PL189459B1 - Sposób wytwarzania delta-4,5-steroidu podstawionego 3-keto-7 alfa-alkoksykarbonylem oraz związki pośrednie i sposoby ich wytwarzania - Google Patents

Sposób wytwarzania delta-4,5-steroidu podstawionego 3-keto-7 alfa-alkoksykarbonylem oraz związki pośrednie i sposoby ich wytwarzania

Info

Publication number
PL189459B1
PL189459B1 PL97334084A PL33408497A PL189459B1 PL 189459 B1 PL189459 B1 PL 189459B1 PL 97334084 A PL97334084 A PL 97334084A PL 33408497 A PL33408497 A PL 33408497A PL 189459 B1 PL189459 B1 PL 189459B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
group
hydrogen
formula
alkyl
cyano
Prior art date
Application number
PL97334084A
Other languages
English (en)
Other versions
PL334084A1 (en
Inventor
John S. Ng
Chin Liu
Dennis K. Anderson
Jon P. Lawson
Joseph Wieczorek
Sastry A. Kunda
Leo J. Letendre
Mark J. Pozzo
Yuen-Lung L. Sing
Ping Wang
Edward E. Yonan
Richard M. Weier
Thomas R. Kowar
Julio A. Baez
Bernhard Erb
Original Assignee
Searle & Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26709541&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL189459(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Searle & Co filed Critical Searle & Co
Publication of PL334084A1 publication Critical patent/PL334084A1/xx
Publication of PL189459B1 publication Critical patent/PL189459B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J75/00—Processes for the preparation of steroids in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/06—Hydroxylating
    • C12P33/08—Hydroxylating at 11 position
    • C12P33/10—Hydroxylating at 11 position at 11 alpha-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D301/00—Preparation of oxiranes
    • C07D301/02—Synthesis of the oxirane ring
    • C07D301/03—Synthesis of the oxirane ring by oxidation of unsaturated compounds, or of mixtures of unsaturated and saturated compounds
    • C07D301/12—Synthesis of the oxirane ring by oxidation of unsaturated compounds, or of mixtures of unsaturated and saturated compounds with hydrogen peroxide or inorganic peroxides or peracids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J1/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen, not substituted in position 17 beta by a carbon atom, e.g. estrane, androstane
    • C07J1/0051—Estrane derivatives
    • C07J1/0059—Estrane derivatives substituted in position 17 by a keto group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J21/001—Lactones
    • C07J21/003—Lactones at position 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J31/00—Normal steroids containing one or more sulfur atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J31/006—Normal steroids containing one or more sulfur atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J31/003
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0094—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 containing nitrile radicals, including thiocyanide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J53/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton has been modified by condensation with a carbocyclic rings or by formation of an additional ring by means of a direct link between two ring carbon atoms, including carboxyclic rings fused to the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton are included in this class
    • C07J53/002—Carbocyclic rings fused
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C07J71/001—Oxiranes
    • C07J71/0015—Oxiranes at position 9(11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/005—Degradation of the lateral chains at position 17

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Epoxy Compounds (AREA)
  • Catalysts (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania ? -4 ,5 -steroidu podstawionego 3-keto-7a-alkoksykarbonylem, znamienny tym, ze obejmuje reakcje odczynnika alkilujacego z substratem 4,5-dihydro-5,7- -laktonosteroidu, w obecnosci zasady, przy czym wymieniony substrat laktonowy podstawio- ny jest grupa keto lub dialkoksy przy atomie wegla 3 i dodatkowo obejmuje ugrupowanie: gdzie C(5) reprezentuje atom wegla 5 i C(7) reprezentuje atom wegla 7 struktury steroido- wej substratu. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania A-4,5-steroidu podstawionego 3-keto-7α-alkoksykarbpnylem oraz związki pośrednie i sposoby ich wytwarzania. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy nowych i korzystnych sposobów wytwarzania woóorometylo-9,11α-epoksy-17α-hydroksy-3-oksouregn-4-en-7α,21 -dikarboksylanu, γ-laktonu (przytaczanego także jako eplerenon lub euoksymeksrenon)'
Sposoby wytwarzania związków z szeregu 20-spiroksanu ujawniono w opisie patentowym U.S. nr 4 559 332. Związki wytwarzane zgodnie z procesem z tego opisu, mają otwarty pierścień E, zawierający atom tlenu, o ogólnym wzorze
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2 lub -CH=CH-; r1 reprezentuje nizszą grupę alkoksykarbonylową o orientacji α albo grupę hydroksykarbonylową, -B-B- reprezentuje grupę lCH2lCH2- lub α- albo βlzorientowaną grupę
—ch-ch2-ch—
III przy czym r6 i r7 oznaczają atom wodoru; X reprezentuje dwa atomy wodoru lub grupę okso; γ1 i Y2 jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- albo γ1 reprezentuje grupę hydroksy i Y2 reprezentuje grupę hydroksy, nizszą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje H2, także nizszą alkanoiloksy; oraz sole takich związków, w których X reprezentuje grupę okso i Y reprezentuje grupę hydroksy, czyli odpowiadających kwasom 17β-hyóroksy-21-karboksylowym.
Opis patentowy U.S. nr 4 559 332 opisuje liczne sposoby wytwarzania epoksymeksrenonu i związków pokrewnych o wzorze IA. Ukazanie się nowych i rozszerzenie klinicznych
189 459 oastosouań dla epokeymekerenonu etwarzają potrzebę ulepezenia proceeów produkcji tego i innych pokrewnych etenOidów.
Zgodnie z ujawnieniem wynalazek doetarcza ulepezone epoeoby wytwarzania epokeymekerenonu, innych 20-epiroheaaóu i innych eteroiaóu, mających wepólne cechy etrukturalne. Wśród poezczególaych przedmiotów wynalazku znajduje eię: zapewnienie ulepezonego epoeobu, który wytwarza produkty o wzorze IA i inne związki pokrewne, z wyeoką wydajnością; doetarczenie takich epoeobóu, które obejmują minimum etapów izolacji; oraz doetarczenie takich epoeobóu, z których można eię wywiązać, dyeponując rozeądnym kapitałem i przeprowadzić przy rozeąaaych koeztach przemian.
W związku z tym, niniejezy wynalazek odnoei eię do eoeregóu echematów eyntez epokeymekerenonu; związków pośrednich uzytecznych w wytwarzaniu epokeymekerenonu; oraz eyntezy takich nowych związków pośrednich.
Przedmiotem wynalazku jeet epoeób wytwarzania A-4,5-eteroidu podetawionego C-keto-7α-tlkokeykarbonylem, polegający na tym, ze obejmuje reakcję odczynnika alkilującego z eubetratem 4,5-aihyaro-5,7-laktonoeteroiau, w obecności oaeaay, przy czym wymieniony eubetrat laktonowy podetawiony jeet grupą keto lub dialkokey przy atomie węgla C i dodatkowo obejmuje ugrupowanie:
\i 1/ ę(5V?(7) ó—Λ o
gdzie C(5) reprezentuje atom węgla 5 i C(7) reprezentuje atom węgla 7 etruktury eteroidowej eubetratu.
Korzyetnie wymieniony eubetrat eteroidowy obejmuje aaeyooną lub nieaaeycoaą etrukturę jądrową, zawierającą: ugrupowanie 9,11-epokeydoud lub jego prekureor oraz podetawnik przy atomie węgla 17 wybrany z grupy ekładającej eię ze epirolaktonu, grupy ketonowej lub innego prekureora wobec epirolaktonu.
Korzyetniej wymieniony eubetrat eteroidowy i wymieniony produkt eteroidowy eą podeta^one w pozycji 17 podetaunikiem epirolaktonowym, odpowiadającym wzorowi XXXIII
XXXIII
Korzyetnie eubetrat eteroidowy i produkt eteroidowy eą podetawione w pozycji 17 podetaunikiem keto.
Korzyetnie wymieniony eubetrat laktonowy obejmuje podetawniki C-dialkokey. Korzyetnie wymieniony 5,7-lakton reaguje z halogenkiem alkilu w obecności zaetdy. Przedmiot wynalazku etanowi również epoeób wytwarzania związku 4,5-dihydro-5,7-laktonoeteroiaouego, w którym wymieniony laktonoeteroid poaetauioay jeet grupą keto lub dialkokey przy atomie węgla C i obejmuje ugrupowanie \l 1/
C(5)^ę(7) ó— o
189 459 gdzie C(5) reprezentuje atom węgla 5 i C(7) reprezentuje atom węgla 7 struktury steroidu substratu, polegający na tym, że obejmuje przekształcenie steroidu podstawionego grupą cyjano w pozycji 7 w odpowiedni kwas 7-karboksylowy i potem przekształcenie kwasu 7-karboksylowego w odpowiedni 5,7-lakton.
Korzystnie steroid podstawiony w pozycji 7 kwasem karboksylowym obejmuje steroid 3-keto-A-4,5-7-karboksylowy i tworzy się pośredni ketal, obejmujący 3-dialkoksy-5,7-laktoa, przy czym wymieniony 3-dialkoksy-5,7-lakton ulega hydrolizie w warunkach kwasowych, tworząc 3-keto-5,7-lakton.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi II:
II w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R1 reprezentuje alfa-zorientowaną niższą grupę alkoksykarbonylową lub grupę hydroksykarbonylową, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowzj, alkoksyalkilowej, hya-oksyka-bonylowei, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β-zonentowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III w której R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hyd-oksyka-bonyloalkilowej, alkoksykt-bonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z r6 i Ri obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, polegający na tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wzorze El przez hydrolizę po czym reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze El ma strukturę:
EI
189 459 w której -A-A-, r3, R™, r9 i -B-B- są takie jak określono powyżej i Rn oznacza grupę C1 do Ce alkilową.
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę sCHR4sCHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6sCHR0-.
Korzystniej każdy z R4, R5, r6 i R0 oznacza atom wodoru.
Wynalazek dotyczy również sposobu wytwa-o7aia owląoku, odpowiadającego wzorowi IIC:
IIC w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHRe-CHR5- lub -CR4=CR5s, r1 reprezentuje alfa-zo-ieato\gana niższą grupę alkoksykarbonylową lub grupę hydroksykarbonylową, R3 r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowo7, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hyaroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę sCHR6-CHR0 lub k- albo P-zorientowaną grupę:
R6>
R7 —ch-ch2-ch—
III
6*7· · w której R i R wybi era się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokys7lkilowzj, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksy7lkilowzj, cyjano i aryloksy, polegającego na tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wooroe E przez hydrolizę po czym reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze E ma strukturę:
-1 «17 w której -A-A-, R jest taki jak określono powyżej i R oznacza grupę C1 do C4 alkilową.
189 459
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi E:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, κ oznacza grupę C1 do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-ChR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
Rc —ch-ch2-chIII r τ w której R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, polegający na tym, że obejmuje termiczny rozkład związku, odpowiadającego wzorowi DE2 w obecności halogenku metalu alkalicznego, przy czym wymieniony związek DE2 ma strukturę:
CO2R12
DE2 w której Ru oznacza grupę C1 do C4 alkilową i -A-A-, -B-B-, R3 i Rn są takie jak określono poniżej.
189 459
Korzystnie Rc oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z r4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Przedmiot wynalazku stanowi także sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi DE2:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksy4lkilowej, αlkokey4lkilowej, hyarokeyk4rbonylowej, cyjano i aryloksy R12 i R17 wybiera się spośród grupy C1 do C4 alkilowej, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7lub α- albo β-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III
A 7 ♦ w której R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, 4lkokeyalkilowej, hyarokeykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, 4cylokeyalkilowej, cyjano i aryloksy, polegający na tym, ze obejmuje kondensację związku o wzorze DE1 z malonianem dialkilu w obecności zasady, przy czym związek o wzorze DE1 ma strukturę:
DE1 w której -A-A-, -B-B-, R3 i Rn są takie jak określono powyżej.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, R5, r6 i R7 oznacza atom wodoru.
189 459
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania związku o wzorze, odpowiadającym wzorowi DE1:
DEl w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i R5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hyaroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, R17 oznacza grupę C1 do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-z.onentowaną grupę:
—CH-CH2CH—
III w której R6 i r7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hyd2okysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, aoyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, polegający na tym, ze obejmuje reakcję związku o wzorze D z ylidem sulfoniowym w obecności zasady, przy czym wymieniony związek D ma strukturę:
17 w której -A-A-, -B-B-, R i R są takie jak określono powyżej.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, r5, r6 i R7 oznacza atom wodoru.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi D:
189 459 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluo-owca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, 7lkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy,
R17 oznacza grupę C1 do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-Chr7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:
R° —ch-ch2-chIII w której r6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluz-owca, nizszej alkoksy, acylowej, hyarokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, 7cyloksyalkilowzj, cyjano i aryloksy, polegającego na tym, że obejmuje hydrolizę związku o woo-ze C w kwas 7α-k7rboksylowy i reakcję w warunkach kwasowych z ortom-owcoanem trialkilu, przy czym związek C ma strukturę:
w której -A-A-, -B-B-, r3 są takie jak określono powyżej.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wo-oru.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi I:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksyka-bonylowej, cyjano i aryloksy, R26 oznacza grupę C1 -o C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-Chr7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III w której R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej,
189 459 »90 alkoksykarbonyloalkiloweje acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz r8° i R9° wybiera się niezaleznie spośród R8 i r9 odpowiednio; lub r8° i r9° tworzą razem grupę keto; oraz R8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej. acylokswalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z R6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, polegający na tym, że obejmuje alkilowanie związku o wzorze A211 przez reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze A211 ma strukturę:
[A211] i Rn on w której -A-A-, -3-3-, R , R, R i są takie jak określono powyżej.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHRZCI IRn- i -B-Breprezentuje grupę lCHR6-CHR7l.
Korzystniej każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Przedmiot wynalazku stanowi także sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi IE:
IE w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5l, R3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hyóroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hyóroksykarbonylowej. cyjano i aryloksy,
189 459
R26 oznacza grupę C1 do C4 alkilową, i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III gdzie r6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, polegający na tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wzorze 211 przez reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze 211 ma strukturę:
[ 211] w której -A-A-, -B-B- i R są takie jak określono powyżej.
Korzystnie R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-,
Korzystniej każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi A211:
[A211] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i R5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hya-oksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub a- albo β-zorientowaną grupę:
ch-ch2-ch—
III
189 459
7 gdzie R i R wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu uoaoru, fluorouca, niżezej alkokey, acylowej, hyarokyealkilouej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylouej], alkilowej, alkokeykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey, oraz r8° i R9° wybiera eię niezaleznie epośród R8 i R9 odpowiednio, lub r8° i R9° tworzą razem grupę keto, oraz R8 i r9 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, grupy hydrokey, fluorouoa, niżezej grupy alkokey, acylowej, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonyloalkilowej, alkokeykarbonyloalkilouej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową, albo R8 i R9 razem z R6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, polegający na tym, że obejmuje utlenianie związku o wzorze A210, przy czym związek o wzorze A210 ma etrukturę:
[A210] w której -A-A-, -B-B-, RC, r8° i r9° eą takie jak określono powyżej.
Korzyetnie R oznacza atom uoaoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzyetniej każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Korzyetnie r8° i r9° łącznie z C (17) obejmują
Y\ V2 /^17).....(CH2)2-C=X gdzie X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okeo lub =b, Y - i Y- jednocześnie reprezentują moetek tlenowy -O- lub =b albo Y* reprezentuje grupę hydrokey i γ2 reprezentuje grupę hydrokey, nizezą alkokey lub, jeśli X reprezentuje H2, także nizezą alkanoiloksy.
Korzyetniej r8° i R9° łącznie z C(17) obejmują
O
Przedmiotem wynalazku jeet również epoeób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi [A211]:
[A211] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, rC, r4 i r5 wybiera eię z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorowot, grupy hydrokey, nizezej alkilowej, niżezej
189 459 alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub a- albo β-zorientowaną grupę:
-CH-CH2-CH—
III * 6 7 gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz R80 i r90 wybiera się niezaleznie spośród R8 i R9 odpowiednio, lub r8® i r90 tworzą razem grupę keto, oraz r8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo r8 i r9 razem z r6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, polegający na tym, że obejmuje reakcję 3-keto-5,7-hemiacetalowego związku pośredniego o wzorze A209C z nadtlenkowym odczynnikiem utleniającym, przy czym wymieniony związek o wzorze A209C odpowiada wzorowi:
[A209C]
T Q Q w którym -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono powyżej.
Korzystnie r8 i r9 łącznie z C(17) obejmują Y1 Y2 /C(17).....(CH2)2-C=X gdzie X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S, Y i Y jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- lub =S albo Y1 reprezentuje grupę hydroksy i Y2 reprezentuje grupę hydroksy, nizszą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje Ib, także niższą alkanoiloksy.
Korzystniej r80 i R90 łącznie z C(17) obejmują
O
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
189 459
Przedmiot wynalazku stanowi także sposób wyt\r7-oaai7 związku, odpowiadającego wzorowi:
[A210] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CRe^R5-, r3 r4 i r5 wybiera się z grupy obejmującej atom wodoru, fluorowca, grupę hydroksy, niższą alkilową, niższą alkoksy, hydroksyalkilową, alkoksyalkilową, hydroksykarbonylową, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6ScHR0 lub k- albo β-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III
7 gdzie R i R wybiera się aizz7lzznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkeksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilo>90 wej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz R™0 i R90 wybiera się alezaleeale spośród R™ i R9 odpowiednio, lub R™0 i r90 tworzą razem grupę keto, oraz R™ i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksyka-bonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, 7oyloksyalkllowej, cyjano i aryloksy, albo R™ i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R™ i r9 razem z R6 i R0 obejmują ka-bocykliczaą lub heterocykliczną strukturę pizrścizaiową połączoną z pentacyklicznym pie-ścieniem D, polegający na tym, ze obejmuje reakcję pośredniego 3-ketOs5,0shzmi7ceaalu o wzorze A209 z nadtlenkowym odczynnikiem utleniającym, przy czym wymieniony związek o wzorze A209C odpowiada wzorowi:
[A209C] w którym -A-A-, -B-B-, r3 R™ i r9 są takie jak określono powyżej.
189 459
9
Korzystnie R iR łącznie z C(17) obejmują ^C(17).....(CH2)2-C=X gdzie X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S, Y*i γ2 jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- lub =S albo Y1 reprezentuje grupę hydroksy i γ2 reprezentuje grupę hydroksy, nizszą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje H2, także nizszą alkanoiloksy.
Korzystniej R8° i R9° łącznie z C(17) obejmują
O
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z r4, R5, R6 i r7 oznacza atom wodoru.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania związku odpowiadającego wzorowi [A209]:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i R5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, 4lkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III
6*7 · gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyarokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyłoksy4lkilowej, cyjano i aryloksy, oraz R8° i R9° wybiera się niezaleznie spośród R8 i R9 odpowiednio, lub κ'·’ i r9° tworzą razem grupę keto oraz r8 i R9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hyaroksyalkilowej, alkokeyalkilowej, hyaroksyka-bonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksy4lkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i R9 razem z R6
189 459 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
\l I
c— c—
z r23 Γ< XLIII
R21
\ _ _ I
c— -c—
/ XLIV
R21 OR24
\i I
c— -c—
XLV
OR24 R21
XLVI
V—CR21/ XLVII
77 71 gdzie R, R i R wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R*4 wybiera sśę spośród atomu wodom i nizsejj grupy alklknYej ; polegający na tym, ze obejmuje hydrolizę związku, odpowiadającego wzorowi A208
w którym -A-A-, -B-B-, -E-E-, R3 . R8° i r9° są takie jak określono powyżej, r1? oznacza grupę C do C4 alkilową lub grupy r9°O - wwozzą razem mottek O,O-oksyalklinnowy ; i iZ0 oznacza grupę C;-C4 alkilową.
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę lCHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7Korzystniej każdy z r4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
189 459
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, r5, R- i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
XLIII
V—CR21' XLVII
P-oedmiot wynalazku stanowi również sposób wytwarzania związku o woo-ze [A205]:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowzj, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Brep-eeentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III
7 gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyarokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, R*9 oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O^-oksyalkilznowy i RM oznacza grupę C1-C4 alkilową oraz przy czym -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
R'
XLIII
189 459
R21 . I
-C—
XLIV
OR i
-C
XLV
OR24 R21
I
-C— r22 * XLVI
-ĆR21XLVII
22 23 gdzie R, R i R wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i r24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej, polegający na tym, ze obejmuje reakcję związku, odpowiadającego wzorowi A204 z niższym alkoholem i kwasem, przy czym wymieniony związek o wzorze A204 ma strukturę:
[A204] w której -A-A-, -B-B-, -E-E-, R3 i Rw są takie jak określono powyżej.
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, r5, R® i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21
R22 i
C—
R23
XLIII
CR21XLVII
189 459
Przedmiotem wynalazku jeet również epoeób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi [A204]:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, RC, r4 i r5 wybiera eię odpowiednio z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorouca, grupy hydrokey, nizezej alkilowej, niżezej alkokey, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, cyjano i arylokey, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo e-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III gdzie r6 i r7 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu uodo-u. fluorouca, nizezej alkokey, acylowej, hydrokyealkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, alkilowej, alkokeykarboayloudj, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey, R^ oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy r19O- tworzą razem moetek O,O-okeyalkilenowy, przy czym -E-E- wybiera eię epośród:
R‘ >
R22 □23
K XLIII
XLIV
R‘ >
OR'
I
-C
R'
XLV
OR24 R21 \i I ;c—c— / ό>22
XLVI
-CR21i
XLVII
189 459
22 23 gdzie R,R - R wybiefa sie spośród atomu , grnpy akrowej , fluorowca, grupy alarowej i cyjano i r24 wybiera się spośród atomu wodoru i niższej grupy alkilowej, polegający na tym, że obejmuje hydrolizę związku, odpowiadającego woorowi A203, przy czym wymieniony związek o wzorze A203 ma strukturę:
w której -A-A-, -B-B- -E-E-, r3 są takie jak określono powyżej, Ru oznacza grupę C1 do Ce alkilową lub grupy R^O- twoką razem mostek O,Osoksyalkilenowy.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę sCHR4-CHR5- i -B-Brepreoentsje grupę sCHR6-CHR0-.
Korzystniej każdy z r4, r5, r6 i r0 oznacza atom wodoru.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- repreoentsje grupę sCHR4sCHR5- i -B-Brepreoeaaujz grupę -CHR6-CHR0s, każdy z R4, r5, R* i r0 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22 /C l
XLIII
-ĆR21' XLVII
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi o wzorze [A204]:
w którym -A-A- reprezentuje grupę sCHR4sCHR5- lub -CR4=CR5-, R3 R4 i r5 wybiera się aieealeeaie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hyUroksyalkilowei, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę sCHR-CHR0 lub k- albo β-oorieatowaaą grupę:
—CH-CH2-CH—III
189 459 • 6 · 7 · gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, R19 oznacza grupę Cdo C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, przy czym -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
XLIII
R21
XLIV
R'
OR'
I
-C
R‘
XLV
OR24 R21
XLVI
CR'
XLVII
99 99
R, R i R wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i niższej grupy alkilowej, polegającego na tym, ze obejmuje zabezpieczenie podstawników keto związku, odpowiadającego wzorowi A201 przez reakcje alkanolu w warunkach kwasowych w obecności ortomrówczanu, przy czym wymieniony związek o wzorze A201 ma strukturę:
[A201]
189 459 w której -A-A-, -B-B-, -E-E- i R3 są takie jak określono powyżej, wytwarzając przez pośredni 3-znoloztzr, odpowiadający wzorowi A202:
w którym -A-A-, -B-B-, -E-E- i r3 są takie jak określono powyżej i oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilznowy oraz redukcję związku o wzorze A202, z utworzeniem związku odpowiadającego wzorowi A203:
· 18 w którym -A-A-, -B-B-, -E-E-, R i R są takie jak określono powyżej i hydrolizę wymienionego związku, o-powia-ającego wzorowi A203 wytwarzając wymieniony związek o wzorze A204.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każ-y z R, R, R i R oznacza atom wodoru.
Korzystnie r3 oznacza atom wo-oru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22 i
-CR'
XLIII —<3R21' XLVII
P-ezdmiot wynalazku stanowi również sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi [A203]
R18O
R3 OR18
Ję-OR-ia
B /
B
CHO [A203]
189 459 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyαlkilowejjj 4lkokeyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo e-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-chiii •6*7 · · · · gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokys4lkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksy4lkilowej, cyjano i aryloksy, przy czym -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
C /C I R
XLIII ,23
R21
XLIV
OR i
-C
XLV
OR >
d21
R i
-c»22
XLVI
-'CR'
XLVII gdzie r!8 oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R^O- w pozycji C-17 tworzą razem mostek O,O-oksyalkilrnowy, R21, r22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej, polegający na tym, że obejmuje redukcję związku o wzorze A202:
1 s w którym -A-A-, -B-B-, -E-E-, R i R są takie jak określono powyżej.
189 459
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR.4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
Korzystniej każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
I
-C->23
XLIII
-Cr21XLVII
Przedmiotem wynalazku jest również związek odpowiadający wzorowi D:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i R5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, Rn oznacza nizszą grupę C1 do C4 alkilową i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHr7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III • 6 7 gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hyaroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy.
Przedmiot wynalazku stanowi także związek odpowiadający wzorowi E:
189 459 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, rC, r4 i R5 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorouoa, grupy hydrokey, niżezej alkilowej, nizezej alkokey, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, cyjano i arylokey, Rr7 oznacza nizezą grupę C1 do C4 alkilową i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHr7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III gdzie R6 i R7 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorowca, nizezej alkokey^, acylowej, hydrokyealkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, alkilowej, alkokeykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey.
Przedmiotem wynalazku jeet także związek odpowiadający uooroui F:
niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fltorouca, grupy hydrokey, nizezej alkilowej, nizezej alkokey, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkiloudj, hyarokeykarboaylowdj, cyjano i arylokey, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo fl-zorientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III
6*7 · . , gdzie R i R wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu uoaoru, fluorouca, nizezej alkokey, acylowej, hydrokyealkiloudj, tlkokeytlkilouej, hydrokeykarbonylowej, alkilowej, alkokeykarbonylowej, acylokeyalkiloudj. cyjano i ar^-lokey.
Wynalazek dotyczy również związku odpowiadającego wzorowi A211:
[A211]
189 459 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub lCR4=CR5l, R3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hyóroksyalkilpwej, alkokswalkilowee, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β-zorientpwaną grupę:
R' —CH-CH2CH—
III gdzie r6 i r7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyórokysalkilowee, alkoksyalkilowej, hyóroksykaśbonyloo’ej. alkilowej, alkoksykarbonylowej. acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz r8° i r9° wybiera się niezaleznie spośród r8 i R9 odpowiednio; lub R° i r9° tworzą razem grupę keto; oraz r8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hwdroksyαlkilowej, alkokswalkilowee, hwdrokswkarbonwloalkilowee. rlkoksykarbonwloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z R6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.
Przedmiotem wynalazku jest także związek odpowiadający wzorowi A210:
[A210] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4lCHR5l lub lCR4=:CR5l, r3, r4 i R5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy·', niższej alkilowej, niższej alkoksy, hyóroksyalkiloweee alkoksyalkilpwee, hyóśoksykarbonyloo’ee, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR-CHR7 lub α- albo βlzprientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III gdzie r6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wpdośu. fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hyórokysalkilpwej, alkoksyalkilowee. hwdśoksykarbdnylowej. alkilowej, alkoksykarbonylowej, acwloksyalkilowee, cyjano i aśwloksw, oraz r8° i r9° wybiera się niezaleznie spośród R8 i r9 odpowiednio; lub R° i r9° tworzą razem grupę keto oraz R8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hyóroksyalkilowej, alkoksyalkilowee, hyórdksykαśbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acwloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; albo R8 i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z R6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.
189 459
Przedmiot wynalazku stanowi także związek odpowiadający wzorowi A209:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hya-oksyalkilowej, tlkoksytlkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:
Rh—rR' —ch-ch2-ch— iii gdzie R6 i R7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz r8° i r9° wybiera się niezaleznie spośród R8 i r9 odpowiednio, lub r8° i r9° tworzą razem grupę keto; oraz r8 i R9® wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hya-oksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; albo R8 i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową; albo r8 i r9 razem z r6 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22 \i 1 >—c— / r23
H XLIII R21 \=C' XLIV d24
R21 OR 1 zC—c— / R22 κ XLV
OR24 R21 \i i ;c—c— / I 99
R22
XLVI \-CR21' XLVII
77 77 gdzie R ,R iR wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano, i R2'4 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
189 459
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
Ω
-CR21XLVII
R21 . i
-C—
XLIV gdzie R21 oznacza atom wodoru.
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR.7-, każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R>
21 R22 i
C—
XLIII ;CR21XLVII
Przedmiotem wynalazku jest także związek odpowiadający wzorowi A208:
A208 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i R5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR-CHR7 lub a- albo β-zorientowaną grupę:
-ch-ch2-ch— iii gdzie R6 i r7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilo189 459 wej, alkokeykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey oraz r2° oznacza grupę C1-C4 alkilową i -E-E- wybiera eię epośród:
,21
R22 i
•c— r23
K XLIII
XLIV
R21 OR24 \i I /-?
XLV
OR24 R21
I
-C—
R22
XLVI
O
V—bR21Z XLVII gdzie R19 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem moetek O,O-okeyalkildaowy. r21, κ ί R2c wybiera eię niezależnie epośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorouca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera eię epośród atomu wodoru i niżezej grupy alkilowej.
Korzyetnie RC oznacza atom woaoru. -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E-B wybiera eię epośród
O
CR' ,21_
XLVII
R21 . I
-C—
XLIV gdzie R oznacza atom wodoru.
Korzyetaid RC oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera eię epośród:
R' >
k23
XLIII /ć—Cr21XLVII
189 459
P-zzdmiotzm wynalazku jest także związek odpowia-ający wzorowi A207:
CO2R25 [A207] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hy-roksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hy-roksyalkilowzj, alkoksyalkilowej, hy-roksykarbonylowzj, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-ozrizntow7ną grupę:
R° —ch-ch2-chiii g-ziz R6 i r7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hya-okysałkilowzj, alkoksyalkilowej, hy--oksyka-bonylowzj, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz R20 oznacza grupę C1-C4 alkilową i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22 \l I r23
K XLIII
R21 . i
-C—
XLIV >21
OR' i ;c—c/ i >9 R22
XLV
OR24 R21 c— r22 K XLVI
V—ĆR21' XLVII g-ziz R’9 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R19O- tworzą razem mostzk O,O-oksyalkilznowy, R2’, r2 wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, alkilowej, fluo-owcα, grupy nitrowej i cyjano i R71 wybiera się spośród atomu wo-oru i nizszej grupy alkilowej.
189 459
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- -epreeenauje grupę sCH2-CH2s, -B-B- repreeeatsje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
O
ĆR21XLVII
XLIV • 21 gdzie R oznacza atom wodoru.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHRe-CHR5-, -B-B-ep-eeenauje grupę -CHR6-CHR0-, każdy z r4, r5, r6 i r0 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21
XLIII
-ĆR21XLVII
Prozdmioa wynalazku stanowi także związek odpowiadający woorowi A206:
[A206] w którym -A-A- -ep-ezzaauje grupę -CHR-CHR - lub -CR=CR -, r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hyd-oksy7lkllowej, alkoksy-alkilowej· hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR0 lub k- albo P-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III gdzie R6 i R0 wybiera się alez7leonle z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyarokys7lkllowej, 7lkoksyalkllowej· hydroksykarbonylowej, alkilo68
189 459
9Π wej, alkoksykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz R oznacza grupę C1-C4 alkilową i -E-E- wybiera się spośród:
R· >
,21 ,22
XLIII ,21
XLIV
R21 OR' \l I
XLV
OR24 R21
I
-CR'
XLVI )ć— CR21XLVII gdzie r1 oznacza ^rupe C1-C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, R21, R22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród ?CR21XLVII
R' ,21 )c—CXLIV gdzie R oznacza atom wodoru
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
V—C/ ^3
XLIII /Ć—CR21XLVII
189 459
Przedmiotem wynalazku jest także związek odpowiadający wzorowi A205:
[A205J w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy bydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR.6-CHR7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hya-okysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz r2° wybiera się spośród grupy C1-C4 alkilowej i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22 \i 1 ;c—c— / R23 κ XLIII ,21
XLIV
R' >
OR' i
-C— d22
XLV
OR24 R21 xc—c/ ^22
XLVI
V—ĆR21Z XLVII gdzie R19 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, R21, r2 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej,
189 459 fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
O
XLVII
-CR'
R21
XLIV • 91 gdzie R oznacza atom wodoru.
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, R5, R6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22 XC—C7 R23
XLIII
-ĆR21XLVII
Przedmiot wynalazku również stanowi związek odpowiadający wzorowi A204:
j3
[A204] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, R4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR -CHR? lub α- albo β-zorientowaną grupę:
r6 r h—r
-CH-CHj-CHIII gdzie R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, B hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy i -E-E- wybiera się spośród:
189 459
R‘ >
,21
R22 i
-C— □23 fi XLIII ,21
XLIV
R' \i
OR' i ;c—c— / R22
H XLV
OR24 R21 \i i /C-C22
XLVI
V—CR21' XLVII gdzie r19 oznacza grupęC1-C4 alkilową lub grupy R?9O- tworzą razem moetek O,O-okeytlkileaowy, r21, R“ i R2C wybiera eię niezaleznie epośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fltorowoa. grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera eię epośród atomu wodoru i niżezej grupy alkilowej.
Korzyetnie RC oznacza atom uoaoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera eię epośród
O
-CR'
XLVII
XLIV • 21 gdzie R oznacza atom wodoru.
Korzyetnid RC oznacza atom uoaoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera eię epośród:
R' >
R22 i
-C—
R2^
XLIII
-CR'
XLVII
189 459
Wynalazek dotyczy także związku odpowiadającego wzorowi 203:
[203] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR^CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hwdrdksyalkilowejje alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo p-zorientowaną grupę:
—rR? —ch-ch2-ch— iii gdzie r6 i r7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, αcylowee. hydśokwsalkilowee, alkoksyalkilowej, hwórokswkaśbonwlowej. alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowee, cyjano i aryloksy i -E-E- wybiera się spośród:
R21 R22
\l I
0— c—
/ r23 XLIII
R21
\ _ _ I
;c— -c—
z XLIV
R21 OR24
\—C— Z R22
XLV
OR24
R21 i
C— ±22
XLVI
V—feR21Z XLVII gdzie R18 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R^O- przy C-17 tworzą razem mostek O.O-oksyalkilenowy, R, R22 i r23 wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca. grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
189 459
Korzystnie R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, i -E-E- wybiera się spośród
O
XLVII
XLIV XĆ-ĆR21
R21 >=ógdzie R21 oznacza atom wodoru.
Korzystnie r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, R6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
R22
I
-C—
R23
XLIII XĆ — CR21' XLVII
Nowe schematy syntezy opisuje się szczegółowo w opisie zalecanych postaci realizacji. Wśród nowych związków pośrednich według wynalazku znajdują się opisane bezpośrednio poniżej.
Związek o wzorze IV odpowiada strukturze:
IV gdzie: -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-; r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, byaroksytlkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy; R1 reprezentuje α-oorientowaaą grupę niższą alkoksykarbonylową lub grupę hydroksykarbonylową; R2 oznacza grupę pozostającą 11 a, której usunięcie powoduje skuteczne utworzenie podwójnego wiązania między atomami węgla w pozycji 9 i 11; -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- al5o fl-zorientowaną grupę:
R6R7 —CH—CH2-CH—
III
189 459 gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksyk7-beaylowej, 7cyloksy7lkllowej· cyjano i aryloksy; oraz R™ i r9 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, chlorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hyd-oksyalkllowej, alkoksyalkilowej· hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R™i R9 razem obejmują karbocykliczaą lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R i R razem z r6 i r0 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pent7cykllcoaym pierścieniem D.
Związek o wzorze IVA odpowiada woo-owi IV, gdzie R™ i R9 razem z atomem węgla ple-ścieai7, do którego są dołączone, tworzą strukturę:
XC(17) / \
IUIl( CH2) 2
XXXIV • 12· · · gdzie X, Y , Y i C(10) są takie jak określono powyżej.
Związek o wzorze IVB odpowiada wzorowi IV, gdzie R™ i R9 razem tworzą strukturę o wzorze XXXIII:
O
mu.
Związki o wzorach, odpowiednio IVC, IVD i IVE, odpowiadają każdemu wzorowi IV. IVA lub IVB, gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -C^-CHa-, R3 oznacza atom wodoru i R‘ oznacza grupę alkoksyk7-boaylową, korzystnie metoksykarbonylową. Związki wchodzące w zakres weors IV można wytwarzać przez reakcję nizszego odczynnika 7lkilosslfoaylującego lub acylującego albo czynnika tworzącego halogenek, z odpowiadającym związkiem wchodzącym w zakres wzoru V.
Związek o wzorze V odpowiada strukturze:
V gdzie -A-A-, -B-B-, R1, r3 R™ i R9 są takie jak określono we wzorze IV.
189 459
Związek o wzorze 104 o-powiada strukturze:
104 g-ziz -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze IV i Rn oznacza grupę Cj -o C4 alkilową.
Związek o wzorze 104A o-powia-a wzorowi 104 gdzie każ-y z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2-, R3 oznacza atom wo-oru. Związki w zakresie wzoru 104 można wytworzyć przez rozkład termiczny związku o wzorze 103.
Związek o wzorze 103 odpowia-a strukturze:
103 g-ziz -A-A-, -B-B-, R3 i R11 są takie jak określono we wzorze 104 i R12 oznacza grupę C1 -o C4 alkilową.
Związek o wzorze 103A o-powia-a wzorowi 103 g-ziz każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2-, R3 oznacza atom wo-oru. Związki w zakresie wzoru 103 można wytworzyć przez reakcję odpowia-ajączgo związku o wzorze 102 z malonianzm alkilu w obecności zasady takiej jak alkoholan metalu alkalicznego.
Związek o wzorze 102 o-powia-a strukturze:
102 gdzie -A-A-, -B-B-, r3 i R1’ są takie jak określono wz wzorze 104.
189 459
Związek o wzorze 102A odpowiada wzorowi 102, gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2-, RC oznacza atom wodoru. Związki w zakreeie wzoru 102 można wytworzyć przez reakcję odpowiadającego związku o wzorze 101 z związkiem trialkiloeulfoniouym w obecności oaeaay.
Związek o wzorze 101 odpowiada etrukturze:
101 gdzie -A-A-, -B-B-, R i R eą takie jak określono we wzorze 104.
Związek o wzorze 101A odpowiada wzorowi 101, gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza
-CH2-CH2-, RC oznacza atom wodoru. Związki w zakreeie wzoru 101 można wytworzyć przez reakcję na-hydrokeyandroeteno-C,17-dionu lub innego związku o wzorze XXXVI z ortomrówczanem trialkilu w obecności kwaeu.
Związek o wzorze XL odpowiada wzorowi:
XL gdzie -E-E- wybiera eię epośród:
R21 R22 r23
K XLIII >21
Rz \=c— / XLIV >21
OR )Ć—022
XLV
189 459
OR24 R21
I
-CR
XLVI XĆ—CR21' XLVII
22 · 23 ·
R , R i R wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, chlorowca, grupy nitrowej i cyjano; r24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej; r8 ΰ i Ri° wybiera się niezaleznie spośród grupy ketonowej i podstawników, które mogą stanowić R8 i R9 (jakie określono w mniejszym opisie powyżej w odniesieniu do wzoru IV); i -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono we wzorze IV.
u J 91 99 97
Związek o wzorze XLA odpowiada wzorowi XL gdzie R, R i R wybiera się niez^ leznie spośród atomu wodoru, chlorowca i nizszej grupy alkilowej.
Związek o wzorze XLB odpowiada wzorowi XLA gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
Związek o wzorze XLC odpowiada wzorowi XLB gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLV. Związek XLD odpowiada wzorowi XLB gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLVII. Związek o wzorze XLE odpowiada wzorowi XL gdzie R8° i R9° razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, obejmują grupę ketonową lub:
17) / \
XXXIV • 1 9 gdzie X, Y , Y i C(17) są takie jak określono powyżej lub
O
XXXIII.
Związki o wzorze XLIE odpowiadają wzorowi XL, w którym R8° i r9° tworzą razem grupę ketonową.
Związki o wzorach XLF, XLG, XLH, XLJ, XLM i XLN odpowiadają wzorowi XL, XLA, XLB, XLC, XLD i KLE odpowiednio, w których -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono powyżej.
Związek o wzorze XLI odpowiada wzorowi·.
189 459 gdzie -E-E- wybiera się spośród:
R' >
R22 i
-C— r23 rc xliii
R21 _ i ~c—
XLIV
R21 OR24 \i I ;c—οχ ‘ 99
R22
XLV
OR24 R21
XLVI /Ć—CR21XLVII i λ
R oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy; R, R22 i R23 wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, chlorowca, grupy nitrowej i cyjanowej; R24 wybiera się spośród atomu wodoru i niższej grupy alkilowej; R™ i r90 wybiera się niezaleznie spośród grupy ketonowej i podstawników, które mogą stanowić R8 i r9; oraz -A-A-, -B-B- i Rrsą takie jak określono we wzorze IV.
Związek o wzorze XLIA odpowiada wzorowi XLI gdzie R21, r22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, chlorowca i niższej grupy alkilowej.
Związek o wzorze XLIB odpowiada wzorowi XLlA gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
>90
Związek o wzorze XLIC odpowiada wzorowi XLI gdzie R80 i R90 razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, obejmują grupę ketonową lub:
C{ 17) 11111( CH-) , - C - X / \
XXXIV gdzie X, Y1 Y2 i C(17) są takie jak określono powyżej.
Związki o wzorach XLID odpowiadają wzorowi XLI, w których podstawnik XXXIV odpowiada strukturze XXXIII
XXXIII.
189 459
Związki o wzorze XLIE odpowiadają wzorowi XL, w którym R80 i r90 tworzą razem grupę ketonową.
Związki o wzorach KLIF, XLIG, XLIH, XLIJ, XLIM i XLIN odpowiadają wzorowi XLI, XLIA, XLIB, XLIC, XLID i XLIE odpowiz-nio, w których -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono powyżej. Związki w zakresie wzoru XLI wytwarza się przez hy-rolizę odpowiadających związków o wzorze XL jakie określono w niniejszym opisie poniżej.
Związek o wzorze XLII o-powia-a woo-owi:
XL g-ziz -E-E- wybiera się spośród:
R' >
21 R22 I
C— R23
XLIII
R21 >=iXLIV
R21 OR24 XC—C / I
XLV
OR24 R21
I
-C>22
XLVI
Q
V—CR21z XLVII
R21, R22 i R23 wybiera się niezależnie spośród atomu wo-oru, grupy alkilowej, chlorowca, grupy nitrowej i cyjano; R7* wybiera się spośród atomu wo-oru i niższej grupy alkilowej; R80 i r90 wybiera się niezaleznie spośród grupy ketonowej i podstawników, które mogą stanowić r8 i R9; i -A-A-, -B-B- i R3 sątakke jak okkeślono we wzooze -V.
Związek o wzorze XLIIA o-powia-a wzorowi XLII g-ziz R21, R22 i R75 wy/biera się niezaleznie spośród atomu wo-oru, chlorowca i nizszej grupy alkilowej.
Związek o wzorze XLIIB odpowiada wzorowi KLIIA gdzie -E-E- odpowidda wot^wi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
189 459
Związek o wzorze XLIIC odpowiada wzorowi XLII gdzie R8° i r9° razem z atomem węgla pierścienia, do którego eą dołączone, obejmują grupę ketonową lub:
C( 1 7) mn( CH-) Z \
Y* c
XXXIV i 2 · · ♦ gdzie X, Y , Y i C(17) eą takie jak określono powyżej.
Związki o wzorach XLIID odpowiadają wzorowi XLII, w których podetawnik XXXIV odpowiada etrukturze XXXIII xxiii.
Związki o wzorze XLIIE odpowiadają wzorowi XLII, w którym r8° i r9° razem tworzą grupę ketonową. Związki o wzorach XLIIF, XLnG, XLIIH, XLIIJ, XLIIM i XLIIN odpowiadają wzorowi XLII, XLIIA, XLIIB, XLIIC, XLIID i XLIIE odpowiednio, w których -A-A-, -B-B- oznaczają -CH2-CH2- i RC oznacza atom wodoru. Związki w zakreeie wzoru XLII wytwarza eię przez odbezpieczenie odpowiadających związków o wzorze XLI.
Związki o wzorze XLIX odpowiadają etrukturze:
8 9 gdzie -E-E- jeet taki jak określono jak we wzorze XL i -A-A-, -B-B-, R , R , R i R eą takie jak określono we wzorze IV.
. · R Q
Związek o wzorze XLIXA odpowiada wzorowi XLIX gdzie R i R razem z atomem węgla pierścienia, do którego eą dołączone tworzą etrukturę:
XC( 17) / \
XXXIV gdzie X, Y1 Y2 i C(17) eą takie jak określono powyżej.
189 459
Związek o wzorze XLIXB odpowiada wzorowi XLIX gazieR8 i r9 razem tworzą strukturę o wzorze XXXIII:
O
XXXIII.
Związki o wzorach XLIXC, XLIXD, XLIXE oapowiranio, odpowiadają każdemu wzorowi XLIX, XLIXA lub XLIXB gdzie każdy z -A-A i -B-B- oznacza -CH2-CH2-, R3 oznacza, atom wodoru i R1 oznacza grupę alkoksykarbonyłową, korzystnie metoksykarbonylową. Związki w zakresie wzoru XLIX można wytwarzać przez reakcję rozpuszczalnika alkoholowego lub wodnego z odpowiadającym związkiem o wzorze VI, w obecności odpowiedniej zasady.
Związek o wzorze A203 odpowiada strukturze:
R
B
CHO [A203] gdzie -E-E- wybiera się spośród:
XLIV
/Ć—CR21R18 wybiera się spośród grupy C1 do C4 alkilowej ; R21, R22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, chlorowca, grupy nitro i cyjano; Ru wybiera się
189 459 spośród atomu wodoru i niższej grupy alkilowej; oraz -A-A, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze IV.
Związek o wzorze A203A odpowiada wzorowi A203, gdzie r21, R22 i R23 wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, chlorowca i niższej grupy alkilowej.
Związek o wzorze A203B odpowiada wzorowi A203A gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
Związki o wzorach odpowiednio A203C, A203D i A203E odpowiadają wzorowi A203, A203A i A203B gdzie każdy -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru. Związki w zakresie wzoru A203 wytwarza się przez redukcję związku o wzorze A202 jaki określono w niniejszym opisie poniżej.
Związek o wzorze A204 odpowiada strukturze:
gdzie R19 oznacza grupę C1 do C4 alkilową i -E-E-, -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono we wzorze 203.
Związek o wzorze A204A odpowiada wzorowi A204, gdzie R^, r22 i r23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, chlorowca i niższej grupy alkilowej.
Związek o wzorze A204B odpowiada wzorowi A204A, gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
Związki o wzorach odpowiednio A204C, A204D i A204E odpowiadają wzorom A204, A204A i A204B, gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru. Związki w zakresie wzoru A204 wytwarza się przez hydrolizę odpowiadających związków o wzorze A203.
Związek o wzorze A205 odpowiada strukturze:
[A205] gdzie r2 oznacza grupę Ci do C4 alkilową i -E-E-, r19, -AlAl. -B-B- i r3 są takie jak określono we wzorze 204.
189 459
Związek o wzorze A205A odpowiada wzorowi A205 gdzie R21 R22 i r23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, chlorowca i niższej grupy alkilowej.
Związek o wzorze A205B odpowiada wzorowi A205A gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVn.
Związki o wzorach odpowiednio A205C, A205D i A205E odpowiadają wzorom A205, A205A i A205B gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru. Związki w zakresie wzoru A205 wytwarza się przez reakcję odpowiadających związków o wzorze A204 z alkanolem i kwasem.
Związek o wzorze A206 odpowiada strukturze:
[^^06] gdzie R19, R20, -E-E-, -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze 205.
Związek o wzorze A206A odpowiada wzorowi A206 gdzie R21, R22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, chlorowca i niższej grupy alkilowej.
Związek o wzorze A206B odpowiada wzorowi A206A gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
Związki o wzorach odpowiednio A206C, A206D i A206E odpowiadają wzorom A206, A206A i A206B gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru. Związki w zakresie wzoru A206 wytwarza się przez reakcję odpowiadającego związku w zakresie wzoru A206 z halogenkiem trialkilosulfoniowym.
Związek o wzorze A207 odpowiada strukturze:
[A207] gdzie R25 oznacza grupę C1 do C4 alkilową i -E-E-, R19, r2°, -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze A205.
