATTTCGTTGGATGATTATACCAATTTTTTTTCCTCTTTTGAAAAAACTA 318 ► cGlxiAszXPheLysAi^LeuLysPheAzgTEpMetXlellePcoIlePheFhaPxoljauLeuLysLysLeu

Hindlll

2731 AAACTAACAAATACAACAGTATCGATAAATTTCTTTTTTACTCCAACTACCAATCCCATGATAAGCTTGA 342 ► LyKT^ťlŤiT-Aqnate^aiiValSerXlaAaiaPhftPhftPhřťrhT^rtťrhrThrAmPggiMftť-Tl^qAT-Tz^ťP

2801 CGTCAAGTAAACCAATTGGAATTATACTGTTTTTCTTTTGTACCAATGAATTGCAACATAAGAGCCTGAA

2871 GCGCCCAGCATCTCCATCAGATGAAGAAAAGCCACCAAAAATCCAATGTGGATTTTTTAGTCAACATTTT 388 ► sArgPxroAlaSerProSerAspGluGltíLysProProLysIleGlECysGlyPhsPiieSexGliiHisPhe

2941 GTAAATACGGATGTTAATATTAAACCCTÁATTAAATGACGTAAAATGATAAAXTGTATTTAAAGAGAAGT 412 ► ValAsnXhrAspValAsnlleLysPro· · ·

Hindlll COL3—>

3011 TTTTTCCAAAAGACAAGCrrTTATTAATAATGTCACTAGAAGATAATAATGTACAATCGTTTGATC AACT 1 ► MafcSftrtzajflT uAgpAmAmVal m rvOoT-Pho t»t «

3081 GGAACCTCCTATTACATCATTTTCTATAATAAATTGCTCTGGATCGAGACCTGGATGTCTACCATGTATG ► uiGliiProPwTleThrSerPheSerllelleAsECysSexGlySerArgPrtiGlyCysLeuProCysMst

9 · · φ * · ·

Φ 9 ·♦

ΦΦΦΦ · • φ

4»

PCT/FR97/01115

ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ

WO 97/49825 -25- .'/»·<

Vyobr.1/3, pokračování

3151 TATGTAACTACAAAATCACTTCTATGTATTGGACTTCAAGCTGGAATTTTAACAGCCTTAATTATATTAA

3221 TTCAAATATTAACTGAAAGTreCGTATGTTCTATAATTCTTATAGCAACTGTGTTAATATTTACGCTATC 61 ► leGlriCleLeweiaai^uSerPheValCzsSerlleXleLexLQeAlaXlti^all^uIlePhelbrLeuSe

3291 AAAAATATCTATTTCTACTTCTGAAAAAATTTCTTCTATTTGTAGAArrAGTCAGTCG ATATTTGTAACA 84 ► rLysIleSerlleSerfaicSerGluIysIleSexSerlleCysArglleSexGlxiSerllePhftValThr

3361 ATAGCCGCCTTTTGTTGGGGGTTTGATTGGATATTAAATCCAATAGCAATTAAAATAATTCTTATATTAA 108 ► IleAlaAlaPhsQysTrpGlyPheAspTrpIleljeuAsnPEOIleAlalleLysXlelleLeuIleDeuS 3431 GŤTTATCATTTTTAACTATTTGTACAATAAAAATACATATATTTTATTTGATAAGTATATTAAATGGTTC 131 ► erLeuSegPheIjeUThgIleQrsOŽ>glleLvsneHisnePhgTyri^iťCleSggTlAT/*iiAgťi«iyfto 3501 TGGATCTCATGTAAAAGGATCGCTAGTAACAATATTGTTTGGAACTATACTAGGTGTATrTGGAACTCTT 154 ► rGlySegHi^alLvsGlvSerLeuVallhrlleljeuPheGiyQicllel^uGlyvaTPb^Qiyrh-rT^i 3571 AATGTTATTAAAATAGAAATTTTAATTGGATTTGGTATAGC ACTTTGTATAATTTTATCTAAC ACC AACT 178 ► AšnValIleLysIleGluIleLeMXleGlyPhe<a.yIleAlaI«jCysIleIleLe«SexAstíEbrAsnP Spěl Bglll

3641 TTGGACTAGTAATTAGAG ATAC ATGCTATTATCGTATAGGAAGATATAAATTAATGAGAACTTTTACAGA 201 ► heGlyLeuValIleArgAspTlizCysTyi^iyrArglleGlyAirgTyrLysljeuMatArgTlirPhaTliEAs