• 21 22 ^3
Związek o wzorze A207A odpowiada wzorowi A207 gdzie R, R i R wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, chlorowca i nizszej grupy alkilowej.
189 459
Związek o wzorze A200B odpowiada wzorowi A200A gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
Związki o wzorach odpowiednio A200C, A200D i A200E odpowiadają woo-om A200, A200A i A200B gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i r3 oznacza atom wodom. Związki w zakresie wzoru A200 wytwarza się przez reakcję związków o wzorze A206 z malonianem dialkilu.
Związek o wzorze A20™ odpowiada strukturze:
[A20™] ori QA 1 gdzie -E-E-, Ri Rsą takie ,jak określono we wooroe XLII; -A-A-, -B-B- i R są takie jak określono we wzorze 104; i R , R20, -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono we wzorze 205.
Związek o wzorze A20™A odpowiada wzorowi A20™ gdzie R21 i r22 wybiera się niezależaiz spośród atomu wodoru, chlo-owo7 i niższej grupy alkilowej.
Związek o wzorze A20™B odpowiada wzorowi A20™A gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIII, XLIV, XLV lub XLVII.
Związek o wooroe A20™C odpowiada wzorowi A20™ gdzie R™0 i R90 razem z atomem węgla ple-ścizaia, do którego są dołączone, obejmują grupę ketonową lub:
XXXIV • 1 9 gdzie X, Y , Y i C(10) są takie jak określono powyżej.
Związek o wzorze 20™B odpowiada wzorowi 20™C, w którym grupa XXXIV odpowiada sa-skauree XXXIII:
XXXIII.
Związki o wzorach odpowiednio A20™E, A20™F, A20™G, A20™H i A20™J odpowiadają wzorom A20™, A20™A, A20™B, A20™C i A20™D gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i r3 oznacza atom wodom. Związki w zakresie wzoru A20™ wytwarza się przez rozkład termiczny odpowiadających związków o wooroe A200.
189 459
Związek o wzorze A209 odpowiada strukturze:
[A209] gdzie Ri Rsą takie jak określono we wzorze XLI i -E-E- oraz -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze 205.
Związek o wzorze A209A odpowiada wzorowi A209 gdzie R21 i R22 wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, chlorowca i niższej grupy alkilowej. Związek o wzorze A209B odpowiada wzorowi A209A gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLlH, XLIV, XLV lub XLVII. Związek o wzorze A209C oapowi4a4 wzorowi A209B gdzie -E-E- odpowiada wzorowi XLIV.
Związek o wzorze A209D odpowiada wzorowi A208 gdzie r8° i r9° razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, obejmują grupę ketonową lub:
XXXIV
XXXIV gdzie X, Y1, Y2 i C(17) są takie jak określono powyżej.
Związki o wzorze 209E odpowiadają wzorowi 209D, w którym grupa XXXIV odpowiada strukturze XXXIII:
XXXIII.
Związki o wzorach odpowiednio A209F, A209G, A209L i A209M odpowiadają wzorom A209, A209A, A209B, A209c i A209D gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru. Związki w zakresie wzoru A209 wytwarza się przez hydrolizę odpowiadających związków o wzorze A208.
Związek o wzorze A210 odpowiada strukturze:
[A210]
189 459 gdzie r8° i r9° są takie jak określono we wzorze XLI i podstawniki -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono we wzorze IV.
Związek o wzorze A210A odpowiada wzorowi A210 gdzie R8° i r9° razem z atomem węgla pierścienia, do którego są dołączone, obejmują grupę ketonową lub:
7) illii( CHj) 2 - C « X
XXXIV • l 2 · · · gdzie X, Y , Y i C(17) są takie jak określono powyżej.
Związki o wzorze 209E odpowiadają wzorowi 209D, w którym grupa XXXIV odpowiada strukturze XXXIII:
XXXIII.
Związki o wzorach odpowiednio A201B odpowiadają wzorowi A210A, w którym R8° i r9° razem tworzą grupę ketonową.
Związki o wzorach odpowiednio A210D, A210E, A210F i A210G odpowiadają wzorowi A210, A210A, A210B i A210C gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru. Związki w zakresie wzoru 210 wytwarza się przez epoksydację związku o wzorze 209, w którym -E-E- oznacza >C=CH-.
Związek o wzorze A211 odpowiada wzorowi
gdzie -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono powyżej.
Związek o wzorze A211A odpowiada wzorowi A211 gdzie r8° i R9° razem obejmują grupę ketonową lub:
C( 1 7) mii( CHj) 2 . C - X
XXXIV gdzie X, Y1 Y2 i C(17) są takie jak określono powyżej.
189 459
Związki o wzorze A211B odpowiadają wzorowi A211A, w którym grupa XXXIV odpowiada etrukturze XXXIII:
XXXIII.
Związek o wzorze A211C odpowiada wzorowi A210A, w którym r8° i r9° razem tworzą grupę ketonową.
Związki o wzorach odpowiednio A211D, A211E, A211F i A211G odpowiadaj ąwzorowi A211, A211A, A211B i A211C gdzie każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i R.3 oznacza atom wo-oru. Związki w zakreeie wzoru A211 wytwarza eię przez epokeydację odpowiadająodgo związku o wzorze 210 lub przez dpokeyaaoję o-powia-ającego związku o wzorze A209 gdzie -E-E- oznacza >O=CH-. Związki o wzorze a211 można przekeotaSoać do związków o wzorze I w epoeób opieany poniżej.
Związek o wzorze L odpowiada etrukturze:
gdzie R11 oznacza grupę C do C4 alkilową i -A-A-, -B-B- i R1 r2, rC, r8 i r9 eą takie jak określono powyżej.
Związek o wzorze LA odpowiada wzorowi L gdzie r8 i r9 razem z atomem węgla, -o którego eą przyłączone obejmują grupę ketonową lub:
C( 1 7) 11111( CH-) , - C / \
XXXIV • 1 2 g-zie X, Y , Y i C(17) eą takie jak określono powyżej.
Związki o wzorze LB o-powiadają wzorowi L, w gdzie R8 i R9 odpowiadają wzorowi
XXXIII
XXXII];.
Związki o wzorze LC, LD, LE odpowiadają wzorom L, LA i LB, odpowie-nio, gdzie każ-y -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2- i RC oznacza atom wodoru.
189 459
Na podstawie opisu konkretnych schematów reakcji, jakie przedłożono w niniejszym poniżej, będzie widoczne, które z tych związków mają największe wykorzystanie w stosunku do poszczególnego schematu reakcji. Związki według tego wynalazku są użyteczne jako pośrednie dla euoksymeksśenonu i innych steroidów.
Krótki opis rysunków figura 1 jest schematem sposobu biokonwersji kanrenonu lub pochodnej kanrenonu do odpowiadającego związku 11α-hyó.śokswlowego;
figura 2 jest schematem zalecanego sposobu biokonwersji/11-α-hydroksylacji kaurenonu i pochodnych karnenonu;
figura 3 jest schematem szczególnie zalecanego sposobu biokpnwersji/11-α-hydroksylacji kamenonu i pochodnych kanrenonu;
figura 4 ukazuje rozkład wielkości cząstek dla kam-enonu jaki wytworzono zgodnie ze sposobem według fig. 2; oraz figura 5 ukazuje rozkład wielkości cząstek dla kanśenomu jaki wwJałowipnp w bioreaktorze transformacyjnym zgodnie ze sposobem według fig. 3.
Odpowiednie litery odniesienia wskazują odpowiadające części w rysunkach.
Opis zalecanych postaci realizacji
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, opracowano różne nowe schematy sposobu wytwarzania epoksymeksśenonu i innych związków, odpowiadających wzorowi I:
gdzie -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHr5- lub -CR4=CR5-; r3, r4 i R5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, nizszej alkoksy, hyóroksyalkiloweJ, alkpkswalkiloweJ, hydrokswkaśbonwloweJ. cyjano i aryloksy; r1 reprezentuje αlzoriemtowamą grupę nizszą alkoksykarbonylową lub grupę hyóroksykαśbonylową; -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub a- albo p-zorientowaną grupę:
—ch-ch2-ch—
III gdzie r6 i R7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, αcylpweJ. hyórokysalkilpwej, alkoksyalkilowej, hwóśokswkaśbonwlowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aśylpksw; oraz R8 i r9 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, chlorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hyórokswalkiloweJ, alkoksyalkilowej, hwdrpksykaśbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acylpksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R?i r9 razem obejmują karbocyklicsmą lub heterocykliczną strukturę pieśściemiowąi albo R8 i r9 razem z R6 i R7 obejmu189 459 ją karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę piz-ścizniową połączoną z pzntacyklicznym piz-ściznizm D.
Z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, grupy organiczne przytaczane jako „niższe” w niniejszym opisiz o7wiz-ają w większości 7, a korzystnie o- 1 do 4 atomów węgla.
Nizszą grupę alkoksykarbonylową oznacza korzystnie grupa pochodząca o- grupy alkilowej, mającej o- 1 do 4 atomów węgla, takiej jak grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, butylowa, ioobutylowa, szc-butylowa i tzrtbutylowa; zwłaszcza zaleca się grupę mztoksykarbonylową, ztoksykarbonylowa i izopropoksyka-bonylową. Niższa grupa alkoksy korzystnie oznacza grupę pochodzącą od jz-nzj z wyżej wspomnianych grup C1-C4 alkilowych, zwłaszcza od pizrwsozrzędowyoh grup C1-C4 alkilowych, szczególnie zaleca się grupę mztoksy. Nizszą grupę 7lk7noilową oznacza korzystnie grupa pochodząca o- prostołańcuchowzj grupy alkilowej, mającej od 1 do 7 atomów węgla; zwłaszcza zaleca się grupę formylową i acztylową.
Mostzk metylenowy w pozycji 15, 16 jest korzystnie β-eorizntowany.
Zalecaną klasą związków, które można wytwarzać zgodnie ze sposobami wz-ług wynalazku są związki 70-spiroks7nowz opisane w opisiz patentowym US nr 4 559 332, to jest tz, które odpowiadają wzorowi IA:
w którym -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2 lub -CH=CH-; -B-B- rzprzzzntujz grupę -CH2-CH2- lub α- albo β-oorizntowaną grupę o wzorze IIIA:
-CH—- CH2 — CH—
IIIA
R1 reprezentuje nizszą grupę alkoksykarbonylową o orientacji a albo grupę hy-roksykarbonylową; X reprezentuje -wa atomy wo-oru, grupę okso lub =S; Y’ i Y2 razem reprezentują mostzk tlenowy -O- albo Y1 rzprzzzntujz grupę hy-roksy i Y2 rzprzzzntujz grupę hy-roksy, nioszą alkoksy lub, jeśli X rzprzzzntujz H2, także nizszą alkanoiloksy.
Korzystnie, związki 20-spiroksanowz wytwarzane nowymi sposobami wz-ług wynalazku są tymi związkami o wzorze I, w których Y2 i Y2 razem reprezentują mostzk tlenowy -O-.
Zwłaszcza zalzcanymi związkami o wzorze I są tz, w których X reprezentuje grupę okso. Ze związków 20-spiroksanowych o wzorze LA, w których X reprezentuje grupę okso, najbardziej zaleca się tz, w których Y1 razem z Y2 reprezentują mostzk tlenowy -O-.
Jak już wspomniano, kwas 17β-hydroksy-21-k7rbzksylowy może także występować w postaci swej soli. Bierze się pod uwagę zwłaszcza sole metalu i amonowe, takie jak metali alkalicznych i sole metali ziem alkalicznych, np. sodu, wapnia, magnezu i korzystnie sole potasowe oraz sole amonowe, pochodzące od amoniaku lub odpowiednich, korzystnie fiojolzgicznie tolerowanych organicznych zasad, zawierających azot. Zasa-ami branymi po- uwagę są nie tylko aminy, np. nizszz alkiloaminy (takie jak triztylo7min7), hydroksy-nizszz-alkiloaminy (takie jak 2-hydroksyztyloamin7, di-(2-hydrzksyztylo)7mina lub tri-(2-hy-roksyztylo)amina, cykloalkiloaminy (takie jak dicyklohzksyloamina) lub benzy^ami^ (takie jak benzy^ami^ i N,N'--ibznoy'loztylzaodiamina), lzcz także związki heterocykliczne, zawierające azot, np. tz o charakterze aromatycznym (takiz jak pirydyna i chinolina) lub tz, które mają
189 459 co najmniej częściowo nasycony pierścień heterocykliczny (takie jak N-etylopiperazyna, morfolina, piperazyna lub N,N'-dimetylopiperazyna).
Wśród objętych zalecanych związków są także sole metali alkalicznych, zwłaszcza sole potasowe związków o wzorze IA, w którym R* reprezentuje grupę alkoksykarbonylową, przy czym X reprezentuje grupę okso i każdy z Y1 i Y2 reprezentuje grupę hydroksy.
Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze I i IA są np. następujące:
9α, 11 α-epoksy-7α-metoksykarbonylo-20-spiroks-4-eno-3,21 -dion,
9α, 11 a-epoksy-7a-etoksykarbonylo-20-spiroks-4-eno-3,21 -dion,
9a,11a-epoksy-7a-izopropoksykarbonylo-20-spiroks-4-eno-3,21-dion oraz analogi 1,2-dehydro każdego ze związków;
9α, 11 α-epoksy-6α,7α-metyleno-20-spiroks-4-eno-3,21 -dion,
9α, 11 a-epoksy-6β,7aβ-metyleno-20-spπΌks-4-eno-3,21 -dion,
9a,l1a-epoksy-6β,7 β ;15 p,16p-bismetyleno-20-spiroks-4-eno-3,21-dion oraz analog 1,2-dehydro każdego z tych związków;
kwas 9α, 11 α-epoksy-7α-metoksykarbonylo- 17(3-hydr0ksy-3-oksopregn4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9α, 11 α-epoksy-7α-etoksykarbonylo-17 β -hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9(α 11 a-epoksy-7a-izopropoksykarbonylo-17 β -hydroksy-3-oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9α,11α-epoksy-7α-17β-hydroksy-6α,7α-metyleno-3-oksopregn-4-eno-2l-karboksylowy, kwas 9α, 11 α-epoksy-17 β-hydroksy-6β,7 (3-metyleno-3 -ok s opregii-4-eno-21 -karboksylowy, kwas 9α, 11 α-epoksy-17β-hydroksy-6β,7β; 15 β, 17β-bismetyleno-3 -oksopregn-4-eno-21 -karboksylowy oraz sole metali alkalicznych, zwłaszcza sole potasowe lub amonowe każdego z tych kwasów, a także odpowiadające analogi 1,2-dehydro każdego ze wspomnianych kwasów karboksylowych lub ich soli;
ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9a,11α-epoksy-7α-15β,16β-metyleno-3,21-diokso-20-spiroks-4-eno-7a-karboksylowego, ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9α,11α-epoksy-7α-15β,16β-metyleno-3,2l-diokso-20-spiroksa-l,4-dieno-7a-karboksylowego, ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9α,11α-epoksy-15 β,16 β-20-spiroks-4-eno-7a-karboksylowego,
9a,11<a-epoksy-6β,7β-metyleno-20-spiroks-4-en-3-on,
9α, 11 a-epoksy-6β,7β; 15 β, 16 β-bismetyleno-20-spiroks-4-en-3-on, ester metylowy, ester etylowy i ester izopropylowy, kwasu 9a,11a-epoksy47β-hydroksγ-l7a(3-hγdroksypropyk))-3-oksoandrost-4-eno-7a-karboksylowego,
9α, 11 α-epoksy- l7β-hydroksy-l7(a(3-hydroksypropylo)-6a,7β-metylenoandIΌst^-4-en-3-on,
9α, 11 α-epoksy-n β-hydroksy- 17α(3 -hydroksypropylo)-6 β,7β-metylenoandrost-4-en-3 -on,
9α, 11 α-epoksy-17β-hydroksy-17α(3-hydroksypropylo)-6β,7β; 15 β, 16 β-bismetylenoandrost-4-en-3-on, łącznie z analogami 17α-(3-acetoksypropylo) i 17α-(3-formyloksypropylo) wspomnianych związków androstanowych, a także analogi 1,2-dehydro wszystkich wspomnianych związków szeregu androst-4-en-3-onu i 20-sproks-4-en-3-onu.
Nazwy chemiczne związków o wzorach I i IA i związków analogicznych, mających takie same charakterystyczne cechy strukturalne, są zgodne z aktualnym nazewnictwem w następujący sposób: dla związków, w których γ1 razem z Y2 reprezentują -O-, od 2-spiroksanu (np. związek o wzorze IA, w którym X reprezentuje grupę okso i Y1 razem z Y2 reprezentują -O- pochodzi od 20-spiroksan-21-onu); dla tych, w których każdy z Y1 i Y2 reprezentuje grupę hydroksy i X reprezentuje grupę okso. od kwasu 17β-hydroksy-17α-pregneno-21 karboksylowego; i dla tych, w których każdy z γ1 i Y2 reprezentuje grupę hydroksy i X reprezentuje dwa atomy wodoru, od 17β-hydroksy-17α-(3-hydrokspropylo)androstanu. Jako że postacie cykliczne i o otwartych łańcuchach, czyli odpowiednio laktony oraz kwasy 17β-hydroksy-2l-karboksylowe i ich sole są ściśle spokrewnione ze sobą w taki sposób, ze te drugie mogą być uznane jedynie za uwodnioną postać tego pierwszego, należy rozumieć, że w częściach opisanych powyżej i poniżej, chyba ze zaznaczono inaczej, zarówno w produktach końcowych
189 459 o wzorze I, jak i w materiałach wyjściowych oraz produktach pośrednich o analogicznej strukturze, w każdym wypadku mogą wystąpić wszystkie wymienione postacie razem.
Zgodnie z wynalazkiem, opracowano kilka oddzielnych schematów sposobu wytwarzania związków o wzorze I w wysokiej wydajności i przy rozsądnych kosztach. Każdy ze schematów syntezy następuje poprzez wytworzenie szeregów związków pośrednich. Liczne z tych związków pośrednich są związkami nowymi i sposoby wytwarzania tych związków pośrednich są sposobami nowymi.
Schemat 1 (poczynając od kanrenonu lub materiału pokrewnego)
Jednym zalecanym schematem sposobu wytwarzania związków o wzorze I, korzystnie rozpoczyna się kanrenonem lub pokrewnym materiałem odpowiadającym wzorowi XIII (albo alternatywnie, sposób może się zacząć androstendionem lub pokrewnym materiałem wyjściowym)
XIII gdzie -A-A- reprezentuje grupę CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-; R3, R4 i R5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkokeyalkilowej, hyarokeykarbonylowej, cyjano i aryloksy; -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β-z.orientowaną grupę:
—CH-CH2-CH—
III gdzie R6 i R7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, chlorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkokeyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz r8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodom, grupy hydroksy, chlorowca, niższej grupy alkoksy, acylowej, hyarokey4lkilowej, alkoksy4lkilowej, hyarokeykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i R9 razem obejmują, karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i R9 razem z r6 i Rr obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.
Stosując sposób biokonwersji typu zilustrowanego na fig. 1 i 2, grupę 11-hydroksy o orientacji a wprowadza się do związku o wzorze XIII, wytwarzając przez to związek o wzorze VIII:
VIII
189 459
8 9 gdzie -A-A-, bB-Β-, R , R i R są takie jak określono we wzorze XIII . Kooyytanie , ewiozkk o wzorze XIII ma strukturę
XIIIA i produkt 11a-hydroksy ma strukturę
VII IA w której każdy -A-A- reprezentuje grupę -Ο©-®© lub -CH=CH=; -B-B- reprezentuje grupę -CHL-CIL·- lub grupę α- lub β-zorientowaną:
-CH— CH2—CH—
IIIA
R3 oznacza atom wodoru, nizszą grupę alkilową lub niższą alkoksy; X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S; Y i Y2 razem reprezentują mostek tlenowy -O- lub Y1 reprezentuje grupę hydroksy i Y2 reprezentuje nizszą grupę alkoksy albo, jeśli X reprezentuje FĘ, także niższą alkanoiloksy; oraz sole związków, w których X reprezentuje grupę okso i Y2 reprezentuje grupę hydroksy. Korzystniej, związek o wzorze VIIIA wytwarzany w reakcji, odpowiada związkowi o wzorze VIIIA gdzie -A-A- i -B-B- oznaczają każdy grupę -ί'ΙΕ-Ο©-; R3 oznacza atom wodoru; Y1 Y2 i X są takie jak określono we wzorze XIIIA; i R8 i R9 razem tworzą strukturę 20-spiroksanu:
O
XXXIII.
189 459
Wśród zalecanych organizmów, które można stosować w tym etapie hydroksylach, są Aspergillus ochraceus NRRL 405, Aspergillus ochraceus ATCC ^50)(0, Aspergillus niger ATCC 16™™™ i ATCC 26693, Aspergillus nidulans ATCC 11260, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolonifer ATCC 6220b, Streptomyces fradiae ATCC 10045, Bacillus megaterium ATCC 14945, Pseudomonas cruciviae ATCC 13262 i Trichothecium roseum ATCC 12543. Innymi zalecanymi organizmami są Fusarium oxysporum f. sp cepae ATCC 11101 i Rhisopus arrhizus ATCC 11145.
Inne organizmy, które wykazały aktywność dla tej reakcji obejmują Absidia coerula ATCC 6640, Absidia glauca ATCC 22052, Actinomucor elegans ATCC 6406, Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Beauveria bassiana ATCC 0159 i ATCC 13144, Botryosphaeria obtusa IMI 03™560, Calonectria decora ATCC 1-4760, Chaetomium cochliodes ATCC 10195, Corynespora cassiicola ATCC 1601™, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a, Cunninghamella echinulata ATCC 3655, Cunninghamella elegans ATCC 9245, Curvularia clavata ATCC 22921, Curvularia lunata ATCC 12010, Cylindrocarpon radicicola ATCC 1011, Epicoccum humicola ATCC 12022, Gongronella butleri ATCC 22™22, Hypomyces chrysospermus ATCC IMI 109™91, Mortierella isabellina ATCC 42613, Mucor mucedo ATCC 4605, Mucor griseocyanus ATCC 1200A, Myrothecium verrucaria ATCC 9095, Nocardia corallina ATCC 19000, Paecilomysces carneus ATCC 46509, Pemcillum patulum ATCC 24550, Pithomyces alroolivaceus IFO 6651, Pithomyces cynodontis ATCC 26150, Pycnosporium sp. ATCC 12231, Saccharopolyspora erythrae ATCC 11635, Sepedonium chrysospermum ATCC 1330™, Stachylidium bicolor ATCC 12602, Streptomyces hygroscopicus ATCC 2043™, Streptomyces purpurascens ATCC 254™9, Syncephalastrum racemosum ATCC 1™192, Thamnostylum piriforme ATCC ™992, Thielavia terricola ATCC 13™00 i Verticillium theobromae ATCC 12404.
Inne organizmy, u których można spodziewać się aktywności dla 11k-hydroksylaojl, obejmują Cephalosporium aphidicola (Thytochemistry (1996), 42(2), 411-415), Cochliobolus lunatas (j. Bioaechaol. (1995), 42(2), 145-150), Tieghemella orchidis (Khim.-Farm. Zh. (19™6), 20(0), 801s806)· Tieghemella hyalospora (Kb^-Farm. Zh. (19™6), 20(0), ™01-™06), Monosporium olivaceum (Acta Mlcrobiol.Pol.Se-.B. (1903), 5(2), 103-110), Aspergillus ustus (Acta Microbiol. Pol. Ser. B. (1903), 5(2), 103-110), Fusarium grammearum (Acta Microbiol. Pol. Ser. B. (1903), 5(2), 103-110), Verticillium glaucum (Acta Miorobiol. Pol. Ser. B. (1903), 5(2), 103-110) i Rhizopus nigricans (J. Steroid Biochem. (19™0), 2™(2), 190-201).
Pochodne 11 β-hydroksy androstendions i meksrenons można wytwarzać zgodnie ze sposobem biokonwersji proeałożonym w przykładach 19A i 19B, odpowiednio. Wynalazcy zakładają proeo analogię, że odpowiadający izomer p-hydroksy związku o wzorze VIII, mający podstawnik β-hydroksy przy C11 zamiast pedstawnika k-hydroksy przy C11, można także wytworzyć przy użyciu podobnego sposobu biokonwersjii, wykorzystując odpowiednie drobnoustroje zdolne do przeprowadzenia np-hydroksylacji, takich jak jeden lub więcej drobnoustrojów opisanych w niniejszym.
Wytwarza się szczep komórek przygotowawczy do fermentacji na skalę produkcyjną hydroksylach kamenonu lub innych substratów o wzorze XIII, w uał7aolz fermentacyjnym z posiewaniem, obejmującym bioreaktor do posiewania lub szeregi dwóch lub więcej bioreaktorów do posiewania. Pracującą podstawową zawiesinę spor wprowadza się do pizI'wszzgo bioreaktora do posiewania, razem z roztworem odżywczym dla wzrostu komórek. Jeśli objętość szczepu żądana lub potrzebna do produkcji przekracza tę w pierwszym bioreaktorze do posiewania, objętość szczepu można postępowo i gzometrycoaie powielać proeo aamaazaaie w pozostałych bioreakaorach, w ciągu bioreaktorów z posiewaniem. Korzystnie szczep wytworzony w układzie blore7kaorów z powsiewaaizm ma korzystną objętość i żywe komórki do osiągnięcia szybkiego początku reakcji w biore7kto-zz produkcyjnym, relatywnie krótkie cykle produkcyjne fermentacji i wysoką aktywność bioreaktora produkcyjnego. Obojętnie jaka będzie ilość naczyń w ciągu bioreaktorów do posiewania, drugi i następne bioreaktory do posiewania są korzystnie takiej wielkości, aby wielkość rozcieńczenia w każdym etapie w ciągu była zasadniczo taka sama. Początkowe roecleńcozalz szczepu w każdym bioreaktoroe do poslznaala może być w przybliżeniu takie same jak roooizńczeaiz w biore7kaorzz produkcy]94
189 459 nym. Kamenon lub inny eubetrat o wzorze XIII ła-uje eię do bioreaktora produkcyjnego razem ze ezczepem i roztworem odżywczym i zachodzi tam reakcja hy-rokeylacji.
Ztuideiaa zarodników ładowana do układu bioreaktoróu do poeiewania pocho-zi z fiolek użytecznej wyjściowej zawieeiny zarodników, wziętych z wielu fiolek, etanowiących bank użytecznych komórek wyjściowych, który przechowuje eię przed użyciem w uarunktoh kriogenicznych. Z kolei bank uzytecznych komórek wyjściowych pochodzi z głównego banku komórek wyjściowych, wytworzonego w naetępujący epoeób. Próbkę zarodników otrzymanych z odpowiedniego źródła, np. ATCC zauieeoa eię początkowo w pożywce wodnej, takiej jak np. roztwór eoli, roztwór odżywczy lub roztwór środka pouierzchaiouo czynnego (np. środka powierzchniowo czynnego anionowego, takiego jak Tween 20 o etężeniu około 0,001% wagowego) i oauieeinę rozprowadza eię wśród płytek hodowlanych, przy czym każ-a płytka nideie etałą mieeotniaę oaoyuozą- zwykle opartą o nldetrawnd polieacharydy, takie jak agar, g-zie zarodniki namnażają eię.
Stała mieezanina odżywcza zwykle zawiera mię-zy około 0,5% i około 5% wagowych glukozy, między około 0,05 i około 5% wagowych źródła azotu, np. peptonu, mię-zy około 0,05 i około 0,5% wagowych źró-ła foeforu, np. foeforanu amonowego lub metalu alkalicznego, takiego jak uoaorofoeforan dipotaeowy, między około 0,25% i około 2,5% wagowych lizatu drożdżowego lub eketraktu (albo innego źródła amlaoku’teów, takiego jak eketrakt mięeny lub infuzji mózgouo-eercoudj), między około 1% i około 2% wagowych agaru lub innego nieetraundgo polieaoharyau. Ewentualnie, etała mieezanina odżywcza może dodatkowo obejmować i/lub zawierać między około 0,1% i około 5% wagowych eketraktu eło-owego. pH etałej mieezaniny odżywczej wynoei korzyetnie między około 5,0 i około 7,0, uetawionego zgodnie z potrzebą wodorotlenkiem metalu alkalicznego lub kwaeem ortofoeforowym. Wśród uzytecznych pożywek wzroetowych eą naetępujące:
1. Pożywka etała #1: 1% glukoza, 0,25% eketraktu drozdzowego, 0,C% K2HPO4 i 2% agar (Bacto); pH ^taMone -o 6,5 20% NaOH.
2. Pożywka etała #2: 2% pepton (Bacto), 1% eketrakt drożdżowy (Bacto) 2% glukoza i 2% agar (Bacto), pH ^ta^one do 5 10% H3PO4.
C. Pożywka etała #C: 0,1% peptydon (Bacto), 2% eketrakt eło-owy (Bacto), 2% glukoza i 2% agar (Bacto); pH jakie jeet 5,C.
4. Płynna pożywka: 5% melaea z trzciny cukrowej, 0,5% płynu z moczenia kuktry-zy0,25% glukoza, 0,25 NaCl i 0,5% KH2PO4, pH uetawione do 5,8.
5. Agar Difco Mycological (niekie pH).
Wiele z płytek agarowych używanych w rozwoju głównego banku zbioru komórek można edlekcjoaować pod względem proyeoSych wymagań -la głównego zbioru, lecz zwykle wytwarza eię tak około 15 do około C0 płytek. Po odpowiednim okreeie wzroetu, np. 7 -o 10 -ni, płytki zdrapuje eię w obecności wo-nego podłoża, zwykle roztworu eoli lub buforu, w celu zebrania prodtrutlaików. i otrzymaną główną oauideiaę zbiorczą -zieli eię między małe fiolki, np. jednomililitroud w każdej z wielu 1,5 ml fiolek. Aby wytworzyć pracującą zaweeinę zbiorczą przdtrualaikóu -o użytku w badaniach lub operacjach fermentacji produkcyjnej, zawartości jednej lub więcej tych fiolek z głównym zbiorem drugiego pokolenia można porozdzielać i inkubować na płytkach agarowych w epoi^h opieany powyżej dla wytwarzania głównej zawieeiny po-etawowej prz.etrwalników. Jeśli rozważa eię rutynowe operacje pro-ukcyjne, można etoeouać az 100 do 400 płytek do wytworzenia zbioru pracującego drugiego pokolenia. Każ-ą płytkę zdrapuje eię do oddzielnej fiolki ze zbiorem pracującym, przy czym każ-a fiolka zwykle zawiera jeden ml wytworzonego ezczepu. Dla etałej obedruaoji. zarówno główną ztwieeiaę zbiorczą, jak i ezczep produkcyjny drugiego pokolenia ko^etnie przechowuje eię w parującej etrefie naczynia -o przechowywania kriogenicznego, zawierającego ciekły N2 lub inny płyn kriogeniczny.
W epoeobie oiltetroutnym na fig. 1, wytwarza eię wodną pożywkę wzroetową, która zawiera źródło azotu, takie jak pepton, pochodną drożdży lub równoważnik, glukozę i źródło foeforu, takie jak eól foeforanowa. Prodtrualaiki drobnouetroju hoduje eię w tej pożywce w układzie fermentacyjnym do poeieutnia. Zalecanym drobnouetrojem jeet Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). Tak wytworzony ezczep podetawowy wprowadza eię atetępnid -o
189 459 bioreaktora produkcyjnego z substratem o wzorze XIII. Bulion fermentacyjny miesza się i napowietrza przez czas wystarczający do postępu reakcji do żądanego stopnia zakończenia.
Pożywka do bioreaktora do posiewania korzystnie obejmuje wodną mieszaninę, która zawiera: między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, np. pepton, między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, np. fosforan amonowy lub metalu alkalicznego, taki jak momozasadoww fosforan amonowy lub woóośofosforαn diuotasowy. między około 0,25% i 2,5% wagowo lizat drożdzowy lub ekstrakt (lub inne źródło aminokwasów, takie jak gorzelniane substancje rozpuszczalne), między około 1% i około 2% wagowo agar lub inny niestrawny polisacharyd. Szczególnie zalecana pożywka wzrostowa do posiewania zawiera około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, takie jak pepton, między około 0,25% i około 2,5% wagowo autolizowane drożdże lub ekstrakt drozdzowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, takie jak monozasadowy fosforan amonowy. Szczególnie ekonomiczne operacje w sposobie uzyskuje się przez użycie innej zalecanej hodowli do posiewania, która zawiera między około 0,25% i około 5% wagowych płynu z namaczania kukurydzy, między około 0,25% i około 2,5% autolizpwamych drożdży lub ekstraktu drozósowego, między około 0,5% i około 5% wagowych glukozy i około 0,05% i około 0,5% wagowych monozasadowego fosforanu amonu. Płyn z namaczania kukurydzy jest szczególnie ekonomicznym źródłem białek, ueutwóów, węglowodanów, kwasów organicznych, witamin, jonów metali, pierwiastków śladowych i fosforanów. Płyny zacierowe z innych zbóz można stosować w miejsce lub jako dodatek do płynu z namaczania kukuś\'ós\' pH pożywki korzystnie reguluje się w zakresie między około 5,0 i około 7,0, np. przez dodanie wodorotlenku metalu alkalicznego lub kwasu ortofosforowego. Jeśli płyn z namaczania kukurydzy służy jako źródło azotu i węgla, pH reguluje się korzystnie w zakresie około 6,2 do około 6,8. Pożywkę, zawierającą pepton i glukozę reguluje się korzystnie do pH między około 5,4 i około 6,2. Wśród użytecznych pożywek do stosowania w fermentacji do posiewania:
1. Pożywka # 1: 2% pepton, 2% drożdże autolizowane (lub ekstrakt drozdzowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.
2. Pożywka #2: 3% płyn z namaczania kukurydzy, 1,5% ekstrakt drożdzowy, 0,3% momozasaóoww fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.
Przetrwalniki drobnoustroju wprowadza się do tej pożywki z fiolki zwykle zawierającej około 1 °9 urzetrwalników na ml zawiesiny. Optymalną produktywność pokolenia do posiewania realizuje się jeśli rozcieńczenia pożywki wzrostowej na początku hodowli do posiewania nie zmniejsza gęstości populacji urzetrwalników poniżej około 1°7 na ml. Korzystnie, przetrwalniki hoduje się w układzie fermentacyjnym do posiewania dotąd, aż objętość upakowanych miceli (PMV) w bioreaktorze wynosi co najmniej około 20%, korzystnie około 35% do około 45%. Ponieważ cykl w naczyniu fermentacyjnym do posiewania (lub każdym naczyniu z wielu, które obejmują ciąg fermentacyjny do posiewania) zalezy od początkowego stężenia w tym naczyniu, może być pożądane zapewnienie dwóch lub więcej etapów fermentacji z posiewaniem, w celu przyspieszenia całości procesu. Jednakże, korzystne jest unikanie stosowania znacznie więcej niż trzech bioreaktorów do posiewania w szeregu, ponieważ aktywność może być kompromisowa jeśli fermentację z posiewem przeprowadza się przez nadmierną ilość etapów. Fermentację kultury do posiewu przeprowadza się przy mieszaniu w temperaturze w zakresie około 23° do około 37°C, korzystnie w zakresie między około 24° do około 37°C.
Kulturę z układu fermentacji do posiewu wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego razem z produkcyjną pożywką wzrostową. W postaci realizacji według wynalazku, nie wyjałowiony kanOnon lub inny substrat o wzorze XIII służy jako substrat dla reakcji. Korzystnie, substrat dodaje się do bioreaktora produkcyjnego w postaci 10% do 30% wagowych zawiesiny w pożywce wzrostowej. W celu zwiększenia powierzchni dostępnego obszaru dla reakcji 1la-lWólIΌksylacji. wielkość cząstek substratu o wsdśse XIII zmniejsza się przez przepuszczenie substratu przez rozdrabniacz makrocząsteczkowy wyłączony z linii, przed wprowadzeniem do bioreaktora. Wprowadza się także oddzielnie jałową pożywkę podstawową, zawierającą glukozę oraz drugi roztwór odżywczy, zawierający pochodną drozdzową, taką jak poddane autolizie drożdże (lub równoważny preparat aminokwasowy na podstawie alternatywnych
189 459 źródeł, takich jak rozpuszczalne substancje gorzelniane). Pożywka obejmuje wodną mieszaninę, zawierającą: między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, np. pepton, między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródła fosforu, np. fosforan amonowy lub metalu alkalicznego, takiego jak wodorofosforan dipotasowy, między około 0,25% i około 2,5% wagowo lizat drożdżowy lub ekstrakt (lub inne źródło aminokwasów, takie jak rozpuszczalne substancje gorzelniane), między około 1% i około 2% wagowo agar lub inny niestrawny polisacharyd.
Szczególnie zaleca się produkcyjną pożywkę wzrostową, zawierającą około 0,05% i około 5% wagowo źródło azotu, takiego jak pepton, między około 0,25% i około 2,5% wagowo drożdże poddane autolizie lub ekstrakt drozdzowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i między około 0,05% i około 0,5% wagowo źródło fosforu, takie jak monozasadowy fosforan amonu. Inna zalecana produkcyjna pożywka wzrostowa zawiera między około 0,5% i około 5% wagowo płyn z namaczania kukurydzy, między około 0,25% i około 2,5% drożdże poddane autolizie lub ekstrakt drożdżowy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę i około 0,05% i około 0,5% wagowo seryjnej.
Korzystnie, substrat wprowadza się początkowo w ilości wystarczającej do ustalenia stężenia, wynoszącego między około 0,1% wagowo i około 3% wagowo, korzystnie między około 0,5% i około 2% wagowo, przed zaszczepieniem posiewowym bulionem fermentacyjnym, następnie dodaje się okresowo, dogodnie co 8 do 24 godzin, do podstawowego stężenia, wynoszącego między około 1% i około 8% wagowych. Jeśli dodatkowo substrat dodaje się co 8 godzin, całość dodatku może być nieco nizsza, np. 0,25% do 2,5% wagowych, niż w wypadku gdy substrat dodaje się tylko na podstawie dziennej. W drugim przypadku łączne dodanie kanrenonu może wynosić w zakresie 2% do około 8% wagowych. Uzupełniającą mieszaniną odzywczą dodawaną podczas reakcji fermentacji jest korzystnie koncentrat, np. mieszanina, zawierająca między około 40% i około 60% wagowo jałową glukozę i między około 16% i około 32% wagowo jałowy ekstrakt drozdzowy lub inne jałowe źródło pochodnej drożdzowej (lub inne źródło aminokwasów). Ponieważ substrat dodawany do bioreaktora produkcyjnego z fig. 1 nie jest jałowy, okresowo do bulionu fermentacyjnego dodaje się antybiotyki, w celu kontroli niepożądanych organizmów.. Antybiotyki, takie jak kanamycyna, tetracyklina i cefaleksyna można dodawać bez niekorzystnego wpływu na wzrost i biokonwersję. Korzystnie, wprowadza się je do bulionu fermentacyjnego w stężeniu, wynoszącym np. między około 0,0004% i około 0,002% na podstawie całej ilości bulionu, zawierającego np. między około 0,0002% i około 0,0006% siarczanu kanamycyny, między około 0,0002% i około 0,006% tetracykliny HCl i/lub między około 0,001% i około monozasadowy fosforan amonu. pH produkcyjnej pożywki fermentacyjnej korzystnie reguluje się w sposób opisany powyżej, w takich samych zakresach dla pH pożywki opartej o pepton/glukozę i pożywek opartych o płyn z aamacztaia kuku-yaoy, odpowiednio. Użyteczne pożywki wzrostowe do biokonwersji przedłożono poniżej:
1. Pożywka #1: 2% pepton, 2% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.
2. Pożywka #2: 1% pepton, 1% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) i 2% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.
3. Pożywka #3: 0,5% pepton, 0,5% drożdże po autolizie (lub ekstrakt drożdżowy) i 0,5% glukoza; pH ustawione do 5,8 20% NaOH.
4. Pożywka #4: 3% płyn z namaczania kukurydzy, 1,275% ekstrakt drożdżowy, 0,3% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.
5. Pożywka #5: 2,55% płyn z umaczania kukurydzy, 1,275% ekstrakt drozdzowy, 0,255% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.
6. Pożywka #6: 2,1% płyn z namacoaaia kukurydzy, 1,05% ekstrakt drożdżowy, 0,21% monozasadowy fosforan amonu i 3% glukoza; pH ustawione do 6,5 20% NaOH.
Nie wyjałowowiony kanrenon i jałowe roztwory odzywcz.e podaje się łańcuchowo do bioreaktora produkcyjnego w około pięciu do około dwudziestu, korzystnie około dziesięciu do około piętnastu, korzystnie zasadniczo równych porcjach do każdego cyklu produkcji 0,003% cefaleksyny, ponownie na podstawie całej ilości bulionu.
189 459
Zazwyczaj, cykl produkcji seryjnej wynosi około 80-160 go-zin. Tak więc, części każdego z substratów o woo-zz XIII i roztwory odżywcze, -o-ajz się zwykle co około 2 do 10 go-zin, korzystnie co około 4 -o 6 go-zin. Korzystnie, -o układu fermentacyjnego z posiewem oraz -o biorzaktora produkcyjnego wprowadza się także śro-zk zapobiegający tworzeniu się piany.
Korzystnie, w sposobie wz-ług fig. 1 ła-unzk szczepu -o biorzaktora produkcyjnego wynosi około 0,5% do około 7%, korzystniej około 1% -o około 2% objętościowo na podstawie całości mieszaniny w bio-zakto-zz, a stężenie glukozy utrzymuje się między około 0,01% i około 1,0%, korzystnie mię-zy około 0,025% i około 0,01%, korzystniej mię-zy około 0,05% i około 0,25% wagowych z okresowymi dodawaniami, które korzystnie są porcjami o około 0,05% -o około 0,25% wagowych, w oparciu o całość ładunku. Temperaturę fermentacji kontroluje się -ogo-niz w zakresie, wynoszącym około 20° -o około 37°C, korzystnie około 24°C -o około 28°C, lzcz może być potrzebne obniżenie temperatury podczas reakcji, np. w 2°C przyrostach, w celu zachowania objętości upakowanych miczli (PMV) poniżej około 60%, korzystnie poniżej około 50% i przez to zapobiec zakłócaniu z-powizanizgo mieszania dzięki lepkości bulionu fermentacyjnego. Jeśli rosnąca biomasa wychodzi ponad powierzchnię płynu, substrat pozostający wewnątrz biomasy może zostać przeniesiony poza strefę reakcji i stać się niedostępnym -la reakcji hy-roksylacji.
W celu produktywności, pożą-anz jest aby osiągnąć PMV w o7krzsiz 30 -o 50%, korzystnie 35% -o 45% w ciągu pierwszych 24 go-zin reakcji fermentacji, lzcz potem warunki korzystnie są w stanie kontrolować dalszy wzrost w granicach ustalonych powyżej. Podczas reakcji, pH pożywki fermentacyjnej kontroluje się w zakresie mię-zy około 5,0 i około 6,5, korzystnie mię-zy około 5,2 i około 5,8, a bio-zakto- po--ajz się mieszaniu w tzmpiz, wynoszącym mię-zy około 400 i około 800 obrotów na minutę. Poziom rozpuszczonego tlenu, wynoszący co najmniej około 10% nasycenia, uzyskuje się przez napowietrzanie ła-unku przy mię-zy około 0,2 i około 1,0 vvm i utrzymywanie ciśnienia w głównej przestrzeni biorzaktora między około ciśnieniem atmosferycznym i około 100 KPa n7-ciśnizni7, najkorzystniej około 70 KPa nadciśnienia. Tempo mieszania można także zwiększać wz-ług potrzeby, aby utrzymać minimum poziomu rozpuszczonego tlenu. Korzystnie, rozpuszczony tlen utrzymuje się -obrzz ponad około 10%, w rzeczywistości az około 50% w celu pobudzenia konwersji substratu. Utrzymywanie pH w zakresie 5,5 ± 0,2 jest także optymalne dla biokonwersji. Pienienie kontroluje się wz-ług potrzeby przez -odaniz zwykłego środka zapobiegającego pienieniu. Po dodaniu całego substratu reakcję korzystnie kontynuuje się aż -o uzyskania stosunku molowego produktu o wzorze VIII -o pozostałego nie p-zz-zagowαnzgo substratu o wzorze XIII, wynoszącego co najmniej około 9 do 1. Taką konwersję można uzyskać w ciągu 80-160 godzin cyklu fermentacyjnego zaznaczonego powyżej.
O-kryto, że wysokie przemiany wiążą się z wyczerpaniem początkowego poziomu odzywki poniżej początkowego poziomu załadunku i przez kontrolę tempa napowietrzania oraz tzmpa mieszania w celu uniknięcia wylania się substratu poza płynny bulion. W sposobie według fig. 1 poziom o-zywki wyczerpał się, a potem utrzymywał na poziomie niz większym od około 60%, korzystnie około 50% początkowego poziomu załadunku; podczas g-y w sposobach według fig. 2 i 3 poziom o-żywki zmniejszył się i utrzymywał na poziomiz niz większym o- około 80%, korzystnie około 70% początkowego poziomu załadunku. Tempo napowietrzania wynosi korzystnie niz więcej niz jeden wm, korzystniej w o7krzsiz około 0,5 wm; podczas gdy tempo mieszania wynosi korzystnie niz więcej niz 600 obrotów na minutę.
Szczególnie zalecany sposób wytwarzania związku o wzo-zz VIII zilustrowano w fig. 2. Zalecanym drobnoustrojem -la 11a-hy-roksylacji związku o wzorze XIII (np. kanrznonu) jest Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500). W tym sposobie, pożywka wzrostowa korzystnie obejmuje mię-zy około 0,5% i około 5% wagowo płyn z umaczania kukurydzy, między około 0,5% i około 5% wagowo glukozę, między około 0,1% i około 3% wagowo ekstrakt --ozdoowy i między około 0,05% i około 0,5% wagowo fosforan amonu. Jz-nakże, można także stosować inne p-odukcyjnz pożywki wzrostowe, jakie opisano w niniejszym. Kulturę posiewową wytwarza się zasadniczo w sposób opisany w sposobie wz-ług fig. 1, przy użyciu każ-ej z posiewowych pożywek fermentacyjnych opisanych w niniejszym. Zawiesinę kanrznonu niz p-zzpuszczonzgo przez -ooarabniace mikrocoąstzcokowy lub innego substratu
189 459 o wzorze XIII w pożywce wzrostowej, wytwarza się aseptycznie w blenderoe, korzystnie przy stosunkowo wysokim stężeniu, wynoszącym między około 10% i około 30% wagowych substratu. Korzystnie, aseptyczne wytwarzanie może obejmować wyjaławianie lub pasteryzację zawiesiny po mieszaniu. Całą ilość jałowej zawiesiny substratu wymaganą dla wsadu produkcyjnego wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego na początku wsadu lub przez okresowe karmienie łańcuchowe. Wielkość cząstek subst^tu zmniejsza się przez mielenie na mokro w pompie ścinającej włączonej w linię, która przenosi zawiesinę do bioreaktora produkcyjnego, wyjaśniając potrzebę użycia roodrabni4co4 mikrocząsteczkowego wyłączonego z linii. Jeśli warunki aseptyczne uzyskuje się raczej przez pasteryzację niż wyjaławianie, rozmiar aglomeracji może być nie znaczący, lecz stosowanie pompy ścinającej może być pożądane w celu zapewnienia dodatniej kontroli wielkości cząstek. Jałową pożywkę wzrostową i roztwór glukozy wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego zasadniczo w taki sam sposób, jak opisano powyżej. Wszystkie składniki pożywki do bioreaktora produkcyjnego wyjaławia się przed wprowadzeniem tak, że antybiotyki nie są potrzebne.
Korzystnie, w operacji sposobu według fig. 2, szczep wprowadza się do bioreaktora produkcyjnego w proporcji, wynoszącej między około 0,5% i około 7%, temperatura fermentacji wynosi między około 20°C i około 37°C, korzystnie między około 24°C i około 28°C, a pH kontroluje się w zakresie między około 5,3 i około 5,5 np. przez wprowadzenie gazowego amoniaku, wodnego roztworu wodorotlenku amonu, wodnego roztworu wodorotlenku metalu alkalicznego lub kwasu ortofosforowego. Tak jak w sposobie według fig. 1, temperaturę obniża się korzystnie w celu kontrolowania PMW, tak aby nie przekraczała 55-60%. Początkowy załadunek glukozy wynosi korzystnie między około 1% i około 4% wagowo, najkorzystniej 2,5% do 3,5 wagowych, lecz korzystnie pozwala się na opadnięcie poniżej około 1,0% wagowych podczas fermentacji. Dodatkową glukozę dodaje się okresowo w porcjach, wynoszących między około 0,2% i 1,0% wagowych na podstawie całego ładunku tak, aby utrzymać stężenie glukozy w strefie fermentacji w o4kreeie między około 0,1% i około 1,5% wagowych, korzystnie między około 0,25% i około 0,5% wagowych. Ewentualnie, można uzupełniać źródła azotu i fosforu razem z glukozą. Jednakże, ponieważ cały o4łaaunek kanrenonu wykonuje się na początku cyklu fermentacyjnego, w tym czasie można wprowadzić także pozostałe uzupełnienie odżywkami, niosącymi azot i fosfor, co pozwala na stosowanie dokarmiania roztworem glukozy tylko podczas reakcji. Tempo i charakter mieszania jest w znacznej mierze zmienny. Średnio energiczne mieszanie pobudza przenoszenie masy między stałym s^s^atem i fazą wodną. Jednakże, powinno się stosować wirnik niskoobrotowy, w celu zapobieżenia rozkładowi mieliny drobnoustrojów. Optymalna prędkość mieszania zmienia się w zakresie wynoszącym 200 do 800 obrotów na minutę, w zalezności od lepkości bulionu hodowlanego, stężenia tlenu i warunków mieszania jak wpływ naczynia, przegroda i konfiguracja wirnika. Zwykle, zalecane tempo mieszania wchodzi w zakres 350-600 obrotów na minutę. Korzystnie wirnik mieszający zapewnia funkcję pompowania osiowo w dół tak, aby sprzyjać dobremu mieszaniu fermentowanej biomasy. Masę korzystnie napowietrza się w tempie wynoszącym między około 0,3 i około 1,0 vvm, korzystnie 0,4 do 0,8 vvm, a ciśnienie w głównej przestrzeni bioreaktora wynosi korzystnie między około 50 i około 100 kPa nadciśnienia. Temperaturę, mieszanie, napowietrzanie i ciśnienie wsteczne kontroluje się korzystnie w celu utrzymania rozpuszczonego tlenu na poziomie co najmniej około 10% objętościowych podczas biokonwersji. Cykl całej masy trwa zwykle między około 100 i około 140 godzin.
Mimo, ze zasada operacji dla sposobu według fig. 2 opiera się o wczesne wprowadzenie zasadniczo całości załadunku kanrenonu, zrozumiałym będzie, ze wzrost bulionu fermentacyjnego można przeprowadzać przed załadunkiem masy kanrenonu. Ewentualnie, część porcji kanrenonu można także dodać do masy później. Jednak generalnie, co najmniej około 75% jałowego kanrenonu powinno się wprowadzić do bioreaktora transformacyjnego w ciągu 48 godzin po zapoczątkowaniu fermentacji. Ponadto, pożądane jest wprowadzenie co najmniej około 25% wagowych kanrenonu na początku fermentacji albo co najmniej w ciągu pierwszych 24 godzin, w celu pobudzenia tworzenia się enzymu(ów) biokonwersji.
W dalszym zalecanym sposobie jaki zilustrowano na fig. 3, całość ładunku fermentacyjnego i roztworu odżywczego wyjaławia się w naczyniu do fermentacji produkcyjnej przed
189 459 wprowadzeniem szczepu. Roztwory odżywcze, które można stosować, jak również preferencje wśród nich są zasadniczo takie same jak w sposobie według fig. 2. W tej postaci realizacji wynalazku działanie ścinające wirnika mieszającego rozbija aglomeraty substratu, które z drugiej strony mają tendencję do tworzenia się w czasie wyjaławiania. Stwierdzono, ze reakcja zachodzi z powodzeniem jeśli średnia wielkość cząstek kanrenonu wynosi mniej niz 300 μ i co najmniej 15% wagowych cząstek jest mniejszych niż 240 μ. Stosowanie odpowiedniego wirnika, np. wirnika z turbiną talerzową, przy odpowiedniej prędkości w zakresie 200 do 800 obrotów na minutę, przy prędkości szczytowej, wynoszącej co najmniej 400 cm/sekundę, jak odkryto, zapewnia współczynnik ścinania wystarczający do utrzymania takiej charakterystyki wielkości cząstek mimo tendencji do aglomeracji, występującej w czasie wyjaławiania wewnątrz bioreaktora produkcyjnego. Pozostałe operacje sposobu według fig. 3 są zasadniczo takie same jak w sposobie według fig. 2. Sposoby według fig. 2 i 4 oferują kilka różnych korzyści w stosunku do sposobu według fig. 1. Szczególną korzyścią jest odpowiedzialność wobec stosowania bazy odzywczej o niskich kosztach, takiej jak płyn z namaczania kukurydzy. Ale dalsze korzyści realizuje się poprzez eliminację potrzeby antybiotyków, uproszczenie procedur dokarmiania i pozwalanie na masowe wyjaławianie kanrenonu lub innego substratu o wzorze XIII. Inną szczególną korzyścią jest możliwość stosowania raczej prostego roztworu glukozy niz kompleksowego roztworu odżywczego do uzupełniania w czasie cyklu reakcyjnego.
W sposobach opisanych w fig. 1 do 3, produkt o wzorze VIII jest krystalicznym ciałem stałym, które razem z biomasą można oddzielić od bulionu reakcyjnego przez filtrację lub wirowanie z niską prędkością. Alternatywnie, produkt można ekstrahować z całości bulionu reakcyjnego rozpuszczalnikami organicznymi. Produkt o wzorze VIII odzyskuje się przez ekstrakcję rozpuszczalnikami. W celu maksymalnego odzysku, zarówno przesącz fazy ciekłej jak i filtr biomasy lub placek z wirówki traktuje się rozpuszczalnikiem do ekstrakcji, lecz zwykle > 95% produktu wiąże się z biomasą. Zazwyczaj do ekstrakcji można stosować rozpuszczalniki estru węglowodoru, chlorowanego węglowodoru i ketonowe. Zalecanym rozpuszczalnikiem jest octan etylu. Inne, zwykle odpowiednie rozpuszczalniki obejmują toluen i keton metyloizobutylowy. Do ekstrakcji z fazy ciekłej, dogodne będzie użycie objętości rozpuszczalnika w przybliżeniu równej objętości roztworu reakcyjnego, z którą się styka. Aby odzyskać produkt z biomasy, tę ostatnią zawiesza się w rozpuszczalniku, korzystnie w wielkim nadmiarze w stosunku do początkowego ładunku substratu, np. 50 do 100 ml rozpuszczalnika na gram początkowego ładunku kanrenonu i uzyskaną zawiesinę korzystnie ogrzewa się w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez okres około 20 minut do kilku godzin, w celu zapewnienia przeniesienia produktu do fazy rozpuszczalnika z zagłębień i porów biomasy. Następnie, biomasę usuwa się przez filtrację lub wirowanie i placek filtracyjny korzystnie przemywa się zarówno świeżym rozpuszczalnikiem, jak wodą dejonizowaną. Produkt przemycia wodą i rozpuszczalnikiem łączy się potem i fazy pozostawia do rozdzielenia. Produkt o wzorze VIII odzyskuje się przez krystalizację z roztworu. Aby zmaksymalizować wydajność, grzybnię styka się dwukrotnie ze świeżym rozpuszczalnikiem. Po osadzeniu w celu zakończenia rozdzielania fazy wodnej, produkt odzyskuje się z fazy rozpuszczalnika. Najkorzystniej, rozpuszczalnik usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem do rozpoczęcia krystalizacji, następnie zatęzony ekstrakt chłodzi do temperatury około 0° do około 20°C, korzystnie około 10° do około 15°C przez okres czasu wystarczający do wytrącenia kryształów i wzrost, zwykle około 8 do około 12 godzin.
Sposoby według fig. 2, a zwłaszcza według fig. 3 zaleca się szczególnie. Sposoby te działają przy niskiej lepkości i są odpowiedzialne za ścisłą kontrolę parametrów procesu, takich jak pH, temperatura i rozpuszczony tlen. Ponadto, jałowe warunki łatwo jest zabezpieczyć bez uciekania się do antybiotyków.
Proces biokonwersji jest egzotermiczny tak, ze ciepło powinno się usuwać przy użyciu bioreaktora z płaszczem lub osłoną chłodzącą wewnątrz bioreaktora produkcyjnego. Alternatywnie, bulion reakcyjny może krążyć przez zewnętrzny wymiennik ciepła. Rozpuszczony tlen utrzymuje się korzystnie na poziomie co najmniej około 5%, korzystnie co najmniej około 10% objętościowych, wystarczających do zapewnienia energii dla reakcji i zapewnienia przemiany glukozy w CO2 i H2O, przez regulację tempa wprowadzania powietrza do reaktora
100
189 459 w oapowieaoi na pomiar potencjalnego tlenu w bulionie. pH kontroluje się korzystnie w zakresie między około 4,5 i około 6,5.
W każdym z alternatywnych sposobów dla 11-hyarok.sylacji substratu o wzorze XIII, produktywność ograniczana jest przez transfer masy ze stałego substratu na fazę wodną lub powierzchnię stykania się faz, gdzie, jak wiadomo zachodzi reakcja. Jak zaznaczono powyżej, produktywność nie jest zasadniczo ograniczona przez tempo p-oeaizsizaia masy, tak długo jak średnią wielkość cząstek substratu zmniejsza się do mniej niż około 300 μ i co najmniej 75% wagowych cząstek jest mniejszych niż 240 μ.
Jednakże produktywność tych procesów można dodatkowo wzmocnić w pewnych alternatywnych postaciach realizacji, które zapewniają zasadniczy załadunek kamenonu lub innego substratu o wzorze XIII do bioreaktora produkcyjnego w rozpuszczalniku organicznym. Zgodnie z jedną opcją, substrat rozpuszcza się w rozpuszczalniku nie mieszającym się z wodą i miesza ze szczepem w wodnej pożywce wzrostowej oraz środkiem powierzchniowo czynnym.
Uzyteczne rozpuszczalniki nie mieszające się z wodą obejmują np. DMF, DMSO, kwasy tłuszczowe C6-C12, n-alkany C6-C12, oleje roślinne, sorbitany i wodne roztwory środków powierzchniowo czynnych. Mieszanie tego ładunku tworzy układ reakcyjny emulsji, mający poszerzony obszar styku faz dla transferu masy substratu z ciekłej fazy organicznej do miejsc reakcji.
Druga opcja dotyczy początkowego rozpuszczenia substratu w rozpuszczalniku, mieszającym się z wodą, takim jak aceton, keton metyloetylowy, metanol, etanol lub glicerol w stężeniu zasadniczo większym niz. rozpuszczalność w wodzie.
Przez wytworzenie początkowego roztworu substratu przy podwyższonej temperaturze rozpuszczalność zwiększa się zwiększając przez to dalej ilość substratu w postaci roztworu wprowadzanego do reaktora i niezwykle wzmagając ciężar ładunku reaktora.
Ciepły roztwór substratu ładuje się do produkcyjnego reaktora fermentacyjnego razem ze stosunkowo chłodnym ładunkiem wodnym, zawierającym pożywkę wzrostową i szczepionkę.
Gdy roztwór substratu miesza się z wodną pożywką, występuje wytrącanie się substratu. Jednakże w warunkach zasadniczego nadnasycenia i średnio energicznego mieszania, sprzyja to raczej tworzeniu się zarodków kryształów niż ich wzrostowi i tworzą się bardzo drobne cząstki na dużym obszarze powierzchni.
Duży obszar powierzchni pobudza przenoszenie masy między fazą ciekłą a stałym substratem. Ponadto, stężenie równowagi substratu w ciekłej fazie wodnej wzmacnia się także w obecności rozpuszczalnika mieszającego się z wodą.
W związku z tym podnosi się produktywność. Mimo, że drobnoustroje niekoniecznie tolerują wysokie stężenie etanolu, np. w zakresie, wynoszącym około 3% do około 5% wagowych, można go stosować według potrzeby.
Trzecia opcja dotyczy rozpuszczenia substratu w wodnym roztworze cyklodekstryny. Przykładowe cyklodekstryny obejmują hyd-oksypropylo-β-cyklodekstryaę i metylo-e-cyklodekstrynę. Stosunek molowy substrat : cyklodekstryna może wynosić około 1:0,5 do około 1:1,5, korzystniej około 1:0,8 do około 1:1. Mieszaninę substrat : cyklodekstryna można dodawać aseptycoaie do reaktora biokonwersji.
11a-Hyaroksykaa2enon i inne produkty procesu 11α-hyd2oksylacji (wzory VIII i VIIIA) są nowymi związkami, które można wyodrębniać przez filtrację środowiska reakcyjnego i ekstrahowanie produktu z biomasy zebranej na środowisku filtracji.
Konwencjonalne rozpuszczalniki organiczne, np. octan etylu, aceton, toluen, chlorowane węglowodory i keton metyloizobutylowy można stosować do ekstrakcji. Produkt o wzorze VIII można potem rek-ystalioować z rozpuszczalnika organicznego tego samego typu. Związki o wzorze VIII mają zasadniczą wartość jako pośrednie do wytwarzania związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA.
Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-Boznaczają grupę -CHR-CHR-, R3 oznacza atom wodoru, niższa grupę alkilową lub nizszą alkoksy, a R8i R9 razem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:
189 459
101
XXXIII.
Dalej, zgodnie ze epoeobem we-ług echematu 1, związek o wzorze VIII poddaje eię reakcji w warunkach alkalicznych ze źródłem jonu cyjankowego, w celu wytworzenia związku dntmiaouego o wzorze VII
gdzie -A-A-, -B-B-, R3, r8 i r9 eą takie jak określono powyżej. Jeśli uubslhat appgwtada związkowi VIIIA. produkt ma wzór ViIA
VIIA
T ł 9 2 gdzie -A-A-, -B-B-, R , Y , Y i X eą takie jak określono we wzorze KIIIA. Korzyetnie R oznacza atom wo-oru.
Cyjanowanie eubetratu 11α-hydrokeyloudgo o wzorze VIII można przeprowadzać przez jego reakcję ze źródłem jonu cyjankowego, takim jak ketoao-oyjaaohy-ryna. najkoroyetaiej aodtoao-cyjaaohyaryna, w obecności zaea-y i eoli metalu alkalicznego, aajkoroyetnidj LiCl. Alternatywnie, cyjanowanie można uzyekać bez cyjanohydryny przez użycie cyjanku metalu alkalicznego w obecności kwaeu.
102
189 459
W p-oczsiz ketono-c-yjanohydryny, reakcję p-owadzi się w roztworze, korzystnie p-zy użyciu ap-otycenzgo rozpuszczalnika polarnego, takiego jak dimetyloformamid lub sulfotlznzk -imztylu. Tworzenie się znaminy wymaga co najmniej -wóch moli źródła jonu cyjankowego na mol substratu, a korzystnie stosuje się lekki nadmiar źródła jonu cyjankowego. Zasadą jest korzystnie zasa-a azotowa, taka jak -i7lkiloamlna, trialkiloamina, alkano^a-mina, pi-ydyna lub inne Jednakże, zasady nieorganiczne, takie jak węglany metali alkalicznych lub wodorotlenki metali alkalicznych takżz można stosować. Korzystnie, substrat o wzorze VIII jest początkowo obecny w proporcji, wynoszącej około 20 i około 50% wagowych, a zasada jest obecna w proporcji, wynoszącej około 0,5 -o -wóch równoważników na równoważnik substratu. Temperatura reakcji niz jest krytyczna, lzcz produktywność wzmaga się przez operację przy temperaturze podwyższonej. Tak więc, np. jeśli stosuje się Metyloaminę jako zasadę, reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze w zakresie około 80°C do około 90°C. Przy takiej temperaturze reakcja postępuje do zakończenia w ciągu około 5 -o około 20 go-zin. Jeśli stosuje się diieopropyloaminę jako zasadę i reakcję prow7-oi w temperaturze 105°C, reakcja kończy się w ciągu 8 godzin. Przy końcu okresu reakcji, rozpuszczalnik usuwa się po- zmniejszonym ciśnieniem i pozostały olej rozpuszcza w wo-ziz i zobojętnia do pH 7 rozcieńczonym kwasem, korzystnie chlorowodorowym. Pro-ukt wytrąca się z tego roztworu i następnie przemywa się go wodą destylowaną i suszy na powietrzu. Uwolniony HCN można odpędzać obojętnym gazem i gasić w zasadowym roztworze. Wysuszony osa- o-bizra się w chloroformie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku, następnie ekstrahuje stężonym kwasem, np. 6N HCl. Ekstrakt zobojętnia się -o pH 7 przez dodanie zasady nieorganicznej, korzystnie wodorotlenku metalu alkalicznego i chłodzi -o temperatury w zakresie 0°C. Otrzymany osad przemywa się i suszy, potem rzkrystalizujz z odpowiedniego rozpuszczalnika, np. acetonu, w celu wytworzenia pro-uktu o wzorze VII odpowiedniego do użytku w następnym etapie procesu.
Alternatywnie, reakcję można prowadzić w układzie rozpuszczalników wo-nych, obejmującym rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak metanol lub w dwufazowym układzie, zawierającym wodę i rozpuszczalnik organiczny, taki jak octan etylu. W tej alternatywie, produkt można odzyskiwać przez rozcieńczenie roztworu reakcyjnego wodą i potem ekstrakcję produktu przy użyciu rozpuszczalnika organicznego, takiego jak chlorek metylenu lub chlorofo-m, a potem ponownie ekstrakcję z ekstraktu organicznego przy użyciu stężonego kwasu mineralnego, np. 2N Cl; patrz opis patentowy nr 3 200 113.
Zgo-niz z jeszcze inną alternatywą, reakcję można prowadzić w rozpuszczalniku mieszającym się z wo-ą, takim jak dimetyloformamid, -imztyloaoztami-, N-mztylopiroliaon lub sulfotlznzk -imztylu, po której roztwór produktu reakcji rozcieńcza się wo-ą i czym zasadowym, np. przez -odaniz węglanu metalu alkalicznego, potem chło-zi -o temperatury 0°C -o ’0°C, powodując przez to wytrącenie się produktu. Korzystnie, ukła- gasi się podhalogeninzm mztalu alkalicznego lub innym odczynnikiem skutecznym -o zapobiegania tworzenia się cyjanku. Po przesączeniu i przemyciu wodą, wytrącony osad jest o-powiz-ni -o użycia w następnym etapie procesu.
Zgodnie z jeszcze dalszą alternatywą, produkt znaminowy o wzorze VII można wytworzyć przez reakcję substratu o wzorze VIII w obecności źró-ła protonów, z n7-mirrzm cyjanku metalu alkalicznego, korzystnie NaCN, w rozpuszczalniku wo-nym, zawierającym aprotyczny polarny rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak dimetyloformamid lub -imetyloacztami-. Źródło protonów jest korzystnie kwaszm mineralnym lub C’ do C5 kwasem karboksylowym, przy czym szczególnie zaleca się kwas siarkowy. Wyjątkowo, niz potrzeba -odawać oddzielnego źró-ła protonów, jeśli odczynnikiem cyjanowania jest han-lowy LiCN w DMF. Źródło jonu cyjankowego, takiego jak sól mztalu alkalicznego, ła-ujz się korzystnie -o reaktora w proporcji, wynoszącej około 2,05 -o około 5 równoważników molowych na równoważnik substratu. Uważa się, ze kwas mineralny lub inne źródło protonów pobudza -odmie HCN poprzez 4,5 i 6,7 wiązania podwójne i jest korzystnie obecny w proporcji, wynoszącej co najmniej jeden równoważnik molowy na mol równoważnika substratu; lzcz ukła- reakcyjny powinien pozostawać zasadowy przez utrzymanie nadmia-u cyjanku mztalu alkalicznego wobec obecnego kwasu. Reakcję przeprowadza się korzystnie w temperaturze co najmniej około 75°C, zwykle 60°C do 100°C, przez okrzs o- 1 do około 8 godzin, korzystnie około 1,5 -o około 3 godzin. P-zy końcu okrzsu reakcyjnego, mieszaninę reakcyjną chłodzi się, korzystnie do temperatury
189 459
103 pokojowej; i produkt, będący enaminą wytrąca się przez zakwaszenie mieszaniny reakcyjnej i mieszanie z zimną wodą, korzystnie o temperaturze bliskiej temperatury łaźni lodowej. Uważa się, ze zakwaszenie zamyka 17-lakton, który ma tendencje do otwierania w warunkach zasadowych, przeważających przy cyjanowaniu. Mieszaninę reakcyjną zakwasza się dogodnie przy użyciu tego samego kwasu, jaki jest obecny podczas reakcji, korzystnie kwasu siarkowego. Korzystnie dodaje się wodę w urouoścji, wynoszącej między około 10 i około 50 równoważników molowych na mol produktu.
Związki o wzorze VII są związkami nowymi i mają zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-, R3 oznacza atom woópśu, niższa grupę alkilową lub niższą alkoksy, a R8 i R9 razem stanowią pierścień 20lspiśoksanowy':
XXXIII.
Najkorzystniej, związek o wzorze VII oznacza 5'R(5'a),7'β-20'-amimoheksaóekahydrOl 1Γβlhyóroksyl10'α,13'α-dimetylOl3',5-óioksospπΌ[furan-2(3H),17'α(5Ή)-[7,4]metemo[4H]l lcyklouenta[a] fenantreno] -5'lkarbonitśyl.
W przemianie związku o wzorze VIII w enaminę o wzorze VII pochodną 7-cyjanową związku o wzorze VIII obserwowano przez chromatografię w surowym produkcie. Założono, ze związek 7-cwjamowy jest pośrednim w procesie przemiany'. Zakłada się dalej, ze związek pośredni 7-cyjanowy sam reaguje tworząc drugi związek uośśeóni. pochodną 5,7-cyjanową związku o wzorze VIII, który odwrotnie reaguje tworząc enester. Patrz np. R. Christiansen i m., The Reaction of Steroidal 4.6lDienl3lOmes With Cwamide, SteroWs, tom 1, czerwiec 1963, który załącza się w niniejszym jako odniesienie. Te nowe związki mają także zastosowanie jako markery chromatograficzne, jak również są syntetycznymi związkami pośrednimi. W zalecanej postaci realizacji tego etapu całości schematu 1 procesu syntezy, te związki pośrednie to kwas 7αlCyjano-11α,17-óihyóroksy-3-okso-17αlUregm-4-emd-21-dikarboksylowy. /--akton i kwas α, l7-dihydśoksy-3-okso-17α-uregmano-21 óikarboksylooy', γ-ΗΛίοη.
W następnym etapie schematu 1 syntezy, enamina o wzorze Vń ulega hydrolizie w celu wytworzenia związku kiketuoo4vego o wzorze VI
o
VI gdzie -AlAl. -B-B-, R3, R8 i r9 są takie jak określono we wzorze XIII. Do hydrolizy można stosować każdy wodny kwas organiczny lub mineralny. Zaleca się kwas chlorowodorowy. Aby wzmóc produktywność, korzystnie stosuje się rozpuszczalnik mieszający się z wodą, taki jak óimetyloacetamió lub nizszy alkanol, jako równoczesny rozpuszczalnik. Korzystniej, rozpuszczalnikiem jest dimetwloacetamió. Kwas powinien być obecny w proporcji co najmniej
104
189 459 jednego równoważnika na równoważnik subst^tu o wzorze VII. W układzie wodnym enaminowy substrat o wzorze VII można zasadniczo przekształcić w diketon o wzorze VI, w okresie około 5 godzin, w temperaturze około 80°C. Operacja przy podwyższonej temperaturze zwiększa produktywność, lecz temperatura nie jest krytyczna. Odpowiednie temperatury wybiera się na podstawie lotności układu rozpuszczalnika i kwasu.
Korzystnie, enaminowy substrat o wzorze VII odpowiada wzorowi VIIA
VIIA a produkt diketonowy odpowiada wzorowi VIA
VIA z których każdy -A-A-, -B-B-, r3, Y1, Y2 i X są takie jak określono we wzorze XIIIA. Korzystnie r3 oznacza atom wodoru.
Przy końcu okresu reakcyjnego, roztwór chłodzi się do temperatury między około 0°C do około 25°C w celu krystalizacji produktu. Kryształy produktu można rekrystalizować z odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak izopropanol lub metanol w celu wytworzenia produktu o wzorze VI odpowiedniego do użytku w następnym etapie procesu; lecz rekrystalizacja nie jest zwykle konieczna. Produkty o wzorze VI są związkami nowymi, które mają zasadniczą wartość w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie związki o wzorze VIII odpowiadają wzorowi VIIIA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-, R3 oznacza atom wodoru, nizszą grupę alkilową lub nizszą alkoksy, a R 1 R9 razem stanowią pierścień 20-spiroksanowy:
XXXIII.
189 459
105
Nąjkorzyetniej, związek o wzorze VI jeet 4'S(4'α),7'α-hdkeaddkahydro-lΙ'α-hydrokey-10'βlC'β--imetylo-C',5,20'-triokeoepiro[furaa-2(CH).17'β-4,7]mdtano[17H]oyklopenta[a]feaąatrdao] -5' (3(2 ,H)karbonitrylem.
W ezczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, daąmiaouy produkt o wzorze VII wytwarza eię ze związku o wzorze VIII w epoeóU opieany powyżej i proekeztałcą in situ w -iketon o wzorze VI. W tej poetaci realizacji wynalazku, eubetrat o wzorze VIII poddaje eię reakcji z aą-miąrem cyjanku metalu alkalicznego w rozpuszczalniku wo-nym, zawierającym źró-ło protonów lub ewentualnie na-miarem ketonocyjanohydryny w obecności zaeady i LiCl, jak opieano powyżej. Jednakże, zamiąet chło-zenia mieeoąniny reakcyjnej, zakwaszenie i -o-anie wody w proporcjach obliczonych dla epouodouąnią wytrącenia enaminy, ząea-niozo, korzyetnie omija chłodzenie midezaainy reakcyjnej. Ząmiąet tego, do mieezaniny reakcyjnej dodaje eię wodę i kuae, korzyetnie kwae mineralny, taki jak eiąrkowy, przy końcu reakcji cyjanowania. Proporcja dodanego kwasu jeet uyetąrcząjąoa do zobojętnienia nadmiaru cyjanku metalu alkalicznego, który zwykle wymaga uprouądzeaią co najmniej jednego równoważnika molowego na mol eubetratu o wzorze VIII, korzyetnie między około 2 i około 5 moli równoważników na równoważnik eubetratu. Jednakże, utrzymuje eię wyetarczająco wyeoką temperaturę i wyetarczająco wyeokie rozcieńczenie aby unikać oąea-niczego wytrącania, a hy-rolizę enaminy -o diketonu pozoetawia eię -o poetępowania w fazie ciekłej. Tak więc, proces przebiega z minimum przerwań i z wyeoką produktywnością. Hydrolizę prowadzi eię korzyetnie w temperaturze co najmniej 80°C, korzystnie w oakreeid, wynoezącym około 90°C -o około 100°C, przez okree zwykle wynoszący około 2 do około 5 godzin. Naetępnie mieeztaiaę reakcyjną chłodzi eię, korzyetnie -o temperatury, wynoezącej mię-zy około 0°C i około 15°C, koroyetnid w łaźni lodowej -o około 5°C -o około 10°C, w celu wytrącenia -iketonowego produktu o wzorze VI. Stały produkt można o-zyekiuąć, np. przez filtrację, a zanieezozyezczenią zmniejeza eię przez przemycie wo-ą.
W następnym etapie schematu 1 eyntezy, związek -iketonowy o wzorze VI poddaje eię reakcji z alkoholanem metalu w celu otworzenia mostka ketonowego między pozycjami 4 i 7 poprzez rozezcoepidaie wiązania między grupą karbonylową i atomem węgla w pozycji 4, ttwo-zdaia α-zorleatouąaej grupy ąlkokeyktrUoaylouej w pozycji 7 i ueunięcia cyjanku przy atomie węgla w pozycji 5. Produkt tej reakcji jeet związkiem hyarokeyeetrouym. odpouia-ąjącym wzorowi V
V g-zie -A-A-A, -B-B-, RC, r8 i r9 eą takie jak określono we wzorze XIII i R1 oznacza nizezą grupę alkokeykarbonylową lub hy-rokeykarUonylou·ą. Alkoholan metalu etoeouany w reakcji o-poula-ą wzorowi RWOM g-zie M jeet metalem alkalicznym i r1°O- odpowiada grupie alkokey R1 Wydajności tej reakcji eą w większości zadowalające jeśli alkoholanem metalu jeet metanolan potaeu lub metanolan eo-u, lecz można etoeować inne nizeze alkoholany Alkoholan potaeu zaleca eię ezczdgólaie. Fenolany, inne ąryloąlkoholąny można także etoeować. jak również aryloeiarczki. Reakcję -ogo-nie przdprouą-zą eię w obecności alkoholu, o-pouiaaająodgo wzorowi RWOH gdzie R™ jeet takie jak określono powyżej. Można etoeowąć inne konwencjonalne rozptezooąlaiki. Koroyetnie. s^etrat o wzorze VI jeet obecny w propor106
189 459 cji, wynoszącej między około 2% i około 12% wagowych, korzystniej co najmniej około 6% wagowych. Korzystnie, RWOM jest obecny w proporcji, wynoszącej między około 0,5 i około 4 moli na mol substratu, korzystniej między około 1 i około 2 molami na mol substratu, a jeszcze korzystniej około 1,6 mola na mol substratu. Temperatura nie jest krytyczna, lecz podwyższenie temperatury wzmaga produktywność. Czas reakcji wynosi zwykle około 4 i około 24 godzin, korzystnie około 4 do około 16 godzin. Dogodnie, reakcję prowadzi się temperaturze wrzenia pod ciśnieniem atmosferycznym w zalezności od użytego rozpuszczalnika.
Czas wymagany dla reakcji w celu osiągnięcia równowagi zależy od ilości alkoholanu dodanego do mieszaniny reakcyjnej i sposobu w jaki dodaje się alkoholan. Alkoholan można dodawać w pojedynczej porcji lub w wielu porcjach, albo można go dodawać w sposób ciągły. Jeśli alkoholan dodaje się w wielu porcjach, korzystne jest dodanie około 1,6 równoważnika metanolanu sodu w dwóch etapach. W tym dwuetapowym dodaniu, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się początkowo 1 równoważnik metanolanu potasu, po czym 0,6 równoważnika metanolanu potasu około 90 minut później. Ten dwuetapowy sposób dodawania skraca czas osiągnięcia równowagi w stosunku do dodania w pojedynczej porcji 1,6 równoważnika metanolanu potasu.
Ponieważ równowaga jest korzystniejsza dla wytwarzania hydroksyestru o niskim stężeniu diketonu, reakcja przebiega korzystnie raczej przy wysokim rozcieńczeniu, np. 40:1 dla reakcji z metanolanem sodu. Odkryto, że znacznie wyzszą produktywność można zrealizować przez użycie metanolanu potasu niz metanolanu sodu, ponieważ rozcieńczenie w zakresie 20:1 jest generalnie wystarczające dla minimalizacji rozmiaru odwrotnego cyjanowania, jeśli odczynnikiem jest metanolan potasu.
Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono dalej, ze reakcję odwrotnego cyjanowania można zahamować przez wzięcie odpowiedniego odczynnika chemicznego lub miar fizycznych w celu usunięcia pobocznego produktu jonu cyjankowego ze strefy reakcyjnej. Tak więc, w dalszej postaci realizacji wynalazku reakcję diketonu z alkoholanem metalu alkalicznego, można prowadzić w obecności czynnika strącającego dla jonu cyjankowego, takiego jak np. soli, zawierającej kation, który tworzy nierozpuszczalny związek cyjankowy. Takimi solami mogą być np. jodek cynku, siarczan zelazowy lub zasadniczo każdy halogenek, siarczan lub inna sól ziem alkalicznych lub metal przejściowy, który jest bardziej rozpuszczalny niz odpowiadający cyjanek. Jeśli jodek cynku jest obecny w proporcjach w zakresie około jednego równoważnika na równoważnik substratu diketonowego, zaobserwowano, ze produktywność reakcji zwiększa się znacznie w porównaniu z procesem prowadzonym przy nieobecności halogenku metalu alkalicznego.
Nawet jeśli czynnik strącający stosuje się do usunięcia jonu cyjankowego, pozostaje korzystnym przebieg przy dość wysokim rozcieńczeniu, lecz przez stosowanie czynnika strącającego, stosunek molowy rozpuszczalnika do substratu diketonowego można zmniejszyć znacznie w porównaniu z reakcjami przy nieobecności takiego czynnika. Odzyskanie hydroksyestru o wzorze V można przeprowadzić albo zgodnie z procedurami ekstrakcji lub bez ekstrakcji, opisanymi poniżej.
Równowagę reakcji można także kontrolować pod względem wytwarzania hydroksyestru o wzorze V przez usuwanie tego hydroksyestru z mieszaniny reakcyjnej, po jego syntezie. Usuwanie hydroksyestru może postępować albo etapami, albo w sposób ciągły, środkami takimi jak filtracja. Usuwanie hydroksyestru można stosować do kontroli równowagi albo pojedynczo albo w połączeniu z chemicznym lub fizycznym usuwaniem cyjanku z mieszaniny reakcyjnej. Ogrzewanie otrzymanego przesączu kieruje potem równowagą reakcji pod względem przemiany pozostającego diketonu o wzorze VI w hydroksyester o wzorze V.
W przemianie diketonu o wzorze VI w hydroksyester o wzorze V, 5-cyjanohydroksyester, obserwowano w surowym produkcie w małych ilościach, zwykle mniejszych niz około 5% wagowych. Zakłada się, ze ten 5-cyjanohydroksyester jest pośrednim związkiem równowagi między diketonem o wzorze VI i hydroksyestrem o wzorze V. Zakłada się dalej, ze ten pośredni związek równowagi tworzy się z diketonu przez atak metanolanu na grupę 5,7-okso i protonowanie enolanu oraz z hydroksyestru przez addycję Michaela produktu ubocznego jonu cyjankowego wobec grupy funkcyjnej 3-keto-A4’5 hydroksyestru.
189 459
107
Oprócz 5scyjano-0-kwass i 10-alkoholanu hya-oksyesa-s o wooroe V, zaobserwowano, ze pośredni 5scyjaao hydroksyzsaer reaguje z ubocznym produktem jonu cyjankowego (obecnym jako wynik odcyjanowania, które wprowadza podwójne wiązanie a4’5) w celu wytworzenia 5soyjano-0-kw7su. Zakłada się, ze działanie jonu cyjankowego aeałkiuuje grupę 0sestrową 5soyj7aohydroksyesaru, do uzyskania 5scyj7nOs0-kw7SU i odpowiadającego alkilonitrylu.
Zakłada się dalej, ze prozjśoiony związek pośredni 17-alkoholan awo-oy się prozo atak metanolu na 10-spirolakaoa hydroksyzsars (albo poprzedni związek pośredni, który następnie przekształca się w hyaroksyester). 10-alkoholan łatwo przekształca się w hya-oksyestzr p-zzz traktowanie kwasem. Zatem, generalnie nie obserwuje się go w macierzy produktu.
5-Cyj7aohya-oksyestzr, 5-oyjaao-0skw7s i 17-alkoholan są nowymi związkami, użytecznymi jako markery chromatografii i jako pośrednie w wytwarzaniu hyaroksyestrs. Można je wyodrębniać z surowego produktu tego etapu schematu 1 syntezy. Alaern7aywaiz· można je syntetyzować bezpośrednio do użytku jako markery lub związki pośrednie. S-Cyjanohyd-oksyzsaz- można syntetyzować przez reakcję rozano-u wyizolowanego dikzaonu o wzorze VI z zasadą, taką jak alkoholan lub amina, i wyodrębnienie otrzymanego osadu. Wytworzony związek korzystnie jest wodoro-0-metylo-5β-cyjano-11α,10-alhydIΌksy-3-okso-l0k-prekn7no-0k,21 -alk7rboksyl7azm, y-laktonem.
Kwas 5scyj7ao-0skarboksylowy można syntetyzować bezpośrednio proeo reakcję dikeaoas o woo-oe VI ze słabym wodnym roztworem zasady, takiej jak octan sodu lub wodorowęglan sodu i wyodrębnienie otrzymanego osadu. Wytworzony związek jest korzystnie kwasem 5-β-oyj7no-11 α, 10sdlhydroksy-3-okso-10k-prekn7nos0k,21 -dikarboksylowym, υ-ΡΑιοι·!—!!.
17-Alkoholan można syntetyzować bezpośrednio przez reakcję roztworu hydroksyesars o weorzz V z alkoholanem, uzyskując mieszaninę 17-alkoholanu i odpowiadającego hydroksyestru. Wytworzony związek korzystnie jest dimztylo-11α,10salhydroksy-3-okso-10kspreknaa-4sznOs0k·21saikarboksylaazm, γ-Η^ηοΉ.
Korzystnie, substrat kiketonowy o wzorze VI odpowiada wzorowi VIA
o
VIA a produkt liydroksyestru odpowiada wzorowi VA
VA
108
189 459 w których każdy z -A-A-, -B-B-, R3, Y1, Y2 i X są takie jak (^Ikeeśo^i^o W9 gozooze XIRA i R1 jest taki jak określono we wzorze V. Korzystnie r3 oznacza atom wodoru.
Produkty o wzorze V są związkami nowymi, które mają znaczącą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Korzystnie, związki o wzorze V odpowiadają wzorowi VA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-, R3 oznacza atom wodoru, niższa grupę alkilową lub niższa alkoksy, a R8 i R9 razem stanowią pierścień 20-epπΌke4nowy:
O
XXXIII.
Najkorzystniej, związek o wzorze V oznacza wodorometylo-11α,17α-dihydrokey-3-okeopregn-4-eno-7α,21 -dikarboksylan, γ-ldkton.
Związek o wzorze V można wyodrębnić przez filtrację lub zakwaszenie roztworu reakcyjnego, np. kwasem mineralnym, takim jak wodny roztwór Cl lub kwasu siarkowego, ochłodzenie do temperatury otoczenia i ekstrakcję produktu rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak chlorek metylenu lub octan etylu.
Ekstrakt przemywa się wodnym roztworem zasady, suszy i filtruje, po czym usuwa rozpuszczalnik. Alternatywnie, roztwór reakcyjny, zawierający produkt o wzorze V można zgasić stężonym kwasem. Roztwór produktu zatęża się, chłodzi do temperatury między około 0°C do 25°C i stały produkt izoluje przez filtrację.
W zalecanej postaci realizacji, metanol i HCN usuwa się przez destylację po zakończeniu okresu reakcyjnego, za pomocą kwasu mineralnego (takiego jak kwas chlorowodorowy lub kwas siarkowy) dodawanego przed destylacją, oraz wody dodawanej po destylacji. Kwas mineralny można dodawać w pojedynczym etapie, w wielu etapach i w sposób ciągły.
W zalecanej postaci realizacji, kwas mineralny dodaje się w sposób ciągły przez okres, wynoszący około 10 do około 40 minut, korzystniej około 15 do około 30 minut. Podobnie, wodę można dodawać na spód aparatu destylacyjnego w pojedynczym etapie, w wielu etapach lub ciągle.
W zalecanej postaci realizacji, zatęzoną mieszaninę reakcyjną chłodzi się od temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin przed dodaniem wody. Korzystnie, mieszaninę chłodzi się do temperatury, wynoszącej między około 50°C do około 70°C, korzystnie między około 60°C do około 70°C i korzystniej około 65°C przed dodaniem wody. Następnie dodaje się wodę, korzystnie w sposób ciągły przez okres około 15 minut do około 3 godzin, a korzystniej przez około 60 minut do około 90 minut, utrzymując temperaturę w przybliżeniu stałą.
Produkt o wzorze V zaczyna krystalizować od spodu aparatu do destylacji, w trakcie dodawania wody. Po dodaniu wody do mieszaniny, rozcieńczoną mieszaninę utrzymuje się w mniej więcej tej samej temperaturze przez około 1 godzinę, a potem chłodzi do temperatury około 15°C przez dodatkowy okres, wynoszący około 4 do około 5 godzin. Mieszaninę utrzymuje się w temperaturze około 15°C przez okres około 1 do 2 godzin. Dłuzszy okres utrzymywania w temperaturze 15°C zwiększa wydajność cyjanoestru w mieszaninie. Ten sposób odzyskiwania zapewnia wysokiej jakości krystaliczny produkt bez operacji ekstrakcji.
Zgodnie z innym zalecanym sposobem odzyskiwania produktu o wzorze V, metanol i HCN usuwa się przez destylację po zakończeniu, okresu reakcyjnego, za pomocą wody dodawanej przed lub w czasie destylacji. Dodawanie wody przed destylacją upraszcza operację, lecz postępowe dodawanie w czasie destylacji pozwala na utrzymanie zasadniczo stałej objętości w aparacie destylacyjnym. Produkt o wzorze V krystalizuje od spodu aparatu w trakcie przebiegu destylacji. Ten sposób odzyskiwania zapewnia wysokiej jakości krystaliczny produkt bez operacji ekstrakcji.
189 459
109
Zgodnie z jeszcze dalszą alternatywą, roztwór reakcyjny, zawierający produkt o wzorze V można zgasić kwasem mineralnym, np. 4N HCl, po czym rozpuszczalnik usuwa się przez destylację. Usuwanie rozpuszczalnika jest także skuteczne do usuwania pozostałości HCN z produktu reakcji.
Stwierdzono, że wielokrotne ekstrakcje rozpuszczalnika w celu oczyszczenia związku o wzorze V nie są konieczne jeśli związek o wzorze V służy jako pośredni w procesie wytwarzania epoksymekrenonu, jaki opisano w niniejszym opisie. W rzeczywistości takie ekstrakcje można często całkiem wyeliminować. Jeśli ekstrakcję rozpuszczalnika stosuje się do oczyszczania produktu, pożądane jest uzupełnienie przemywania rozpuszczalnika solanką i przemywanie wodorotlenkiem sodu. Ale jeśli ekstrakcję rozpuszczalnika eliminuje się, przemywania solanką i sodą kaustyczną eliminuje się także. Eliminacja ekstrakcji i przemywania znacznie wzmaga produktywność procesu bez zmniejszania wydajności lub jakości produktu, a także eliminuje potrzebę suszenia przemywanego roztworu środkiem odwadniającym, takim jak siarczan sodu.
Surowy produkt 11α-hydroksy-7α-alkoksykt-bonylowy odbiera się ponownie w rozpuszczalniku, do następnego etapu reakcji, który jest przemianą grupy 11-hydroksylowej w grupę pozostającą w pozycji 11, wytwarzając przez to związek o wzorze IV:
IV gdzie -A-A-, r3, -B-B-, R8 i r9 są takie jak określono we wzorze XIII, R1 jest taki jak określono we wzorze V i R2 oznacza nizszą grupę arylosulfonyloksy, alkilosulfonyloksy, acyloksy lub halogenek.
Korzystnie grupę 11α-hyd-oksy estryfikuje się przez reakcję nizszego halogenku alkilosulfonylu, halogenku acylu lub bezwodnika kwasowego, który dodaje się do roztworu, zawierającego produkt pośredni o wzorze V. Niższy bezwodnik kwasowy, taki jak bezwodnik octowy i tt2(eOoI<o^-o^(0(^vwaIa^ be:zwodniki kwasowe, takie jak bcezwodnik trifluorooctowy. można stosować do wytwarzania odpowiednich pozostających grup acyloksy. Jednakże zaleca się niższe halogenki alkilosulfonylowe, a zwłaszcza chlorek metanosulfonylu.
Alternatywnie, grupę 1a-hy-droksy można przekształcić w halogenek przez reakcję odpowiedniego odczynnika, takiego jak bromek tionylu, chlorek tionylu, chlorek sulfurylu lub chlorek oksalilu. Inne odczynniki do tworzenia estrów kwasu 11α-sulfonowzgo obejmują chlorek tosylu, chlorek benzenosulfonylu i bezwodnik t2ifluorometaaosulfoaowy. Reakcję prowadzi się w rozpuszczalniku, zawierającym wymiatacz cblorowcowoao2owy, taki jak trietyloamina lub pirydyna. Można także stosować zasady nieorganiczne, takie jak węglan potasu lub węglan sodu. Początkowe stężenie bya-oksyest2u o wzorze V wynosi korzystnie między około 5% i około 50% wagowych. Odczynnik estryfikacyjny jest korzystnie obecny w lekkim nadmiarze. Chlorek metylenu jest szczególnie odpowiednim rozpuszczalnikiem dla reakcji, lecz można także wykorzystać inne rozpuszczalniki, takie jak dichloroetan, pirydynę, chloroform, keton metylowoetylowy, dimetoksyetaa, keton metylowo-izobutylowy, aceton, inne ketony, etery, acetonitryl, toluen i tetrabyd-ofuran. Temperaturę reakcji ustala się przede wszystkim ze względu na lotność rozpuszczalnika. W chlorku metylenu temperatura reakcji zawiera się korzystnie w oak2zsie między około -10°C i około 10°C.
110
189 459
Korzystnie, substrat hydśoksyestśowy o wzorze V odpowiada wzorowi VA
VA a produkt odpowiada wzorowi IVA
IVA z których każdy z -A-A-, -B-B-, R , Y , Y i X są takie jak określono we wzorze XIIIA, r1 jest niższą grupą alkoksykarbonylową lub hydroksykarbonylową, a r2 jest taki jak określono we wzorze IV. Korzystnie R3 oznacza atom wodoru.
Produkty o wzorze IV są nowymi związkami, które mają zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze LA. Korzystnie, związki o wzorze V odpowiadają wzorowi VA, w którym -A-A- i -B-B- oznaczają grupę -CH2-CH2-, R3 oznacza atom wodoru, niższa grupę alkilową lub niższa alkoksy, a R8 i r9 razem stanowią pierścień 20-spiroksαmρww:
O'
11111
XXXIII.
Najkorzystniej związek o wzorze IV jest wodośometwlo-17α-hwóroksy-11α-(metylosulfpmwlo)oksy-3-oksopregn-4leno-7α.21-dikarboksylanem. /-bfiktonem. Jeśli pożądana jest pozostająca grupa acyloksy, związek o wzorze IV jest korzystnie 7lwodośometylo-17lhyóśoksy-3 -okso-l 1 α-(2,2.2-tnfluoro-1 -oksoetoksy)-17α-pregn-4leno-7α,21 -dikarboksylanem, γ-laktonem; lub 7-metylo-11α-(acetwloksy)-17lhydroksy-3-okso-17αlpregm-4-eno-7α,21-óikarboksylanem, '/daktonem.
Jeśli trzeba, związek o wzorze IV można wyodrębniać przez usunięcie rozpuszczalnika. Korzystnie, roztwór reakcyjny najpierw przemywa się wodnym roztworem zasady, np. 0,5-2N NaOH, po czym przemywa kwasem, np. 0,5-2N HCl. Po usunięciu rozpuszczalnika reakcyjnego produkt kekrystahzuje się, np. przez odebranie produktu w chlorku metylenu, a potem dodanie drugiego rozpuszczalnika, takiego jak eter etylowy, który obniża rozpuszczalność produktu o wzorze IV, powodując wytrącanie się go w formie krystalicznej.
Przy odzyskiwaniu produktu o wzorze IV lub przy wytwarzaniu roztworu reakcyjnego do przemiany związku pośredniego o wzorze IV w związek pośredni o wzorze II, jak dalej
189 459
111 opieano poniżej, wszystkie etapy ekstrakcji i/lub przemywania można pominąć jeśli roztwór zamiast tego traktuje eię żywicą jonowymienną, naetępnie żywicą kationowymienną. Alternatywnie, roztwór reakcyjny można najpierw traktować ą-eorUentąmi nidrogąniczaymi, takimi jak zaeadowy tlenek glinu lub ząeaaoua krzemionka, po czym przemyć rozcieńczonym kwąeem. Krzemionka ząeadowa lub zaeadouy tlenek glinu można zwykle mideząć z roztworem reakcyjnym w proporcji, wynoezącej między około 5 i około 50 g na kg produktu, korzyetnie między około 15 i około 20 g na kg produktu. Zarówno przy etoeowąait żywicy jonowymiennej, jak i ądeorUentóu nieorganicznych, traktowanie można przeprowadzać przez proete ząuieeoeaie żywicy lub a-eorbdatą nieorganicznego z roztworem reakcyjnym przy mieezaait w temperaturze otoczenia, naetępnie ueuaięoie żywicy lub ądeorbenta nieorganicznego przez filtrację.