3711 TCTTGGAC ATGG AGCGTCTTACTCAATAGAGGAAGATGAAACCTCTGATTACAGTGAAATACATGAAAGA 22 4 ► pLeuGlyHisGlyAl^erTyrSerlleGluGluAspGluThrSerAspTyrSerGluIleHisGluArg· 3781 AAAATTAGTAGTTTTC AACTAATTTATAAATATCC AAGTATGATAATAATTTCTATTTTAGGATTTATGT

3851 TAACTATAGCTATTTGGGGATTAAATGTATACTTAAAAAATTTAAAATTTCATTCTCCTTTTACACTTGT

271 ► euThrIleAlaTleT±p3lyLeuAsnValTyrLeuLysAsaLeaiLysPhfiHisSerPixďhellu:Leu.Va

3921 TATTAGGTTTATTGTTGGTC ATTGTTTAGCATTCTTAGTTGAACCGTTTAACTATAAGATTAAATGTATA 294 ► lIleSerPhelleValGlySisCysLeuAlaPheLeuValGluProPhfiAsrťryrLysIleLysGysIle

3991 TC ACG AATTATACTAATTATTTGTCTTTTACTAGAATTAATTGCTTC ACTTATTTCTGTACTAGG ATTAA

4061 ATTTTGGATC ACC ATTAATCTTGACAACAACTACTACAATTTCGTTAGTTTCACTTTTGTATATACGAAA 341 ► siiPhj^lySerPixmeuXleIj9ii3±ixTíira±irThrThrIleSarI_JeuVal^erleiiL<euTyrIleAra'Ly 4131 ACAAACACAAGGTGTAAACCGTCTTGCTGCCACATATATTTCACGAGCCCTAATTATTGGTTTGTATATG 364 ► sGlxfl±itGlnGlyValAsiiArgLexiAlaAla31irayrIleSexArgAlaIjeuLlleIleGlyLes3Tyií4Bt 4201 ACTGTTGGAATTTGTTAC ATTTTTATTAAAACAATAAATTAAATTTTTTAAACTATATTACGGTTGTGTG 3 8 8 ► ThsValGlylleCysTyrllePhalleLysaairlleAsn· · ·

EcoRI

4271 TGTTTTAAGTTTTAAATAAAGCAATATTTCGAATTCACATTTATCAAAAACATTAAAACCCAACACAAAA COL4~>

4341 AAATTTCTATAATCATTAAGGTAATAAGTCAAAATGAGTTTTAAAAATTTTTATCTAATATATGTAATTA 1 ► řfet^erPheLysAsxjPheTyrLeuIleTyiValIlel

4411 TAATTTTTATAAACTCGATAATAACTTCGGCATCTACATCCAAACCTTCAACACCTACCATAATTCCAAC 13 ► lellePhelleAsnSerllelleThrSexAlaSeraítóeELysProSesTfarPsoTfarllellePraTli

4481 TTCAGC AAATGAATCACCTGCTTCCATAGATACAACTATAACAAAACCTATATCTACAGAGGCAAATAAT 3 6 ► xSexAlaAsaGlxiSexPsaAlaSerlleAspTlxrtSirllealirLysProIleSerairGluAlaAsnAsa

4551 TTAAAATC AGTAAGTACCTCAATTAAACCACCTAAAAACTTAAAAAAAAAATTACTTAAATCTAAATGTA 60 ► LeuLysSerVal^erTlc^erlleLysProPrxiLysAsxiLeuLysLysLysLeuleuLysSerLysCysA

4621 GAGATAATGTTATTTATAGGCCATATTTTAGTCAATTAGAAATTAACTGTACTATAACTAAAAAGCAAAA

4691 TTTAAGTAATCCTTTAATTGAGTTATGGTTTAAAGAACTTTCTACATATAATAAAACCAATGAAAATGTT 106 ► uLeuSeiAstťPEOljeuIleGltfLeuahnpPhaLysGltiLeuSeraSiETyEAsiiLysThxAsnGluAsnVal

4761 GAAAGTTTAAAAAC AGATATATC AAAAAATATTTTATTATTTTCGAC AAAAAATAATAGTGATAACTTTT (»

PCT/FR97/01115 »· · * φ φ · · « φ • φ ί»/ • ♦ ♦ φ φ · • φ '· φ φφ φφφφ φ • φ · • φ φφ

WO 97/49825

-26— _ν , Vy obr ,1/4, zakončení

4831 ATAATCATTTTTTATTAGGTATACAAAATCAACCAGTAAATTATAAACTTTACGGTTCCCAATTrTATGA

4901 TAATGGAAACATATTACTAAATATAAAGTCGGTTGACTTTAAAACCTCTGGAATATATACTTGGAAACTA 17 6 ► pAsiXllyAsialleLeuIjauAsiiXleLysSeiAraJAspPhenysaiirSerGlylleTyťSirTtpLysLeu.