W ąltematyundj i zalecanej poetaci realizacji wynalazku, produkt, będący związkiem o wzorze IV odzyekuje eię w poetaci surowej jako zatężony roztwór przez ueunięcid części rozptezozalnika. Ten zatęzony roztwór stoeuje eię bezpośrednio w naetępującym etapie procesu, którym jeet uetnięcid grupy pozostającej 11 ze związku o wzorze IV, tworząc w ten epoeób eneeter o wzorze II:
II g-zie -A-A-, -B-B-, RC R8 i R9 eą takie jak określono we wzorze XIII i r1 jeet takie jak określono we wzorze V. Dla celów tej reakcji, grupa R2 związku o wzorze IV może być każ-ą grupą pozostającą, której usunięcie skutecznie tworzy wiązanie podwójne między atomami węgla w pozycji 9 i 11. Korzystnie, grupą pozostającą jeet nizsza grupa alkilosulfonylokey lub acylokey, którą usuwa się przez reakcję kwasu i soli metalu alkalicznego. Można stosować kwasy mineralne, lecz zaleca się nizeze kwasy alkanowe. Korzystnie, odczynniki do reakcji obejmują -alej eól metalu alkalicznego wykorzystanego kwasu alkanowego. Szczególnie zaleca eię, żeby grupa pozostająca obejmowała grupę meeyloksy i odczynnik do reakcji obejmował kwas mrówkowy lub kwas octowy oraz eól metalu alkalicznego jednego z tych kwasów lub innego nizezego kwasu alkanowego. Jeśli grupą pozostająca jeet meeylokey i odczynnikiem usuwającym jest albo kwas octowy i octan so-u, albo kwae mrówkowy i mrówczan potaeu, obserwuje eię relatywnie wysoki stosunek 9,11-olefiny do 11,12-olefiny. Jeśli w czasie usuwania grupy pozostającej obecna jeet wolna woda, występuje tendencja do tuorzdnią zanieczyszczeń, szczególnie 7,9-ląktoau
gdzie -A-A-, RC, -B-B-, R8 i r9 eą takie jak określono we wzorze XIII, który jest tru-ny -o usunięcia z końcowego produktu. Skutkiem tego, stosuje się bezwodnik octowy lub inny
112
189 459 czynnik odwadniający do usunięcia wody obecnej w kwasie mrówkowym. Zawartość wolnej wody w mieszaninie reakcyjnej przed reakcją powinna być utrzymana na poziomie poniżej około 0,5%, korzystnie poniżej około 0,1% wagowych, zmierzonego przez analizę Karla Fischera pod względem wody, na podstawie całkowitego roztworu reakcyjnego. Mimo to, zaleca się, aby mieszaninę reakcyjną utrzymywać tak suchą jak tylko możliwe do wypraktykowania, przy czym zadowalające wyniki uzyskano przy 0,3% wagowych wody. Korzystnie, mieszanina ładunku reakcyjnego zawiera między około 4% i około 50% wagowych substratu o wzorze IV w kwasie alkanowym. Korzystnie obejmuje ona między około 4% i około 20% wagowych soli metalu alkalicznego kwasu. Jeśli stosuje się bezwodnik octowy jako czynnik odwadniający, korzystnie jest on obecny w proporcji, wynoszącej między około 0,05 mola i około 0,2 mola na mol kwasu alkanowego. Stwierdzono, ze proporcja produktu ubocznego 7,9-laktonu i 11,12-olefiny w mieszaninie reakcyjnej jest stosunkowo niska jeśli odczynnik eliminujący zawiera połączenie kwasu trifluorooctowego, bezwodnika trifluorooctowego i octanu potasu jako odczynnika do eliminacji pozostającej grupy i tworzenia enestru (9,11-olefiny). Bezwodnik trifluorooctowy służy jako odczynnik odwadniający i powinien być obecny w proporcji co najmniej około 3% wagowych, korzystniej co najmniej około 15% wagowych, najkorzystniej około 20% wagowych, na podstawie kwasu trifluorooctowego jako czynnika eliminującego. Oprócz 7,9-laktonu, inne zanieczyszczenia i produkty uboczne, które są użyteczne jako pośrednie w syntezie oraz jako markery chromatograficzne, obserwowano w tym etapie schematu 1 syntezy. Nowy 4,9,13-trien enestru o wzorze II (np. 7-metylo-17-metylo-3-okso-18-nonpregna-4,9(11),13-trieno-13 a,21-dikarboksylan) wyodrębniono chromatograficznie z roztworu produktu. Ilość tego wytworzonego związku wydaje się zwiększać ze wzrostem czasu reakcji dla tego etapu syntezy. Zakłada się, że związek tworzy się w czasie protonowania laktonu i powstały jon karboniowy C17 ułatwia migrację kątowej grupy metylowej z pozycji'C13. Odprotonowanie tego związku pośredniego daje 4,9,13-trien. Nową grupę 5-cyjano-A11’n enestru o wzorze II (np. wodoro-7-metylo-5β-cyjano-17-hy-droksy-3-okso-17α-pregn-l1-eno17α, 21-dikarboksylan, ydakton) także wyodrębniono chromatograficznie z surowego produktu. Zakłada się, ze te związki tworzą się poprzez odwodnienie pozostałego odpowiednio 5-cyjano-7-kwasu i 5-cyjanohydroksyestru, które są obecne w surowym roztworze produktu jako wynik trzeciego etapu syntezy według schematu 1. Nowy epimer C17 enestru o wzorze II (np. wodoro-7-metylo-17-hydroksy-3-okso-17α-pregna-4,9(11 )-dieno-7,21 -dikarboksylan, γ-lakton) także wyodrębniono chromatograficznie z surowego produktu. Zakłada się, ze warunki kwasowe reakcji eliminacji mogą powodować racemizację centrum chiralnego C17, dając 17-epimer enestru. 17-Epimer można syntetyzować bezpośrednio przez reakcję związku o wzorze IV z roztworem mrówczanu potasu, kwasu mrówkowego i bezwodnika octowego oraz izolację 17-epimeru. Mimo, że nie obserwowano go jako zanieczyszczenia w roztworze surowego produktu, 11-keton hydroksyestru o wzorze V można wytworzyć przez utlenienie grupy 11-hydroksy odpowiadającego hydroksyestru odpowiednim czynnikiem utleniającym, takim jak odczynnik Jonesa. Wytworzony Π-keton korzystnie jest wodoro-7-metylo- 17-hydroksy-3,11 -diokso-17α-pregna-4-eno-7α,21 -dikarboksylanem, Ydaktonem. Alternatywnie, grupy pozostające 11α ze związku o wzorze IV można eliminować w celu wytworzenia enestru o wzorze II przez ogrzanie roztworu o wzorze IV w rozpuszczalniku organicznym, takim jak DMSO, DMF lub DMA. Dalej zgodnie z wynalazkiem, związek o wzorze IV poddaje się reakcji początkowo z alkanianem alkenylu, takim jak octan izopropenylu w obecności kwasu, takiego jak kwas toluenosulfonowy lub bezwodnik kwasu mineralnego, takiego jak kwas siarkowy, w celu utworzenia estru 3-enolu:
Ac o
IV(Z)
189 459
113 związku o wzorze IV. Alternatywnie 3-znolozstzr można utworzyć przez traktowanie związku o wzorze IV bzzwo-nikizm kwasowym lub zasadą, takim jak kwas octowy i octan sodu. Dalszą alternatywą jest traktowanie związku o wzorze IV ketenem w obecności kwasu w celu wytworzenia związku o wzorze IV(Z). Pośredni związek o wzorze IV(Z) reaguje potzm z mrówczanem metalu alkalicznego lub octanem w obecności kwasu mrówkowego lub octowego w celu utworzenia octanu A9· 11-znolu o wzorze IV(Y)
IV (Y) któ-y można potzm przekształcić w znzstzr o wzorze II w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie alkoholu, takim jak metanol albo przez rozkład termiczny octanu znolu, albo jzgo reakcję z alkoholanem metalu alkalicznego. Reakcja eliminacji jest wysoce selektywna wobec estru o wzorze II z piz-wszzństwzm wobec 11,12-olzfiny i 7,9-laktonu i ta selektywność jzst zabezpieczona przez przemianę octanu znolu w znon.
Korzystnie, substrat o wzorze IV odpowia-a wzorowi IVA
IVA a produkt znzstrowy o-powiada wzorowi IIA
gdzie każdy -A-A-, -B-B-, R3 Y’ i Y2 oraz X są takie jak określono wz wzorze XIIIA i R1 jzst takiz jak określono wz wzorze V. Korzystnie R7 oznacza atom wodoru.
Jeśli trzeba, związek o weo-oz II można izolować przez usunięcie rozpuszczalnika, odebranie stałego produktu w zimnej wo-ziz i ekstrakcję rozpuszczalnikiem organicznym, takim jak octan etylu. Po o-powiz-nim przemyciu i etapach suszenia, pro-ukt odzyskuje się przez usunięcie rozpuszczalnika -o ekstrakcji. Następnie znzstzr izoluje się przez -odaniz wody do
114
189 459 zatężonego roztworu produktu i filtrację stałego produktu, usuwając przez to korzystnie 0,9-lakton. Przemianę substratu o wzo-oe II w produkt o wzorze IA można prowadzić w sposób opisany w opisie patentowym 4 559 332, który załącza się poprozo odniesienie lub korzystniej przez nową reakcję przy użyciu promotora chlorowco7cet7mlau jaki opisano poniżej.
W innej postaci realizacji wynalazku, hyaroksyester o wooroe V można proeksea7łclć w zazstzr o wzorze II bez izolacji związku pośredniego o wzorze IV. W tej metodzie, hydroksyester odbiera się w rozpuszczalniku organicznym, takim jak chlorek metylenu; i do roztworu dodaje się albo czynnik acylujący, np. chlorek metanosulfonylu albo czynnik chlorowcujący, np. chlorek sulfurylu. Mieszaninę miesza się i jeśli wykorzystano cblorowoow7ale· dodaje się środek wymiatający HCl, taki jak imidazol. Reakcja ta jest bardzo zkzoaermlozna i dlatego powinno się ją prowadzić w kontrolowanym tempie przy pełnym ohłoaoeais. Po dodaniu zasady uzyskaną mieszaninę ogrzewa się do średniej temperatury, np. około 0°C do temperatury pokojowej albo nieco powyżej i poddaje reakcji przez okres zwykle około 1 do około 4 godzin. Po zakończeniu reakcji, rozpuszczalnik odpędza się, korzystnie pod bardzo niskim ciśnieniem (np. około 600 do około 000 mm Hg) w temperaturze około -10°C do około +15°C, korzystniej około 0° do około 5°C, w celu zatęzenia roztworu i usunięcia nadmiaru zasady. Substrat rozpuszcza się potem ponownie w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w chlorowoowaaym rozpuszczalniku, takim jak chlorek metylenu w celu przemiany w
Odczynnik eliminujący grupy pozostające wytwarza się korzystnie przez mieszanie kwasu o-gaaioznzko soli kwasu organicznego i czynnika oaw7anlająozko, korzystnie kwasu mrówkowego, mrówczanu metalu alkalicznego i bezwodnika ootowzkO· odpowiednio, w suchym reaktorze. Dodanie bezwodnika octowego jest ekooaermiconz i daje uwalnianie CO, tak, ze tempo dodawania musi być w związku z tym kontrolowane. Aby pobudzić usuwanie wody, temperaturę tej reakcji utrzymuje się korzystnie w zakresie około 60°C do około 90°C, najko-zysaaiej około 65°C do około 05°C. Następnie dodaje się ten odczynnik do roztworu produktu związku o weorzz IV, aby wykonać reakcję eliminacji. Po około 4 do około ™ godzinach, mieszaninę reakcyjną ogrzewa się korzystnie do aempz-aauI'y, wynoszącej co najmniej około 85°C· lecz korzystnie nie powyżej około 95°C aż do usunięcia całego lotnego destylatu, a potem przze aoaaakony okres do zakończenia reakcji, zwykle około 1 do około 4 godzin. Mieszansę reakcyjną chłodzi się i po odzyskaniu przez standardową technikę ekstrakcji, enzsaemożna odzyskać według potrzeby przez odparowanie rozpuszczalnika. Stwierdzono —71ζ], że zazstz- o weo-oe II można odzyskiwać z roztworu reakcyjnego przez alternatywną proozasrę, która unika potrzeby etapu ekstrakcji po reakcji eliminacji, zapewniając prezz to oszczędzanie koszaów· polzpszzaie wydajności i/łub poprawę produktywności. W tym p-oczsIz, produkt znzsarony wytrąca się przez -ozclzńcoenie mieszaniny reakcyjnej wodą po usunięciu kwasu mrówkowego. Produkt następnie izoluje się przez filtrację. Nie potrzeba żadnej ekstrakcji.
Zgodnie z dalszą alternatywą dla przemiany hydroksyestru o wooroe V w zazstzr o wzorze II bez izolacji związku o wzorze IV, grupę Uk-hydroksy hydroksyzsaru o wzorze V zamienia się na ohlerowlzc, a znesae- o wooroe V tworzy się in situ przzo odohlorowoowooaos -owanlz aermloone. Zamianę grupy hydroksy przez chlorowiec wykonuje się przez reakcję halogenku sulfurylu, korzystnie chlorku sulfurylu, w zimnie w obecności środka wymiatającego woaorohalogzaek, takiego jak imidazol. Hya-oksyesaer rozpuszcza się w rozpuszczalniku takim jak tet-7hyd-ofsr7n i ohłoaoi do temperatury około 0°C do około -00°C. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się halogenek sulfurylu i ok-zzwa się przez czas wystarczający do zakończenia reakcji eliminacji, zwykle około 1 do około 4 godziny. Sposób według tej postaci realizacji nie tylko łączy dwa etapy w jednym, lecz eliminuje użycie chlorowcowanego odczynnika oawaaal7jączgo (takiego jak bezwodnik octowy lub siarczan sodu). Ponadto, reakcja nie wymaga warunków refluksu i unika aworeznia produktu ubocznego CO, który powstaje przy stosowaniu kwasu octowego jako odczynnika odwadniającego.
Zgodnie ze szczególnie zalecaną postacią realizacji wynalazku, związek alkztoaowy o wzorze VI można przekształcać w zpoksymeksrenon lub inny związek o wzorze I bez izelacji żaaazgo związku pośredniego w postaci oczyszczonej. Zgodnie z tym zalecanym sposobem, roztwór reakcyjny, zawierający hydroksyzstz- gasi się silnym roztworem kwasu, cbłoaei do azmpz-aasIy otoozznia· a potem ekstrahuje odpowiednim rozpuszczalnikiem ekstra^yjnym Korzystnie, wodny roztwór soli alzo-kaaloeazj· np. około 10% wagowo roztwór solanki,
189 459
115 dodaje eię do mieszaniny reakcyjnej przed ekstrakcją. Ekstrakt przemywa się i suszy przez destylację ązeotropouą w celu usunięcia rozpuszczalnika metanolowego, pozostałego z reakcji rozszczepienia ketonu.
Otrzymany zatęzony roztwór, zawierający mię-zy około 5% i około 50% wagowych związku o wzorze V, kontaktuje się następnie w zimnie z odczynnikiem acylującym lub alkilsulfontjąoym w celu utworzenia estru sulfonowego lub estru kwasu dikarbokeylowego. Po zakończeniu reakcji alkiloeulfonylącji lub kąrUoksylaoji, roztwór reakcyjny przepuszcza eię przez kolumnę z żywicą wymienną kwasową, a potem zasa-ową w celu usunięcia zanieczyszczeń zasadowych i kwasowych. Po każdym przejściu, kolumnę przemywa eię o-powie-nim rozpuszczalnikiem, np. chlorkiem metylenu w celu o-zyskania z niej pozostałego estru sulfonowego lub dikąrUokeylowdgo. Połączone eluaty i frakcje przemywania łączy się i redukuje, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, w celu wytworzenia zatęzonego roztworu, zawierającego ester sulfonowy lub ester dikarboksylowy o wzorze IV. Ten zatęzony roztwór kontaktuje eię naetępnie z odczynnikiem o-uadniającym. zawierającym czynnik usuwający grupę pozostającą 11a-eetru i usuwający wo-ór, tworząc podwójne wiązanie 9,11. Korzystnie, odczynnik -o usuwania grup pozostających zawiera roztwór odczynników douadaiąjąoych kwae mrówkowy/mróuozan metalu alkalicznego/bezwodnik octowy, opisanych powyżej. Po ukończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną chłodzi się i usuwa kwae mrówkowy/inne lotne składniki, pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość chłodzi się -o temperatury otoczenia, poddaje o-powie-nim etapom przemywania, a potem euszy uzyskując zatęzony roztwór, zawierający enester o wzorze II. Ten eneeter można naetępnie przekształcać w epoksymekerenon lub inny związek o wzorze I przy użyciu sposobu opisanego w niniejszym opieie lub w opisie patentowym 4 559 CC2.
W szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, rozpuszczalnik usuwa się z roztworu reakcyjnego pod zmniejszonym ciśnieniem i produkt o wzorze IV dzieli się między wo-ę i odpowiedni rozpuszczalnik organiczny, np. octan etylu. Warstwę wodną ekstrahuje się następnie z powrotem z użyciem rozpuszczalnika organicznego i powrotny ekstrakt przemywa roztworem ząeąaouym, korzystnie roztworem wodorotlenku metalu alkalicznego, zawierającym halogenek metalu alkalicznego. Fazę organiczną zatęza się, korzystnie pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując enestrowy produkt o wzorze II. Pro-ukt o wzorze II można potem o-Uldrąć w rozpuszczalniku organicznym np. chlorku metylenu i -alej poddawać reakcji w sposób opieany w opieie 4 559 CC2 w celu wytworzenia produktu o wzorze I. Jeśli w reakcji epoksydacji stoeuje się trichloIΌuooacdtoaitryS, stwierdzono, że wybór rozpuszczalnika jeet istotny, przy czym aajUąr-zidj zaleca eię rozpuszczalniki ohlorouoouąad, a szczególnie zaleca się chlorek metylenu. Rozpuszczalniki, takie jak dichloroetan i chloroUdaoea dają rozsądnie zadowalające wydajności, lecz wydajności eą generalnie lepsze w środowisku reakcji chlorku metylenu. Rozpuszczalniki takie jak ąodtoaitryl i octan etylu -ają słabe wydajności, podczas g-y reakcja w rozpuszczalnikach takich jak metanol lub mieszanina uoaątetrahydrokfurąa -aje niewiele żądanego pro-uktu.
Dalej zgo-nie z niniejszym wynalazkiem, stwierdzono, że liczne ulepszenia w syntezie epoksymdksreaoat można zrealizować raczej przez użycie trichloroucoącetąmidu niż trichlorowooaoetonit-ylt jako aktywatora nadtlenkowego przy reakcji epoksydami. Zgo-nie ze szczególnie zalecanym sposobem, epokey-ąoję przeprowadza się przez reakcję substratu o wzorze IIA z nadtlenkiem wodoru w obecności trichloroacetamiau i odpowiedniego buforu. Korzystnie, reakcję prową-zi się przy pH w zakresie około C do około 7, najkorzystniej między około 5 i około 7. Jednakże mimo tych uąruaków, zadowalającą reakcję realizowano poza zalecanymi zakresami pH.
Szczególnie korzystne warunki otrzymuje się przy buforze, zawierającym uodorofoeforan dipotąeouy i/lub buforze, zawierającym połączenie wo-orofosforanu dipotaeowego i -iwodo-ofosforąnt potasu w stosunku mię-zy około 1:4 i około 2:1, najkorzystniej w zakresie około 2:C. Można także stosować bufory Uorąaoud, lecz generalnie dają one niższe przemiany niz fosforan ^potasowy lub mieszaniny K2HPO4/KH2PO4. Jaki by nie był zestaw buforu, powinien on zapewnić pH w zakresie wskazanym powyżej. Oddzielnie od całości kompozycji buforu lub dokładnego pH, które może zapewniać, zaobserwowano, że reakcja postępuje znacznie efektywniej jeśli co najmniej część buforu zawiera dizasadowy jon wodorofosforanowy. Uważa eię, ze ten jon może uczestniczyć oąeą-niczo jako katalizator homogeniczny
116
189 459 w tworzeniu dddkktu lub kompleksu, obejmującego promotor i jon nadtlenku wodoru, którego tworzenie może być, o-wrotniz, zasa-niczz dla całości mechanizmu reakcji zpoksy-acji. Tak więc, wymaganiem ilościowym -la ^zasadowego wo-orofosforanu (korzystnie z K2HPO4) może być tylko małe stężenie katalityczne. Generalnie, zaleca się, aby K2HPO4 był obecny w proporcji co najmniej około 0,1 równoważnika, np. między około 0,1 i około 0,3 równoważnika na równoważnik substratu. Reakcję przeprowadza się w odpowiednim rozpuszczalniku, korzystnie chlorku metylenu, lzcz alternatywnie można stosować inne chlorowcowane rozpuszczalniki, takie jak chlorobenzen lub dichloroetan. Toluen i mieszaniny toluenu i acztonitrylu także okazały się zadowalające. Bzz wiązania się z konkretną teorią, są-zi się, ze reakcja przebiega najefektywniej w ukła-ziz dwufazowym, w którym tworzy się pośredni nadtlenek wo-oru i rozkłada w stosunku do fazy organicznej o niskiej zawartości wody, a reaguje z substratem w fazie organicznej. Tak więc zalecanymi rozpuszczalnikami są tz, w których rozpuszczalność w wodzie jzst niska. Efektywny odzysk z toluenu pobudzany jzst p-zez inkluzję innego rozpuszczalnika, takiego jak acztonitryl. W przemianie substratów o wzorze II w produkty o wzorze I, toluen zapewnia korzyść sposobu, ponieważ subst-aty swobodnie rozpuszczają się w wo-ziz, a produkty niz. Tak więc, pro-ukt osadza się podczas reakcji jeśli przemiany sięgają zakresu 40-50%, tworząc trójfazową mieszaninę, z której pro-ukt można dogodnie wydzielić przez filtrację. Metanol, octan etylu, sam acztonitryl, THF i THE/woda niz okazały się tak efektywne jak rozpuszczalniki chlo-owocowane lub toluen, w przeprowadzaniu przemiany tego etapu sposobu.
Mimo, ze trichloro7czt7mia jzst szczególnie zalecanym odczynnikiem, można takżz stosować inne trifluorowco7cztami-y, takie jak t-ifluorz7czt7mi- i ohloro-ifluoro7cztami-. Można także stosować trifluorowcomztylobznzami- i inne związki, mające cząstkę arylznową, alkilznową lub alkinylową (lub inną grupę, która pozwala na przeniesienie zfzktu wycofania elektronu grupy wycofującej elektron -o grupy karbonylowej amidu) między grupą trichlorowcomztylową wycofującą elektron i grupą karbonylową amidu. Można takżz stosować hzpt7fluorobutyro7mi-y, lzcz z mnizj korzystnymi wynikami. Generalnie, aktywator nadtlenkowy może odpowiadać wzorowi:
x’ O 2 1 □ H
X — C—Rp-C—NH, i· gdzie Rp oznacza grupę, która pozwala na przeniesienie zfzktu wycofania elektronu grupy wycofującej zlzkt-on -o grupy karbonylowej amidu, a korzystnie wybiera się ją spośród grupy arylznowzj, alkznylowzj, alkinylowej i (CX4X5)n-; X’, x2, X3, X4 i X5 wybiera się niezależnie spośród fluorowca, atomu wodoru, grupy alkilowej, fluzrzwcoalkilowzj i cyjanowej oraz cyjanoalkilowzj: oraz n wynosi 0, 1 lub 2; pod warunkiem, że gdy n wynosi 0 wtedy co najmniej jeden z X’, X- i χ3 oznacza fluorowizc; i g-y rp oznacza -(CX4X5)n- oraz g-y n wynosi 1 lub 2, wtedy co najmniej jeden z X4 i X5 oznacza fluorowizc. Jeśli każdy z X’, X7, X3, X4 i X5 niz jzst fluorowczm, korzystnie jzst grupą fluorowcoalkilową, najkorzystniej n7dfluorowcoalkilową. Szczególnie zaleca się aktywatory, w których n wynosi 0 i co najmniej -wa X’, X2 i χ3 są fluorowczm lub tz, w których Rp jzst -^Χ^Χ5^-, n wynosi 1 lub 2, co najmniej jz-zn z χ4 i X5 oznacza fluorowizc, inne z X4 i X5 oznaczają fluorowizc lub n7-fluorowcoalkil i X’, X2 i X3 oznaczają fluorowizc lub nadfluorowcoalkil. Każ-y z X’, X2, X3, X4 i X5 oznacza korzystnie Cl lub E, najkorzystniej Cl, choć mieszane halogenki są także odpowiednie, jak na-chloroalkil lub nadbromoalkil i ich połączenia, pod warunkiem, ze atom węgla bezpośrednio dołączony -o grupy karbonylowej amidu podstawiony jzst co najmniej jedną grupą chlorowcową.
Korzystnie aktywator nadtlenkowy jzst obzcny w proporcji, wynoszącej co najmniej jeden równoważnik, korzystniej między około 1,5 i około 2 równoważniki substratu obecnego początkowo. Nadtlenek wo-oru powinien być załadowany -o reakcji w co najmniej śrz-nim nadmiarze lub dodawany progresywnie w trakcie trwania reakcji zpoksydacji. Choć reakcja zuzywa tylko jeden lub -wa równoważniki nadtlenku wodoru na mol substratu, nadtlenek wo-oru ła-ujz się korzystnie w znacznym n7-mirroz w stosunku -o aktywatora obecnego początkowo. Bzz ograniczania wynalazku -o poszczególnej teorii, uważa się, ze mechanizm reakcji wiążz się z tworze189 459
117 niem aóóuktu aktywatora i anionu nadtlenku, że tworzenie się tej reakcji jest odwracalne przy równowadze z przewagą reakcji odwrotnej oraz że znaczny początkowy nadmiar nadtlenku wodoru jest zatem konieczny w celu napędzania reakcji mαuśzóó' Temperatura tej reakcji nie jest ściśle krytyczna i można ją efektywnie prowadzić w zakresie, wynoszącym około 0°C do około 100°. Generalnie, zalecana temperatura wynosi między około 20°C i około 30°C lecz przy pewnych rosuuyzczαlnikach. np. toluenie, reakcję można korzystnie prowadzić w zakresie około 60°C do około 70°C. Przy około 25°C reakcja zwykle wymaga mniej niż 10 godzin, zwykle około 3 do około 6 godzin. Jeśli trzeba, w celu uzyskania pełnej przemiany substratu można dodać dodatkowy aktywator i nadtlenek wodoru, przy końcu cyklu reakcyjnego. Przy końcu cyklu reakcyjnego usuwa się fazę wodną, roztwór organiczny korzystnie przemywa się w celu usunięcia zanieczyszczeń rozpuszczalnych w wodzie, po którym produkt można odzyskiwać przez usunięcie rozpuszczalnika. Przed usunięciem rozpuszczalnika, roztwór reakcyjny powinno się przemyć środkiem do przemywania co najmniej łagodnym do średnio zasadowego, np. węglanem sodu. Korzystnie, mieszaninę reakcyjną przemywa się sukcesywnie z użyciem: łagodnego roztworu redukującego, takiego jak słaby (np. około 3% wagowo) roztworem siarczynu sodu; roztworem zasadowym, np. NaOH lub KOH (korzystnie około 0,5N); roztworem kwasu, takiego jak HCl (korzystnie około 1N) i na koniec przemycie środkiem obojętnym, zawierającym wodę lub solankę, korzystnie nasyconą solanką, w celu zminimalizowania strat produktu. Przed usunięciem rozpuszczalnika reakcyjnego, można korzystnie dodać drugi rozpuszczalnik, taki jak rozpuszczalnik organiczny, korzystnie etanol tak, że produkt można odzyskiwać przez krystalizację po destylacji w celu usunięcia bardziej lotnego rozpuszczalnika. Powinno się zrozumieć, ze nowy sposób euoksyóacei, wykorzystujący trichloroacetamió lub inny nowy aktywator nadtlenku, ma zastosowanie poza różnymi schematami wytwarzania eppkywmekrenpnu i w rzeczywistości można go stosować do tworzenia epoksydów poprzez podwójne wiązania olefinowe w wielu różnych substratach poddanych reakcji w fazie ciekłej. Reakcja jest szczególnie efektywna przy związkach nienasyconych, w których olefmy podóaje się tetrasubstytucji i ^substytucji, to jest oraz RaRbC=CRcH gdzie Ra do Ró oznacza podstawniki inne niż atom wodoru. Reakcja postępuje najszybciej i w sposób pełny przy wiązaniu podwójnym poddanym tetrasubstytucji. Przykłady substratów dla reakcji epoksydacji obejmują Δ9li-kam·enom i następujące substraty:
O
118
189 459
Ponieważ reakcja postępuje szybciej i pełniej z wiązaniami podwójnymi podataymi trisubstytucji i tetrasubstytucji, jest to szczególnie efektywne dla selektywnej epoksydach przez takie wiązanie podwójne w związkach, które mogą obejmować inne wiązania podwójne, gdzie atomy węgla oleimy poddaje się mono substytucji lub nawet dusubstyluicji.
Innymi nie ograniczającymi przykładami ilustrującymi ogólną reakcję epoksydacji są następujące reakcje epoksydacji:
Powinno się dalej zrozumieć, że reakcję można stosować korzystnie w epoksydami mo^podstawionych lub nawet aipoadtawioyycb wiązań podwójnych, takich jak 11,12-olefmowych w różnych substratach steroidowych. Jednakże, ponieważ przeważnie epoksyduje ona więcej wysoko podstawionych wiązań podwójnych, np. 9,11-olefinowycb, z wysokoą selektywnością, sposób według tego wynalazku jest szczególnie efektywny dla uzyskiwania wysokich wydajności i produktywności w etapach epoksydacji różnych schematów reakcji opisanych gdzie iyaoiej w niyiejdoym opisie.
189 459
119
Ulepszony sposób okazał się szczególnie korzystnym zastosowaniem w wytwarzaniu:
IB przez epoksyda^:
i wytwarzanie:
IC przez epoksydację:
Wiele korzyści przedstawiono dla sposobu według wynalazku, w którym stosuje się trichloroacetamia zamiast trichloroacetonitrylu jako odczynnika przenoszącego atom tlenu dla reakcji epoksydacji. Układ odczynnika trichloroacetamidu ma niskie powinowactwo do olefin ubogich w elektrony w substratach, zawierających oba typy wiązań podwójnych. Dodatkowo, w substratach kompleksowych, takich jak steroidy, olefiny dipodstawione i tripodstawione można różnicować przez reakcję. Tak więc, obserwuje się dobrą selektywność w epoksydacji izomerycznych związków A-9,11 i A-11,12. W tym wypadku, epoksyd 9,11 tworzy się z minimalną reakcją izomeru, zawierającego wiązanie podwójne A-i 1,12. W związku z tym, wydajność reak120
189 459 cji, profil produktu i końcowa czystość są znacznie wzmocnione w porównaniu z reakcjami, w których stosuje się t2ichlorowooacetoad12yl. Stwierdzono także dodatkowo, że znaczny nadmiar tworzenia się tlenu obserwowany przy stosowaniu t2icblo-owooacztoyitrylu jest zminimalizowany przy t2ichlo-oacetamidoie, powodując poprawę bezpieczeństwa procesu epoksydacji. Dalej, w przeciwieństwie do reakcji pobudzanej przez tricbloroacetomt2yl, reakcja z trichloroacetamidem wykazuje minimum efektów egzotermicznych, ułatwiając w ten sposób kontrolę profilu cieplnego reakcji. Efekty mieszania obserwuje się jako minimalne i wydajność reaktora bardziej stałą, co jest dalszą korzyścią nad procesem z tricbloroacetoyit-ylem. Reakcja jest łatwiejsza do zwiększania skali niz reakcja pobudzana trichloroacetonitrylem. Izolacja produktu i oczyszczanie jest proste. Nie obserwuje się utleniania Bayera-Villagera karbonylowej grupy funkcyjnej (przemiana ketonu w ester pobudzana nadtlenkiem) jak doświadczono przy użyciu kwasu m-chlo-operoksybeyooedowego lub innych naakwadów. Odczynnik jest niedrogi, łatwo dostępny i łatwo go obrabiać.
Oprócz tego, następujące związki obserwowano przez chromatografię w surowym produkcie z etapu schematu 1 syntezy, w którym enester o wzorze II przekształca się w związek o wzorze I:
(1) nowy 11α,12α epoksyd enedt2u o wzorze II, np. woaoro-7-metylo-11α,12α-epokdy-17-byd-okdy-3-okso-17a-p-egn-4-eno-7a,21-dikarbokdylan, γ-lnkton;
(2) nowy 4^:9 ilkdiepodsyd kby-tna z wz orzw II np i wadoee-a-metylo-4yl5α;9α,ll9-diepoksy-17-hyd-oksy-3-okso-17a-p-egnano-7a,21-aikarboksylan, ^la]kł^oa;
(3) nowy 12-keton eyedtrz o wzorze II np. wodo-o-7-metylo-17-hy'droksy-3,12-aiokso-17α-p-egya-4-aieyo-7a,21 -dika2bokd9lay, γ-kikton;
(4) nowy 9,11-dib9drokd9 eyedt2z o wzorze II np. woao-o-7-metylo-9α,l 1 (,J7-dih9d2okd9-3-okdo-17a-pregna-4-eno-7a,21-dika-boksylay, γ-łakton;
(5) nowy analog n-hydroksy eyest-z o wzorze II, np. wodoro-7-metylo-12α,17-aihydroksy^-okso-17α-pregya-4,9( 11 )-dieno-7α,21 -aika2boks9lan, γ-^ΐοη; oraz (6) nowy 7-kwas związku o wzorze I, np. kwas 9, 11α-epoksy-17-h9droks9ł3-okso-17αł -pregy-4-eno-7a,21 -dikarboksylowy,
Związki te mają wykorzystanie jako syntetyczne związki pośrednie i/lub markery chromatograficzne w wytwarzaniu związku o wzorze I, szczególnie epokdymeksrenonu. Zakłada się, ze 11α,12αłepokdya enes^ o wzorze II tworzy się przez oanieczydoozeyit wytworzone podczas poprzeayiego etapu, w którym związek o wzorze IV przekształca się w eaesteo wzorze II. To zanieczyszczenie wyizolowano choromatograficonie i jest to Δ'’Ί eyester. Tworzy się on zwykle z eyzdtrem Δ ’ w stosunku około 90:10 (enestru Δ ’ ekstra Δ ’ ), chociaż ten stosunek może się zmieniać. Utlenianie enestru Δ11’1 podczas przemiany enestru o wzorze II w związek o wzorze I daje 11 α ,12α-zpoksya.
4,5:9,11łepoksyd eyedtru o wzorze I wyizolowano chromatograficznie. Zakłada się, ze pochodzi on z nadepokd9aacji znedt2u. Obserwuje się go zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać.
12-Keton enedt2u o wzorze II wyizolowano chromatograficznie. Zakłada się, ze powstaje on z allllicznsgo utleniania enestru. Obserwuje się zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać. Poziom 12-ketonz wykrytego w surowym produkcie, po użyciu tricbloroacetonit-ylu jako aktywatora nadtlenku wodoru, był wyzszy niż poziom wykryty przy stosowaniu t-icbloroacetamidu jako aktywatora.
9, 11-dihyaroksyeneste- o wzorze II wyizolowano chromatograficznie. Obserwuje się go zwykle w surowym produkcie na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać. Zakłada się, ze powstaje on z b9arolio9 epoksydu o wzorze I.
12-Hydrokdyeyeste- o wzorze II wyizolowano chromatograficznie. Obserwuje się go zwykle w surowym proazkciz na poziomie około 5% wagowych lub mniej, chociaż ilość ta może się zmieniać. Zakłada się, że powstaje on z hydrolizy 11,12-epoksydu z późniejszą ρΙιmiyaoją 11 β-b9aroksy.
Poza tym, związki o woo-oe I wytworzone zgoayiz z tym opisem, można dodatkowo modyfikować w celu uzyskania metabolitu, pochodnej, proleku lub innego o ulepszonych właściwoSciacb (takich jak ulepszona rozpuszczalność i aUdo-pcja), które ułatwiają podawanie i/lzb skuteczność epokd9meksrenonu. Grupa 6-b9aroksy związku o wzorze I (np. woaoro-7łmst9lo189 459
121
-6β,17ldihydroksy-9,11αlrpokeylC-okeo-17α-pregn-4-enOl7α,21laikαrbokeylαn, γ-ΝΚίοιι) jest nowym związkiem, który zidentyfikowano jako możliwy metabolit u szczura. Metabolit 6lhyaroksy można wytwarzać z odpowiadającego eteru etyloenolu (np. woaoro-7-metylo-9,11αl lepoksy-17lhydroksy-17α-pregn-4lrno-7α,21-aikwboksylan, γ-krkton). Eter etyloenolowy związku o wzorze I można wytworzyć zgodnie z procedurą przedłożoną w publikacji R. M. Weier i L. M. Hofman (J. Med. Chem. 1977, 1304), którą załącza się jako odniesienie. Eter etyloenolowy poddaje się potem reakcji z kwasem m-chloronadbeznoesowym, uzyskując odpowiadającą pochodną 6-hydrokey związku o wzorze I. Zakłada się dalej, ze sole monokarboksylowe epoksymeksrenonu, szczególnie sole potasowe i sodowe, są odpowiednią alternatywą wobec ułatwienia podawania związku o wzorze I osobom, dla których wskazane jest podawanie pochodnych alaostrronu. W warunkach łagodnie zasadowych możliwe jest selektywne otwarcie spirolaktonowych związków o wzorze I, bez hydrolizy grupy estrowej Cl, dając odpowiadający analog kwasu 17βlhydroksy-17α-(C-propionowrgo). Te analogi o otwartym łańcuchu są bardziej polarne niż ich odpowiedniki laktonowe i mają krótszy czas retencji przy analizie przez HPLC z odwrotną fazą. Warunki kwasowe generalnie powodują regenerację pierścienia laktonowego. W warunkach bardziej wymuszonych, spirolakton otwiera się i ester C7 hydroliouje, dając odpowiadające produkty uboczne, analogi kwasu 17β-hydroksy-17αl(c-propionow'ego) związków o wzorze I. Te kwasy karboksylowe mają krótszy czas retencji niż kwasy monokarboksylowe przy analizie przez HPLC z odwrotną fazą. Warunki kwasowe (np. traktowanie rozcieńczonym kwasem, takim jak 0,1-4 M kwasem chlorowodorowym) generalnie powodują regenerację pierścienia laktonowego kwasu aikαrbokeylowego.
Nowy sposób epoksydacji według wynalazku jest wysoce użyteczny jako kończący etap syntezy według schematu 1. W szczególnie zalecanej postaci realizacji, całość procesu według schematu 1 postępuje następująco:
NMj
HCL CH,OH, M,O, BO *C, IM
O
HyUrokeyrster o
Schemat 2
122
189 459
Schemat 2
Według pierwszych trzech etapów schematu 2 wytwarza się związek pośredni o wzorze XVII, zaczynając od związku, odpowiadającego wzorowi XX. Synteza w tym etapie zaczyna się substratem odpowiadającym wzorowi XX
XX gdzie -A-A- i r3 są takie jak określono we wzorze XIII, -B-B- jest taki jak określono we wzorze XIII z wyjątkiem, że ani r6 ani R7 nie jest częścią pierścienia dołączonego do pierścienia D w pozycjach 16, 17, a R26 oznacza niższą grupę alkilową, korzystnie metylową. Korzystnie r3 oznacza atom wodoru. Reakcję substratu o wzorze XX z ylidem sulfoniowym daje epoksydowy związek pośredni, odpowiadający wzorowi XIX
9 A 9 gdzie -A-A-, -B-B-, R i R są takie jak określono we wzorze XX. Korzystnie R oznacza atom wodoru.
W następnym etapie schematu 3 syntezy, pośredni związek o wzorze XIX przekształca się w dalszy związek pośredni o wzorze XVIII
9 gdzie -A-A-, -B-B-, R3 są takie jak określono we wzorze XX. Korzystnie R oznacza atom wodoru. W tym etapie, substrat o wzorze XIX przekształca się w pośredni związek o wzorze XVIII przez reakcję z NaCH(COOEt)2 w obecności zasady w rozpuszczalniku.
189 459
123
Ekspozycja związku o wzorze XVIII wobec gorąca, wody i halogenku alkalicznego óaje pośredni związek óekaśboksyloo'any, odpowiadający wzorowi XVII
XVII gózie -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze XX. Korzystnie RŻ3 oznacza atom wodoru. Sposób przemiany związku o wzorze XX w związek o wzorze XVII odpowiada zasadniczo opisanemu w opisach patentowych 3 897 417, 3 413 288 i 3 300 489, które wyraźnie załączono w niniejszym jako odniesienie. Mimo, że substraty różnią się, mechanizm i warunki wprowadzania cząstki l7-spirolaktonowej są zasadniczo takie same.
Następnie, związek pośredni o wzorze XVII epoksyduje się, np. stosując proces z opisu patentowego 4559332,w celu wytworzenia związku o wzorze XXIV
gózie -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono we wzorze XX. Jednakże, w szczególnie zalecanej postaci realizacji wynalazku, substrat o wzorze XVII epoksyduje się poprzez podwójne wiązanie 9,11 przy użyciu odczynnika utleniającego, zawierającego aktywator nadtlenkowy typu amióu, najkorzystniej trichloroacetamió, zgodnie ze sposobem opisanym powyżej w schemacie 1 dla przemiany enestru o wzorze II w produkt o wzorze I. Warunki i proporcje odczynników dla tej reakcji są zasadniczo takie jak opisano óla przemiany enestru o wzorze II w euoksmeksrenom. Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze XXIV są te, w których -A-A- i -B-B- są takie jak określono we wzorze XIII i R3 oznacza atom wodoru.
Stwierdzono, ze euokyyóację substratu o wzorze XVII można wykonać z bardzo dobrą wydajnością, przy użyciu naókwasu, takiego jak np. kwas m-chlośonaóbenz.oe.sooy Jednakże, odczynnik trichloroacetamióowy zapewnia lepsze wyniki jeśli chodzi o minimalizację tworzenia się produktu ubocznego utlenienia Baytśa-Villagtśa. Ten ostatni produkt uboczny można usuwać lecz wymaga to ucierania z rozpuszczalnikiem, takim jak octan etylu, po czym krystalizacji z drugiego śosuusscsαlnika, takiego jak chlorek metylenu. Związek epoksy o wzorze XXTV odwoóomia się w celu utworzenia podwójnego wiązania między atomami węgla w pozycji 617 przez reakcję z czynnikiem oówOdomiajacym (utleniającym), takim jak DDQ lub chloranil albo przy użyciu sekwencji bśomowmit/oóbśomowania (lub innego chldśowcowamiα/oóchlośowcowwwania). w celu utworzenia drugiego nowego związku pośredniego o wzorze XXIII
124
189 459
XXIII
8 9 gdzie -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono we wzorze XX.
Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze XXIII są te, w których -A-A- i -B-B- są takie jak określono wzorze XIII i r3 oznacza atom wodoru. Mimo, że bezpośrednie utlenienie jest efektywne do tworzenia się produktu o wzorze XXIII, wydajności są generalnie niskie. Korzystnie zatem, utlenienie przeprowadza się w dwóch etapach, pierwszym chlorowcowania substratu o wzorze XXIV w pozycji C-6, następnie odchlorowcowodorowania wobec olefmy 6,7. Chlorowcowanie korzystnie uzyskuje się z użyciem odczynnika N-chlorowcoorganicznego, takiego jak np. N-bromosukcynoimid. Bromowanie przeprowadza się w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak np. acetonitryl, w obecności promotora chlorowcowania, takiego jak nadtlenek benzoilu. Reakcja postępuje efektywnie w rozpuszczalniku, takim jak tetrachlorek węgla, acetonitryl lub ich mieszanina. Jednakże reakcja zwykle wymaga od 4 do 10 godzin do zakończenia. Rozpuszczalnik reakcyjny odpędza się i pozostałość odbiera w rozpuszczalniku mieszającym się z wodą, np. octanie etylu. Uzyskany roztwór przemywa się kolejno średnio alkalicznym roztworem (takim jak wodorowęglan metalu alkalicznego) i wodą lub korzystnie nasyconą solanką w celu zminimalizowania strat produktu, po którym rozpuszczalnik się odpędza i pozostałość odbiera w następnym rozpuszczalniku (takim jak dimetyloformamid), odpowiednim do reakcji odchlorowcowodorowania. Do roztworu dodaje się odpowiedni odczynnik do odchlorowcowodorowania np. 1,4-diazabicyklo[2,2,2]oktan (DABCO) razem z halogenkiem metalu alkalicznego, takiego jak LiBr, roztwór ogrzewa się od odpowiedniej temperatury reakcji, np. 60°C do 80°C i kontynuuje reakcję przez kilka godzin, zwykle 4 do 15 godzin, w celu ukończenia odbromowodorowania. Można dodać dodatkowy odczynnik do odbromowodorowania, zgodnie z potrzebą podczas cyklu reakcyjnego, aby kierować reakcją do końca. Potem, produkt o wzorze XXIII można odzyskać, np. przez dodanie wody do osadu produktu, który następnie oddziela się przez filtrację i korzystnie przemywa dodatkową ilością wody. Produkt korzystnie rekrystalizuje się np. z dimetyloformamidu. Produkty o wzorze XXIII, takie jak 9,11-epoksykanrenon są związkami nowymi, które można izolować przez ekstrakcję/krystalizację. Mają one zasadniczą wartość w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. Przykładowo, można je stosować jako substraty do wytwarzania związków o wzorze XXII.
Stosując zasadniczo sposób opisany powyżej dla wytwarzania związków o wzorze VII, związki o wzorze XXIII reagują z jonem cyjankowym aby wytworzyć nowe związki epoksyenaminowe, odpowiadające wzorowi XXII
XXII
189 459
125 gdzie -A-A-, 43-13-. R3, r8 i R9 są takiz jak określono wz wooroz XX. Szczególnie zalecanymi związkami o wzorze XXII są tz, w których -A-A- i -B-B- są takiz jak określono wzorze XlII i R3 oznacza atom wo-oru.
Produkty o wzorze XXII są związkami nowymi, które można izolować przez wytrącenie i filtrację. Mają one zasadniczą wartość jako pośrz-niz w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXII, -A-A- i -B-Boznaczają -CH2-CH2-, a R3 oznacza atom wodoru.
Przy użyciu zasadniczo sposobu opisanego powyżej -o wytwarzania związków o wzorze VI, związki zpoksyznaminowz o wzorze XXII przekształca się w nowe związki zpoksydikztonowz o wzorze xXi
XXI g-ziz -A-A-, -B-B-, r3, r8 i R9 są takiz jak określono wz wozrzz XIII. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXI, -A-A- i -B-B- oznacza^-C^-C^-, a R3 oznacza atom wo-oru.
Produkty o wzorze XXI są związkami nowymi, którz można izolować przez wytrącenie i filtrację. Mają one zasadniczą wartość jako pośrednie w wytwarzaniu związków o wzorze I, a zwłaszcza o wzorze IA. W najbardziej zalecanych związkach o wzorze XXI -A-A- i -B-Bsą takiz jak określono wz wzorzz XIII. W najbar-zizj zalecanych związkach o wzorze XXI -A-A- i -B-B- oznaczają -CH2-CH2-, a R3 oznacza atom wo-oru.
Stosując zasadniczo sposób opisany powyżej -la wytwarzania związków hydroksyzstrowych o wzorze V ze związków -ikztonowych o wzorze VI, związki zpoksy-iketonowz o wzorze XXI przekształca się w ^wą4>^^k.i o wzorze XXXIII
gdzie -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono wz wzorze XX, a R’ jzst takie jak określono wz wzorze V.
126
189 459
Tak jak w przemianie diketonu o wzorze V w hydrokeyester o wzorze VI, związek pośredni S-e-cyjano^-eetrowy tworzy się także w przemianie epokeydiketonu o wzorze XXI w związki o wzorze XXXII. Pośrednie 5-β-oyjaao-7-estry w obu szeregach można izolować przez traktowanie o-pouiądąjąoego diketonu alkoholem, takim jak metanol w obecności zaea-y, takiej jak Ρ·ϊζ17^οϊ^. Korzystnie, pośrednie związki wytuąroą się przez ogrzewanie w temperaturze urzdaią wobec powrotu ekroplin mieszaniny diketonu w alkoholu, takim jak metanol, zawierającym około 0,1 do około 2 równoważników Metyloaminy na mol -iketonu przez około 4 do około 16 godzin. Produkty izoluje się w poetaci czystej przez ochło-zenie mieszaniny do temperatury około 25°C, po czym filtrację. Wyizolowane związki pośrednie można przekształcać w związki o wzorze XXXII traktując je zasadą, taką jak alkoholan metalu alkalicznego w rozpuszczalniku, korzystnie alkoholu, takim jak metanol. Użycie alkoholanu w alkoholu stabilizuje równowagę mieezaniny po-obną -o tej utworzonej przy traktowaniu o-powia-ającego -iketonu o wzorze XXI w takich samych warunkach.
Oprócz tego, 7β-eeter związku o wzorze XXXlI (np. uoaoro-7-metylo-9,11α-dpoksy-17-hy--okey-C-okso-17α-pregn-4-eno-7β,21--ikąrboksyląn, ^ll^akton) obserwowano przez chromatografię w surowym produkcie końcowego etapu sposobu według schematu 2. Alkoholan i/lub cyjanek w roztworze reagują z produktem przekształcenia 7a-eetru w mieszaninę epimeryczną 70^,^ i jego epimeru 7 e-est-u. Czyety 7 e-ester można izolować z mieszaniny epimerycznej przez krystalizację selektywną.
Korzystnie, związek o wzorze oznacza 4'S(4'α).7'.α-9Ί1αlepokeyhdket^-ekąhy--o-2l(cH),r7'β--imetΛ’lOlc'5,20'ltrioksospirt)[furaa-2(cH),r7'β-[4,7Jmeΐa.ao[r7I i]-c\'klopenta|aj-fdnaatrdao-5-karbonit-yl; związek o wzorze XXII oznacza 5'R(5'α),7'β-20,-ąmino-9,11β-dpokeyhekeąddkahydro-10', 1C '-dimetylo-3',5,10'-trioksotrioksospiro [furąal2(CH), 17'α-(5 ' H)- [7,4] -meteao[4H]-cyklopeatą[a]fenaatreao-5'-kąrUonitryl i związek o wzorze XXIII oznacza kwas 9,11 α-epoksy-17α-hydroksy-C-oksopregaąl4,6-dieno-21 lkąrbokeylouy'. γ-υλΐοι-ι.
W szczególnie zalecanej postaci realizacji, całość eposobu według schematu 2 postępuje następująco:
Epoksymeksrenon
Schemat 3
189 459
127
Schemat 3
Schemat 3 zapewnia korzystny sposób wytwarzania epoksymeksrznoau i innych związków odpowiadających wzorowi I, zaczynając od 11k lub 11P-hydroksylacji androsaenalons lub innego związku o wzorze XXXV
gdzie -A-A-, -B-B- i r3 są takie jak określono we weoroe XIII, wytwarzając związek pośredni, odpowiadający wzorowi XXXVI lub jego odpowiadającemu ioomz-owi 11 [Thydroksy
gdzie -Α-Α-, -B-B- i R są takie jak określono we wzoroz XIII. Z wyjątkiem selekcji subsaraas, sposób prowadzenia 11k-hydroksylacji jest zasadniczo taki jak opisano w niniejszym powyżej dla schematu 1.
Następujące drobnoustroje są zdolne do proep-ow7aoenla nk-hydroksylacji androsteas dionu lub innych związków o wzo-oe XXXV:
Absidia glauca ATCC 22052, Aspergillus flavipes ATCC 1030, Aspergillus foetidus ATCC 1(0254, Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 1 ™500), Aspergillus niger ATCC 11394, Aspergillus nidulans ATCC 11260, Beauveria bassiana ATCC 0159, Fusarium oxysporum ATCC 0601, Fusarium oxysporum cepae ATCC 11101, Fusarium lini ATCC IFO 0156, Gibberella fujikori ATCC 14™42, Hypomyces chyrsospermus IMI 109™91, Mycobacterium forluitum NRRL B™119, Penicillum patulum ATCC 24550, Pycrosporlum Spp. ATCC 12231, Rhizopus arrhizus ATCC 11145, Saccharopolyspora erythraea ATCC 11635, Thamnostylum piriforme ATCC ™992, Rhizopus oryzae ATCC 11145, Rhizopus stolomfer ATCc 6220b i Trichothecium roseum ATCC 12519 i ATCC 8685.
Następujące drobnoustroje są zdolne do przeprowadzania ll p-hydroksylacji 7aa-osteaaioas lub innego związku o wzorze XXXV:
Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus niger ATCC 16™™™ i ATCC 26693, Epicoccum oryzae ATCC 0156, Curvularia lunata ATCC 12010, Cunninghamella blakesleeana ATCC 86887 i Pithomyces atroohvaceous IFO 6651.
128
189 459
11α-Hydrokey4narostl4-eno-3,17-aion lub inny związek o wzorze XXXVI przekształca się następnie w 11α-hydrokey-C,4lrnoloetrr o wzorze (101):
101
Q 1 gdzie -A-A-, -B-B- i R są takie jak określono we wzorze XIII, a R oznacza grupę metylową lub nizszą alkilową (C1 do C4), przez reakcję z odczynnikiem eteryfikującym, takim jak ortomrówczan trialkilu w obecności katalizatora kwasowego. Aby przeprowadzić te przemianę, substrat 11 a-hydroksy zakwasza się przez mieszanie z kwasem, takim jak np. wodzian kwasu beznenosulfonowego lub wodzian kwasu toluenosulfonowego i rozpuszcza w niższym rozpuszczalniku alkoholowym, korzystnie etanolu. Ortomrówczan trialkilu, korzystnie ortomrówczan trietylu wprowadza się stopniowo przez okres od 5 do 40 minut, utrzymując mieszaninę w zimnie, korzystnie w temperaturze około 0°C do około 15°C. Mieszaninę ogrzewa się potem i reakcję prowadzi w temperaturze między około 30°C i około 60°C. Korzystnie, reakcję prowadzi się w temperaturze 30°C do 50°C przez 1 do 3 godzin, potem ogrzewa w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez dodatkowy okres, zwykle 2 do 6 godzin, w celu ukończenia reakcji. Mieszaninę reakcyjną chłodzi się, korzystnie do temperatury 0°C do 15°C, korzystnie około 5?C i rozpuszczalnik usuwa pod zmniejszonym ciśnieniem.
Stosując schemat reakcji opisany powyżej w schemacie 2 dla przemiany związku o wzorze XX w związek o wzorze XVII, do związku o wzorze 101 wprowadza się cząstkę n-spirolaktonu o wzorze XXXIII. Przykładowo, substrat o wzorze 101 może reagować z ylidem sulfoniowym w obecności zasady takiej jak wodorotlenek metalu alkalicznego w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak DmSO, w celu wytworzenia związku pośredniego, odpowiadającego wzorowi 102:
102 gdzie -A-A-, R3, Rn i -B-B- są takie jak określono we wzorze 101. Związek pośredni o wzorze 102 reaguje potem z aieetrem kwasu malonowego w obecności alkoholanu metalu alkalicznego, tworząc pięcioczłonowy pierścień spirolaktonowy i tworząc związek pośredni o wzorze 103
189 459
129
103 gdzie -A-A-, R3, Rh i -B-B- są takie jak określono we wzorze 102, a R12 oznacza grupę C1 do C4 alkilową, korzystnie etylową. Ostatecznie, związek o wzorze 103 w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak dimetyloformamid, poddaje się gorącu w obecności halogenku metalu alkalicznego, oddzielając cząstkę alkoksykarbonylową i tworząc związek pośredni o wzorze 104:
104 gdzie ponownie -A-A-, R , R i -B-B- są takie jak określono we wzorze 102.
Następnie związek 3,4-enoloeterowy o wzorze 104 przekształca się w związek o wzorze
VIII, w którym R8 i r9 razem tworzą cząstkę o wzorze XXXIII. Ten etap utleniania przeprowadza się zasadniczo w taki sam sposób jak etap utleniania dla przemiany związku o wzorze XXIV w związek pośredni o wzorze XXIII w schemacie syntezy 2. Bezpośrednie utlenienie można wykonać stosując odczynnik, taki jak 2,3-dichloro-5,6-dicyjano-1,4-benzochinon (DDQ) lub tetrachlorobenzochinon (chloranil) albo korzystnie dwuetapowe utlenianie wykonuje się najpierw przez bromowanie, np. czynnikiem N-halogenobromującym, takim jak N-bromosukcynoamid (NBS) lub 1,3-dibromo-5,5-dimetylohydantoina (DBDMH), a potem odbromowodorowanie zasadą, np. DABCO w obecności LiBr i gorąca. Jeśli stosuje się NBS do bromowania, do przekształcenia 3-enoloeteru w enon musi być także wykorzystany kwas. DBDMH, raczej jonowy niz odczynnik bromujący w postaci wolnego rodnika, sam jest skuteczny do bromowania i przemiany enoloeteru w enon. Związek o wzorze VIII przekształca się następnie w epoksymeksrenon lub inny związek o wzorze I przez etapy opisane w niniejszym powyżej dla schematu 1. Każdy z pośrednich związków o wzorach 101, 102, 103 i 104 jest związkiem nowym, mającym zasadniczą wartość jako pośredni dla epoksymeksrenonu lub innych związków o wzorach IA i I. W każdym ze związków o wzorach 101, 102, 103 i 104, -A-A-1 -B-B- oznaczają korzystnie -CH2-CH2- i R3 oznacza atom wodoru, nizszą grupę alkilową lub nizszą alkoksy. Korzystnie, R3 oznacza atom wodoru. Najkorzystniej, związek o wzorze 101 oznacza 3-etoksy-llα-hydroksyandrosta-3,5-dien-l7-on, związek o wzorze 102 oznacza 3-etoksyspiro-[androsta-3,5-dieno-l7β,2'-oksiran]-llα-ol, związek o wzorze 103
130
189 459 oznacza wodoroztylo-3-etoksy- 11α- 17a-dihydroksypregna-3,5-dieno-21,21 -dikarboksylan, gamma-lakton, a związek o wzorzz 104 oznacza kwas 3-ztoksy-11α-17α--ihy-roksyprzgna3,5-diznz-21 -karboksylowy, gamma-lakton.
W szczególnie zalecanej postaci realizacji, całość sposobu wz-ług schematu 3 postępuje następująco:
a Hydroksykanrenon Epoksymeksrenon
Zakłada się, że zpoksymzksrznon i inne związki, odpowiadające wzorowi I podobnie można wytwarzać z 11 β-hy-roksyrn-rostzndionu lub innych związków o wzorze XXXV, którz poddano 11e-hy-roksylacji. Innymi słowy, zpoksymzksrznon i inne związki odpowiadające wzorowi I można wytworzyć zgodnie ze sposobem p-zz-łożonym w schemacie 3 stosując albo substrat α-hy-roksylowany o wzorzz XXXV, albo odpowiadający substrat β-hy-roksylowany.
Schemat 4
Znaczna komplikacja syntezy zpoksymzksrznonu i związków pokrewnych potrzebna jzst do stzrzoseiektygnzgz wprowadzenia podstawnika α-7lkoksyk7rbonylowzgo przy atomie węgla w pozycji 7, bzz nieoczekiwanych modyfikacji w innych miejscach struktury steroidowej. Zgodnie z wynalazkiem, odkryto, że szlak efektywnej syntezy -la wprowadzenia grupy 7α-αlaoasykarbonylowzj obejmuje następujące etapy: (i) początkowe cyjanowaniz węgla w pozycji 7 steroidu, (ii) hydrolizę 7-cyjaaostzroiau do postaci mieszaniny steroidów kwasu 7α-aarboasylowzgo i 7e-karboksylowzgo, (III) tworzzniz steroidu 5,7-laatonowzgo z steroidu kwasu 7α-aarboksylowzgz i (iv) oddzielenie steroidu kwasu 7β-k7rboasylowzgo o- 5,7-laktonu stz-oidu Reakcja otwierania 5,7-l7atoau za pośrednictwem zasady odczynnikiem alkilującym dajz żądany steroid 7α-alkoksya7rbonylowy.
189 459
131
W związku z tym, sposób według schematu 4 jest generalnie skierowany na sposób wytwarzania 3-keto-7αlalkokywkarbonylo podstawionego Δ4’5-yteroidu, obejmujący reakcję odczynnika alkilującego z 3-keto-4,5ldihydśo-5.7-lαktonu substratu steroidowego w obecności zasady. Substrat laktonowy podstawia się grupą keto w pozycji 3 i dalej obejmuje cząstkę:
XXX gózie C(5) reprezentuje atom węgla 5 i C(7) reprezentuje atom węgła 7 struktury steroidowej substratu.
Przemianę 5,7llαktdmu w grupę 7α-alkokyykaśbonylo\oą wykonuje się korzystnie przez reakcję z halogenkiem alkilu w obecności zasady.
Odczynnikiem halogenku alkilu jest korzystnie joóek, najkorzystniej jodek metylu.
Dalej zgodnie z wynalazkiem, opracowano korzystny sposób wytwarzania związku 4,5-Oihydro^Y-laktonu steroidu opisanego powyżej.
W tym sposobie, substrat steroidowy 3-keto-Δ4’5-7α-cyJampww przekształca się w kwas k-karboksylowy, a kwas odwrotnie reaguje z ortomrówczanem trialkilu w zakwaszonym rozpuszczalniku nizszego alkoholu, uzyskując 5,7-lakton.
Reakcja z estrami ortomrówczanu przekształca grupę 3lketpnową w 3-acykliczny lub cykliczny ketal-5,7-laktonu (lakton, jak wiadomo, tworzy się najpierw).
Korzystnie, 3-ketalo-5,7-laktom jest 3-óialkiloketalOl5,7-laktonem'
Korzystniej, cząstka alkilowa rozpuszczalnika alkoholowego jest taka sama jak cząstka alkilowa grup alkoksy ortomrówczanu (i najkorzystniej wszystkie są metylowe) ponieważ: cząstki alkoksy ketalu mogą pochodzić albo od ortomrówczanu albo od alkoholu; nie zaleca się mieszanych ketali i zaleca się grupę 3-dimetoksy.
Jeśli ketalem jest ketal etylenowy, cząstka alkilowa rozpuszczalnika alkoholowego nie musi być taka sama jak cząstka alkilowa grup alkoksy ortomrówczanu.
3-Ketalo-5,7-lakton łatwo hydrolizuje óo 3-ktto-5,7-laktomu, związku krystalicznego, który można łatwo oczyszczać'
Ponieważ tylko kwas 7α-karboksyloww przechodzi reakcję laktonowania, realizuje się pełną ytereospecyficzność'
Kwas 7 β można potem usunąć z mieszaniny reakcyjnej w postaci jego soli, np. przez traktowanie kwasu 7 β łagodną zasadą, taką jak wodorowęglan.
Substrat 7-cyjanoww do tworzenia 5,7-laktonu można wytworzyć w znany sposób. Przykładowo, substrat nieuoóytawionw przy atomie węgla 7 może reagować z lekkim nadmiarem jonu cyjankowego, korzystnie około 1,05 óo około 1,25 równoważnika na równoważnik substratu w słabokwasowym roztworze, obejmującym mieszaninę woda/rozpuszczalnik DMSO.
Korzystnie, mieszanina reakcyjna zawiera kwas karboksylowy, np. około jednego równoważnika kwasu octowego na równoważnik substratu.
Zarówno izomer 7a- jak i 7 β-CN tworzą się z 7α-izomeśem jako izomerem głównym. Steroid 7α-cyjano można odzyskiwać w konwencjonalny sposób.
Inne metody znane w technice są uzyteczne w tym pomocniczym wytwarzaniu.
Generalnie zgodnie ze schematem 4, 5,7-lakton można utworzyć ze związku pośredniego 7-kαśobokyylowegp (który sam tworzy się przez hydrolizę związku pośredniego 7-cyjano), który podstawia się w pozycji 17 albo grupą keto, R8 lub r9, gózie RS i R9 są takie jak opisano
132
189 459 powyżej i mają albo alifatyczną, olefmową, epoksydową, albo h9d2okdypoadtawioyą konfigurację przy C-9 i C11, to jest
gdzie -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono powyżej, r8° i r9° są takie same jak R8 i r9 lub r8o i r90 razem stanowią grupę keto, a R18 jest taki jak opisano poniżej pod względem schematu 5, a -E-E- wybiera się spośród
R' >
,21
R i
-CR:
XLIII
XLIV
R'
OR' i
-C
XLV
OR24 R21
-c— +,22
XLVI
-CR21XLVII
189 459
133
Związek o wzorze XLII przekształca się następnie w związek 7α-alkokdykarbonylowy:
XLII
W każdym z XH, XHI, XIII i XLVIII, R8° i r9° razem korzystnie obejmują grupę keto albo
XXXIV gdzie γ1, γ2, X i C(17) są takie jak określono powyżej, a najkorzystniej r8° i r9° razem obejmują
A...../
XXXIII
R oznacza korzystnie H, R oznacza korzystnie grupę metoksykarboyylową, a -A-A- i -B-Bkażat oznaczają korzystnie -CHRłCHR-. Będzie zrozumiałe, ze reakcję można także przeprowadzać z zabezpieczoną grupą 3-keto przez przekształcenie jej w i utrzymanie jej w każdej postaci eteru lub ketalu poprzez sekwencję reakcji. Alternatywne sposoby według schematu 4 obejmują stosowanie różnych związków prś-sdnicb w zakresie wzorów XHI i XIII jakie przytaczano powyżej w niniejszym opisie.
Pamiętając, ze odczynnikiem do tworzenia 5,7-laktonz z kwasu 3-keto-Δ4’5ł7łkarboksytowego przez schemat 4 jest ortomrówcztn trialkilu, taki sam odczynnik stosowany do przemiany 11 α-bydroks9androsteydioyu w związek pośredni 3łeyoloeterOł3,5-dieno-Πα-h9aroks9lowy o wzorze 101 ze schematu 3, uważa się, że szlak według reakcji ze schematu 4 zalezy od podstawienia przy C-7. Reakcja z o2tom-ówcoayem w obecności H+ tworzy pośredni jon kt-Uoaiowy, mający grupę karboksylową przy C-7 i jest dodatnio naładowany, w równowadze między C-3 i C-5. Przy utracie protonu, jon karboniowy C-3 daje związek o wzorze 101, podczas gdy jon ka-Uoniow9 C-5 daje lakton. Z atomem wodoru przy C-7 uważa się, ze przewaza 3,5-aieyo-3-alkoksy(eyoloete-), z powodu sprzężenia podwójnego wiązania. Z grupą 7α-^2 przy C-7, jon karboniowy C-5 jest chwytany przez grupę karbokd9 i tworzy
134
189 459 się 5,7-lakton. W tym punkcie, grupę 3-keto przeważnie przekształca się w ketal, napędzając przez to reakcję do końca.
Zalecane postacie realizacji schematu 4 opisuje się w schematach 5 i 6 poniżej.
Schemat 5
Schemat 5 rozpoczyna się takim samym subst^t^ jak schemat 2, to jest związkiem o wzorze XX. Ten substrat utlenia się najpierw do związku o wzorze B:
•3 gdzie -A-A-, R i -B-B- są takie jak określono we wzorze XIII. Reakcję utleniania prowadzi się zgodnie z każdym ze schematów reakcji opisanych powyżej dla przemiany związku o wzorze XXIV w pośredni związek o wzorze XXIII w syntezie według schematu 2. Stosując sposoby opisane w schemacie 4, związek o wzorze B przekształca się w związek pośredni 7cyjano o wzorze C:
gdzie -A-A-, R3 i -B-B- są takie jak określono we wzorze XIII. Następnie, związek o wzorze C przekształca się w 5,7-lakton o wzorze D:
D gdzie -A-A-, R3 i -B-B- są takie jak określono we wzorze XIII, a R17 oznacza grupę C1 do C4 alkilową, przy użyciu odczynnika ortomrówczanu trialkilu. 5,7-Lakton o wzorze D oddziela
189 459
135 się łatwo od aieprzerdagouanego 7lβlCOOH, np. przez usunięcie kwasu poprzez przemycie wo-orouęgląaem, ustalając przez to żądaną C-7 stereochemię i hamując epimeryzację w następnych reakcjach, które prowadzi się w warunkach zasa-owych. Eetryfikacją laktonu przez reakcję z halogenkiem alkilu, jaką opisano w schemacie 4, daje daeetrouy związek pośredni o wzorze II.
Kontynuując syntezę ze schematu 5, związek o woorod D przekształca się w związek o wzorze II. Z grupą C-keto zabezpieczoną przez przekształcenie w ketal, grupę 20^-oksanowąo wzorze XXXIII selektywnie wproua-za się w pozycji 17, zgodnie ze schematem reakcji opisanym powyżej dla schematu C powyżej, tworząc przez to związek o wzorze E
E
Ponieważ c-keton jeet zabezpieczony, można wybrać warunki hydrolizy, które eą optymalne dla zaatakowania 17-ketonu bez troski o tworcenie się produktów ubocznych w reakcji w pozycji C. Po hydrolizie C-ketalu związku o wzorze E do grupy C-keto struktury o wzorze F
ten ostatni związek pośredni reaguje z jodkiem alkilu w obecności zasady, przez przemianę według schematu 4, w celu utworzenia pośredniego eneetru o wzorze II. Wreszcie, ostatni związek pośredni przekształca się w epoksymekerenon lub inny związek o wzorze I, przy użyciu każdego ze eposobów opisanych powyżej dla schematu 1.
Schemat 5 daje korzyści nie tylko z kontrolowania stereochemii uzyskanej przez związek pośredni 5,7-laktonowy, lecz uczestniczy w -alezej korzyści pozwalając na szerszy zakres warunków hydrolizy bez zakłócania 17-epirolaktoat.
Tak jak w reakcjach -la innych schematów eyntezy według tego wynalazku, reakcje według schematu 5 można etosować do przemiany substratów innych niz te szczególnie opisane powyżej. Tak więc, np. przemianę C-keto- lub C-keta^^-cyjano steroidów w C-keto- lub C-ketalo-5,7-lakton, albo przemiana C-keto- lub C-ketalOl5,7llaktonu w 7α-alkoksykąrUonyl, moż136
189 459 na przzprowa-zić na związkach podstawionych przy atomie węgla 17 przez R8 i r9 określone powyżej lub konkretniej przez podstawnik o wzorzz:
CH 7) iiiu( CHj) 2 - C - X
XXXIV gdzie X, Y1 i Y2 są takie jak określono powyżej i C(17) wskazuje na atom węgla 17. Jednakże, realizuje się ważne korzyści, zwłaszcza w ekonomice procesu, prozo użycie specyficznej szkwzncji reakcji, stosując substraty 17-kzto i postępując zgodnie z konkretnym schematem reakcji opisanym powyżej dla wprowadzenia 17-spirolaktonu i 7α-7laoksykαrbonylu do steroidu Δ9’11.
Laktony o wzorze D, E i F są związkami nowymi, które są użyteczne w wytwarzaniu epoksyne konenonw i rznych zw-ązków w wkorzi I i IA zgonie z syntezą wedłwg yehgmatu 5. W tych związkach, -A-A- i -B-B- są korzystnie -CFI-CI-U-i R3 oznacza atom wodoru, nizszą grupę aUdk^ lcb nASAi grupę akąksy Nątkorzystaiej, zw-9^ o wza-ze D jwst toki, ne Rią ozuiacza grupę metoksy.
W grupę g&rne zalecanej postaci realizacji, całość sposobu według schematu 5 postępuje następuj ąeo:
Schemat 6
189 459
137
Schemat 6
Schemat 6 jest taki sam jak schemat 5 przez tworzenie się pośredniego związku 7-cyjanowego o wzorze C. W następnym etapie schematu 5, steroid 7-cyjano reaguje z ortomrowczanem trialkilu w rozpuszczalniku alkanolowym, korzystnie ortomrowczanem trimetylu, w celu równoczesnego zabezpieczenia grup 3-keto i 17-keto, przez przekształcenie tej pierwszej w enoloeter i drugiej w ketal. Potem, grupę 7-cyjano redukuje się do 7-formylu, np. przez reakcję z wodorkiem dialkiloglinowym, korzystnie wodorkiem diizobutyloglinowym, tworząc przez to związek o wzorze 203:
203 gdzie -A-A-, R3 i -B-B- są takie jak określono we wzorze XIII, a R?8 oznacza grupę C1 do C4 alkilową. Przed zabezpieczeniem grup ketonowych jak opisano powyżej, zapobiega się ich redukcji przez wodorek dialkiloglinowy. Związek pośredni o wzorze 203 reaguje następnie z rozcieńczonym wodnym roztworem kwasu w celu selektywnej hydrolizy 17-ketalu w obecności nadmiaru alkoholu (R^OH), tworząc związek pośredni o wzorze 204:
[204] gdzie R19 wybiera się spośród niższej grupy alkilowej (korzystnie C1 do C4) lub grup R19 w pozycji 3, tworząc cykliczną grupę O,O-oksyalkilenooksy przy atomie węgla 3. Hemiacetal [204] zabezpiecza się dalej przez traktowanie alkoholem (R*9OH) w obecności niewodnego kwasu w celu utworzenia związku pośredniego o wzorze 205:
[205]
138
189 459 gdzie -A-A-, r3 i R19 sątak-etak (^1-ζ611^ι^ο powyzcJ i R20 oznacza grapę Ci do C4 akkiIową. Cząstkę 10-spl-olaktons można następnie wprowadzić ogodaiz z etapami reakcji opisanymi powyżej dla schematu 3, postępując zgodnie z sekwencją zaznaczoną poniżej:
[207] -»
gdzie -A-A-, -B-B-, R\ R’9 i R20 są takie jak określono powyżej i R25 oznacza grupę Ο do C4 alkilową.
189 459
139
Potem, pozycję 3 odbezpiecza się przez konwencjonalną hydrolizę w celu ponownego wprowadzenia grupy 3-ketonowej i 5,7-hemiacetalu, tworząc dalszy związek pośredni, odpowiadający wzorowi 209:
[209] gdzie -A-A-, -B-B- i R.3 są takie jak określono powyżej. Następnie, cząstkę 9,11-epoksydową wprowadza się ogodyiz z każdym ze sposobów opisanych powyżej dla przemiany związków o wzorze II w związki o wzorze I. W warunkach utleniających reakcji epoksydacji, hemiacetal częściowo przekształca się w 5,7-laktoy, tworząc przez to dalszy związek pośredni, odpowiadający wzorowi 211
gdzie -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak ok-eślryo powyżej. Każdy pozostały 9,11-zppoksył5,7łbemlacetalow9 pośredni produkt reakcji o wzorze 210:
[ 210 ] o
gdzie -A-A-, -B-B- i R są takie jak określono, łatwo utlenia się konwencjonalnymi sposobami do związku o wzorze 211. Wreszcie, pośredni związek o wzorze 211 przekształca się do epoks9meksreyoyu lub innych związków o wzorze I, przy użyciu sposobu opisanego w schemacie 4 dla przemiany 5,7-laktonu w związek 7α-alkokd9karUon9lowy. Tak więc całość,
140
189 459 schemat 6, postępuje następująco, rozumiany jako co najmniej następujące etapy, które można przeprowadzać in situ bez odzyskiwania związków pośrednich. Całość, synteza według schematu 6 postępuje następująco:
1211] ___ Eplcrenon
189 459
141
Jak w wypadku schematu 5, reakcje opisane powyżej dla schematu 6 oferują ważne korzyści, zwłaszcza pod względem ekonomiki procesu; lecz nowe reakcje według schematu 6 mają także bardziej ogólne zastosowania wobec substratów innych niż te konkretnie opisane. Przykładowo, wprowadzenie grupy y-formylowej óo 3-enolotteśosttroidu, zabezpieczenie otrzymanego 7-formylOlA-5,6-3,4-endlotteśu, hydrolizę do 5,7-hemiacetalu i kolejne odbezpieczenie, można prowadzić na steroidach podstawionych w pozycji 17 przez R8 i R9 określone powyżej, lub konkretniej, przez grupę o wzorze
Hlll( CHj) 2 ·
X
XXXIX
7 gózie X, Y , Y i C( 17) są takie jak określono powyżej.
Alternatywne sposoby według schematu 6 obejmują użycie różnych związków pośrednich w zakresie wzorów A203 do A210, odpowiednio, w niniejszym puiyie powyżej. Każdy z tych związków pośrednich o wzorach A203 do A211 jest związkiem nowym, który jest użyteczny w wytwarzaniu epokyymekyrenomu i innych związków o wzorze I i IA zgodnie z syntezą według schematu 6.
W szczególnie zalecanej postaci całość sposobu według schematu 6 postępuje następująco:
Twa
Wet
H
142
189 459
Z kilku schematów zilustrowanych powyżej będzie zrozumiałe, że etapy reakcji wybrane do stosowania według wynalazku, zapewniają zasadniczą elastyczność w produkcji epoksymeksrenonu i związków pokrewnych.
Kluczowe cechy obejmują między innymi:
(a) biokonwersję eubetr4tu, takiego jak kanrenon, 4ndroetendion lub β-eitoeterol w pochodną 11 a- lub -9α-hyarokeylową (z równoczesną przemianą β-eitosterolu w strukturę 17-ketonową;
(b) wprowadzenie podwójnego wiązania 9,11 przez odwodnienie związku zawierającego albo grupę 11α-, albo -9αlhydroksylową, po czym wprowadzenie grupy epoksy przez utlenienie podwójnego wiązania 9,11;
(c) dołączenie 7α-alkokeyk4rbonylu przez utworzenie enaminy, hydrolizę enaminy do diketonu i reakcję diketonu z alkoholanem metalu alkalicznego;
(d) tworzenie pierścienia 20-epirokeαnowrgo w pozycji 17;
(e) tworzenie 5,7-laktonu i estryfikację laktonu do 7-alkoksykarbonylu;
(f) zabezpieczenie 3-ketonu przez przemianę w 3-enoloeter lub 3-ketal podczas różnych przemian przy innych pozycjach (łącznie z tworzeniem się pierścienia 20-spirokeanowrgo w pozycji 17).
Z kilkoma ograniczeniami, te cztery elementy składowe sposobu (b) do (d) można prowadzić w prawie każdej kolejności. Elementy sposobu (e) i (f) oferują porównywalną elastyczność.
Zapewniają one drogę do rpoksymekerenonu i innych związków o wzorze I, które są znacznie prostsze w porównaniu z procesem z opisu patentowego U.S. nr 4 559 332. Ponadto, zapewniają ważne korzyści w produktywności i wydajności.
W opisach schematów reakcji jakie przedłozono powyżej, odzyskiwanie, izolację i oczyszczanie produktów reakcji, można generalnie przeprowadzić metodami dobrze znanymi dla specjalistów. Z wyjątkiem oznaczeń przeciwnych, warunki, rozpuszczalniki i odczynniki są konwencjonalne.
Jednakże, pewne konkretne procedury jakie szczególnie opisano powyżej, zapewniają korzyści, które nadają przeważającą wydajność całości i/lub produktywność różnych etapów sposobu i schematów sposobu i/lub wysoką jakość związków pośrednich oraz ostatecznych produktów 9,11lrpoksyeterodiowych.
Wykorzystanie związków 20-spiroksanowych wytworzonych według wynalazku opisuje się w opisie patentowym Groba U.S. nr 4 559 332, który specjalnie załącza się do niniejszego opisu jako odniesienie.
Związki 20-epiroksanowe wytworzone według wynalazku, odróżnia się przez przeważające biologiczne wlaeciwoeci i są zatem wartościowymi aktywnymi składnikami farmaceutycznymi.
Przykładowo, mają silne działanie antagonietycznr wobec aldosteronu, redukując i normalizując nadmiernie wysoką retencję sodu i wydzielanie potasu powodowane przez aldosteron. Mają zatem, jako chroniące potas, ważne zastosowania terapeutyczne, np. w leczeniu nadciśnienia, niewydolności serca lub marskości wątroby.
Pochodne 20lspiroks4nowe, mające działanie antagonisty^^ wobec aldosteronu są znane, patrz np. Fieser i Fieser: Steroids; strona 708 (Renhol- Publ. Corp., Nowy Jork, 1959) oraz brytyjska publikacja patentowa nr 1 041 534; znane są także analogicznie aktywne kwasy 17β-hyaroksy-21-karboksylowe i ich sole, patrz np. opis patentowy nr U.S 3 849 404
Związki z tego rodzaju, które dotychczas stosowano w terapii, mają jednak poważne wady, ponieważ posiadają pewną aktywność specyficzną wobec seksualności, która prędzej czy później, daje kłopotliwe konsekwencje w zwyczajowej terapii długoterminowej.
Zwłaszcza niepożądane są kłopotliwe skutki, które można przypisywać aktywności anty-anarogrnicznej znanych preparatów anty-aldoeteronowych.
Sposoby, procesy i związki według wynalazku i warunki oraz odczynniki stosowane w niniejszym, opisuje się dalej w następujących przykładach.
Przykład 1
Wytworzono skosy z pożywką wzrostową, jaką przedłożono w tabeli 1.
189 459
143
Tabela 1
YPDA (pożywka dla skosów i płytek)
Ekstrakt a-reaeeny 20 g
P-pton 20 g
Glukoza 20 g
Agar 20 g
Woda destylowana, q. s. do - pH jaki- j-st 6,0 - ustawić przy pH 5 za pomocą 10% H3PO4 cięzar/objętość 1000 ml
aredidseoedaid - dla skosów 0,5 ml w ^0 x mm rurkach - dla płytek (10 cm Φ) 25 ml w 200 x 20 mm rurkach - wyjaławiać w addpdr7au-ed 120°C pre-e 20 minut - pH po nyJ7łenidaisl 5
Aby wytworzyć kultury pierwszego pokolenia, kolonię Aspergillus ochraceus zawieszono w wodzi- destylowanej (2 ml) w rurc- tzstow-j i do każdego ze skosów nałożono 0,15 ml równych ilości tej zawiesiny, którą wytworzono jak opisano powyżej. Skosy inkubowano p-eeo siedem dni w temperaturze 25°C, po których pojawienie się kultury powie-oohalowej było w postaci białej, bawełnianej grzybni. Odwrotna strona była plkmzatow7a7 na pomarańczowo w nizszej części i zółto-pomarańczowa w wyższej części.
Kultury pierwszego pokolenia ze skosów oawidsooao w jałowym roztworze (4 ml), zawi-rającym niejonowy środek powiereohalowo czynny Twzen (3% wagowo) i 0,15 ml równe ilości tej zawiesiny użyto do zaszczepienia skosów drugiego pokolenia, które wyawos rzono z użyciem pożywki wzrostowej przedłożonej w tabeli 2.
Tabela 2 dla skosów prkrldai7 i -sayarnyoh
Ekstrakt słodowy 20 g
P-pton 1 g
Glukoza 20 g
Agar 20 g
Woda destylowana, q s. do - pH jaki- j-st 5,3 - rozmi-ścić w rurkach (^0 x mm) 0,5 - wyjaławiać w admpdr7au-ed 120°C prede 20 minut 1000 ml
Skosy drugizgo pokolenia inkubowano przez 10 dni w temper7turoz 25°C, wytwarzając oaroamki o dużej masie, zabarwione na złoto; odwrotna strona zabarwiona była na brązowopomaranczowo.
Wytworzono pożywkę zabezpieczającą, mającą skład p-oedłoooay w tabeli 3.
144
189 459
Tabela 3
PtZyukt zabezpieczająca
Mleko odtłuszczone tog
Woda ddstyltutaą 100 g
W 50 ml kolbie, otuid-tjącdj 100 ml wody ddetyltuąadj w temperaturze 50°C dodać mleko odtłuszczone. Wyjaławiać w tddpd-ttt-od 120°C przez 15 minut. Ochłodzić w tddpd-ttt-od CC °C i używać przed otktńl czeniem dnia
Kultury z pięciu skosów drugiego pokoldaią zawieszono w roztworze zabezpieczającym (15 ml) w 100 ml kolbie. Zawiesinę roomideocoono w równych ilościach (0,5 ml każda) w 100 x 10 mm rurkach w celu liofilizacji. Wstępnie je zamrożono w temperaturze -70°C do -80°C w łaźni aceton/euchy lód przez 20 minut, potem przeniesiono bezpośrednio -o pomieszczenia -o suszenia, wstępnie ochłodzonego -o temperatury -40°C -o -50°C. Wstępnie zamrozone równe ilości liofilizowano w ciśnieniu resztkowym, wynoszącym 50 pg Hg i < -C0°C. Przy końcu liofilizacji, do każdej rurki ze wskaźnikiem wilgotności dodano dwie do trzech granulek jałowego zelu krzemionkowego i uszczelniono w płomieniu.
Aby otrzymać ekoey kultur matecznych do fermentacji na skalę przemysłową, pojedynczą równą ilość liofilizowanej kultury, którą wytworzono w epoeób opieany powyżej, zawieszono w wodzie destylowanej (1 ml) i 0,15 ml równej ilości zawiesiny użyto do zaszczepienia ekosów, które zaopatrzono w pożywkę wzrostową, mającą skład proeaSożoay w tabeli 2. Skoey mateczne inkubowano przez eiedem dni w temperaturze 25°C. Przy końcu inkubacji, kulturę rozwiniętą na skosach oąkonseruowąao w temperaturze 4°C.
Aby wytworzyć rutynową kulturę na skosie, kulturę ze skosów matecznych zawieszono w jałowym roztworze (4 ml), zawierającym Tween 80 (C% wagowo) i otrzymaną zawiesinę rooprową-zoao w 0,15 ml równej ilości wśród skosów, które powleczono pożywką wzrostową opisaną w tabeli 2. Kultury skosów rutynowych można etosować -o zaszczepienia kolb z pierwotnym posiewem do fermentacji laboratoryjnych lub przemysłowych.
Aby wytworzyć kolbę z kulturą do pierwotnego posiewu, kulturę ze ekosu rutynowego, który wytworzono jak opisano powyżej, usunięto i zawieszono w rootwo-oe (10 ml), zawierającym 80 (C% wagowo). Do 500 ml kolby z przegrodą, zawierającej pożywkę wzrostową, mającą ekła- przedstawiony w tabeli 4, wprowadzono 0,1 równą ilość otrzymanej zawiesiny.
Tabela 4 dla kultury pid-uttadj i kolby trtasίo-mtcyjadj trtz kolby okrągStadaadj
Glukoza 20 g
Pepton 20 g
Auttlίott d-todotuy 20 g
Woda ddetyltutat, q s. do - pH jakie jest 5,2 - ustawić przy pH 5,8 20% NaOH - -toprouądoić w 500 ml kolbie z przegrodą 100 ml - -top-tutdoić w 2000 ml tkrągSoddnnych kolbach (C p-odg-tdy) 500 ml - uyJtStuitć w temperaturze 120°C p-zez 20 minut - pH po uyjtStuidnit uyatsiSt tktłt 5,7
Kolbę z posiewem inkubowano na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów na minutę, 5 cm przemieszczenia) przez 24 godziny w temperaturze 28°C, wytwarzając przez to kulturę w postaci grzybni podobnej do grudki, o średnicy wyaoeoąodj C do 4 mm. W czasie oUserwa189 459
145 cji mikroskopowej zauważono, ze kultura posiewowa jest kulturą czystą, o synchronicznym wzroście, dużej strzępce i dobrze skręconą. pH zawiesiny wynosiło 5,4 do 5,6. PMV wynosiło 5 do 8% jak określono przez wirowanie (3000 obrotów na minutę x 5 minut).
Kolbę z kulturą transformacyjną wytworzono przez zaszczepienie pożywki wzrostowej (100 ml) mającej skład przedłożony w tabeli 4, w drugiej 500 ml kolbie do wytrząsania za pomocą biomasy (1 ml) z kolby z kulturą posiewową. Otrzymaną mieszaninę inkubowano na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów na minutę, 5 cm przemieszczenia) przez 18 godzin w temperaturze 28°C. Kulturę przebadano i odkryto, że zawiera grzybnie podobne do grudek o średnicy 3-4 mm. Po badaniu mikroskopowym, kulturę określono jako czystą, o synchronicznym i nitkowatym wzroście, w której komórki wierzchołkowe są pełne cytoplazmy, a komórki starsze są nieco zwakuolizowane. pH zawiesiny kultury wynosiło 5 do 5,2 i PMV określone przez wirowanie wynosiło między 10% i 15%. W związku z tym, kulturę określono jako odpowiednią do transformacji kanrenonu w Πα-hydroksykanrenon.
Kanrenon (1 g) mikronizowano do około 5 μ i zawieszono w jałowej wodzie (20 ml). Do tej zawiesiny dodano: 40% (ciężar/objętość) jałowego roztworu glukozy; 16% (ciężar/objętość) jałowego roztworu autolizowanych drożdży; oraz jałowy roztwór antybiotyku; wszystkie proporcje zaznaczono dla 0 godziny czasu reakcji w tabeli 5. Roztwór antybiotyku wytworzono przez rozpuszczenie siarczanu kanamycyny (40 mg), tetracykliny HCl (40 mg) i cefaleksyny (200 mg) w wodzie (100 ml). Zawiesinę steroidu, roztwór glukozy i autolizowanych drożdży dodano stopniowo do kultury, zawartej w kolbie do wytrząsania.
Tabela 5
Wskaźnikowe dodanie steroidu i roztworów (dodatki i antybiotyki) w przebiegu biokonwersji kanrenonu w kolbie do wytrząsania
Czas reakcji (godziny) Zawiesina steroidu (ml mg w przyblizeniu) Roztwór glukozy (ml) Roztwór autolizowanych drożdży (ml) Roztwór antybiotyków (ml)
0 1 50 1 0,5 1
8 2 100 2 1
24 2 100 1 0,5 1
32 5 250 2 1
48 2 100 1 0,5 1
56 5 250 2 1
72 3 150 1 0,5 1
90
W czasie postępu reakcji, mieszaninę reakcyjną okresowo analizowano w celu określenia zawartości glukozy oraz przez chromatografię cienkowarstwową w celu określenia przemiany w Πα-hydroksykanrenon. Do fermentacyjnej mieszaniny reakcyjnej dodano dodatkowy substrat kanrenonu w czasie reakcji w kontrolowanym tempie, w celu utrzymania zawartości glukozy w zakresie około 0,1% wagowego. Tryb dodawania dla zawiesiny steroidu, roztworu glukozy, autolizowanego roztworu drożdży i roztworu antybiotyków przedłozono w tabeli 5. Reakcję transformacji kontynuowano przez 96 godzin w temperaturze 25°C na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów na minutę i 5 cm przemieszczenia). Zakres pH wynosił między 4,5 i 6 podczas fermentacji. Jeśli PMV osiągało lub przekraczało 60%, oo^t^iią^ian^o 10 ml porcję bulionu hodowlanego i zamieniano na 10 ml wody destylowanej. Zniknięcie kanrenonu i pojawienie się 11 α-hydroksykanrenonu monitorowano podczas reakcji przez próbkowanie bulionu w przerwach 4, 7, 23, 31, 47, 55, 71, 80 i 96 godzin po rozpoczęciu cyklu fermentacyjnego, i analizowanie próbek przez TLC. Postęp reakcji jaki określono z tych próbek, przedłozono w tabeli 6.
146
189 459
Tabela 6
Czas przebiegu Uirkrawsrtji kta-saraz w kolbie do wytrząsania
Czas (grazia9) Tempo trtatformtoji
Ktarsara RF = 0,81 11α-h9arrkt9ktarsara RF = 0,29
0 100 0,0
4 50 50
7 20 80
23 20 80
31 30 70
47 20 80
55 30 70
71 25 75
80 15 85
96 -10 -90
Przykład 2
Pie-wrtaą kulturę posiewową w kolbie do wytrząsania wytworzono w sposób opisany w przykładzie 1. Wytworzono mieszaninę o-zywczą, mającą skład prze-łozony w tabeli 7
Tabela 7
Kultura do t-tntformtoji w 10 1 Uirrstktrrzs szklanym
Ilość g/l
Glukoza 80 g 20
Pepton 80 g 20
Aztrlizrwtas -toż-żs 80 g 20
Śrrask p-zsoiwpismąo9 SAG 471
Wo-a asjraiorwtat q. s aby - wyjałowić pusty Uirrstktrr przez 30 minut w tsmpsrttzros 130°C - otłt-rwtć go 3 l wo-y -sjraiorwtasj, ogrzać -o temperatury 40°C - -o-ać przy mieszaniu tkłt-mki pożywki - mieszać przez 15 minut, tprrwt-oić objętość -o 3,9 1 - pH jakie jest 5,1 -ustawić na 5,8 NaOH 20% ciężar/objętość - wyjałowić w tsmps-ttzros 120°C x 20 minut - pH po wyjałowieniu 5,5-5,7 41
Początkowy załadunek tej mieszaniny odzywczej (4 l) wprowadzono do Uio-eakto-t fe-meatac9jyego, wynoszącego 10 l objętości geometrycznej. Bioreaktor był kształtu cylmd-yozysgo o stosunku wysokości do S-eayic9, wynoszącym 2,58. Zaopatrzono go w mieszalnik turbinowy o 400 obrotach na minutę, mający dwa koła talerzowe nr 2, o 6 ostrzach każde. Zewnętrzna ś-eaaica wirnika wynosiła 8θ mm, każde z 0dt209 miało promień 25 mm i 30 mm wysokości, górne koło ustawiono 280 poniżej wierzchołka naczynia, dolne koło znajdowało się 365 mm poniżej wierzchołka, a przegrody naczynia miały 210 mm wysokości i scboaoił9 się promieniście do wewnątrz 25 mm od wewnętrznej ściany pionowej naczynia.
189 459
147
Kulturę posiewową (40 ml) wymieszano z l7dnnaizD odżywczym do biozzaatoz7 i ustabilieow7nz kulturę transformacyjną arzzo inkubację arzzz 2 godziny w tZDazz7tnroz 28°C i tempo napowietrzania, wynoszące 0,5 1/1 minutę pr^r^^ ciśnieniu 0,5 kg/cm2. Po 22 godzinach PMV kultury wynosiło 20-25%, z pH - 5 -o 5,2.
Wytworzono zawiesinę zawierającą kzazznon (80 g) w jałowej wo-ziz (400 ml) i 10 ml porcję dodano -o mieszaniny w biorzzato-zz fzrDzntzcyjnyD. W tym samym czasie -o-mo 40% (cięzar/objętość) jałowego roztworu glukozy, 16% (cięzar/objętość) jałowego roztworu antollzowanycb -roż-ży i jałowy' roztwór antybiotyków, w proporcjach z7onzczonycb w tabeli 8 o 0 czasie reakcji. Roztwór antybiotyków wytworzono w sposób opisany w przykładzie* 1.
Tabela 8
Wskaźnikowe dzaralr stz-ziaóg i -zetgz-óg (dodatki i antybiotyki) w azezbizon bizkzagz-sji ara-zazan w 10 l seklraeD bizzzratzzez
Czas reakcji (ozaeiae) Zrgizsiar stz-zian Rzetgóz glukozy (ml) Rzetgó- rntzliezgαi nych drożdży (ml) azetgóz antyblzteaóg (ml)
ml o w azeyblizzain
0 10 4 25 12,5 40
4 25 12,5
8 10 4 25 12,5
12 25 12,5
16 10 4 25 12,5
20 25 12,5
24 10 4 25 12,5 40
28 10 4 25 12,5
32 12,5 5 25 12,5
36 12,5 5 25 12,5
50 12,5 5 25 12,5
44 12,5 5 25 12,5
48 12,5 5 25 12,5 40
52 12,5 5 25 12,5
56 12,5 5 25 12,5
60 12,5 5 25 12,5
64 12,5 5 25 12,5
68 12,5 5 25 12,5
72 12,5 5 25 12,5 40
76 12,5 5 25 12,5
80
84
88
148
189 459
W czasie postępu reakcji, mieszaninę reakcyjną analizowano ok2edowo w celu określenia zawartości glukozy i przez chromatografię cienkowarstwową w celt określenia przemiany w 11α-h9alΌkdykan2zaoa. Na podstawie analizy THC próbek bulionu reakcyjnego jak opisano w niniejszym poniżej, dodano dodatkowy kaa2eaoa -o mieszaniny reakcyjnej, w miarę zużywania duUstratz kaa2znoaz. Monitorowano także poziom glukozy i jeśli stężenie glukozy spadało do około 0,05% wagowo lub niżej, dodawano uzupełniający roztwór glukozy, aby doprowadzić stężenie -o około 0,25% wagowo. Dodawano także dkła-nlke odżywcze i antybiotyki w o-dzielnym czasie w trakcie cyklu reakcyjnego. Tryb dodawania -la zawiesiny steroidu, roztworu glukozy, roztworu autolioowanych drożdży i roztworu antybiotyków p-zz-Iozono w tabeli 8. Reakcję transformacji kontynuowano przez 90 godzin i przy tempie napowietrzania, wynoszącym 0,5 objętości powietrza na objętość płynu na minutę (vvm) przy dodatnim ciśnieniu głównym, wynoszącym 0,3 kg/cm2. Temperaturę utrzymywano przy 28°C -o osiągnięcia przez PMV 45%, następnie omaiejdzoao temperaturę do 26°C, a potzm kontrolowano przy 24°C. Początkowe tempo mieszania wynosiło 400 obrotów na minutę, zwiększając do 7θ0 obrotów na minutę po 40 godzinach. pH utrzymywano między 4,7 i 5,3 przez dodawanie 2 M kwasu ortofosforowego lub 2M NaOH, jak zaznaczono. Pienienie kontrolowano przez dodawanie kilku kropli Aatefoam SAG 471 w miarę pojawiania się piany. Znikanie kam-enonz pojawianie się 11α-h9d2okdykanrenoaz monitorowano co 4 godziny podczas reakcji, przez analizę THC próbek bulionu. Gdy większość kan2eaoaz zniknęła z bulionu, dodano do więcej.