4971 TATAATTCAAATAATGAAAGTATTTTTGAAACTTTTAAAATTCAAGTATATGCATATCATTCACCAAATG 200 ► 0yiAsiJSerAsxiAsnGliiSerIlePheGlia2icPheLysIleGlaValTyxAlaTyraisSeEPEOAsnV

5041 TAAACTTAAAATCAAACCCAAGTTTATATAATGAAAACTACAGCGCTATTTGTACAATAGCAAATTACTT 223 ► alAsiiLeuLysSexAsnEiroSerLeairyrAsnGlxiAsiťryxSerAlalleCysBaElleAlaAsnTycPh

5111 TCCATTGGAATCTACGGAAATATTTTGGTTTAACGATGGACAACCTATTGATAAAAAATATATAGATGAA 246 ► eProLeiiGlijSein2uX31iiIlePh2TrpPhaAsnAspGl-yGlriProIleAspLysLysTyrIleAspGlu

5181 ACTTATAGTGTATGGATTGACGGTCTTATAACACGCACTTCAATATTATCCCTTCCCTTTTCCGAAGCCA 270 ► ThrTyrSeWalT±pIleAspGlyLeuTleTlirArgn±irSerIleLeuSerLeuProPh£^exGluAlaM

5251 TGG AAAGCCCCCCCAATTTGCGATGTAATGTTGAATGGTATAAAAATTCAAAGGCCTCAAAAAAATTTTC 293 ► etGluSerPrcProAsnljeuArgGysAsnValGliťrrpTyrLysAsxiSerLysAlaSerLysLysPhfiSe 5321 AAATACCGTTATTCCAAAAGTTTACTATAAACCTTTTATATCTATAAAATTTGATAATGGTTTAGCTATT 316 ► rAsiťrfaxValIlePxoLy^alTyrTyrLysProPhelleSerlleLysPhaAspAsnGlyLeuAlalle 5391 TGTGATGCTAAATGTGTTTCCCGTGAAAATAATAAATTACAATGGTTAGTTAAAGATATACCTATAAATG 3 40 ► Q/sAspAlaLysCÝSValSeiArgGluAsiaAsaLysLeuGljítepLeu,ValLysAspIleProIleAsnG 5461 GTG ATGATATTATAAGCGGCCCCTGTTTAAACCACCCTGGTTTGGTCAATATTCAAAATAAAATAGATAT 3 63 ► lyAspAspIlelleSejXjlyProCysú^euAsnHi^ProGlyLeuValAsaiZleGloAsnLyslleAspIl 5531 ATCGGATTATGATGAACCTGTTACCTATAAATGTTCAATTATTGGTTATCCAATAATTTTTCCCAACTTT 386 ► eSerAspa^xAspGlxtí^VaiaaarayrLysQfsSerllelleGlyTyrProIlellePhePrQAsciPha 5601 TATGATGAAAAGGTGTTTGATGCATCGGATGAAAATGTTAGTAAATCGATGTTAATAAGTATTACC ACAA 410 ► ayzAspGluLyšValPheAspAlaSerAspGltiAsaValSerLysSeiMetleuIleSerlleíIhrThrl 5671 TAATTGGTGG AGCCATTTTTGTTATAGTATTGATTTTTATAAC AGCTTTATGTTTTTATTGTTCAAAAAA

BglT

5741 TAATAAG ATCTAATATCAATATTTACGTAAATGGATTATATAATGTTATATTCGTGTTATTATGATTTAT 456►oAsnLysIle···

COL5—>

5811 AAGTTCATCAAATTTAAAAATTTGTATAGTATrAAGATrTTTAATAGGGGTATCGTTTAAT ATGGCTC AG l^MetAlaGln

5381 TTAGTTTTAACTGATATTCCCCTCGAAGATGTGGAAAATAAAAATACTTCATCCGACGAAGAAACAACTA 4 ► LeuVaJLIjsuThiAspXleProIjeuGliiAspValGluAsxiLyaAsiťliirSerSerAspGliiGliťllirThxA

5951 ACTTAAACC AGAAAAAATCAACATGTC AATGTTTATGTGTTACCCTTGGATTTTTTGCAGCTGGAATTTT 27 ► snLeuAsxMSkaLysLysSexOtaCysGlnCysIfiuCysváiaairLeuGlyPhePheAlaAlaGlyllaLe