Po dodaniu całego kaa2zaoaz, reakcję zakończono gdy analiza THC wykazała, ze stężenie duUst-atu kaa2zaoaowego w stosunku do produktu 11α-h9drokdykaa-eaonowego spa-ło -o około 5%.
Na kończ cyklu reakcyjnego, bulion fermentacyjny przesączono przez chustę derowa-ską w celu oddzielenia grzybni od płynnego bulionu. Frakcję z grzybnią zawieszono w octanie etylu przy użyciu około 65 objętości (5,2 litra) na gram kaa2eaonu załadowanego w trakcie reakcji. Zawiesinę grzybni w octanie etylu ogrzewano w tempe2atu2oe wrzenia wobec powrotu skroplin przez je-ną godzinę przy mieszaniu, ochłodzono do około 20°C i przesączono na lejkz Buchnera. Placek grzybni przemyto kolejno octanem etylu (5 objętości na g ładunku kaa2enoaz; 0,4 1) i wodą -ejoaizowaaą (500 ml) w celu usunięcia ekstraktu octanu etylu z placka. Placek filtracyjny zniszczono. Bogaty ekstrakt, pozostałość po przemyciu rozpuszczalnikiem i pozostałość po przemyciu wodą oeb2aao w depa-atoroe, potem pozostawiono na godziny do roodzeeleaia faz.
Fazę wodną zsunięto potem, a fazę organiczną oatężoao pod omaezjdzoa9m ciśnieniem do końcowej objętości, wynoszącej 350 ml. Naczynia dedt9larke ochłodzono do temperatury 15°C i utrzymywano przy mieszaniu przez około jedną godzinę. Otrzymaną zawiesinę filtrowano w celu zsunięcia krystalicznego produktu, a placek filtracyjny przemyto octanem etylu (40 ml). Po wysuszeniu, określono wydajność 11α-h9drokd9kan2znoaz na 60 g.
Przykład 3
Wytworzono zawiesinę oaroaników z rutynowego skosu w sposób opisany w przykładzie 1. W 2000 ml kolbie okrągło-ennej z przegrodami (3 p-ozgro-9, każda 50 mm x 30 mm), wprowadzono równe ilości (0,5 ml) zawiesiny zaro-ników do roztworu odżywczego (500 ml), mającego skład przedłozony w tabeli 4. Otrzymaną mieszaninę iakuUowano w kolbie przzz 24 godziny w temperaturze 25°C na wytrząsarce aaproemianległeJ (120 suwów na minutę; przemieszczenie 5 cm), wytwarzając przez to kulturę, która po badaniz mikroskopowym okazała się kulturą czystą, z dobrą grzybnią, i skręconą. pH kultury wynosiło między około 5,3 i 5,5, aPMV (jak określono przez wirowanie przy 3000 obrotach na minutę) wynosiło 8 do 10%. Przy użyciu tak wytworzonej kultury, wytworzono kulturę posiewową w bioreaktorze ze stali nierdozwneJ o pionowej konfiguracji cylindrycznej, mającym objętość geometryczną, wynoszącą 160 l i współczynnik kształtu 2,31 (wysokość - 985 mm; średnica = 425 mm). Bir-eaktor zaopatrzono w mieszalnik typu turbiny talerzowej mającej dwa koła, kaz-e koło mające sześć ostrzy o średnicy zewnętrznej 240 mm, przy czym każde ostrze ma promień 80 mm i wysokość 50 mm. Górne koło umieszczono na głębokości 780 mm od wie-oobołka bio-eaktr-t, a drogie na głębokości 995 mm. Pionowe p2zegro-9, mające wysokość 890 mm scho-ziły się promieniście ku środkowi 40 mm od zewnętrznej ściany pionowej bioreaktora. Mieszalnik pracował przy 170 obrotach na minutę. Mieszaninę odżywczą (100 l) mającą skład
189 459
149 przedstawiony w tabeli 9, wprowadzono óo biρreaktośa, po czym wytworzono porcję wstępnego zaszczepu (1 1) jak ρuiyamp powyżej i mającą pH 5,7.
Tabela 9
Dla wegetatywnej kultury w 160 l bipśtaktpśst potrzeba dkdłd 8 l do biprttktpśt urpdukująctgp posiew
Ilość g/l
Glukoza 2 kg 20
Pepton 2 kg 20
Autdlispwαnt drożdże 2 kg 20
Antyssitniacs SAG 471 0,010 kg ślady
Woda dejdnispwana q. s. aby - wyjałowić pusty reaktor przez 1 godzinę w temperaturze 130°C - załadować 6 l wody dejpnisPwαneJ, ogrzać do temperatury 40°C - dodać przy mieszaniu składniki pożywki - mieszać przez 15 minut, sprowadzić objętość do 95 l - wyjałowić w temperaturze 121°C przez 30 minut - pH po oyjtłpwitniu wynosi 5,7 - dodać jałową wodę dejpnizooanądp 100 l 1001
Zaszczepioną mieszaninę inkubowano przez 2 gpóziny, przy tempie napowietrzania wynoszącym 0,5 l/l-minutę przy ciśnieniu głównym wynoszącym 0,5 kg/cm2. Temperaturę kontrolowano przy 28°C do osiągnięcia PMV 25%, a potem obniżono ją óo 25°C. pH kontrolowano w zakresie wynoszącym 5,1 do 5,3. Wzrost objętości grzybni ukazuje się w tabeli 10, razem z pH i profilem rozpuszczonego tlenu reakcji kultury posiewowej.
Tabela 10
Czas przebiegu wzrostu grzybni w fermentacji kultury ppsitwpoej
Okres fermentacji (godziny) pH Upakowana objętość grzybni (PMV) % (3000 obrotów na minutę przez 5 minut) % rdsuusscspntgp tlenu
0 5,7 ±01 100
4 5,7 ±0,1 100
8 5,7 ±0,1 12 ± 3 85 ±5
12 5,7 ±01 15 ± 3 72 ±5
16 5,5 ±01 25 ±5 40 ±5
20 5,4 ±0,1 30 ±5 35 ±5
22 5,3 ±0,1 33 ±5 30 ±5
24 5,2 ±0,1 35 ±5 25 + 5
Stosując tak wytworzone kultury posiewowe, przeprowadzono fermentację transformacyjną w pionowym cylindrycznym bioreaktorze ze stali nierdzewnej, mającym średnicę 1,02 m, wysokość 1,5 m i objętość geometryczną 1,4 m3. Bioreaktor zaopatrzono w mieszalnik turbinowy, mający ówa wirniki, jeden umieszczony 867 cm poniżej wierzchołka reaktora i drugi
150
189 459 umieszczony 1435 cm poniżej wieroohołk7. Każde koło zaopatrzono w sześć ostrzy, każde o promi-niu 95 cm i 05 cm wysokości. Pionowe przegrody wysokości 1440 cm schodziły się ku środkowi 100 cm od wewnętrznej ściany pionowej reaktora. Wytworzono mieszaninę odżywczą, mającą skład przedstawiony w tabeli 11.
Tabela 11
Dla kslas-y biekeand-sJi w 1000 l bir--7ktrre-
Ilość g/l
Glukoza 16 kg 23
P-pton 16 kg 23
Astrliern7a- drożdże 16 kg 23
Środ-k pre-oinpi-niąoy SAG 401 2,282 kg ślady
Woda a-Jrniern7n7 q s. aby - wyjałowić pusty I-7kar- pre-e 1 godzinę w a-mp--7asre- 130°C - załadować 600 l wody d-Jraieen7a-J; ogrzać de temp-atury 40°C - dodać przy mi-szaniu składniki pożywki - mi-szać pre-e 15 minut, sprrn7aeić objętość do 650 l - wyjałowić w t-mp--7ts-ed 121°C p-ede 30 minut - pH po wyj7łrni-nis wynosi 5,0 - dodać jałową wodę a-jraϊernanąde 000 l
Do biore7kao-7 wprowadzono początkowy ładunek (000 l) tej mieszaniny odzywcz-j (pH = 5,0), po czym zaszczep posiewu według tego przykładu (0 l) wytworzony jak opisano powyżej.
Mieszaninę odzywczą, zawierającą szczep, inkubowano 24 godziny proy tempie napowietrzania wynoszącym 0,5 l/l minutę przy ciśnieniu dolotowym 0,5 kg/cm7. Temperaturę kontrolowano przy 2™°C i tempo mieszania wynosiło 110 obrotów na minutę. Wzrost objętości grzybni ukazano w tabeli 12, razem z pH i profilem rozpuszczonego tlenu reakcji kultury posiewowej.
Tabela 12
Prz-bi-g ne-rsts grzybni w birr-7ktr-e- dla kultury ar7asfe-m7oyJa-J
Okres f--m-naaoJi (godzmy) pH Upakowana objętość grzybni (PMV) % (300 rpm x 5 minut) % rozpuszczonego tl-nu
0 5,6 ± 0,2 100
4 5,5 ± 0,2 100
5,5 ± 0,2 12 ±3 95 ±5
12 15 ±3 90 ±5
16 5,4 ±0,1 20 ±5 05 ±5
20 5,3 ±0)1 25 ±5 60 ±5
22 5,2 ±0)1 30 ±5 40 ±5
189 459
151
Na końcu inkubacji oUedruowano zlepianie grzybni w grudki, lecz grudki były generalnie małe i stosunkowo luźno upakowane.
Rozproszoną grzybnię zawieszono w bulionie.
Końcowe pH wynosiło 5,1 do 5,C.
Do tak wytworzonej kultury transformacyjnej dodano zawiesinę kaarenont (1,250 kg; mikroaioouaay do 5 μ) w jałowej wodzie (5 l).
Jałowy roztwór dodatków i roztwór antybiotyków dodano w proporcjach zaznaczonych przy czasie reakcji 0 w tabeli 14.
Skład roztworu dodatków prze-stawiono w tabeli 1C.
Tabela 13
Dla kultury t-tnsfordtcyjndj
Il-ść
Deke^-za 16 kg
Aut-liza drtżdZtgy 8 kg
Środek prodcίupίdnίący SAG 471 0,010 kg
W-da ddjtaiotutnt q. e aby - uyjąStuić 150 l pusty reaktor przez 1 g-dzinę w tddpdrtttrod 130°C - otStd-utć 70 1 w-dy ddjtnio-uąadj. -grzać d- tempe-atury 40°C - d-dać przy mieszaniu składniki „rootu-ru z d-datkami” - mieszać p-zez 30 minut, sprowadzić -bjęt-ść do 95 l - pH jakie jest 4.9 - wyjałowić w tddpdrtttrod 120°C x 20 minut - pH p- uyjtłouidniu wyn-si -k-ł- 5,0 100 l
Biokonwersję przeprowadza się przez około 96 godzin przy napowietrzaniu, wynoszącym 0,5 l/l-minutę przy ciśnieniu głównym 0,5 kg/cm2 i pH w zakresie między 4,7 i 5,C, ustawionym według potrzeby przez dodanie 7,5 M NaOH lub 4 M H3PO4.
Tempo mieszania wynosiło początkowo 100 obrotów na minutę, zwiększając eię do 165 obrotów na minutę po 40 godzinach i 250 obrotów na minutę po 64 godzinach. Początkowa temperatura wynosiła 28°C, obniżono ją do 26°C gdy PMV osiągnęło 45% i obniżono do 24°C gdy PmV wzrosło -o 60%.
Dodawano SAG 471 w drobnych kroplach według potrzeby, w celu kontrolowania piany. Monitorowano poziom glukozy w fermentacji co 4 godziny i jeśli stężenie glukozy spadało poniżej 1 g na litr, dodawano więcej jałowego roztworu glukozy (10 l) do masy.
Zniknięcie kąnreaont i pojawienie się 11 α-hy-roksykanrenoau monitorowano także po-czae reakcji, przez HPLC. G-y co najmniej 90% początkowego ładunku kąarenoau przekeztałciło eię w 11 α-hy-roksykaarenon, dodano jeszcze 1,250 kg kąarenonu.
G-y 90% kanreaoau z tego dodania uległo przekształceniu, wprowadzono następne 1,250 kg. Stosując takie same kryteria, dodawano daleze porcje (po 1,250 kg) az -o uprouądodaią do reaktora całkowitego ładunku (20 kg).
Po załadowaniu całości kąnreaonu do reaktora, reakcję zakończono gdy stężenie nie przdrdagowaaego kąnrenont wynosiło 5% w stosunku do ilości wytworzonego 11 α-hy-rokeykaarenont. Tryb dodawania kanrenonu, jałowego roztworu z dodatkami i roztworu z antybiotykami jeet taki jak ukazany w tabeli 14.
152
189 459
Tabela 14
Dodawanie etr-oiaów 1 roztwór (aoa4tki i antybiotyki) w przebiegu biokonwersji k4nrenonr w reaktorze
Czas reakcji (godziny) K4n-rnon w zawiesinie Jałowy roztwór dodatków (l) Roztwór antybiotyków (l) Objętość (l ok)
kg postęp (kg)
0 1,250 1,25 10 8 700
4 10
8 1,250 2,5 10
12 10
16 1,250 10
20 10
24 1,250 5 10 8 800
28 1,250 10
32 1,250 10
36 1,250 10
40 1,250 10
44 1,250 10
48 1,250 12,5 10 8 900
52 1,250 10
56 1,250 10
60 1,250 10
64 1,250 10
68 1,250 10
72 1,250 20 10 8 1050
76 0
80
Całość
Po zakończeniu brokonwereji grzybnię oddzielono od bulionu przez wirowanie w wirówce koszowej. Przez HPLC określono, że przesącz zawiera tylko 2% całej ilości Πα-hydrokeykαnrrnonu z zebranego bulionu, a zatem usunięto go. Grzybnię zawieszono w octanie etylu (1000 l) w zbiorniku do ekstrakcji o pojemności 2 m3. Zawiesinę tę ogrzewano przez jedną godzinę przy mieszaniu i w warunkach ogrzewania w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin octanu etylu, następnie ochłodzono i wirowano w wirówce koszowej. Placek grzybni przemyto octanem etylu (200 l) i potem usunięto. Ekstrakt bogaty w roztwór steroidu pozostawiono na jedną godzinę w celu oddzielenia fazy wodnej. Fazę wodną ekstrahowano dodatkową ilością rozpuszczalnika octanu etylu (200 l) i potem usunięto. Połączone fazy rozpuszczalnika sklarowano przez wirowanie i umieszczono w urządzeniu do zatęzania (500 l objętości geometrycznej) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do końcowej objętości, wynoszącej 100 l.
189 459
153
Podczas przeprowadzania odparowywania, początkowy ładunek do urządzenia do zatęzania połączonego ekstraktu i roztworów z przemywania wynosił 100 1 i tę objętość utrzymywano jako stałą przez ciągłe lub okresowe dodawanie połączonego roztworu w miarę jak rozpuszczalnik odbierano.
Po zakończeniu etapu odparowania, pozostałość z destylacji ochłodzono do temperatury 20°C i mieszano przez dwie godziny, następnie filtrowano na filtrze Buchnera.
Naczynie urządzenia do zatęzania przemyto octanem etylu (20 1) i roztwór ten użyto potem do przemycia placka na filtrze.
Produkt wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez 16 godzin w temperaturze 50°C Wydajność lla-hydroksykanrenonu wynosiła 14 kg.
Przykład 4
Liofiliozowane zarodniki Aspergillus ochraceus NRR1 405 zawieszono w pożywce z płynu z namaczania kukurydzy (2 ml), mającej skład przedstawiony w tabeli 15.
Tabela 15
Pożywka z płynu z namaczania kukurydzy (pożywka wzrostowa dla hodowli posiewu pierwotnego)
Płyn z namaczania kukurydzy 30 g
Ekstrakt drozdzowy 15 g
Monozasadowy fosforan potasowy 3g
Glukoza (ładunek po wyjałowieniu) Woda destylowana q s do 1000 ml pH jakie jest 4,6, Ustawić dp pH 6,5 20% NaOH, Rozprowadzić 50 ml do 250 ml kolby Erlenmeyera, Wyjałowić w temperaturze 121°C przez 20 minut 30 g
Otrzymaną zawiesinę użyto do zaszczepienia w celu namnożenia zarodników na płytkach agarowych. Wytworzono dziesięć płytek agarowych, przy czym każda niosła stałą pożywkę, zawierającą glukozę/ekstrakt drożdżowy/fosforan/agar, mającą skład przedstawiony w tabeli 16.
Tabela 16
GYPA (Glukoza/ Ekstrakt drożdżowy/fosforan/agar do płytek)
Glukoza (ładunek po wyjałowieniu) 10g
Ekstrakt drozdzowy 2,5 g
K2HPO4 3g
Agar Woda destylowana, q. s do 1000 ml Ustawić pH do 6,5 Wyjałowić w temperaturze 121 °C przez 30 minut 20 g
Równą ilość 0,2 ml zawiesiny przeniesiono na powierzchnię każdej płytki. Płytki inkubowano w temperaturze 25°C przez dziesięć dni, po których zarodniki ze wszystkich płytek zebrano najałową kriogeniczną pożywkę konserwującą mająca skład przedstawiony w tabeli 17.
154
189 459
Tabela 17
GYP/giiosrrl (Pożywka glukoza/ekstrakt -rrZ-Zrw9/fotfrrtn/gliosrrl, -la fiolek oUirroz9oh)
Glukoza (łt-znsk po wyjałowieniu) 10 g
Ekstrakt -rpz-Zrw9 2,5 g
K2HPO4 3 g
Glios-pl Wo-a -stt9lrwtnt, q s. -o 1000 ml Wyjałowić w tsmperttz-zs 121°C przez 30 minut 20 g
Otrzymaną zawiesinę podzielono na dwadzieścia fiolek, przenosząc je-en ml do każdej fiolki. Fiolki te stanowią główny bank komórek, który można przenieść w celu wytworzenia pracującego banku komórek -o stosowania w wytwarzaniu zaszczept do Uiokoawersji karnenonz w 11α-h9aroksykan2enon. Fiolki, zawierające główny bank komórek przechowywano w strefie par zamrażarki z płynnym azotem w tempe-atz-oz -130°C.
Aby rozpocząć wytwarzanie pracującego banku komórek, oaro-aeki z pojedynczej fiolki z głównym bankiem komórek zawieszono w jałowej pożywce wzrostowej (1 ml), mającej skład prze-łozony w tabeli 15. Zawiesinę tę podzielono na 0,2 ml równe ilości i każdą ilość użyto do zaszczepienia na płytce agarowej, niosącej stałą pożywkę wzrostową, o składzie przedłożonym w tabeli 16. Te płytki inkubowano przez dziesięć dni w tempe-atu-oe 25°C. Do trzeciego -nia inkubacji, spodnia strona pożywki worodtoweJ była brązowopomaranczowa. Na końcu inkubacji utworzyło się bardzo dzzo oa2odaików o złotej ^ι^πρ. Zarodniki z każdej płytki zebrano przez proce-zrę opisaną w niaezjd09m powyżej -la wytwarzania głównego banku komórek. Wytworzono całość stz fiolek, przy czym każda zawiera 1 ml zawiesiny. Fiolki te stanowiły pracujący bank komórek. Fiolki pracującego banku komórek zakonserwowano także przez przechowywanie w strefie par oam2aża2ki z płynnym azotem w tzmpe-atu2oe -130°C.
Pożywkę wzrostową (50 ml) o składzie przedstawionym w tabeli 15 załadowano -o 250 ml kolby E-lenme9era. Równą ilość (0,5 ml) zawiesiny komórek pracujących wprowadzono do kolby i wymieszano z pożywką wzrostową. Zaszczepioną mieszaninę iakuUowtao przez 24 godziny w temperaturze 25°C w czlu wytworzenia pierwotnej kultury posiewowej, mającej procent upakowanej objętości grzybni wynoszący około 45%. Po wzrokowym oUaaaniu okazało się, że kultura zawiera grzybnię podobną do grudek, o średnicy 1 do 2 mm; a po obserwacji mikroskopowej okazała się być kulturą czystą.
Hodowlę wtórnej kultury posiewowej zapoczątkowano przez wprowadzenie pożywki wzrostowej, mającej skład proe-łożoa9 w tabeli 15, do kolby Fzmabacha o pojemności 2,8 l i zaszczepienie pożywki porcją (10 ml) pierwotnej kultury posiewowej z tego przykładu, której wytworzenie opisano powyżej. Zaszczepioną mieszaninę inkzbowano w temperaturze 25°C przez 24 godziny na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów na minutę, 5 cm przemieszczenie). Przy końcu inkubacji, kultura wykazywała takie same właściwości jak opisano powyżej -la pierwotnej kultury posiewowej i była odpowiednia do użytku w fermentacji transformacyjnej, w której kta2saon poddano Uiokoawersji w 11α-h9drokdykaa2enoa.
Traadformtcję prowaaooao w bio-etktorze Braun E Biostat skonfigurowanym następująco:
Pojemność: 15 it-rów z okąągfym dnem
Wysokość: 53 cm
Ś-eaalct: 20 cm
W9tokość/ś-eaaiot: 2,65
Wirniki: 7,46 cm śsadniyy, zześź oopat, 2,2 x 1,4 cm każda
Odstępy wirników: 65,6 , 14,5 i 25,5 cm od dna ςΙμο™^
P-oegroa9: οζΙο99' 1,9 x 48 cm
Zraszacz: 10, 1 mm -s-am9y, 1 1 otworów- 1 mm rsadmyy
Kontrola temperatury: aapewnian a a a prnncąą zewnętrapąg o płascza a pacynnia
189 459
155
Kanrenon o stężeniu 20 g/l zawieszono w wodzie dejonizowαmeJ (4 l) i część (2 l) pożywki wzrostowej, mającej skład przedłozony w tabeli 18, dodano do mieszaniny w bioreaktorze przy mieszaniu z prędkością 300 obrotów na minutę.
Tabela 18
Pożywka wzrostowa do bidkpnotrsji kultury w 10 l biprtαktρrst
Ilość llość/l
Glukoza (ładunek po wyjtłpoitnir) 160 g 20 g
Pepton 160 g 20 g
Ekstrakt drozdżowy 160 g 20 g
Środek prstciwpitniący SAF471 4,0 ml 0,5 ml
Kamenon Woda dejpnispwtnt q sdo 7,5 1 Wyjałowić w temperaturze 121°C przez 30 minut 160 g 20 g
Uzyskaną zawiesinę mieszano przez 15 minut, po których objętość sprowadzono do 7,5 l dodatkową ilością wody dejonizowanej. W tym punkcie, pH zawiesiny wyregulowano z 5,2 na 6,5 przez dodanie 20% roztworu NaOH i zawiesinę wyjałowiono następnie przez ogrzanie w temperaturze 121°C przez 30 minut w bioreaktorze Braun E. pH po wyjałowieniu wynosiło 6,3 ± 0,2, a końcowa objętość wynosiła 7,0 1 Wyjałowioną zawiesinę zaszczepiono częścią (0,5 l) wtórnej kultury posiewowej z tego przykładu, którą wytworzono jak opisano powyżej, a objętość sprowadzono óo 8,0 l przez dodanie 50% jałowego roztworu glukozy. Fermentację przeprowadzono w temperaturze 28°C do osiągnięcia PMV równej 50%, potem obniżono do 26°C i dalej obniżono do 24°C gdy PMV przekroczyło 60%. Wprowadzano powietrze przez zraszacz w tempie 0,5 vvm na podstawie początkowej objętości płynu i ciśnienie w bioreaktorze utrzymywano przy 70 KPa nadciśnienia' Mieszanie rozpoczęło się przy 600 obrotach na minutę i stopniowo zwiększano je do 1000 obrotów na minutę zgodnie z potrzebą, aby utrzymać zawartość rozpuszczonego tlenu powyżej 30% objętościowych. Monitorowano stężenie glukozy. Po początkowym wysokim stężeniu glukozy, spadło poniżej 1 z powodu zużycia przez reakcję fermentacji, zapewniono uzupełniającą glukozę dodając 50% wagowo jałowy roztwór glukozy, w celu utrzymania stężenia w zakresie 0,0% do 1% przez pozostały cykl fermentacji. Przed zaszczepieniem pH wynosiło 6,3 ± 0,2. Po obniżeniu się pH do około 5,3 podczas początkowego okresu fermentacji, utrzymywano je w zakresie 5,5 ± 0,2 przez resztę cyklu, przez dodawanie wodorotlenku amonu. Pianę kontrolowano przez dodawanie glikolu polietylenowego jako środka przeciwpieniącego sprzedawanego pod oznaczeniem handlowym SAG 471 przez OSI Specialties, Inc.
Wzrost kultury miał miejsce przede wszystkim podczas pierwszych 24 godzin cyklu, w czasie których pMv wynosiło około 40%, pH wynosiło około 5,6 i zawartość rozpuszczonego tlenu wynosiła około 50% objętościowych' Przemiana kanrempmu rozpoczęła się nawet w czasie wzrostu kultury. Stężenia kanśemomu i Ιία-hyóroksykanrenonu monitorowano w czasie biokonwersji przez analizę dziennych próbek. Próbki ekstrahowano gorącym octanem etylu i otrzymany roztwór próbek analizowano przez TLC i HPLC. Bipkpmwersję uznano za zakończoną, gdy stężenie pozostałego karnenonu wynosiło około 10% stężenia początkowego. Przyblizony czas przemiany wynosił 110 óo 130 godzin.
Po zakończeniu biokonwersji, biomasę grzybni oddzielono od bulionu przez wirowanie. Supematant ekstrahowano równą ilością octanu etylu i warstwę wodną usunięto. Frakcję z grzybnią zawieszono w octanie etylu, przy użyciu około 65 objętości na g karnenonu załadowanego do reaktora fermentacyjnego. Zawiesinę grzybni ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez jedną godzinę przy mieszaniu, ochłodzono do temperatury około 20°C i filtrowano na lejku Buchnera. Placek filtracyjny grzybni przemyto dwukrotnie 5 objstościami octanu etylu na gram karnenonu załadowanego óo reaktora i następnie przemy156
189 459 to wo-ą dej onizowzną (1 l) w celu usunięcia pozostałości octanu etylu. Ekstrakt wodny, bogaty rozpuszczalnik, rozpuszczalnik z azzzDywzne7 i wodę z arozDywαnia połączono. Pozostały wyczerpany placek grzybni albo usunięto, albo ponownie zkstzαbowzno, w zależności od analizy po- względem pozostałości w nim steroidów. Połączone fazy płynną pozostawiono na -wiz godziny. Potzm, fazę wodną od-zielono i usunięto, a fazę zzgαmeznίs zatężonz pod zmniejszonym ciśnieniem do końcowej objętości, wynoszącej około 500 d1. Naczynie destylarki ochłodzono następnie -o temperatury około 15°C azoy powolnym mieszaniu przez około jedną godzinę. Krystaliczny pro-ukt odzyskano przez filtrację i przemyto oobło-zonyD octanem etylu (100 ml). Rozpuszczalnik usunięto z kryształów przez odparowanie i krystaliczny produkt wysuszono po- zmniejszonym ciśnieniem w temaezztnzze 50°C.
Przykład 5
Liofilizowaną zzrodniae Aspergillus ochraceus ATCC 18500 zawieszono w pożywce wzrostowej z płynem z nαDaoozniz kukurydzy (2 ml) jaki opisano w przykładzie 4. Następnie sporządzono płytki zozzowz, także w sposób z azoykłz-u 4. Płytki inaubowzno i zebrano jak opisano w przykładzie 4 w celu zapewnienia głównego banku komórek. Fiolki, zawierające główny bank komórek przechowywano w strefie par zamrażarki z ciekłym azotem, w temperaturze -130°C.
Z fiolki głównego banku koDórzk wytworzono pracujący bank koDózza, jak opisano w przykładzie 4 i przechowywano w zzDzażazcz z ciekłym azotem, w tąDaązztnzzz -130°C.
Do 2 l kolby z arzzgro-zDi załadowano pożywkę wzrostową (300 ml), mającą skład azzz-łzezny w tabeli 19.
Równą ilość (3 ml) zawiesiny komórek pracujących wazowz-zono do kolby. Zaszczepioną mieszaninę inkubowano przez 20 do 24 godzin w tZDazzztuzze 28°C na wytrząsarce obrotowej (200 obrotów na minutę 5 cm azezDizszczzniz) w celu wytworzenia pierwotnej kultury posiewowej, mającej procent upakowanej objętości grzybni, wynoszący około 45%. Po wizualnym badaniu kultury, okazało się, że zawiera ona grzybnię az-zbną -o gru-ek o średnicy 1 do 2 dd; a po obserwacji mikroskopowej okazało się, ze jest to anltnzz czysta.
Tabela 19
Pożywka ge-zstzgr dla pierwOtnej i wtórnej azazgli azsiegzgzj
Ilość/l
Glukoza (ładunek po gejrłzglznin) 20 g
Pepton 20 g
Ekstrakt dzzedezgy 20 g
Woda destylowana q. s. do 1000 ml Wyjałowić w tzDazzrtuzez 121^ a-eze 30 minut
Hodowlę wtórnej kultury posiewowej zzinecjowano azozz wpzowz-ozniz 8 l pożywki wzrostowej, mającej skład pzzz-łożzny w tabeli 19 -o 14 l szklanego bizrzzktoza. Zaszczepiono bizzzzator 160 d1 -o 200 d1 pierwotnej kultury posiewowej według tego p-oykłα-n, której wytworzenie było takie jak opisano powyżej.
Zaszczepioną mieszaninę hodowano w temperaturze 28°C przez 18-20 go-zin, przy mieszaniu z arę-kzścią 200 obrotów na minutę, tempo nzpowiztrozniz wynosiło 0,5 wm. Przy końcu naDnażania, kultura wykazywała takie szdz właściwości jak opisano powyżej -la posiewu pierwotnego.
Transformację azowa-zono w 60 l biorzzktozzz, zasz-niczo w sposób opisany w azoyi kładzie 4 z wyjątaizD, że pożywka wzrostowa miała skład przedstawiony w tabeli 20 i początkowy ładunek wtórnej kultury posiewowej wynosił 350 ml -o 700 d1. Tempo mieszania wynosiło początkowo 200 obrotów na minutę, lzcz zwiększono je do 500 obrotów na minutę, aby utrzymać pzzizD rozpuszczenia tlenu powyżej 10% objętościowych. Przybliżony czas przemiany -la 20 g/l kaazznonn wynosił 80 -o 160 go-zin.
189 459
157
Tabela 20
Pożywka wzrostowa dla kultury do biokonwersji w 60 l bioreaktorze
Ilość Ilość/l
Glukoza (ładunek po wyjałowieniu) 17,5 g 0,5 g
Pepton 17,5 g 0,5 g
Ekstrakt drozdzowy 17,5 g 0,5 g
Kanrenon (ładunek jako 20% zawiesina w jałowej wodzie) 700 g 20 g
Woda dejonizowana, q s do 35 1 Wyjałowić w temperaturze 121°C przez 30 minut
Przykład 6
Stosując zawiesinę zarodników z banku komórek pracujących wytworzonego zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 4, sporządzono pierwotną i wtórną kulturę posiewową, także zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 4. Stosując wtórną kulturę posiewową wytworzoną w ten sposób, wykonano dwa przebiegi biokonwersji zgodnie ze zmodyfikowanym procesem typu zilustrowanego w fig. 1 i dwa przebiegi wykonano zgodnie z procesem zilustrowanym w fig. 2. Pożywkę wzrostową do transformacji, tryb dodawania kanrenonu, czas zbioru i stopnie przemiany dla tych przebiegów, przedłożono w tabeli 21. Przebieg R2A użyty dla schematu dodawania kanrenonu, bazował na takiej samej zasadzie jak przykład 3, podczas gdy przebieg R2C modyfikował schemat z przykładu 3 przez wykonanie jedynie dwóch dodań kanrenonu, jednego na początku fermentacji i jednego po 24 godzinach. W przebiegach R2B i R2D, cały ładunek kanrenonu wprowadzono na początku fermentacji i proces generalnie przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 4 z wyjątkiem, ze ładunek kanrenonu wyjałowiono w oddzielnym naczyniu przed załadowaniem go do bioreaktora, a glukozę dodano w czasie trwania fermentacji. Do zredukowania bryłek tworzących się w czasie wyjałowienia, użyto blendera Waring. W przebiegach R2A i R2B, kanrenon wprowadzono do fermentacji w roztworze metanolu, z tego względu te przebiegi dodatkowo różniły się od przebiegów z przykładów 3 i 4, odpowiednio.
Tabela 21
Opisy procesów początkowej biokonwersji kanrenonu
Numer przebiegu R2A R2B R2C R2D
1 2 3 4 5
Pożywka (g/l) Takie same jak przebieg R2A Takie same jak przebieg R2C
Płyn z namaczania kukurydzy 30 30
Ekstrakt drozdzowy 15 15
NH4H2PO4 3 3
Glukoza 15 30
OSA 0,5 ml 0,5 ml
pH ustawione na 6,0 2,5 N NaoH ustawione na 6,0 2,5 N NaoH
158
189 459 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4 5
KtnIdnoa 10g/80 ml MeOH dodanego w 0, 18, 24, 30, 36, 42, 50, 56, 62 i 68 g-doiaid 80 g/640 ml MeOH dodtadg- w 0, wszystkie od razu WyjtS-uiond i uydidsoaad. doaane w 0 godzinie: 25 g, w 24 g-dolaid: 200 g WyjtS-uiond i uydίdsoąad, dodane w 0 godzinie: 200 g
Czas obiOIt 143 g-doiaą 166 g-doint 125 g-doint 104 godoint
Bi-k-nudrsjt 45,9% 95,6% 98, 1% 95,1%
W przebiegach R2A i R2B stężenie metanolu zbierało eię do około 6,0% w zacierze fermdatąoyjaym, co okazało się hamujące dla wzrostu kultury i bi-konwersji. Jednakże na podstawie wyników tych przebiegów uznano, ze metanol lub inne rozpuszczalniki mieszające się z wo-ą mogły służyć efektywnie przy nizezych stężeniach -o zwiększania ładunku kanrenonu i -ostarczać kąnrdaon w postaci drobnych cząstek osadu, zapewniając wielki obszar mięazyfąoouy dostarczając kanrenon przedmiotowi reakcji. Kąnrdaoa okazał się stabilny w temperaturze wyjaławiania (121°C) lecz zlepiał eię w bryłki. Wykoroyetąao blen-er Waring -o porozUijąnią zlepków na drobne cząstki, które z powodzeniem przekształcały eię w pro-ukt.
Przykład 7
Stosując zawiesinę zarodników z banku komórek pracujących wytworzonego zgodnie ze sposobem opisanym w przykładzie 4, sporządzono pierwotną i wtórną kulturę posiewową, także oasą-aiozo w epoeób opisany w przykładzie 4. Opis i wyniki przykładu 7 ukazano w tabeli 22. Stosując wtórną kulturę posiewową wytworzoną w ten sposób, jedną biokoaudreję (RCC) przeprowadzono zasa-niczo jak opisano w przykładzie C, a trzy bi-konwersje przeprowadzono zgodnie z procesem generalnie opisanym w przykładzie 5. W ostatnich. Pzech przebiegach (RCA i RCD), kanrenon wyjałowiono w przenośnym zbiorniku, razem z pożywką wzrostową z wyjątkiem glukozy. Glukozę dodano ąedptycoaie z innego zbiornika. Wyjałowioną zawiesinę kąnrdnonu wprowadzono do Uioreąktorą albo przed zaszczepieniem, albo po-czas wczesnego etapu bi-konwersji. W przebiegu RCB wprowadzono uzupełniający jałowy kamenon i pożywkę wOrostową w 46,5 godzinie. Zlepki kaareaoau utuorooad w czasie wyjaławiania rozbito z użyciem blen-era Waring, tworząc przez to zawiesinę drobnych cząstek wchodzących -o reaktora. Transformacyjne pożywki wzrostowe, tryb doaąuąaia kam-en-nu, tryby dodąuąnią o-żywek, czasy zbioru i stopnie konwersji dla trzech przebiegów przedłożono w tabelach 22 i 2C.
Tabela 22
Opisy procesu ^ο^^Μΐ kta-dn-au
Numer przebiegu R3A RCB RCC R3D
1 2 3 4 5
Pożywka (g/l) Pepton: 20 Taki sam jak przebieg R3C
Płyn z ntmtcotnit kukurydzy Taki sam jak przebieg R3A Ekstr d-oż.: 20
30 Glukoza 20
Ekstrakt droodż-l 15 OSA: 3 ml
wy
NHH2PO4 3
Glukoza 15
OSA 0,5 ml
PH ustawione do 6,5 2,5 N NaOH ustawione do 6,5 2,5 N NaOH
189 459
159 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4 5
Ładun-k kta--arau K7n-dnrn wyjawiono i wymi-szane. BI- 50 g 16,5 kraeina 110 g Tak samo jak prz-bi-g R3A BI. 50 g 16.5 kraein7: 110 g 46.5 krdeia7 30 g K7n--arn ni-jałewy: e7ł7arn7ay w trybie wymi-nionym w tabeli 23 Tak samo jak prz-bi-g R3A. BI: 50 g 16,5 goaein7: 110 g
Dodatki Patrz tabela 23 Patrz tabela 23 Patrz tabela 23 Patrz tabela 23
Czasy zbioru 1^,5 kraeia7 11™,5 krdeiat 11™,5 keaein7 03,5 kraeia7
Birkran-rsJ7 93,0% 94,0% 60,0% 6™,0%
T a b - 1 a 23
Tiyb dodawania k7nr-nrnu, glukozy i pożywki wzrostowej w arświ7aoedais -oenΌJrwym
R3C R3A R3B R3D
Cza dodawania (godziny) Kani-non 200 g/21 jałowej (DI) Glukoza roztwór 50% P-pten i ekstrakt drreaeeny 20 g każdy w 1 l wody (g) Antybiotyki 20 mg kanamycyny 20 mg tetracykliny 100 mg o-f7l-ksyny w 50 ml pożywka pat-z tabela 22 (g/l) Κ^-ιοι/ pożywka neroston7 patrz tabela 22 (g/l) Kam-non/ pożywka wzrostowa patrz tabela 22 (g/l)
0 - - - - 50 g/0,4 l 50 g/0,4 l 50 g/0,4 l
14,5 16 100 25 50 - - -
16,5 - - - - 110 g/1,2 l 110 g/1,2 l 110 g/1,2 l
20,5 16 140 25 - - - -
2™,5 16 140 25 - - - -
34,5 16 150 25 - - - -
40,5 16 150 25 50 ml - - -
46,5 880 130 25 - - ™0 gW l -
52,5 160 120 25 - - - -
5™,5 160 150 25 - - - -
64,5 160 1™0 25 50 ml - - -
00,5 160 140 25 - - - -
Z powodu wz-osts nitkowatego, we wszystkich czterech proebizgach w tyra przykładzie widać było bardzo lepki bulion fermentacyjny. Aby obejść prozsokoay, tworząc- wysoką lepkość ze względu na napowiearz7aiz, mlzszanid, kontrolę pH i temperatury, tempo napowlda-z7ala i prędkość mieszania zwiększone podczas tych p-zebiegów. Przemiany postępowały zadowalające w bardziej surowych warankach, lecz gęsty placek utworzył się powyżej powle-ochal płynnego bulionu. Nieco niz p-zdrdagowanego kanrenons placek ten wyniósł poza bulion.
160
189 459
Przykład 8
Opis i wyniki przykładu 8 omówiono w tabeli 24. Wykonano cztery przebiegi fermentacji, w których przez biokpawe-sJę kaa-eaonu wytwarza się 11α-h9droksykaa2enpn. W dwóch z tych przebiegów (R4A i R4D), biokonwe-sję prowadzpap oadadneczo w taki sam sposób jak przebiegi R3A i R3D z przykładu 6. W przebiegu R4C, kaarenpa przekształcono w Πα^d-pks9kta-enpn generalnie w taki sposób jak opisany w przykładzie 3. W przebiegu R4B, p-poes p-oeprowa-opno generalnie jak opisano w przykładzie 4, to jest z wyjałowieniem kanreapau i pożywki wzrostowej w Uio-eakto-ze tuż przed zaszczepieniem, całość odzywki azotowej i fosforowej wprowadzono na początku fermentacji, a roztwór odżywczy, zawierający glukozę, -odano do bip2zaktp2a tylko w celu utrzymania poziomu glukozy w czasie postępu fermentacji. W ostatnim procesie (przebieg R4B), stężenie glzkoz.y monitorowano co 6 godzin i -oaawtao roztwór glukozy jak wskazano -o kontrolowania poziomu glukozy w oak2edie 0,5 -o 1%. Tryb dodawania kan2enpnu dla tych przebiegów p-oe-łpżoap w tabeli 25.
Tabela 24
Opisy p-poesu Uipkpnwsrsji w -pewit-oosniu rpowpjpw9m
Numer p-osUisgu R4A R4B R4C R4D
Pożywka (g/l) Płyn z ntmtcotmt kukury-zy Ekstrakt -roZ-Zrw9 NH4H2PO4 Glukoza OSA pH 30 15 3 15 0,5 ml Ustawione -o 6,5 2,5 N NaOH Taki sam jak przebieg R4A Pepton: 20 Ekstr. -roz 20 Glukoza- 20 OSA: 3 ml Ustawione -o 6,5 2,5 N NaOH Taki sam jak przebisg R4A
Łt-unsk ^η-ρηΜυ Ktn-snrn wyjałowipar i wymieszano BI: 40 g 23,5 gp-zint: 120 g 160 g ^μ-ρ^nz w9jtłpwirap w Uiprstktproe Ktnrsapn aiejałowy: otłt-pwtay w trybie wymisnipa9m w tabeli 25 ^^ρ^η wyjałowiono i w9elistotł no BT 40 g 23,5 gp-oint 120 g
Łt-znsk pożywki Patrz tabela 25 Patrz tabela 25 Patrz tabela 25 Patrz tabela 25
Czas zUIo-z 122 gr-omt 122 gp-oint 122 gp-oint 122 gp-oint
Bipkrnwsrtjt 95,6% 97,6% 95,4% 96,7%
Tabela 25
Tryb -r-twtalt ktn-sapnu, glukozy i pożywki worpttpwsj w -pświt-ooeniz rozwojowym
R4C R4A R4B RD
1 2 3 4 5 6 7 8
Cza -! dawania gr-zlny Ktnrsnrn 200 g/2 l jałowej wo-y Glukoza roztwór 50% Pepton i ekstrakt -roz-Zpw9 20 g każ-y w 1 l wo-y (g) Antybiotyki 20 mg kan^ycy^ 20 mg tetracykliny 100 mg osftlskt9- ny w 50 ml (^-οns -o 0twistin9 ktnrsnrnu) Pożywka wzrostowa patrz ttbslt 24 Pożywka wzrostowa patrz ttbslt 24 Pożywka wzrostowt patrz ttbslt 24
14 600 135 25 50 ml - - -
20 - 100 - - - - -
23 120 g/1,2 l 120 g/1,2 l
189 459
161 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4 5 6 7 8
26 - 100 25 - - - -
32 - 135 25 - - - -
38 500 120 25 50 ml - - -
44 - 100 25 - - - -
50 - 100 25 - - - -
56 - 150 25 - - - -
62 500 150 25 50 ml - - -
68 - 200 25 - - - -
74 - 300 25 - - - -
80 - 100 25 - - - -
86 - 125 25 - - - -
92 - 175 25 - - - -
98 - 150 - - - - -
104 - 175 - - - - -
110 - 175 - - - - -
116 - 200 - - - - -
Wszystkie fermentacje przebiegały w warunkach silnego mieszania i napowietrzania podczas większości cyklu fermentacyjnego, ponieważ zacier fermentacyjny stał się bardzo lepki w ciągu dnia mniej więcej po zaszczepieniu.
Przykład 9
Pożywki wzrostowe do transformacji, tryby dodawania kanrenonu, czasy zbioru i stopnie konwersji dla przebiegów z tego przykładu przedłozono w tabeli 26.
Cztery przebiegi biokonwersji przeprowadzono zasadniczo w sposób opisany dla przebiegu R4B z przykładu 8, z wyjątkiem, jaki opisano poniżej. W przebiegu R4B wierzchni turbinowy wirnik talerzowy użyty do mieszania w innych przebiegach, zastąpiono wirnikiem okrętowym, pompującym w dół. Działanie pompowania w dół osiowo przelewało bulion do środka reaktora i zmniejszało tworzenie się placka. Bezpośrednio po zaszczepieniu, w przebiegu R5D, dodano metanol (200 ml). Ponieważ kanrenon wyjałowiono w reaktorze, wszystkie odzywki z wyjątkiem glukozy dodano na początku fermentacji, unikając potrzeby łańcuchowego dodawania źródła azotu, źródeł fosforu lub antybiotyków.
Tabela 26
Opisy procesu biokonwrreji w aoewi4acornir rozwoju procesu na skalę 10 l
Numer przebiegu R5A R5B R5C R5D
1 2 3 4 5
Pożywka (g/l) Płyn z n4daco4nl4 kukurydzy Ekstrakt drożdżowy NH4H2PO4 Glukoza OSA PH 30 15 3 15 0,5 ml Ustawione do 6,5 2,5 N NaOH Taki sam jak przebieg R5A Pepton. 20 Ekstr droz.: 20 Glukoza 20 OSA. 3 ml Ustawione do 6, 5 2,5 N NaOH Taki sam jak przebieg R5A
162
189 459 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4 5
Ładunek kanrenonu 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze
Ładunek pożywki Dodatek glukozy Dodatek glukozy Dodatek glukozy Dodatek glukozy
Czas zbioru 119,5 godzina 119,5 godzina 106 119,5 godzina
Biokonwersja 96% 94,1% 88,5% 92,4%
W celu utrzymania imersji fazy stałej rosnącej ponad powierzchnię płynu, dodano pożywkę wzrostową do każdego reaktora, 96 godzin po rozpoczęciu fermentacji. Problemy z mieszaniem nie zostały całkowicie ominięte ani przez dodanie pożywki wzrostowej ani użycie wirnika, pompującego w dół (przebieg R5B) lecz wyniki przebiegów pokazały łatwość i korzyści z procesu i wskazały, ze zadowalające mieszanie można by zapewnić zgodnie z konwencjonalnymi praktykami.
Przykład 10
Przeprowadzono trzy przebiegi biokonwersji, zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 9. Transformacyjne pożywki wzrostowe, tryby dodawania kanrenonu, czasy zbioru i stopnie konwersji dla przebiegów z tego przykładu, przedstawiono w tabeli 27.
Tabela 27
Opis procesu doświadczenia biokonwersji na skalę 10 l
Numer przebiegu R6A R6B R6C
Pożywka (g/l) Płyn z namaczania kukurydzy Ekstrakt drożdżowy NH4H2PO4 Glukoza OSA PH 30 15 3 15 0,5 ml Ustawione do 6,5 2,5 N NaOH Taki sam jak przebieg R6A Pepton 20 Ekstr droz 20 Glukoza 20 OSA 0,5 ml Ustawione do 6,5 2,5 N NaOH
Ładunek kanrenonu 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze 160 g kanrenonu wyjałowiono w bioreaktorze
Ładunek pożywki Dodatek glukozy, 1,3 1 pożywki i 0,8 jałowej wody w 71 godzinie Dodatek glukozy: 0,5 1 pożywki i 0,5 jałowej wody w 95 godzinie Dodatek glukozy brak innego dodawania
Czas zbioru 120 godzina 120 godzina 120 godzina
Biokonwersja 59% 44% 80%
Równowaga masy 95% 96% 90%
Pożywkę wzrostową (1,3 1) i wodę jałową (0,8 l) dodano po 71 godzinach w przebiegu R6A do zanurzonego placka grzybni, który urósł powyżej powierzchni płynnego bulionu. W tym samym celu dodano pożywkę wzrostową (0,5 l) i jałową wodę (0,5 l) po 95 godzinach w przebiegu R6B. Dane o równowadze materiału pokazały, ze lepszą równowagę masy można określić jeśli budowanie placka ponad powierzchnię płynu jest zminimalizowane.
Przykład 11
Wykonano przebiegi fermentacji w celu porównania wstępnego wyjaławiania kanrenonu z wyjaławianiem kanrenonu i pożywki wzrostowej w bioreaktorze transformacyjnym.
189 459
163
W przebiegu R7a proces przebiegał jak zilustrowano w fig. 2, w warunkach porównywalnych z warunkami przebiegów R2C, R3A, R3B, R3D, R4A i r4d. Przebieg R7B zilustrowano w fig. 3 w warunkach porównywalnych z warunkami z przykładów 4, 9 i 10 oraz przebiegu R4B. Pożywki wzrostowe do transformacji, tryby dodawania kanśempmu, czasy zbioru i stopień konwersji dla przebiegów z tego przykładu, przedłożono w tabeli 28.
Tabela 28
Opis procesu doświadczenia bidkdnotrsji na skalę 10 l
Numer przebiegu R7A R7B
Pożywka (g/l) Płyn z ntmtcstnit kukurydzy Ekstrakt drozdzowy NH4H2PO4 Glukoza OSA pH 30 15 3 15 0,5 ml Ustawione do 6,5 2,5 N NaOH Taki sam jak przebieg R7A
Ładunek ktnrtndnu 160 g ktnśtndnu wyjałowiono i wymieszano poza bidrtaktdśtm 160 g kanśtnpnu oyjtłdoipnd w bipśttktdśst
Czas zbioru 118,5 godzina 118,5 godzina
Bldkpnotrsjt 93% 89%
Równowagę masy na podstawie końcowej próbki pobranej z przebiegu R7B określono na 89,5%, wskazując, ze nie było znaczącej utraty substratu lub rozkładu w biokonwersji. Mieszanie określono na adekwatne dla obu przebiegów. Końcowe stężenie glukozy wynosiło ponaó żądane 5-10 g na litr zakresu kontrolnego, podczas początkowych 80 godzin. Wydajności przebiegu nie zakłócał lekki placek utworzony w głównej przestrzeni w obu bioreaktorach.
Przykład 12
Skuteczność ekstrakcji określono w szeregu przebiegów 1 litrowych ekstrakcji, jakie omówiono w tabeli 29. W każdym z tych przebiegów, steroidy ekstrahowano z grzybni, przy użyciu octanu etylu (1 l/l objętości fermentacyjnej). Przeprowadzono dwie kolejne ekstrakcje w każdym przebiegu. Na podstawie RP-HPLC, odzyskano około 80% całości steroidu w pierwszej ekstrakcji; i odzysk zwiększył się óo 95% w drugiej ekstrakcji. Trzecia ekstrakcja odzyskałaby następne 3% steroidu. Pozostałe 2% są utracone w fazie wodnej supematantu. Ekstrakt póciągnisto do sucha przy użyciu próżni, lecz nie przemywano żadnym dodatkowym rozpuszczalnikiem. Obróbka rozpuszczalnikiem poprawi odzysk z początkowej ekstrakcji, jeśli oceniać ekonomikę procesu
Tabela 29
Odzysk 11 αlHydrpksykanśtnpnu przy l-litrowej ekstrakcji (% całości)
Numer przebiegu 1 Ekstrakt 2 Ekstrakt 3 Ekstrakt Supernatant
R5A 79% 16% 2% 2%
R5A 84% 12% 2% 2%
R4A 72% 20% 4% 4%
R4A 79% 14% 2% 5%
R4B 76% 19% 4% 1%
R4B 79% 16% 3% 2%
R4B 82% 15% 2 % 1%
Średnia 79% 16% 3% 2%
164
189 459
Keton Dztyloizobntylzwy (MIBK) oraz toluen oceniano jako rozpuszczalniki ekstrakcji/kryst7lizzcji -la 11α-hyaroksykanząnznn w skali 1 litra. Przy użyciu protokołu ekstrakcji jaki opisano w mniejszym powyżej, zarówno MIBK, jak i toluen były aozównywzlnz do octanu etylu po- względem zarówno skuteczności ekstrakcji jak i wydajności krystalizacji.
Przykład 13
Jako część oczny procesów z fig. 2 i 3 prowadzono ba-aniz wielkości cząstek na substracie kanrznonowyD -ostzrczonyD na początku cyklu fermentacyjnego w każdym z tych procesów. Jak opisano powyżej, kanrznon -o-awany do procesu z fig. 1 Diazonezowano przed wazzwadzznizD -o beozązatzrz. W tym proczsie kan-znonu niz wyjałowiono, wzrost niepożądanych drobnoustrojów azntzolowznz przez dodatek antybiotyków. W arzoąsaob z fig. 2 i 3 km-znon wyjałowiono prze- reakcją. W procesie z fig. 2 uzyskuje się to w blzndzrzz a-ozwprowadzznizm kznzznonu -o biozzzktora. W procesie z fig. 3, zawiesinę kan-znonu w pożywce wzrostowej wyjaławia się w beorzaatzzzz na początku fzrDzntzcji. Jak omówiono w nlnizjseyD powyżej, wyjaławianie dz tzn-zncję -o aowzazwaniz aglomeracji cząstek kanrznznu. Z powodu zozzniozonzj rozpuszczalności kαnzznonn w wodnym roztworze pożywki wzrostowej, produktywność procesu zależy o- transferu mzsy z fazy stałej, a więc zalzzy jzk się oczekuje, o- obszaru styku Dięaoyfazowągo prezentowanego przez stały rozdrobniony substrat, który o-wrotniz, zależy o- rozazowzaezniz wielkości cząstek. Tz uwzgi początkowo służyły jako zara-cze wobec procesów z fig. 2 i 3.
Jednakże, mieszanie w blzn-zrzz z fig. 2 i zbiorniku fzrDznt7oyjnyD z fig. 3, razem z działaniem pompy ścinającej stosowanej -o azzznzszzaea fermentacji w fig. 2, jzk się okazało, rozbijają zgloDzrzty nz cząstki o wielkości w zzk-zsiz rozsądnie zblizonzj -o nizwyjzłzwionego i Diazonizowznzgz kanzznonn -o-zwanzgo -o procesu z fig. 1. Zilustrowano to przez rozmieszczenie wielkości cząstek dlz kαnzznznn dostępnego nz początku cyklu reakcyjnego w każdym z trzech procesów. Patrz tabzlz 30 i fig. 4 i 5.
Tabela 30
Rzemizseoeznlz cząstek t-zzch różnych a-óbza aαnzznzan
Próbka 45-125 μ < 180 μ Średnia wielkość (μ) Przebieg bizkzagzzsji (%)
Partia krnzznzau 75,0% 95,0% R3C: 93,1% (120 ozdeinr) R4C: 96,3% (120 godzina)
azed-zbnizar azótar 31,2% 77,2% 139,5 R3A: 94,6% (120 godzina) R3B: 95,2% (120 ozdelar)
Wejrlzglzar próbka 24,7% 65,1% 157,4 R4B: 97,6% (120 gzdeinr) R5B 93,8% (120 ozdelnr)
Z danych z tabeli 30, widać, zz mieszalniki i pompa ścinzjącz skutecznie zmniejsza średnią wielkość cząstek wyjałowionego kan-znonu w stosunku do tego samego rzędu wielkości, co substrat niz wyjałowiony, lzcz pozostała znaczna różnica wielkości na korzyść substratu nizwyjzłowionzgo. Mimo tej różnicy -anz wydajności reakcji pokazały, że procesy wstępnego wyjałzwizniz były co najmniej tak produktywne jzk w procesie z fig. 1. Dzlszz korzyści można rzzlizować w p-oczsie z fig. 2, przez pewne etapy dalszego zmniejszania i kontrolzwzniz wielkości cząstek, np. mielenie nz mokro wyjałowionego kanzznonn i/lub rzczzj pasteryzację niz wyjaławianie.
Przykład 14
Wytworzono kulturę posiewową w sposób opisany w areyalz-oią 5. Po 20 gzdzinacb grzybniz w reaktorze z zaszczepem byłz masą o 40% PMV. Jej pH wynosiło 5,4 i 14,8 g na litr glukozy pozostało niz zużyte.
\g'etwΌzeaaa transformacyjną pożywkę wzrostową (35 l), Dzjącą skłz- ukazany w tabeli 20. Przy wytwarzaniu pożywki o-zywczzj, glukozę i ekstrakt -roż-żowy wyjałowiono oddzielnie i wymieszano jzko pojedynczy dodatek o początkowym stężeniu 30% wagowych glukozy i 10% wagowych ekstraktu -roż-żzwzgz. pH odżywki wyregulowano -o 5,7.
189 459
165
Stosując tę pożywkę (tabela 20), wykonano dwa przebiegi bi-konwersji -la przemiany kąnrdnoau w 11αlhyaroksykąnrenoa. Każdy z tych przebiegów prouąazono w 60 l reaktorze zaopatrzonym w mieszalnik, obejmujący jeden wirnik turbinowy RueRton i dwa wirniki Lightin' AC15.
Początkowy ładunek pożywki wzrostowej do reaktora wynosił C5 l. Mikronizouąay i nie wyjąłouioay kan-enon dodano do początkowego stężenia, wynoszącego 0,5%.
Pożywkę w reaktorze zaszczepiono kulturą posiewową sporządzoną w sposób opisany w przykładzie 5 przy początkowym tempie szczepienia, wynoszącym 2,5%.
Fermentację proua-oono w temperaturze 28°C, tempie mieszania 200 do 500 obrotów na minutę, tempie aapouietroąnią 0,5 vvm i ciśnieniu wstecznym, wystarczającym -o utrzymania poziomu rozpuszczenia tlenu, wynoszącego co najmniej 20% objętościowych.
Kultura traasformącyjną roouiaiętą po-czas przebiegu produkcyjnego była w postaci bar-zo małych owalnych grudek (około 1-2 mm).
Kanrdnon i odzywki uzupełniające podawano łańcuchowo do reaktora, generalnie w epoeób opisany w przykładzie 1.
Dodawanie odżywek wykonywano co cztery go-ziny w tempie wynoszącym C,4 g glukozy i 0,6 g eketraktu drozdzowego na litr bulionu w reaktorze.
W tabeli C1 przedstawiono tempo aapouidtrząaia, tempo mieszania, rozpuszczony tlen, PMV i przeważające pH w ustalonych odcinkach po-czas każdego z przebiegów z tego przykładu, jak również doaauąnie glukozy, wykonywane w czasie fermentacji.
Tabela C2 ukazuje profil przemiany kanien-nu. Przebieg R11A zakończono po 46 go-zinach; przebieg R11B kontynuowano przez 96 go-zin.
W ostatnim przebiegu, osiągnięto 9C% przemiany po 81 godzinach; jeden więcej dodatek odzywki wykonano w 84 go-zinie i potem zakończono dokarmianie.
Należy zauwazyć, że wystąpiła zasadnicza zmiana lepkości między zatrzymaniem okresu dokarmiania i końcem przebiegu.
Tabela 31 Fdrddntącjt R11A
Czas Pouidt-od (1 pm) Ob-oty na minutę % DO Ciśnienie wsteczne PMV (%) PH Gluk cc (g/l)
0,1 20 200 93 0 2 6,17 5,8
7 20 200 85,1 0 5 6,0C 5,5
12,4 20 300 50,2 0 5,43
21,8 20 400 25,5 0 C8 6,98 0
29 20 500 17 0 35 5,22
30,2 20 500 18,8 10 5,01
C1 20 500 79 10 4,81 1
35,7 20 500 100 10 45 5,57 0
46,2 20 500 23 6 45 5,8 1
Całość glukozy 27,5 g/l
Całość ekstraktu d-oż-ż-weg-: 8,75 g/l
166
189 459
Tabela 31 Ρρ™ρ^^ο R11B
Czas Ppwiptrop (1 pm) Obroty nt minutę % DO Ciśnienie wsteczne PMV (%) PH Gluk cc (g/l)
0,1 20 200 92,9 0 2 5,98 5,4
7 20 200 82,3 0 5 5,9 5
12,4 20 300 49,5 0 5,48
21,8 20 400 18 0 40 7,12 0
29 20 500 36,8 0 35 5,1 3
35,7 20 500 94,5 10 4,74 0
46,2 20 500 14,5 6 45 5,32 2
55 20 500 16,7 10 5,31 0,5
58,6 20 500 19,4 15 5,32 1
61,9 20 500 13 15 40 5,36 2
71,7 20 500 13 15 42 5,37 0
21,8 20 400 18 0 40 7,12 0
29 20 500 36,8 0 35 5,1 3
35,7 20 500 94,5 10 4,74 0
81, 1 20 500 22,9 15 5,42 2,5
85,6 20 500 22 15 45 5,48 1
97,5 20 500 108 15 45 6,47 0
117,7 20 500 15 7,38 0
Całość glukozy: 63 g/l
Całość ekstraktu -rpz-zpwpgr: 14,5 g/l
Tabela 32
Fermentacja R11 A- Przemiana ktra-enonz
StęZsnit (g/l) Przemiana Obl. OH-ktn Tsmpt przemiany (g/l/h)
Próbka Czas OH-ktn Ktnrsn. Całość (%) (g/l) Obliczone Zmienione
R11A-0 0.10 0,00 5,14 5,41
R11A-7 7,00 0,18 4,89 5,07 3,58 0,18 0,03 0,03
R11A-22 21,80 2,02 2,12 4,14 48,75 2,44 0,15 0,12
R11A-29 29,00 3,67 4,14 7,81 47,03 4,48 0,28 0,23
R11A-36 35,70 6,68 1,44 8,12 82,27 7,74 0,49 0,45
R11A-46 46,20 7,09 0,41 7,51 94,48 8,59 0,08 0,04
189 459
167
Tabela C2
Fermentacja R11B· Przemiana ktnrdn-nu
Stężenia (g/l) Przemiana Obl OH-kan Tempa przemiany (g/l/h)
Próbka Czas OH-kan Kanien. Całość (%) (g/l) Obliczone Zmierzone
RUM 0,1 0,00 5,60 5,60
R11B-7 7,0 0,20 4,98 5,18 C,78 0,19 0,0C 0,0C
R11B-22 21,8 2,51 2,46 4,97 50,49 2,52 0,16 0,16
R11B-29 29,0 4,48 16,99 21,47 20,87 4,69 0,30 0,27
R11B-C6 35,7 8,18 10,35 18,53 44,16 9,70 0,75 0,55
R11B-55 55,0 17,03 13,20 30,23 56,33 19,50 0,C2 0,36
RnB-59 58,6 20,80 11,73 32,53 6C,95 21,97 0,69 1,05
R11B-62 61,9 22,19 8,62 30,81 72,02 24,50 0,77 0,42
R11Bl72 71,7 26,62 C,61 30,2C 88,06 29,46 0,51 0,45
R11B-81 81,1 27,13 2,05 29,18 92,97 30,32 0,09 0,05
R11B-86 85,6 26,87 2,02 28,88 93,02 30,11 -0,04 -0,06
R11B-97 97,5 23,95 1,71 25,66 93,34 30,22 0,01 -0,25
R11B-118 117,7 24,10 1,68 25,79 93,47 30,26 0,00 0,01
Przykład 15
Różne kultury testowano pod względem efektywności biokoaudrsji kaardnoat w 11αlhy-rokeykąarenon, zgodnie ze sposobami generalnie opisanymi powyżej.
Wytworzono bank komórek pracujących Apergillus niger ATCC 11394, Rhizopus arrhizus ATCC 11145 i Rhizopus stolonifer ATCC 6227U, w epoeób opisany w przykładzie 5. Pożywkę wzrostową (50 ml) mającą skład przedstawiony w tabeli 18 zaszczepiono zawiesiną zaro-ników (1 ml) z banku komórek pracujących i umieszczono w inkubatorze. Sporzą-zono kulturę posiewową w inkubatorze przez fermentację w temperaturze 26°C przez około 20 go-zin. Inkubator mieszano z prędkością 200 obrotów na minutę.
Równe ilości (2 ml) kultury posiewowej każdego -roUaoustroju użyto do zaszczepienia kolb traneformaoyjayoh, zawierających pożywkę wzrostową (C0 ml) z tabeli 18. Każ-ą kulturę użyto do zaszczepienia dwóch kolb, ze wszystkich sześciu. Kamenon (200 mg) rozpuszczono w metanolu (4 ml) w temperaturze C6°C i wprową-oono 0,5 ml równych ilości tego roztworu -o każ-ej kolby.
PrzeprAwa-zono biokonwereje, gdadrąlaie w warunkach opisanych w przykładzie 5 z do-awanidm 50% wagowo roztworu glukozy (1 ml) każ-ego dnia. Po pierwszych 72 go-zinach uykoaąao następujące obserwacje na rozwijającej eię grzybni w odpowiednich kolbach fermentacji transformacyjnej:
ATCC 11C94 - nawet dobry wzrost;
ATCC 11145 - dobry wzrost w pierwszych 48 go-zinąch lecz grzybnia zbiła eię w kulkę; brak uiaocoaego wzrostu w ostatnich 24 godzinach;
ATCC 6227b - dobry wzrost; masa grzybni utworzyła zbitą kulę.
PoUrąao próbki bulionu -o analizy po- względem rozmiaru bi-konwersji. Po trzech dniach, w wyniku fermentacji przy użyciu ATCC 11C94 otrzymano przemianę do 11a-hydrokeykąardaoat, wynoszącą 80 do 90%; ATCC 11145 zapewniła przemianę, wynoszącą 50%; i ATCC 6227b zapewniła przemianę, wynoszącą 80 -o 90%.
168
189 459
Przykład 16
Przy użyciu zasadniczo sposobu opisanego w przykładzie 15, testowano inne drobnoustroje pod względem efektywności przemiany kanrenonu w l1α-hydroksykanrenon. Testowane organizmy i wyniki testów przedstawiono w tabeli 33:
Tabela 33
Kultury testowane pod względem biokonwersji kanrenonu wobec llalhydroksykanrenonu
Kultura ATTC # Pożywki Wyniki Przybliżona konwersja
Rhizopus oryzae 1145 CSL + 50% -
Rhizopus stolomfer 6227b CSL + 80-90%
Aspergillus mdulans 11267 CSL + 50% 80%
Aspergillus niger 11394 CSL + 80-90% -
Aspergillus ochraceus NRRL405 CSL + 90%
Aspergillus ochraceus 18500 CSL + 90%
Bacillus subtilis 31028 Pi CSL - 0% 0%
Bacillus subtilis 31028 CSL - 0% 0%
Bacillus sp 31029 Pi CSL - 0% 0%
Bacillus sp 31029 CSL - 0% *
Bacillus megaterium 14945 P iCSL + 5% 80%*
Bacillus megaterium 14945 CSL + 5% 10%*
Trichothecium roseum 12519 CSL + 80%* 90%*
Trichothecium roseum 8685 CSL + 80%* 90%*
Streptomyces fradiae 10745 CSL + <5% < 10%
Streptomyces fradiae 10745 TSB * * *
Streptomyces lavendulae 13664 CSL - 0% *
Streptomyces lavendulae 13664 TSB - 0% 0%
Nocardiodes simplex 6946 BP - 0% 0%
Nocardiodes simplex 13260 BP - * *
Pseudomonas sp 14696 BP - * *
Pseudomonas sp 14696 CSL + <5% < 10%
Pseudomonas sp 14696 TSB - 0% *
Pseudomonas sp 13261 BP + * < 10%
Pseudomonas cruciviae 13262 BP # < 10%
Pseudomonas putida 15175 BP 0% 0%
Tworzenie mnych niezidentyfikowanych produktów 1 Pożywki
CSL - płyn z mamaczania kukurydzy,
TS - bulion trypsynowo-sojowy,
P&CSL - pepton i płyn z namaczania kukurydzy,
BP- ekstrakt wolowy i pepton
189 459
169
Przykład 17
Różne drobnoustroje testowano pod względem efektywności przemiany karnenonu w αlhyÓIΌksykanrenpn' Pożywki fermentacyjne dla przebiegów z tego przykładu wytworzono tak jak przedstawiono w tabeli 34.
Tabela 34
Mączka sdjpot
dtkstrdst 20 g
mączka sojowa 5g
NaCl 5 g
ekstrakt drożdżowy 5 g
KH2PO4 5 g
woda do 1 l
pH 7,0
Pepton/ekstrakt drdżdsdoy/glukpst
glukoza 40 g
btktdstptpn 10g
ekstrakt drozdzowy 5 g
woda do 1 l
MutlltrlHintdn
infuja wpłpot 300 g
ctytmmpkwtsy 17,5 g
skrobia 1,5 g
woda do 1 l
Grzyby hodowano na mączce sojowej i w pożywce pepton-ekstrakt drożdzowy-glukoza; atinomycetes i eubacteria hodowano na mączce sojowej (plus 0,9% wagowo mrówczanu sodu do biotransformacji) i w bulionie Muellera-Hintona.
Kultury początkowe zaszczepiono zamrożonymi zbiorami zarodników (20 ml mączki sojowej w 250 ml kolbie Erlenmeyera). Kolby przykryto tkaniną do filtrowania mleka oraz pokrywą biologiczną. Kultury początkowe (24 lub 48-godzinme) użyto do zaszczepienia kultur metabolizmu (także 20 ml w 250 ml kolbach Erlenmeyera) - o objętości przechodzącej 10% óo 15% - i tę ostatnią inkubowano przez 24 do 48 godzin przed dodaniem substratu steroidowego óo reakcji transformacji.
Kamenon rozpuszczono/zawieszono w metanolu (20 mg/ml), wyjałowiono przez filtrację i óoóano óo kultur do stężenia końcowego, wynoszącego 0,1 mg/ml. Wszystkie kolby z fermentacją transformacyjną wytrząsano przy 250 obrotach na minutę (2,5 cm rzut) w kontrolowanej temperaturze pokojowej, wynoszącej 26°C i 60% wilgotności.
Produkty biotransformacji zebrano w 5 i 48 godzinie lub w 24 godzinie, po dodaniu substratu. Zbiór rozpoczął się óoóaniem octanu etylu (23 ml) lub chlorku metylenu do kolby fermentacyjnej. Kolby wytrząsano następnie przez dwie minuty i zawartość każdej kolby wylano óo 50 ml rurki stożkowej. W celu rozózielenia faz, rurki wirowano przy 4θ0θ obrotach na minutę przez 20 minut w jednostce temperatury pokojowej. Warstwę organiczną z każdej rurki przeniesiono do 20 ml fiolki ze szkła bośdkrzemiamowego i odparowano poó zmniejszonym ciśnieniem. Fiolki zakorkowano i przechowywano w temperaturze -20°C.
170
189 459
Aby otrzymać materiał do określenia struktury, biotransformację powiększono do skali 500 ml przez zwiększenie do 25 liczby fermentacji w kolbach do wytrząsania. W czasie zbioru (24 lub 48 godzin po dodaniu subst^tu), do każdej poszczególnej kolby dodano octan etylu i kolby zamknięto oraz włożono z powrotem do wytrząsarki na 20 minut. Zawartość kolb wylano następnie do butelek z polipropylenu i wirowano w celu rozaoielenr4 faz lub na lejek rozdzielający, w którym fazy pozostawiono do rozdzielenia grawitacyjnego. Fazę organiczną wysuszono, uzyskując surowy ekstrakt etero1dóg'j zawarty w mieszaninie reakcyjnej.
Produkt reakcji analizowano najpierw przez chromatografię cienkowarstwową na płytkach fluorescencyjnych (254 nm) z żelem krzemionkowym (250 pm). Do każdej fiolki, zawierającej wysuszony ekstrakt octanu etylu z mieszaniny reakcyjnej dodano octan etylu (500 μΐ). Przeprowadzono dalsze analizy przez wysokowydajną chromatografię w fazie ciekłej i spektrometrię masową. Płytki TLC wywołano w mieszaninie rozpuszczalników 95:5 objętościowo chloroform/metanol.
Przeprowadzono dalsze analizy przez wysokowydajną chromatografię w fazie ciekłej i spektrometrię masową. Użyto Waters HPLC z oprogramowaniem Millenium, detektor z diodą szeregową i autosampler. HPLC z odwrotną fazą stosowała wkład Waters NovaPak C-18 (4 pm wielkości cząstek) RaaialP4k 4 mm. 25 minut liniowego gradientu rozpuszczalnika rozpoczynało się przy kolumnie inicjowanej mieszaniną woaa:acetonrtryl (75:25) i kończyło mieszaniną woda:acetonitryl (25:75). Potem następował trzyminutowy gradient do 100% acetonitrylu i 4 minuty przemywania izokratycznego przed regeneracją kolumny w warunkach początkowych.
Do LC/MS, do obu faz, acetonitrylowej i wodnej dodano octan amonu o stężeniu 2 nM. Chromatografia nie była znacząco zakłócona. Eluent z kolumny podzielono 22:1 z większością materiału skierowaną do czujnika PDA. Pozostałe 4,5% materiału skierowano do komory jonizującej z elektrorozpylaniem spektrometru masowego Sciex API ΠΙ. Spektrometrię masową uzyskano w ustawieniu dodatnim. Linia danych analogowych z czujnika PDA na HPLC przenosiła chromatogram o pojedynczej długości fali na spektrometr masowy do koanalizy danych UV 1 MS.
Wzór fragmentacji spektrometrii masowej okazał się użyteczny do sortowania wśród hydroksylowanych substratów. Dwa oczekiwane hydroksylowane kanrenony, 11αlhyarokeyi 9αlhyaroksy- utraciły wodę przy różnych częstotliwościach w taki sam sposób, który moznaby stosować jako środek diagnostyczny. Także 9α-hyarokeyk4nrenon utworzył a—ukt amonowy, znacznie łatwiej niz 11 αlhyaroksykαnrenon. W tabeli 35 przedłozono omówienie danych TLC, HPLC/UV i LC/MS dla fermentacji kanrenonu, które ukazują, ze testowane drobnoustroje były skuteczne w biokonwersji kanrenonu w 9αlhydrokeyk4nrrnon. Z nich zalecanym drobnoustrojem jest Corynespora cassicola ATCC 16718.
Tabela 35
Omówienie danych dla fr-drntacji kanrenonu TLC, HPLC/UV i LC/MS
Dane dla 9αOHlkαnrronr
1 2 3 4
Kultura Plama TLC przy 9aQH-AD Pik HPLC przy 9αOHlk4nl renonu w/UV MS 357 (M+H), 339 (-H2O) i 375 (+NH4)
Absidia coerula ATCC 6647 brak jest jest/brak
Absidia glauca ATCC 22752 brak
Actinomucor elegans ATCC 6476 ślad jest ślad
Aspergillus flavipes ATCC 1030 ślad
Aspergillus fumigatus ATCC 26934 ślad jest brak
189 459
171 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4
Aspergillus nidulans ATCC 11260 ślad j-st j-st
Aspergillus niger ATCC 16™ brak j-st j-st
Aspergillus niger ATCC 26693 biak j-st brak
Aspergillus ochraceusATCC 1 ™500 biak j-st brak
Bacterium cyclooxydans (S-arl-) ATCC 12603 brak ślad brak
Beauveria bassiana ATCC 0159 ślad j-st j-st
Beauveria bassiana ATCC 13144 j-st jest j-st
Botryosphaeria obtusa IMI 238560 j-st ślad ślad
Calonectria decora ATCC 14060 biak ślad j-st
Chaetomium cochliodes ATCC 10195 ślad ślad j-st/brak
Comomonas testosteron (Searl-) ATCC 11996 ślad ślad brak
Corynespora cassiicola ATCC 1601™ j-st j-st j-st
Cunninghamella blakesleana ATCC 86887 j-st j-st j-st
Cunninghamella echinulata ATCC 3655 j-st jest j-st
Cunninghamella elegans ATCC 9245 j-st j-st j-st
Curcularia clavata ATCC 22921 brak j-st j-st/biak
Curvularia lunata ATCC 12001 j-st b-ak brak
Cylmdrocarpon radicicola (S-a-l-) ATCC 11011 ślad b-ak b-ak
Epicoccum humucola ATCC 12022 j-st j-st j-st
Epicoccum oryzae ATCC 12024 ślad ślad ślad
Fusarium oxysporum ATCC 0601 ślad
Fusarium oxysporum f sp cepae ATCC 11101 brak
Gibberella fujikuroi ATCC ^42 ślad j-st j-st
Gliocladium deliguescens ATCC 10090 j-st ślad ślad
Gonaronella butieri ATCC 22™22 j-st jest UV0 jest
Hypomyces chrysospermus Tul. IMI 109™91 j-st j-st j-st
Lipomyces lipofer ATCC 10092 biak
Melanospora ornata ATCC 26^0 ślad b-ak b-ak
Mortierella isabellinay ATCC 42613 j-st j-st b-ak
Mucor ariscocyanus ATCC 1200a biak
Mucor mucedo ATCC 4605 ślad j-st j-st
Mycobacterium fortuitumn NRRL B™119
Myrothecium verrucaria ATCC 9095 ślad ślad j-st
Nocardia aurentia (S-ail-) ATCC 12604 biak ślad brak
172
189 459 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4
Nocardia concicruria ATCC 31548 jzst jzst brak
Nocardia corallina ATCC 19070 brak
Paecdomyces carneus ATCC 46579 brak jzst brak
Penicillium chrysogenum ATCC 9480 brak
Penicillium patulum ATCC 24550 jzst jzst jzst/bzra
Penicillium purpurogenum ATCC 46581 ślad jzst jzst
Pithomyces atroolivaceus ATCC 6651 ślad jzst ślad
Pithomyces cynodontis ATCC 26150 brak ślad ślad
Phycomyces blakesleenus IMI 118496 jzst jzst jest/brak
Pyconosporium sp ATCC 12231 jzst jzst jzst/bzra
Rhizopogon sp ATCC 36060
Rhizopus arrhizus ATCC 11145 ślad jzst brak
Rhizopus stolomfer ATCC 6227b brak
Rhodococcus egui ATCC 14887 brak ślad brak
Rhodococcus egui ATCC 21329 ślad ślad brak
Rhodococcus sp ATCC 19070 brak brak brak
Rhodococcus rhodochrous ATCC 19150 brak ślad brak
Saccharopolyspora erythaea ATCC 11635 jzst jzst jzst
Sepedonium ampullosporum IMI 203033 brak brak brak
Sepedomum chrysospermum ATCC 13378 brak
Septomyxa affinis ATCC 6737 brak jzst UV? jzst/b-ak
Stachylidium bicolor ATCC 12672 jzst jzst jest/brak
Streptomyces cahformcus ATCC 15436 brak
Streptomyces cmereocrocatus ATCC 3443 brak
Streptomyces coelicolor ATCC 10147 brak
Streptomyces flocculus ATCC 25453
Streptomyces fradiae ATCC 10745 brak
Streptomyces griseus sub sp griseus ATCC 13968 brak
Streptomyces griseus ATCC 11984 brak
Streptomyces hydrogenans ATCC 19631 brak
Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438 jzst jzst jzst
Streptomyces lavendulae Plmlzb 105 brak
Streptomyces paucisporogenes ATCC 25489 brak
Streptomyces purpurascens ATCC 25489 brak ślad ślad
189 459
173 ciąg dalszy tabeli
1 2 3 4
Streptomyces roseochromogenes ATCC 13400
Streptomyces spectabilis ATCC 27465 brak
Stysanus microsporus ATCC 2833
Syncephalastrum racemosum ATCC 18192 brak
Thaminidium elegans ATCC 18191
Thamnostylum piriforme ATCC 8992 jest ślad jest
Thielavia terricolan ATCC 1C807 brak
Trichoderma vinde ATCC 26802 brak
Trichothecium roseum ATCC 12543 ślad jest jdSt/Urtk
Verticillium theobromae ATCC 12474 jest ślad ślad
Przykład 18
Testowano różne kultury pod względem efektywności w biokoauersji aadrostdadiont w 11α-hy-roksyandrostdaaion zgodnie ze sposobami ogólnie opisanymi powyżej.
Bank komórek pracujących każdego z Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500); Aspergillus niger ATCC 11C94; Aspergillus nidulans ATCC 11267; Rhizopus oryzae ATCC 11145; Rhizopus stolonifer ATCC 6227b; Trichothecium roseum ATCC 12519 i ATCC 8685 'wytworzono zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 4. Pożywkę wzrostową (50 ml), mającą skład proeaetąuioay w tabeli 18 zaszczepiono zawiesiną oąroaaikdw (1 ml) z banku komórek pracujących i umieszczono w inkubatorze. Wytworzono kulturę posiewową przez fermentację w temperaturze 26°C przez około 20 godzin. inkubator mieszano z prędkością 200 obrotów na minutę. Równe ilości (2 ml) kultury posiewowej każdego z droUaoustrojóu użyto do zaszczepienia kolb transformacyjnych, zawierających pożywkę wzrostową (C0 ml) z tabeli 15. Każdą kulturę użyto do zaszczepienia dwóch kolb, ze wszystkich 16. An-roeten-ion (C00 mg) rozpuszczono w metanolu (6 ml) w temperaturze C6°C i 0,5 ml równe ilości tego roztworu uprouądoono do każ-ej z kolb. Przeprowadzono Uiokonudrsję generalnie w warunkach opisanych w przykładzie 6 przez 48 godzin. Po 48 godzinach próbki bulionu zlano i ekstrahowano octanem etylu jak w przykładzie 17. Octan etylu zatężono przez odparowanie i próbki analizowano przez chromatografię cienkowarstwOwą w celu określenia obecności produktu, mającego mobilność chromatograficzną podobną do etąnaąrdu na-hydrokeyandrosteadiont (Sigma Chemical Co., St.Louis).
Wyniki ukazano w tabeli C6. Wyniki dodatnie zaznaczono jako „+.
Tabela C6
Biok-audrsjt and-ostendi-nu wobec 1 rαlhydroksyąaa-ostdnodionu
Kultura ATTC # Pożywki TLC wyniki
Rhizopus oryzae 11145 CSL +
Rhizopus stolonifer 6227b CSL +
Aspergillus nidulans 11267 CSL +
Aspergillus mger 11394 CSL +
Aspergillus ochraceus NRRL 405 CSL +
Aspergillus ochraceus 18500 CSL +
Trichothecium roseum 12519 CSL +
Trichothecium roseum 8685 CSL +
174
189 459
Dane w tabeli 36 pokazują, że każda z wymienionych kultur była zdolna do wytworzenia związku z αmdrostendionu, mającego te samą wartość Rf jak standard 11α-hyóśoksyl anórostendionu. Aspergillus ochraceus NRRL 405 (ATCC 18500) testowano ponownie w tej samej procedurze jak opisana powyżej i produkty kultury wyizolowano i oczyszczono przez normalną chromatografię kolumnową na żelu krzemionkowym, przy użyciu metanolu jako rozpuszczalnika. Frakcje analizowano przez chromatografię cienkowarstwową. Płytkami TLC były płytki Whatman D6F z żelem krzemionkowym 60A, wielkość 10 x 20, grubość 250 μ. Mieszaniną rozpuszczalników była mieszanina chloroform : metanol, 95:5 objętościowo. Produkt krystaliczny oraz standard 11αlhydrokyyamdrostemdipn analizowano przez LC-MS i spektroskopię NMR' Oba związki dały podobne profile i ciężary cząsteczkowe.
Przykład 19A
Różne drobnoustroje testowano pod względem skuteczności w biokpmwersji anOrostendionu w 110-hydIΌksyandrostendipm, zasadniczo sposobami opisanymi powyżej w przykładach 17 i 18.
Kultury każdego z Aspergillus fumigatus ATCC 26934, Aspergillus niger ATCC 16888 i ATCC 26693, Epicoccum aryzae ATCC 7156, Curvularia lunata ATCC 12017, Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a i Pithomyces atroolivaceus IFO 6651 hodowano zasa^cM w sposób opisany w przykładzie 17. Pożywki wzrostowe i fermentacyjne (30 ml) miały skłaó ukazany w tabeli 34.
e-Hydroksylaj amdśostemdiomu przez wyżej wymienione drobnoustroje analizowano przy użyciu zasadniczo takiego samego sposobu identyfikacji produktu jak opisany w przykładach 17 i 18. Wyniki przedstawiono w tabeli 19A-1.
Tabela 19A-1 βlHydrdksyltcjt tndrpsttndidnu przez różne drobnoustroje
Organizm TLCL C/MS
Aspergillus fumigatus ATCC 26934 +
Aspergillus niger ATCC 16888 i ATCC 26693 + +
Epicoccum oryzae ATCC 12017 + +
Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a + +
Pithomyces atroolivaceus IFO 6651 + +
W tabeli 19A-1 „+” wskazuje wynik dodatni, to jest Rf jakie oczekiwano w chromatografii cienkowarstwowej i w przybliżeniu prawidłowy ciężar cząsteczkowy w LC/MS.
Wyniki te pokazują, że wymienione drobnoustroje są zdolne do przeprowadzania 11 β -hyóroksylacji androstendionu.
Przykład 19B
Różne órobnoustroje testowano poó względem skuteczności przemiany meksrenonu w 11 βlhydroksymekyrenon' Pożywki fermentacyjne óla tego przykładu wytworzono zgodnie z opisem w tabeli 34.
Warunki fermentacji i metody analityczne były takie same jak w przykładzie 17. Płytki TLC i ukłaó rozpuszczalników były takie jak w przykładzie 18. Uzasadnienie óla analizy chromatograficznej jest następujące: 11 α-hydrokyymeksśenom i lla-hydroksykamenon mają taka samą mobilność chromatograficzną, lla-hydroksykanrenon i 9a-hydrokyykanśenon wykazują taki sam wzór mobilności jak 11α-hyóśoksyanórostendiom i 11 β-hyóśoksyanóśostenóion' Zatem, 11 β-hydroksymekyrenon powinien mieć taką samą mobilność jak 9a-hyóśoksykanrenon. Zatem, związki ekstrahowane z pożywek wzrostowych poddano ponownie przebiegowi przeciw 9a-hwdrpksykanrenonowi jako standardowi. Wyniki ukazano w tabeli 36.
189 459
175
Tabela 37
Omówienie danych dla tuorodnit się 11 β-hydroksymdks-dnonu z ddks-daonu
D-obnoustrój Pożywka Charakter plamki
Absidia coerula ATCC 6647 M, S silny
Aspergillus niger ATCC 16888 e,p słaby (S) ? (P)
Beauveria bassiana ATCC 7159 P silny
Beauveria bassiana ATCC 13144 S,P 9 9 9 ·
Botryosphaeria obtusa IMI 038560 słaby
Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a S,P silny
echinulata ATCC 3655 s,p silny
elegans ATCC 9245 SP silny
Curvularia lunata ATCC 12017 s silny
Gongronella butleri ATCC 22822 s,p silny
Penicillium patulum ATCC 24550 SP silny
Penicilliumpurpurogenum ATCC 46581 SP silny
Pithomyces atroolivaceus IFO 6651 S,P słaby
Rhodococcus egui ATCC 14887 M słaby
Saccharopolyspora erythaea ATCC 11635 M, SF słaby
Streptomyces hygroscopicus ATCC 274C8 M, SF silny
Streptomyces purpurascens ATCC 25489 M, SF słaby
Thaminidium elegans ATCC 18191 s,p słaby
Thamnostylum piriforme ATCC 8992 SP słaby
Trichothecium roseum ATCC 12543 P,S słaby (P)
1 M = Mueller-Hinton
P = PYG (pepton/ekstrakt drozdżowy/glukoza)
S = mączka sojowa SF = mączka sojowa plus mrówczan 29 = możliwa do zakwestionowania różnica z kontroli bez substratu
Dane te sugerują, ze większość organizmów wymienionych w tej tabeli wytwarzają pro-ukt po-obny lub identyczny z 11 β-hy-rokeymeksrenonu z meksrenonu.
Przykład 19C
Różne drobnoustroje testowano po- względem skuteczności przemiany meksrdnoat w 11 α lhy-rokeymdkerdaon. Δ 12-meksrenoa, 6β-hydr-keymekerenoa, 12βlhydrokeymdkerdaoa i 9α-hy-rokeymekerdaon. Mekerenon można wytworzyć w sposób przeastąuioay u Wdierą, opis patentowy U.S. nr C 787 C96 i R. M. Weier i 1n., J. Med. Chem., tom 18 strony 817-821 (1975), które załącza się w niniejszym jako odniesienie. Wytworzono pożywki fermentacyjne jak opisano w przykładzie 17, z wyjątkiem, ze włączono mekerenon. Warunki fermentacji były zaeąaaicoo takie same jak w przykładzie 17; meto-y analityczne były także takie same jak w przykładach 17 i 18. Płytki TLC i ukła- rozpuszczalników był taki jak opisano w przykładach 17 i 18.
Testowane drobnoustroje i uzyskane z nimi wyniki ukazano w tabeli 19C-1.
176
189 459
Tabela 19C-1
Wytwarzanie 11 a-h9-rρkt9mpks-pnrnu z mpksrpnpnz przez róZns --pUnpustrpjp
Organizm THC HPHC m/z
457 : 399
Beauveria bassiana ATCC 7159 + + 5:1
Beauveria bassiana ATCC 13144 + + 10.1
Mortierella isabella ATCC 42613 + + 1-1
Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688t + + 1:1
Cunninghamella echinulata ATCC 3655 + + 1 2
Cunninghamella elegans ATCC 9245 + + 1:1
Absidia coerula ATCC 6647 + + 1T
Aspergillus niger ATCC 16888 + + 4:1
Gongronella butieri ATCC 22822 + + 3 1
Pithiomyces atroolivaceus ATCC 6651 + + 3 1
Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438 + + 3:1
W tabeli 19C-1 „+” wskazuje -odatni wynik, to jest Rf w chromatografii cienkowarstwowej i czas retencji, jakie oczekiwano w HPLC. m/z 417:399 wskazuje współczynnik wysokości pikz 417 cząsteczki (hydrokdymekdrenoau) i 399 cząsteczki (mekd-enonu). Stan-arposiada współczynnik wysokości pikz 10:1 z m/z 417 do m/z 399.
ProdZkt otrzymany od Beauvaria bassiana ATCC 13144 wyizolowano z mieszaniny ϊηkzUacyjapJ i analizowano przez NMR, a potwierdzono, ze profil dt2uktz2alny odpowiada 11α-h9-roktymekrenoaowe. Przez analogię, przypuszczano, że produkty otrzymane od innych arobnouttrpjów wymienionych w tabeli 19C-1 są także ϊϊα-hydrpksymzkd-eapnem.
Tabela 19C-2
Wytwarzanie Δl’2łmpkt-pnpnu z mpksrpnrnu przez różne --rUnputt-pJp
Organizm m/z 399 HPHC THC
Rhodococcus egui ATCC 148875 + + +
Bacterium cyclooxydans ATCC 12673 + + +
Comomonas testosterom ATCC 11996 + + +
Nocardia aurentia ATCC 12674 + + +
Rhodococcus egui ATCC 21329 + + +
W tabeli 19C-2 „+” wskazuje -o-atni wynik, to jest Rf w chromatografii cieakpwa-stwowej i czas retencji, jakie oczekiwano w HPHC itd.
Produkt otrzymany o- Bacterium cyclooxydans ATCC 12673 wyizolowano z mieszaniny inkubacyjnej i analizowano przez nMr oraz potwier-opao, żz profil strukturalny odpowiada Δl2-mzksrpaoapwi. Przez analogię przypuszczano,^ produkty otzyymnpe -5 in9och drobnoustrojów wymienionych w tabeli 19C-2 są także Δl’2-mekdrenonpm.
189 459
177
Wytwarzanie 6β- i 12 β-hydroksymeksrenonu
Mortierella isabella ATCC 42613 hodowano jak w przykładzie 17 w obecności mekerel nonu. Produkty fermentacji wyizolowano i oczyszczono przez chromatografię rzutową. Oczyszczone produkty analizowano przez LC/MS jak w przykładach 17 i 18 oraz NMr protonu i NMR węgla-O. Dane wskazywały, ze produkty obejmowały 6β- i Ι2β-hyarokeymekerentln.
Tabela 19C-3
Wytwarzanie 9alhydroksydekerrnonu z drkerrnonr przez różne drobnoustroje
Organizm m/z 417 HPLC TLC
Streptomyces hygroscopicus ATCC 27438 + + +
Gongronella butleri ATCC 22822 + + +
Cunninghamella blakesleeana ATCC 8688a + + +
Cunninghamella echinulata ATCC 3655 + + +
Cunninghamella elegans ATCC 9245 + + +
Mortierella isabellina ATCC 42613 + + +
Absidia coerula ATCC 6647 + + +
Beauveria bassiana ATCC 7159 + + +
Beauveria bassiana ATCC 13144 + + +
Aspergillus niger ATCC 16888 + + +
Drobnoustroje wymienione w tabeli 19C-3 hodowano w takich samych warunkach jak w przykładzie 17, w obecności mekerenonu. Produkty fermentacji analizowano przez TLC i LC/MS jak w przykładach 17 i 18. „+” wskazuje wynik dodatni, np. Rf w chromatografii cienkowarstwowej i czas retencji, jakie oczekiwano w HPLC itd. Dane sugerują, że produkty obejmują 9α-hyarokeymekerenon.
Przykład 19D
Różne drobnoustroje testowano pod względem efektywności w przemianie kanrenonu w Δ 1’2lkanrenon. Pożywki fermentacyjne i warunki wzrostu były zasadniczo takie same jak w przykładzie 17, z wyjątkiem, że w pożywce zawarto kanrenon. Metody analityczne były takie jak opisano w przykładach 17 i 18. Drobnoustroje i wyniki ukazano w tabeli 19D-1 poniżej.
Tabela 19D-1
Wytwarzanie ΔΙ2lkan-rnonr z kam-monu przez różne drobnoustroje
Organizm m/z 339 HPLC TLC
Bacterium cyclo-oxydans ATCC 12673 + + +
Comomonas testosteroni ATCC 11996 + + +
Cylindrocarpon radicicola ATCC 11011 + + +
Paecilomyces carneus ATCC 46579 + + +
Septomyxa affinis ATCC 6737 + + +
Rhodococcus spp. ATCC 19070 + + +
178
189 459
Produkty fermentacji anzlizowzno przez TLC i LC/MS jzk w przykładach 17 i 18. „+” wskazuje wynik -o-ztni, np. Rf w cb-ODZtogzafli ciznaowzzstwowzj i czas retencji, jakie oczekiwano w HpLC itd.
Produkt ztreyDzny od Comomonas testosteroni ATCC 11996 wyizolowano z pożywki wzrostowej i analizowano p-zez spektroskopię UV. Profil spektroskopowy potwierdził obzcność Δ 12-kznzznznu. Przez analogię przypuszczano, żz aro-nkty otrzymane o- innych drabmust-ojów wymienionych w tabeli 19D-1 są także Δ 12-kanzznonzm.
Przykład 20A
Schemat 1:
Etap 1:
Meto-a A:
Wytwarzanie 5'R(5'α),7'β-70'szmiaobąksaazkzby-ro-11 'β10'α, 13'α-dlmztyi lZi3',5idioksospiro[fuzano-7(3H),17'α(5Ή)i[7,4]Dztzno[4H[cyklopznta[a]fznantzznz]-5'i -kazbznitzylu
Do reaktora z wewnętrzną powłoką szklaną o pojemności 225 litrów wprowadzono 61,2 litra (57,8 kg) DMF, po czym p-zy mieszaniu 23,5 kg 11ihy-roksykαnzznznn 1. Do mieszaniny dodano 7,1 kg litu. Całość mieszano przez 20 minut, wazowadzzno 16, 9 kg acztonzoejznzhy-zyne, z potzm 5,1 kg t-iztylzrmiay. Mizszzninę ogrzano do temperatury 85°C i nt-zyDywzno w tej tZDazratn-zz w ciągu 13-18 godzin. Po reakcji dz-anz 353 litry wo-y i potem 5,6 kg kwaśnego węglanu so-u. Mieszaninę ochło-zono do temperatury 0°C, przeniesiono -o reaktora z wewnętrzną powłoką szklzną o pojemności 900 lit-ów i gaszono powoli 130 kg 6,7% roztworu podchlorynu so-u. Produkt odsączono i przemyto pz-cjzmi wody 3 x 40 lit-ów, uzyskując 21,4 kg produktu, znzminy.
NMR 'H (DMSO--6): 7,6 (2H, b-), 4, 53 (1H, -, J = 5, 9), 3,71 (1H, m), 3,0-1,3 (17H, m), 1,20 (5H, m), 0,86 (3H, s), 0,51 (1H, t, J = 10).
P-zykład 20 B
Wytwarzanie ydaktonu kwasu 7αiOyjano-11α,17--ihy-roksy-3-zksz-17α-p-zgn-4-znZi -21 -aa-bzksylzwzgz o
189 459
179
50,0 g 11-hydroksykanrenonu i 150,0 ml dimetyloacetamidu wprowadzono do czystej, suchej trój szyjnej kolby, zaopatrzonej w mechaniczne mieszadło, chłodnicę, termoparę i płaszcz grzejny. Do tej mieszaniny dodano 16,0 ml roztworu kwasu siarkowego (sporządzonego przez zmieszanie 50,0 ml kwasu siarkowego (98,7% gatunek Bakera z 50 ml wody). Następnie dodano roztwór cyjanku sodu zawierający 15,6 g cyjanku sodu i 27,0 ml wody.
Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C przez 7 godzin, sprawdzając okresowo stopień konwersji na drodze TLC lub HPLC. Po około 7 godzinach HPLC mieszaniny wykazała obecność 7-cyjano związku. Mieszaninę mieszano jeszcze przez noc i pozwolono na ochłodzenie do temperatury pokojowej (około 22°C). Do mieszaniny dodano 200 ml wody, potem 200 ml chlorku metylenu i mieszano uzyskaną dwufazową mieszaninę, po czym pozostawiono do rozdzielenia. Warstwę wodną stanowił zel. Do warstwy wodnej dodano 100 ml roztworu kwaśnego węglanu sodu, próbując bez powodzenia rozbić żel. Warstwę wodną wówczas odrzucono.