6021 ATTAACCATAGCTGCAATAATTTTTACTTTTATTTTTACAGTACCATTAGAAATGCTTGGATCGATTAAT 50 ► uLeuThrIleAl^LAlaIleTlePheTtoPhjallePheT±irVaLLProLetiGltiMatLeuGlySerIleAsn

6091 TGTCCTCCATCTACATTTGGTATTGATAATGTTTGTATCGAACCAATAAAAAAATCTATTAATTCTTATT 7 4 ► CysProProSerTíirPheGlylleAspAsn.ValCysXleGliiProIleLysLysSerlleAsxiSexTyrS

Seal

6161 CAGAATTATCTAAAATATGTTATGATAGATTGTCAAATCCGATAAATCAGAGTACT 97 ► erGliiLeuSerLysIleCysTyrAspArgLexiSerAsriPi?oIleAsnGlxiSerT±ir

ÁT'</(,“

KALE

VSElhCKA ZEí-fcwt

A PARTUΓ

120 00 Praha 2, Hálkova 2

Česká republika

WO 97/49825

-27Vyobr .2

Φ · · · * · · · f *

9. *9

9999 t 9 9 9 9

9 9 <99

9 99 9 9 9 fí 9 9 9

PCTZFR97/01115

EcoRI

Híndlll

B.glll

Spel^stXJ^RV Clal • « · » » · · 1 ft ι

WO 97/49825 .28PCT/FR97/01115

BstXI

Apal pGEM4Z

WO 97/49825

-29• · φ *

ΦΦ Φ* ·· ♦ <·Φ* • Φ ΦΦΦ Φ « ΦΦΦΦ Φ

Φ φ · «

ΦΦΦΦ · · *·

PCT/FR97/01115

Místo násobného, klonování

EcoRI-Styl

EcoRV

BstXI

pSP73

HindlII

WO 97/49825

-30Vyobr .5 pGEM4Z • · * * • ftft · • · • · · • e ·· ♦· « * · ♦ · !í ♦ ft*· « ft ftftftft · ft ftftft

PCTŽFR97/01115

t

PCR

Spal-Nrul

Místo násobného klonování

Mfel-Sspl

Smal-Xbal

Mfel-Sspl

Hindlll

EcoRI ^BstX* EcoRV

Apal

WO 97/49825 • 4 ·· 4 ·· ·· ·· ·· 4. 4 4 4 4 · ·♦ * • 4 4 44»·· • 4 4 · · · ··· « · • 4 4 4 4 4 4

- «4444444 4444444 44 ·4

PCT/FR97/01115

Vyobr.6

Eco Rl-Notl

BamHI Xhol BamHI

Poiy A 244 pb

BamHI ^{BamHI Notl}

« · · · · * * * · · · 9 9 9 9 • · · · · · • · « 999 · ·

9 · · · ··»«··· « 9 99

PCT/FR97Z0H15

WO 97/49825

-32Vyobr.7 pCMVB

lllllllllllllll

0 «

WO 97/49825

-33Vyobr.8

EcoRI ♦ 0 0

PCT/FR97/01115

EcoRI

Pstl

Notl

Apal-Clal

Spěl

WO 97/49825

-34-	• · « · • · • · · • ·	«· ♦· ·· • · 9 » · • · 4 9 · · 9 9 9 4 9
	PCT/FR97/01115

Vyobr₀9

	Místo násobného klonování
pPB154	/

pGEM4Z

Apal

EcoRI

Apal-Clal

EcoRI

Apal

Pstl »· 9 9 • · * • · φ 9 9

WO 97Ζ49825

-35Vyobr„10 .9· 99 99 • · · 0 9 · • · 9 « 0 • 9 «99 9 9

9 9 ·

9999 ·* 99

PCT/FR97/01H5

EcoRl

Hindlll

WO 97/49825

-36Vyobr₀ll • 0 «0 00 • 0 0 9 ·

0 0 00 • « 000 0 0

0 0 0

0 0 · « ··

PCT/FR97/01115

gene RAGE |

pSP73

pCMVB

Kpnl

WO 97/49825

37« φφ φφ · φ φφ · φ φ · * · • · φφφφ φ · φ φφφφ φ * · * * φ φ *

PCT/FR97/01115

EcoRV-Sall

EcoRI

4 4

4 4 4

4 4 4 4

4> 4

WO 97/49825

-38PCT/FR97/01115

Vyobr .13

Smal-Apal

Apal

WO 97/49825 • fc ·♦ fc · · fc • · • fcfc • · • fc fcfc fcfc ► · · fcfcfc • · fcfcfc • · fcfcfcfc · fc fcfcfc »fcfcfc fcfc fcfc

-39Vyobr₀14

PCT/FR97/01115

EcoRI

Apal

EcoRV

HindlII EcoRV / ' \ BamHl _MClal Kpnl \ Notl

BamHl

JUDr. Γ

WO 97/49825

-40Vyobr „15 • · · ·

I · · · • · • · • · ·· ·· ·· »9 9 9·· * · · · 9

1 9999 9 · · 9

1*99 99 99

PCT/FR97/01115

EcoRI _M4el ^B?^tXI EooAV

EcoRI

Clal

Notl !|in. pní_t. sz«! ·-VW vU/h i '-jU » ·, ......., •41-

Claims

PATENTOVÍ N / R O K Y

1. Rekombinantní živá vakcina, vyznačující se tím, že obsahuje jako vektor psí herpes-virus, obsahující a exprimující nejméně jednu nukleotidovou sekvenci kódující polypeptid s tím, že tato sekvence je vložena do místa, jež není podstatné pro replikaci.
2o Rekombinantní živá vakcina podle nároku 1, vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence nebo nukleotidové sekvence jest či jsou vložená či vloženy nejméně do jednoho místa, zvoleného ze skupin C0L3, C0L5, génová thymidinová kinasa, sekvence situovaná mezi COL CHV orfl9 a COLCHV orf22, a to jednoduchým vsunutím nebo po vynechání totálním či parciálním.
3. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že pro exprimování vložené sekvence obsahuje vektor silný eukaryotický promotor.
4. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 3, vyznačující se tím, silným promotorem je bezprostředně prvotní promotor CMV, s výhodou bezprostředně prvotní promotor myší nebo lidský.
5. Rekombinantní živá vakcina podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně dvě nukleotidové sekvence vložené v nejméně jednom místě pod kontrolou různých eukarptických promotorů.
6. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 5, vyznačující se tím, že eukaryotickými promotory jsou bezprostředně prvotní promotory CMV původem z různých živočichů.
7. Rekombinantní živá vakcina podle nároků 5 nebo 6, vyznačující se tím, že obsahuje prvou nukleotidovou sekvenci spojenou s bezprostředně prvotním promotorem CMV _adruhou nukleotidovou sekvenci spojenou s jiným promotorem, přičemž ob_a promotory mají v tomto případě sousedící koncovky 5'·
8. Rekombinantní živá vakcina podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že obsahuje jednu nukieotidovou sekvenci > kódující antígenový polypeptid pathogenního psího činidla s tím, že tato sekvence je vsunuta na jednu z jeho stran.
9. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje sekvenci kódující antigen, zvolenou ze skupiny antigenů viru nemoci Carré-ho, viru vztekliny, psího parvoviru, viru psí para-chřipky, viru Rubarth-ovy hepatitidy, Bordetella bromchiseptica, Borrelia burgdorferi, Leptospira spp., Leishmania infantům s tím, že tyto sekvence jsou vsunuty na jednu ze stran.
10. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze sekvencí kódujících polypeptidy HA a P viru nemoci Carré-ho.
11. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 9, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu nukleotidovou sekvenci, zvolenou ze skupiny sekvencí, odpovídajících génu G viru vztekliny, génu VP2 viru psí parvovirosy, genům HA a P viru para-chřipky typu 2, génům OspA a OspB Borrelia burgdorferi.
12. Rekombinantní živá vakcina podle kteréhokoli u nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že obsahuje nukleotidovou sekvenci, kódující polypeptidový imunomodulátor s tím, že tato sekvence je vsunuta na jednu z jeho stran.
13. Rekombinantní živá vakcina podle nároku 12, vyznačující se tím, že tato nukleotidová sekvence je zvolena ze skupiny sekvencí kódujících cytokiny.

• · · ·
14. Rekombinantní živá vakcinapodle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje vsunutou do místa vsunutí expresní kazetku, obsahující postupně promotor, dva nebo více genů, oddělených po dvojicích pomocí IRBS a polyadenylační signál.
15. Forma multivalentní vakciny, obsahující směs nebo k smíchání nejméně dvě živé rekombinantní vakciny, jak jsou definovány v kterémkoli z nároků 1 až 14 s tím, že tyto vakciny obsahují vsunuté různé sekvence,
16 .Fragment ADR, obsahující celkovou sekvenci nebo část sekvence jbeTinované polohami 583 až 4173 na sekvenci SBQ ID č.l.

JUSr. Petr KALENSKÝ