Oddzieloną warstwę chlorku metylenu przemyto 100 ml wody i mieszano uzyskaną dwufazową mieszaninę. Fazy pozostawiono do rozdzielenia i oddzieloną warstwę chlorku metylenu przesączono przez 200 g żelu krzemionkowego (Aldrich 200-400 mesz, 60 A). Przesącz zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C, stosując pochłaniacz wodny i otrzymano około 53,9 g surowego stałego produktu. Surowy stały produkt rozpuszczono następnie w 50 ml chlorku metylenu i potraktowano 40 ml 4N kwasu chlorowodorowego w rozdzielaczu, pozostawiając dwufazową mieszaninę do rozdzielenia. Warstwę chlorku metylenu przemyto 50 ml wody. Połączone warstwy wodne ekstrahowano 50 ml chlorku metylenu. Połączone warstwy chlorku metylenu suszono następnie nad siarczanem sodu, uzyskując 45 g ciała stałego, które było mieszaniną 11 α-hydroksykanrenonu i produktu, γ-kiktonu kwasu 7α-cyjano-l1α, 17ldihydroksy-3-okso-17a-pregnl4-eno-21-karboksylowego.
Próbkę produktu analizowano na drodze HPLC (kolumna: 25 cm x 4,6 mm, 5 Altima Ci8LL); gradient rozpuszczalnika: rozpuszczalnik A = woda/kwas trifluorooctowy - 99,9/0,1, rozpuszczalnik B = acetonitryl/kwas trifluorooctowy = 99,9/0,1, prędkość przepływu = 1,00 ml/minutę, gradient = 65:30 (objętościowo) (A:B - początkowo), 35:65 (objętościowo) (A:B -po 20 minutach), 10:90 (objętościowo) (A:B - po 25 minutach); detektor diodowy), która wykazała λ,,κ1\ 238 nm.
Mieszaninę reakcyjną analizowano przez HPLC-NMR, stosując następujące warunki: HPLC- kolumna: Zorbax RK-C8 (25 cm x 4,6 mm, 5 μ), z użyciem gradientu rozpuszczalnika od 75% D2O, 25% acetonitrylu do 25% D2O, 75% acetonitrylu przez 25 minut przy przepływie 1 ml/minutę;
NMR *H (stosując tłumienie rozpuszczalnikiem WET): 5,84 (s, 1H), 4,01 (m, 1H), 3,2 (m, 1H), 2,9-1,4 (m, znaczenie niecałkowite (integral not meaningful) w związku z tłumieniem rozpuszczalnikiem, acetonitrylem), 0,93-0,83 (s, częściowo zachodzące na siebie 3H i t, 2H).
Przykład 20C
Wytwarzanie ^dld^l:onu kwasu 5β,7α-dicyjano-l7-hydroksy-3-okso-l7α-pregnano-2l-karboksylowego
W okrągłodennej trójszyjnej kolbie o pojemności 3 litrów zawieszono 102 g (0,3 mola) γ-kiktonu kwasu l7-hydroksy-3-okso-l7αlpregna-4,6-dieno-2l -karboksylowego (kanrenonu)
180
189 459 z 46,8 g (0,72 mola) cyjanku potasu, 78,6 ml (1,356 mola) kwasu octowego i 600 ml metanolu' Do mieszaniny dodano 64,8 ml (0,78 mola) piśolidymw i połączoną zawiesinę ogrzano do temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin (64°C) i utrzymywano tak w ciągu około 1,5 godziny.
Temperaturę zawiesiny obniżono wteóy do temperatury 25-30°C przez okres 10 minut na łaźni chłodzącej. Dodano wolno 120 ml stężonego kwasu chlorowodorowego podczas chłodzenia i wytrąciło się ciało stałe o barwie żółtobrązowej.
Całość mieszano w temperaturze 25-30°C przez 1,5 godziny, po czym wprowadzono dodatkowe 500 ml wody w ciągu 30 minut. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 5°C na łaźni lodowej i doprowadzono pH z 3 do 5,5 (monitorowano pH, stosując papierki wskaźnikowe), dodając 1θ0 ml 9,5M wodnego wodorotlenku sodu (0,95 mola).
Nadmiar cyjanku rozłożono przez dodatek domowego wybielacza. Dodano 25 ml (0,020 mola) do uzyskania ujemnego wyniku próby jodkowO-skrobiowej.
Zimną mieszaninę (10°C) odsączono i ciało stałe przemywano wodą aż przemywki wykazały obojętne pH (papierki wskaźnikowe pH).
Ciało stałe wysuszono w temperaturze 60°C do stałego ciężaru 111,4 g.
Wyodrębnione ciało stałe topiło się w temperaturze 244-246°C w aparacie Fishera-Johnsa.
Roztwór metanolowy, zawierający ciało stałe nie wykazywał absorpcji w zakresie UV 210-240 nm.
IR (CHCb) cm’i 2222 (cyjanek), 1775 (lakton), 1732 ^-keto).
NMR ’H (pirydyna ds) ppm: 0,94 (s, 3H), 1,23 (s, 3H).
Przykład 21 A
Schemat 1:
Etap 2:
Wytwarzanie 4'S(4'a),7'a-hekyadekahwdro-1Γa-hydśokyw-10'β,13'βldimetwlo-3',5,20'thokyos]piśo[fuśalio-2(3H),17'βl[4,7]metano[17H|cyklopemta[a]ίenantreno]-5'β(2'H)-karbonitrylu
Do reaktora z wewnętrzną powłoką szklaną o pojemności 900 litrów wprowadzono 50 kg enaminy 2, około 445 litrów 0,8N rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego i 75 litrów metanolu. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C przez 5 godzin i chłodzono w temperaturze 0°C w ciągu 2 godzin. Odsączono ciało stałe, uzyskując 36,5 kg suchego produktu, óiketonu.
NMR 'H (DMSO-d6): 4,53 (1H, d, J = 6), 3,74 (2H, m), 2,73 (1H, dd, J = 14,7), 2,65-2,14 (8H, m), 2,05 (1H, t, J = 11), 1,98-1,71 (4H, m), 1(64 (1H,m), 1,55 (1H, dó, J = 13,5), 1,45-1,20 (7H, m), 0,86 (3H, s).
189 459
181
Przykład 21B
Schemat 1:
Etapy 1 i 2:
Wytwarzanie in situ 4'S(4'k),0'ksheksadekahydro--Γα-hydroksys12'β,13'β-almetylo-3',5,20'-trioksospπΌ[fur7nos2(3H),10'(3-[4,0]mea7ao[10H[cyklopenta[a]fen7ntreao]-5'β(2Ή)kai-bonitrylu z 11k-hyaroksykaarenonu
Do reaktora zaopatrzonego w chłodnicę, mechaniczne mieszadło, płaszcz grzejny i regulator oraz lejek wprowadzono 100 g (2™0,54 mmola) 11-hydIoksyk7areaonu wytworzonego jak w przykładzie 1, potem 300 ml dimeayloaceaamlds (Aldi·^). Całość mieszano do rozpuszczenia 11shyaIoksykaareaonu. Do tej mieszaniny dodano 31,5 ml 50% kwasu siarkowego (Fisher), który spowodował, że temperatura uzyskanej mieszaniny podniosła się o 10-15°C. Następnie dodano do mieszaniny 11-hydroksykaareaonu roztwór cyjanku sodu sporządzony przez rozpuszczenie 31,1™ g (610,20 mmola) (Aldrich) cyjanku sodu w 54 ml za-jonizowanej wody w ciągu 2-3 miasa. Po dodaniu roztworu cyjanku sodu temperatura uzyskanej mieszaniny wzrosła o około 20-25°C.
Mieszaninę ogrzano do temperatury ™0°C i utrzymywano w tej tempeI7asIee pizez 2-3 godziny. Gdy analiza HPLC wykazała, ze reakcja konwersji 11-hydroksyk7nrenonu na ea7minę była zasadniczo zakończona (ponad 9™% konwersji), usunięto źródło ciepła. Nie wyodrębniając enaminy zawartej w mieszaninie wprowadzono w ciągu 3-5 minut do mieszaniny dodatkowe 14™ ml 50% kwasu siarkowego. Następnie w ciągu 10 minut do mieszaniny dodano 490 ml zdejonioowaaej wody.
Mieszaninę ogrzano do temperatury 102°C i utrzymywano w tej temperaasroe aż około 500 g destylatu zostaniz usunięte z mieszaniny. Podczas reakcjl/destylacji do mieszaniny dodano 500 ml zdejoaloow7nzj wody w czterech oddzielnych porcjach po 125 ml. Każdą porcję dodawano do mieszaniny po usunięciu równoważnej ilości destylatu (około 125 ml). Reakcję kontynuowano przez ponad 2 godziny. Gdy analiza HPLC wykazała, ze reakcja hydrolizy enaminy na aiketon była zasadniczo zakończona (ponad 9™% konwersji), mieszaninę ochło-zono do temperatury około ™0°C przez 20 minut. Mieszaninę przesączono przez szklany sączek. Reaktor przemyto 1,2 litrami zdejoaizow7aej wody, z.eby usunąć pozostały produkt. Ciało stałe przemyto na sączku trzy razy, stosując w przybliżeniu równe porcje (około 0,4 litra) wody do przemycia. W reaktorze sporządzono 1 litr roztworu metanolu i oaejoaleowanej wody (1:1 objętościowo) i przemyto przesącz 500 ml tego roztworu. Następnie przemyto przesącz diugi raz pozostałymi 500 ml roztworu metanol/woda. Do lejka podłączono omnlejszone ciśnienie, zeby wystarczająco wysuszyć produkt w celu przeniesienia. Pizesącz pIeeniesiono do suszarki, kaoie suszono go pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu 16 godzin do otrzymania ™4 g suchego produktu, dlketonu 4'S(4'k),0'k-heks7dekahydro-lΓα-łlydroksys12'β,13'βsalmztylo-3',5,22'-trioksospiro[furaaos2(3H),10'β-[4,0]met7ao[10H[cyklopeaaa[a]s sfea7aardao]-5'β(2Ή)skarboalarylu. Oznaczenie HPLC wykazało 94% żądanego aiketoas.
Przykład 22
Schemat 1:
Etap 3A:
Metoda A:
Wytwarzanie γ-ΡΑίζην!. 11 k, 10k-dihydroksys3 soksoprekn-4-eno-0k,21 -alkaIboksylans wodoio-metylowego
4-Szyjną kolbę o pojemności 5 litiów zaopatrzono w mieszadło mechaniczne, wkraplacz z ru-ką doprowadzającą azot i wyrównaniem ciśnienia, termometr i chłodnicę z bełkotką. Bełkotka była połączona poprzez rurkę typu tygon (tygon) z dwoma 2slltrowymi pochłamaczami, z których pierwszy był pusty i umieszczony dla zabezpieczenia przed zassaniem materiału z drugiego pochłaniacza (1 litr stężonego roztworu podchlorynu sodu) do naczynia reakcyjnego. Dlketon 3 (09,50 g; [ciężar nl-skorygowany, dla czystości wynoszącej ™5%]) dodano do kolby z 3 litrami metanolu. 25% metanolowy roztwór metoksylanu sodu (64,™3 g) smieseczoao we wkiaplaczu i wkroplono, mieszając, w atmosferze azotu w ciągu 10 minut. Po zakończeniu dodawania mieszaninę reakcyjną barwy zOho-pomarańczowej ogrzewano w tempeI7asIze wrzenia wobec powrotu skroplln w ciągu 20 godzin. Po tym czasie wkroplono 160 ml 4N HCl (ostrożnie; w tym okresie wydzielani- HCN) z wkraplacza do destylującej
182
189 459 mieszaniny reakcyjnej w tzDazzztn-oz wzzzniz wobec powrotu sk-oplin. Kolo- mieszaniny reakcyjnej zjaśniał -o jasnozloto-aomarzńoe.owzgo. Chło-nicę zastąpiono wtedy głowicą destylacyjną i oddestylowano 1,5 lit-z metanolu, podczas gdy jz-nzczzśnią -z-awanz -o kolby 1,5 lit-z wo-y p-zez wkraplacz zgodnie z prędkością destylacji. Mizszzninę reakcyjną zoałodzznz do tzmpz-atu-y otoczenia i ekstrahowano -wz razy równymi po-cjami 2,25 litra oblzran metylenu. Połączone ekstrakty p-zeDyto kolejno równymi aozcjzDe 750 d1 zimnego nasyconego roztworu NzCl, 1N NzOH i znowu nasyconego NzCl. Warstwę organiczną suszono przez noc nad siz-czanzm so-u, przesączono i zmniejszono objętość -o -250 ml pod zmnizjszznyD ciśnieniem. Dodano toluen (300 d1) i pozostały chlorek metylenu zdpę-zono pozmnizjseznyD ciśnieniem, aoaczzs czego produkt zaczął tworzyć na ścianach kolby białe ciało stałe. Zawartość kolby oblo-zonz p-zez noc i ciało stałe usunięto a-oąz filtrację. P-zzmyto je 250 ml toluenu i -wz rzzy równymi aozojzmi 250 d1 eteru i suszono na próżniowym lejku, zt-zymnjąo 58,49 g białego cizłz stałego o 97,3% czystości, oznaczonej p-zez HPLC. Zatęzając ług macierzysty otrzymano -z-atkzwz 6,76 g produktu o 77,1% czystości. Cała wydajność skorygowana wz-ług czystości wyniosła 78%.
NMR 'H (CDCI3): 5,70 (1H, s), 4,08 (1H, s), 3,67 (3H, s), 2,9-1,6 (19H, m), 1,5-1,2 (5H, m), 1,03 (3H, s).
Przykład 23
Schemat 1:
Etap 3B:
Konwersj a γ--aktom 11α, 17 αidihy-roksy-3-zksoprzgn-4-ąnos7α,71 saiaa-bzasylanu wz-o-z-mztylowzgo w γ-kikton 17α-by-roasy-11α-(mztylosnlfbnylz)oksy-3izksopregni4-ζ^^α^ 1 --ika-bzksylznu woao-OsDztylowzgo
5iszyjną kolbę zaopatrzono jzk w powyższym a-oyalz-ziz, poza tym, żz za bełkotką nie uDizseoezno układu pochłaniającego. Do kolby dodano 138,70 g by-zoksyzstzn, potem 1425 ml chlo-ku metylenu p-zy mieszaniu w atmosferze zzotu. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono -o temperatury -5°C, używając łzźni lód/sól. Szybko -o-ano cblozza metanosulfonylu (51,15 g, 0,447 mola) i potem wolno wk-zplznz trietylenozDinę (54,37 g) w 225 d1 oblo-kn metylenu. Do-awaniz, któ-z wymagało --30 minut, tak nastawiono, aby temperatura reakcji nie wzrosła do około 5°C. Po dodzniu kontynuowano Dezszzaez p-zez 1 godzinę i śro-owisko reakcji a-oznizsizno -o 12-litrowzgo roz-zielzcza, g-ziz -o-ano 2100 d1 chlorku metylenu. Roztwór przemyto kolejno równymi zimnymi az-cjzDi 700 d1, 1N HCl, 1N NzOH i nasyconego wodnego roztworu NaCl. PrzzDywki wo-nz połączono i powtórnie zastrzbzwzno 3500 ml oblo-ku metylenu. Wszystkie organiczną przzmywki połączono w 9slitzowyD naczyniu, do którego dodano 500 g obojętnego tlenku glinu o aktywności II stopnia o-zz 500 g bezwodnego siazczznn sodu. Zzwz-tość naczynia mieszano dobrze przez 30 minut i ar'z.ąsąoezlao. Przesącz suszono po- zmniejszonym ciśniznizD, otrzymując żółtą, lepką piankę. Rozpuszczono ją w 350 ml oblo-kn metylenu i wk-oplono 1800 d1 eteru przy mieszaniu. Prę-kość dodawania tak nastawiono, aby około połowa ete-u była -o-anz w ciągu 30 minut. Po aoaaniu zkzlz 750 ml zaczął się wydzielać jako krystaliczne ciało stałe. Pozostały eter -odano w ciągu 10 minut. Ciało stałe usunięto przez filtrację, plzczk filtracyjny przemyto 2 litrami eteru i suszono przez noc w próżniowej suszarce w temperaturze 50°C, uzyskując 144,61 g (88%) p-awiz białego ciała stałego o temperaturze topnienia 149-150°C. Materiał wytworzony w ten sposób ma typowo czystość 98-99% przy oznaczeniu na aro-ez HPLC (% powierzchni). W jednej szarzy otrzymano materiał mający tempe-zturę topnienia = 153-153,5°C- p-zy oznaczeniu według HpLc 99,5% azwiz-zcani.
NMR ‘H (CDCI3): 5,76 (1H, s), 5,18 (1H, dt), 3,68 (3H, s), 3,06 (3H, s), 2,85 (1H, m), 2,75-1,6 (19H, m), 1,43 (3H, s), 1,07 (3H, s).
Przykład 24
Schemat 1:
Etap 3C:
Metoda A:
Wytwarzanie γ-iaktann 17α-by-roksy-3-oksoaregna-4,9(11)--iznos7α,21i-laarbzaselanu wzdzro-7-mztylowzgo
189 459
183
Czteroszyjną kolbę zaopatrzono jak w drugim przykładzie. Do kolby dodano przy mieszaniu i w atmosferze azotu kwas mrówkowy (250 ml) i Ueouoanik octowy (62 ml). Do-ano mrówczan potasu (6,17 g) i mieszaninę reakcyjną ogrzewano na łaźni olejowej do temperatury wewnętrznej 40°C (powtórzono to później w temperaturze 70°C z lepszym wynikiem) przez 16 godzin. Po 16 godzinach dodano mesylan i wewnętrzną temperaturę podniesiono -o 100°C. Ogrzewanie i mieszanie kontynuowano przez 2 godziny, po czym usunięto rozpuszczalnik po- zmniejszonym ciśnieniem na wyparce rotacyjnej. Pozostałość mieszano z 500 ml lo-u z wo-ą przez 15 minut, potem ekstrahowano dwa razy równymi porcjami 500 ml octanu etylu. Połączono fazy organiczne i przemyto kolejno równymi zimnymi porcjami 250 ml naeyooadgo roztworu chlorku so-u (dwa razy), 1N roztworu wodorotlenku so-u i znowu nasyconego roztworu chlorku sodu. Naetępnie fazę organiczną wysuszono nad siarczanem so-u, przesączono i odparowano do sucha po- zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując żółtawo-białą piankę, która sproszkowała się na szkło przy dotknięciu łopatką. Utworzony proszek, 14,65 g, stanowił we-ług analizy (przez HPLC jako % powierzchni) mieszaninę 82,1% 17alhydroksy-3-oksopregna-4,9(11)-dieaOl7α,21-dikąrbokeyląau wo-or0l7lmetylouego; 7,4% /--aktorni 17α-hyarokey-Clokeopregaal4,11-dienOl7α,21l-ikarUokeyląau uodorol7lmetylouego i 5,7% kwasu 9α,17l-ihydroksy-3-okso-17α-prcgn-4-eao-7α,21-dikarUokeylowego.
NMR ‘H (CDC1c): 5,74 (1H, s) 5,67 (1H, m), C,61 (CH, s), C,00 (1H, m), 2,84 (1H, ddd, J = 2,6, 15), 2,65-2,42 (6H, m) 2,C-2,12 (5H, m), 2,05-1,72 (4H, m), 1^^^1,45 (2H, m), 1,42 (CH,e), 0,97 (CH, e).
Przykład 25
Schemat 1:
Etap CC:
Meto-a B:
Wytwarzanie Ydaktonu 17α-hy-roksy-3-oksopregna-4,9(11)ldieno-7α,21-aikąrUoksyląnu uo-oro-metylowdgo
Kolbę z pięcioma szyjami zaopatrzono jtk w powyższym przykładzie i do-ano przy mieszaniu i w atmosferze azotu 228,26 g kwasu octowego i 41,C7 g octanu sodu. Stosując łaźnię olejową ogrzano mieszaninę -o wewnętrznej temperatury 100°C. Do-ano mesylan (12C,65 g) i kontynuowano ogrzewanie w ciągu C0 minut. W końcu tego okresu przerwano ogroduąaid i dodano 200 ml lodu z wo-ą. Temperaturą spa-ła -o 40°C i kontynuowano mieszanie przez 1 godzinę, po czym mieszaninę reakcyjną wolno wlano -o 1,5 litra zimnej wo-y w 5-1ϊΡο^ kolbie z mieszaniem. Pro-ukt wy-zielił się jako kleisty olej. Olej rozpuszczono w 1 litrze octanu etylu i przemyto 1 litrem zimnego nasyconego roztworu chlorku sodu, zimnego 1N wodorotlenku sodu i na koniec znów nasyconego roztworu chlorku sodu. Fazę orgaaiooaą wysuszono nad siarczanem so-u i przesączono. Przesącz oapąrouąao -o sucha pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując piankę, która opada, tworząc kleisty olej. Rozcierano go z eterem przez pewien czas i ewentualnie zestalał eię. Ciało stałe odsączono i przemyto je większą ilością eteru, uzyskując 79,59 g żólto-białego ciała stałego. Zawierało ono 70,4% żą-anego enestru Δ9^ 1 6, 12,C% eneetru Δm2 8, 10,8% 7-α, 9-a-laktonu 9 i 5,7% aieproereągouąaego 5.
Przykład 26
Schemat 1:
Etap CD:
Metoda A:
Wytwarzanie γ-laktoau 9,11 α-epokey-17α-hydroksy-C-oksopregn-4-da0l7α,21-dikąrUoksylanu wo-oro-metylowego
Czter-szyjny reaktor z płaszczem o pojemności 500 ml zaopatrzono w mechaniczne mleezą-ło. ohło-aloę/Uełkotkę, termometr i wk-aptecz z rurką aoprowa-zającą azot. Do reaktora uprową-zono 8,C2 g surowego eneetru w 8C ml chlorku metylenu przy mieszaniu w atmosferze azotu. Do-ano do tego 4,02 g -w^aba-owego fosforanu potasowego, potem 12 ml trlohloroąodtoaltrylu. Dopuszczono z zewnątrz zimną wo-ę do płaszcza reaktora i mieszaninę reakcyjną ochło-zono do temperatury 8°C. Przez wk-aptecz do-ano C6 ml C0% nadtlenku wodoru w ciągu 10 minut. Mieszanina reakcyjna początkowo zabarwiona na jasn-żółto zmie184
189 459 niła się na prawie bezbarwną po zakończeniu dodawania. Mieszanina reakcyjna pozostawała w temperaturze 9 ± 1°C w ciągu dodawania i kontynuowano mieszanie przez noc (ogółem 23 godziny). Do mieszaniny reakcyjnej dodano chlorek metylenu (150 ml) i całą zawartość wlano óo -250 ml wody z lodem. Ekstrahowano trzy razy równymi porcjami 150 ml chlorku metylenu. Połączone ekstrakty chlorku metylenu przemyto 400 ml zimnego 3% roztworu siarczynu sodu, aby rozłozyć pozostały nadtlenek. Następnie myto 330 ml zimnego 1N wodorotlenku sodu, 400 ml zimnego 1N kwasu chlorowodorowego i na koniec 400 ml solanki. Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu, przesączono i placek filtracyjny przemyto 80 ml chlorku metylenu. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 9,10 g surowego produktu jako jasnozółte ciało stałe. Rekrystalizowano je z -25 ml 2-butamonu, uzyskując 5,52 g prawie białych kryształów. Końcowa rekrystalizacja z acetonu (~50 ml dało 3,16 g długich, iglastych kryształów o temperaturze topnienia = 241-243°C.
NMR lH (CDCl3): 5,92 (1H, s), 3,67 (3H, s), 3,13 (1H, d, J =5), 2,89 (1H,m), 2,81-2,69 (15H, m), 1,72 (1H, dó, J = 5,15), 1,52-1,22 (5H, m), 1,04 (3H, s).
Przykład 27
Schemat 1:
Etap 3:
Opcja 1:
Wychodząc z 4'S(4'α).7'αlhekyadekahwdro-1Γαlhydśoksy-10'β,13'β-dimetylo-3',5,20'ltril oksoypiśd[furamo-2(3H).17'βl[4,7]metano[17H[cyklopenta[a]fenantreno]-5'β(2ΊH)-karbonitrylu óo γ-kiktonu 9,11α-epoksy-17αlhydśoksWl3lPkyopśeg^-4-enOl7α,21-dikarboksylamu woóoro-metylowego
Do czystego, suchego reaktora wprowadzono diketon (20 g), potem 820 ml MeOH i 17,6 ml 25% roztworu NaOMe/MeOH. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin (~67°C) w ciągu 16-20 godzin. Produkt zgaszono 40 ml 4N HCl.
Rozpuszczalnik usunięto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym. Dodano 100 ml toluenu i pozostały metanol usunięto przez destylację azeotropową z toluenem. Po zatęzeniu surowy hydśoksyeyter 4 rozpuszczono w 206 ml chlorku metylenu i ochłodzono do temperatury 0°C. Dodano chlorek metamoyulfonylu (5 ml), potem wolno dodano 10,8 ml trietyloaminy Produkt mieszano przez 45 minut. Rozpuszczalnik usunięto przez destylację poó zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując surowy mesylan 5.
W oddzielnym suchym reaktorze umieszczono 5,93 g mrówczanu potasu, 240 ml kwasu mrówkowego i potem 118 ml bezwodnika octowego. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 70°C przez 4 godziny.
Mieszaninę kwasu mrówkowego dodano do zatęzonego roztworu mesylanu 5 sporządzonego wyżej. Całość ogrzewano w temperaturze 95-105°C przez 2 godziny. Mieszaninę produktu ochłodzono óo temperatury 50 °C i usunięto lotne składniki przez destylację poó zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C. Produkt rozłożono między 275 ml octanu etylu i 275 ml wody.
Warstwę wodną powtórnie ekstrahowano 137 ml octanem etylu, przemyto 240 ml zimnego 1N roztworu wodorotlenku soóu i potem 120 ml nasyconego roztworu NaCl. Po rozdziale faz warstwę organiczną zatężono przez destylację poó zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując surowy enester.
Produkt rozpuszczono w 180 ml chlorku metylenu i ochłodzono do temperatury 0-15°C. Dodano 8,68 g wodośofoyforamu dipotasowego, potem 2,9 ml trichlproacetonitśylu. Do mieszaniny dodano 78 ml 30% roztworu nadtlenku wodoru w ciągu 3 minut.
Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0-15°C przez 6-24 godzin. Po reakcji dwufazową mieszaninę rozdzielono. Organiczną warstwę przemyto 126 ml 3% roztworu siarczynu soóu, 126 ml 0,5n roztworu wodorotlenku sodu, 126 ml 1n kwasu chlorowodorowego i 126 ml 10% solanki.
Produkt wysuszono naó siarczanem magnezu albo przesączono przez celit i rozpuszczalnik, chlorek metylenu usunięto przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym.
Produkt krystalizowano dwukrotnie z ketonu metylowo-etylowego, uzyskując 7,2 g epokywmeksremonu.
189 459
185
O
Ο
Dl keton
Przykład 28
Schemat 1:
Etap 3:
Opcja 2:
Konwersja ΓS(4'α),7'α-heksadekahydro-lΓα-hydroksy-l0'β,13'β-dimetylo-3',5,20'-trioksospiro[furano-2(3H),17'|3-[4,7]metano[17H[cyklopenta[a]fenantreno]-5'e(2'H)-karbonitrylu do y-Uklonu 9,Πa-epoksy-17alhydroksy-3lOksopregn-4-eno-7α,21-dikarboksylanu wodoro-metylowego bez pośredniego wyodrębniania
Czteroszyjną kolbę okrągłodenną o pojemności 5 litrów zaopatrzono w mechaniczne mieszadło, wkraplacz z rurką doprowadzającą azot, termometr i chłodnicę z bełkotką połączoną ze skruberem z podchlorynem sodu. Do kolby wprowadzono diketon (83,20 g) w 3,05 litra metanolu. Wkraplacz napełniono 67,85 g 25% (wagowo) roztworu metylami sodu w metanolu. w atmosferze azotu i przy mieszaniu wkroplono metylan do kolby w ciągu 15 minut. Powstała ciemna pomarańczowo/żółta zawiesina. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez 20 godzin i wkroplono 175 ml 4N kwasu chlorowodorowego podczas nieprzerwanego ogrzewania w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. (Ostrożnie, wydzielanie HCN w czasie tej operacji). Chłodnicę zwrotną zastąpiono głowicą odbierającą i usunięto przez destylację 1,6 litra metanolu, w czasie gdy wkraplano przez wkraplacz 1,6 litra 10% wodnego roztworu chlorku sodu z prędkością odpowiadającą prędkości destylacji. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury otoczenia i ekstrahowano dwa razy równymi porcjami 2,25 litra chlorku metylenu.
Połączone ekstrakty przemyto zimnymi równymi porcjami 750 ml 1N wodorotlenku sodu i nasyconego roztworu chlorku sodu. Warstwę organiczną suszono przez destylację azeotropową metanolu przy jednej atmosferze do końcowej objętości 1 litra (0,5% całości pobrano do analizy).
Zatęzony organiczny roztwór (hydroksyester) wprowadzono z powrotem do początkowej kolby reakcyjnej zaopatrzonej jak przedtem, ale bez pochłaniacza HCN. Kolbę ochłodzono do temperatury 0°C i dodano 30,7 g chlorku metanosulfonylu przy mieszaniu i w atmosferze azotu. Wkraplacz napełniono 32,65 g trietyloaminy, którą wkroplono w ciągu 15 minut, utrzymując temperaturę 5°C.
Mieszanie kontynuowano przez 2 godziny, w tym czasie mieszanina reakcyjna ogrzała się do temperatury otoczenia. Przygotowano kolumnę zawierającą 250 g kwaśnej żywicy jonowymiennej Dowex 50 W x 8-100 i przemyto przed użyciem 250 ml wody, 250 ml metanolu i 500 ml chlorku metylenu. Mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez kolumnę i odebrano. Przygotowano świeżą kolumnę i powtórzono powyzszy proces. Przygotowano trzecią kolumnę 250 g, zawierającą Dowex 1 x 8-200 zasadową żywicę jonowymienną i wstępnie potrakto186
189 459 wano tak jak' opisano wyżej przy traktowaniu kwaśną, żywicą. Mieszaninę reakcyjną przepuszczono przez kolumnę i odebrano. Przygotowano czwartą kolumnę z zasadową żywicą i znów przepuszczono mieszaninę reakcyjną przez kolumnę i odebrano. Po każdym przejściu przez kolumnę następowało dwukrotne przemycie 250 ml chlorku metylenu w dół kolumny i każde przejście wymagało ~10 minut. Połączono przemywki rozpuszczalnika z mieszaniną reakcyjną i zredukowano objętość pod zmniejszonym cienieniem do ~500 ml, pobierając 2% tego do kontroli ilościowej (qc). Pozostałość zmniejszono dalej do końcowej objętości 150 ml (roztwór surowego mesylanu).
Do początkowego 54itrowego zestawu reakcyjnego dodano 960 ml kwasu mrówkowego, 472 ml bezwodnika octowego i 23,70 g mrówczanu potasu. Tę mieszaninę ogrzewano przy mieszaniu i w atmosferze azotu w temperaturze 70°C w ciągu 16 godzin. Podniesiono wtedy temperaturę do 100°C i dodano roztwór surowego mesylanu w ciągu 30 minut przez wkraplacz. Temperatura spadła do 85°C, gdy chlorek metylenu oaaeetylogywal z mieszaniny reakcyjnej. Po usunięciu całego chlorku metylenu temperatura znów wzrosła do 100°C i tak ją utrzymywano przez 2,5 godzlny'.
Mleszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 40°C i kwas mrówkowy usunięto pod ciśnieniem do osiągnięcia minimalnej objętości do mieszania (-150 ml). Pozostałość ochłodzono do temperatury otoczenia i dodano 375 ml chlorku metylenu. Rozcieńczoną pozostałość przemyto zimnymi porcjami 1 litra nasyconego roztworu chlorku sodu, 1N węglanu sodu i znów roztworu chlorku sodu. Fazę organiczną wysuszono nad siarczanem magnezu (150 g) i przesączono, uzyskując ciemny czerwonawo-brązowy roztwór (roztwór surowego enestru).
Cotrrosoyjny reaktor z płaszczem o pojemności 1 litra zaopatrzono w mechaniczne mieszadło, chłodnlcę/bełkotkę, termometr i wkraplacz z rurką doprowadzającą azot. Do reaktora wprowadzono roztwór surowego enestru (szacunkowo 60 g) w 600 ml chlorku metylenu przy mieszaniu w atmosferze azotu. Dodano do tego 24,0 g dwuzasadowego fosforanu potasowego, potem 87 ml trichloro4cetonit-ylu. Dopuszczono z zewnątrz zimną wodę do płaszcza reaktora i mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury 10°C. Przez wkraplacz dodano do mieszaniny 147 ml 30% nadtlenku wodoru w ciągu 30 minut.
Mieszanina reakcyjna początkowo zabarwiona na ciemnoczerwona wo-brązowo zmieniła się na bladozóltą po zakończeniu dodawania. Mieszanina reakcyjna pozostawała w temperaturze 10 ± 1°C w ciągu dodawania i kontynuowano mieszanie przez noc (ogółem 23 godziny). Rozdzielono fazy i wodną część ekstrahowano dwa razy porcjami 120 ml chlorku metylenu. Połączone fazy organiczne przemyto potem 210 ml 3% roztworu siarczynu sodu. Powtórzono to drugi raz, po czym obie organiczne i wodne części dawały ujemny wynik na nadtlenek przy próbie na wskaźnikowy papierek jodkowolekrobiogj'.
Fazę organiczną przemyto kolejno równymi porcjami 210 ml zimnego 1N wodorotlenku sodu, 1N kwasu chlorowodorowego i na koniec dwa razy solanką' Fazę organiczną suszono azeotropowo do objętości ~100 ml, dodano świeży rozpuszczalnik (250 ml), destylowano azeotropowo do tych samych 100 ml i pozostały rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 57,05 g surowego produktu jako kleistą żółtą piankę. Część (51,01 g) suszono dalej do stałego ciężaru 44,3 g i analizowano ilościowo przez HPLC. Oznaczono 27,1% epoksymeksrenonu.
Przykład 29
Tworzenie Cletoksy-11α-hydrokeylandrosta-3,5-dien-Ι7-onu z 11 α-hyaroksyanarol etenaionu
Do kolby reakcyjnej wprowadzono 11a-hydroksyandrostendion (429,5 g) i wodzian kwasu toluenosulfonowego (7,1) w atmosferze azotu. Do reaktora dodano etanol (2,58 litra) i otrzymany roztwór ochłodzono do 5°C. Do roztworu dodano ortomrówczan trietylu (334,5 g) w ciągu 15 minut w temperaturze 0-15 °C. Po zakończeniu dodawania ortomrówczanu trietylu ogrzano mieszaninę reakcyjną do temperatury 40°C i prowadzono reakcję w tej temperaturze w ciągu 2 godzin, po czym podniesiono temperaturę do temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin 1 kontynuowano reakcję w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez dodatkowe 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną ochłodzono pod zmniejszonym ciśnieniem i usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym cienren1em, uzyskując Cletoksy-11α-hydrokeyandrostaC,5lalenl17-on.
189 459
187
Przykład 30
Two-oenip enaminy z 1ϊα-hyd-okdykaareaoaz
Schemat 1:
Etap 1:
Metoda B:
Wytwarzanie 5 'R(5'α),7'β-20'-amiaohektaaekahydro-11 'β-hydrokdy- 10'α, 13 'α-dimetylo-3',5łaioksospiro[furaao-2(3H),17'α(5Ή)-[7,4]mpteno[4H[cyklopenta[a]fenantreno]-5'-karUonlt-ylu
W trójszyjnej kolbie o pojemności 25 ml zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne umieszczono cyjanek ^-υ (1,72 g). Dodano wo-ę (2,1 ml) i całość mieszano ogrzewając, -o rozpuszczenia ciała stałego. Dodano dimetyloformamid (15 ml), potzm ϊϊα-h9arpkdykanł -piwii (5,0 g). Do mieszaniny -odano mieszaninę wo-y (0,4 ml) i kwasu siarkowego (1,49 g). Całość ogrzewano w temperaturze 85°C przez 2,5 godziny i w tym czasie analiza HPLC wykazała całkowitą konwersję na produkt. Mieszaninę reakcyjną oohłoaopao -o temperatury pokojowej. Dodano kwas siarkowy (0,83 g) i całość mieszano przez pół godziny. Mieszaninę reakcyjną -odano do 60 ml wody ochłodzonej w łaźni lo-owej. Kolbę przemyto 3 ml DMF i 5 ml wo-y. Zawiesinę mieszano przez 40 minut i odsączono. Placek filtracyjny przemyto -wa razy 40 ml wody i suszono w suszarce próżniowej w temperaturze 60°C przzz noc, uzyskując 11α-enamiaę to znaczy 5'R(5'α),7'β-20'łamiaohekdadekahydro-Π 'β-hy-rpkdy-ϊ0'α, ϊ3'a--imetylpł3,,5-aioksotpiro[fZ-ano-2(3H),17'α(5Ή)-[7,4]meteno [4H[c9klopeata[a]fentatreno]-5'-ka-bonitryl (4,9 g).
Przykład 31
Konwersja Ϊϊα-h9d2oks9ktn2eaonu do diketonu w jednym reaktorze
188
189 459
W tróJdzyJneJ kolbie o pojemności 50 ml zaopatrzonej w miedoadłp mechaniczne umieszczono cyjanek .sodu (1,03 g). Do-aao wodę (1,26 ml) i kolbę lekko ogrzewano -o rozpuszczenia ciała stałego. Dodaap dimetyloaoetami- [lub dimetyloformamid] (9 ml), potem 11 α-hydroksykaarenon (3,0 g). Do kolby reakcyjnej, mieszając, -«ΙαΜ mieszaninę kwasu siarkowego (0,47 ml) i wody (0,25 ml). Całość ogrzewano w temperaturze 95°C przez 2 go-ziny. Analiza HPHC wykazała całkowite zajście reakcji. Dodaap kwas siarkowy (0,27 ml) i całość mieszano przez 30 minut. Wprowadzono dodatkowo wo-ę (25 ml) oraz kwas siarkowy (0,90 ml) i całość mieszano przez 16 godzin. Mieszaninę pcbłpdooao potem w łaźni lo-owej -o temperatury 5-10°C. Ciało stałe w9-oeeloao, odsączając przez spiekany sączek szklany, po czym przemyto -wa razy wodą (20 ml). Stały dikztoa to znaczy 4'S(4'α),7'ałheksadekahydro-11 'α-hy--okdy-ϊ0'β, ϊ3'β-dimzt9lo-3',5,20'-triokdOspiro[fu2tap-2(3H), 17'β-[4,7^ρtano[17H[oyklopeata[a]fentatrznp]-5'P(RΉ)łka-bonitr9l suszono w dudza-oe próżniowej, uzyskując 3,0 g ciała stałego.
Przykład 32A-1
Schemat 1:
Etap 3A:
Metoda B:
Wytwarzanie y--aktonu 11α, 17α-dihy-rokd9-3 -pksop-ega-4-zao-7a,21 -dika-boksyltau wodoro-metylowego
Zawiesinę 5,0 g diketonu wytworzonego, jak opisano w przykładzie 31, w metanolu (100 ml) og2otao -o temperatury w-zznia wobec powrotu skroplin i -o-ano w ciągu 1 minuty 25% roztwór metylanu potasu w metanolu (5,8 ml). Mieszanina stała się je-no-odna. Po 15 minutach pojawił się osad. Mieszaninę ogrzano do temperatury w2ozaea wobec powrotu skroplin i znów stała się jednoro-na po około 4 godzinach. Ogrzzwaniz w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin kontynuowano przez ogółem 23,5 godziny i -o-ano 4,0 N HCl (10 ml). Całość 60 ml roztworu cyjanowodoru w metanolu usunięto przez destylację. Do pozostałości destylacyjnej dodano wo-ę (57 ml) w ciągu 15 minut. W czasie dodawania wody temperaturę podniesiono do 81,5°C i dodatkowe 4 ml roztworu cyjanowodór/metanol usunięto przez destylację. Po zakończeniu dodawania wody mieszanina stała się mętna i usunięto źródło ciepła. Całość mieszano przez 3,5 godziny i produkt wolno krystalizował. Zawiesinę odsączono i odeb-aae ciało stałe przemyto wodą, dudooao w strumieniu powietrza na lejkz i suszono w temperaturze 92°C (660 mm Hg) przzz 16 godzin, uzyskując 2,98 g białawego ciała stałego. Ciało stałe zawierało 91,4% hydroksyedt2u to znaczy wagowo laktonu 11α,17α--ihydrokdy-3-oksop-egn-4-eao-7α,21 -dika-Uoksylaau wodoro-met9lowegp. Wydajność wyniosła 56,1%.
Przykład 32A-2
Wytwarzanie γ-Η^ηυ 11 α, 17α-dihy-roksy-3-oksopregn-4-zno-7α,21-dika-Uoksylanz wo-oro-met9lowegp
Diketoa (40 g) wytworzony, jtk opisano w przykładzie 31, umieszczono w czystym, suchym reaktorze z płaszczem o pojemności 1 litra, zaopatrzonym w odpływ w dnie, chłodnicę, sondę RTD i odbieralnik oUie-anych frakcji. Do reaktora wprowadzono następnie metanol (800 ml) i całość zmieszano. Powstałą zawiesinę ogrzano do około 60-65°C i dodano 25% roztwór metyltnu potasu (27,8 ml). Mieszanina stała się homogeniczna.
Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Po około 1,5 godziny w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin wprowadzono dodatkowe 16,7 ml 25% roztworu metylanu potasu, utrzymując temperaturę wrzenia wobec powrotu skroplin. Mieszaninę utrzymywano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez dodatkowe 6 godzin. Konwersję diketonu do h9d-oksyestru analizowano przez HPHC. Gdy HPHC wykazała stosunek diketonu -o h9drpkdyestru mniejszy niż 10% dodano do mieszaniny porcję 77 ml 4M HCl (kwas ohlo-owodorow9 można zastąpić porównywalną ilością 1,5-3M kwasu dia-kowego) w ciągu około 15 minut, kontynuując ogrzewanie w temperaturze w-zeaia wobec powrotu sk-oplin.
Następnie mieszaninę destylowano i około 520 ml destylatu metaaol/HCN o-eU-aao i odrzucono. Zatęzoaą mieszaninę ochłodzono do około 65°C. Do mieszaniny dodano około 520 ml wody w ciągu około 90 minut, utrzymując w czasie dodawania temperaturę około
189 459
189
65°C. Mieszaninę stopniowo chłodzono -o temperatury około 15°C w ciągu około 4 godzin, po czym mieszano i utrzymywano temperaturę około 15°C przez dodatkowe 2 go-ziny. Mieszaninę przesączono i odsączony produkt przemyto dwa razy około 200 ml za każdym razem. Odsączony produkt suszono po- zmniejszonym ciśnieniem (90°C, 25 mm Hg). Otrzymano w przybliżeniu 25-27 g białawego ciała stałego, zawierającego głównie γ-kikton 11α.17αl-il hydroksy-3-oksoprega-4-dno-7a,21 -dikąrUoksyląau woaorolmetylouego.
Przykład C2B-1
Wytwarzanie y-łakt-nu 5βlcyjąno- 11a, 17ldlhydroksy-3-okso-17α-pregnąn0l7α,21 -wo-oro-ikąrUoksyląau 7lmetylowego
Kolbę reakcyjną ząSą-ouąao 4,1 g -iketonu wytworzonego, jak opisano w przykładzie C1, 75 mł metanolu i 1 ml 1N roztworu metanolowego wodorotlenku sodu. Zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej. W ciągu minut otrzymano jednorodny roztwór i po około 20 minutach zaobserwowano osad. Kontynuowano mieszanie przez 70 minut w temperaturze pokojowej. Po tym czasie ciało stałe odsączono i przemyto metanolem. Ciało stałe suszono w komorze parowej, uzyskując C,6 g Y-Uklonu 5 e-cyjano-na, 17-dihydroksy-3-okso-17alpregnąno^a^ 1 -wodorodikąrUokeyląau 7-mdtylouego.
NMR ’H (CDClc) ppm: 0,95 (e, CH), 1,4 (s, CH), C,0C (d, 1H, J15), C,69 (e, CH), 4,1 (m, 1H)
NMR ‘CC (CDClc) ppm: 14,6, 19,8, 22,6, 29,0, C1,0, CC,9, C5,17, C5,20, C6,C, C7,7,
C8,0, C8,9, 40,8, 42,8, 4C,1, 45,C 45,7, 47,5, 52,0, 68,0, 95,0, 121,6, 174,5, 176,4, 207,0. Przykład C2B-2
Wytwarzanie Y-Uklonu 5 β-cyj ano-ę, 11 a-epoksy-17-hydroksy-3-okso-17a-pregnąn0l -7a,21 -wo-orodikarboksylanu 7-metylowego
190
189 459
Do 2,0 g (4,88 mmola) 9,10-epoksydiketonu o wzorze 21 zawieszonego w 30 ml bezwodnego metanolu dodano 0,43 ml (2,4 mmola) trietyloaminy. Zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin i po 4,5 godzinach nie pozostał juz wyjściowy materiał, jak wykazano przy użyciu HPLC (Zorbax SB-C8 150 x 4,6 mm, 2 ml/minutę), liniowy gradient 35:65 A:B do 45:55 A:B przez 15 minut, A = acetonitryl/metanol 1:1, B = woda/0,1% kwas trifluorooctowy, detekcja w 210 nm). Mieszaninę pozostawiono do ochłodzenia i utrzymywano w temperaturze około 25°C przez około 16 godzin. Powstałą zawiesinę odsączono, uzyskując 1,3 g y-la<tonu 5e-cyjano-9,11 ca-epoksy-17-hydroksy-3-okso-l7α-pregnano-7α,2ll -wodorodikarboksylanu 7-metylowego jako białe ciało stałe. Przesącz zatężono do sucha na wyparce obrotowej i pozostałość roztarto z 3-5 ml metanolu. Filtracja dała dodatkowe 260 mg ydaktonu 5 β-cyjano-9,11 α-epoksy-17-hydroksy-3 -okso-17α-pregnano-7α,21 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego. Wydajność wyniosła 74,35%.
NMR *H (400 MHz, deuterochloroform) d: 1,00 (s, 3H), 145 (m, 1H), 1,50 (s, 3H), 1,65 (m, 2H), 2,10 (m, 2H), 2,15-2,65 (m, 8H), 2,80 (m, 1H), 2,96 (m, 1H), 3,12 (d, J = 13,1 H), 3,35 (d, J = 7,1 H), 3,76 (s, 3H).
Przykład 32C
Wytwarzanie γ-kiktonu kwasu 5β-cyjano-llα,l7-dihydroksy-3-okso-l7α-pregnanOl -7α,21 -dikarboksylowego
Kolbę reakcyjną załadowano 6,8 g diketonu (wytworzonego, jak opisano w przykładzie 31), 68 ml acetonitiylu, 6,0 g octanu sodu i 60 ml wody. Mieszaninę ogrzewano i mieszano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Po około 1,5 godziny mieszanina była prawie jednorodna. Po 3 godzinach dodano 100 ml wody, podczas gdy oddestylowało 50 ml acetonitrylu. Mieszaninę ochłodzono i wytrącone ciało stałe (1,7 g) usunięto przez filtrację. Przesącz (pH = 5,5) potraktowano kwasem chlorowodorowym, aby obniżyć pH do około 4,5 i wytrąciło się ciało stałe. Ciało stałe oddzielono, przemyto wodą i suszono, uzyskując 4,5 g ydaktonu kwasu 5P-cyjano- 11α, 17-dihydroksv-3-okso- 17α-pregnano-7α,21 -dikarboksylowego.
NMR *H (DMSO) ppm: 0,8 (s, 3H), 1,28 (s, 3H), 3, 82 (m, 1H).
NMR 13C (DMSO) ppm: 14,5, 19,5, 22,0, 28,6, 30,2, 33,0, 34,1, 34,4, 36,0, 37,5, 37,7,
38,5, 42,4, 42,6, 45,08, 45,14, 47,6, 94,6, 122,3, 176,08, 176,24, 207,5.
Przykład 33
Schemat 1:
Etap 3AMetoda C:
Wytwarzanie γ-kiktonu 11 α, l7α-dihydroksy-3-oksopregn-4-eno-7α,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego
Do czystej i suchej kolby trój szyjnej zaopatrzonej w termometr, nasadkę Deana Starka i mieszadło mechaniczne załadowano diketon (30 g) wytworzony, jak opisano w przykładzie 31. Do tego reaktora wprowadzono metanol (24 ml) w temperaturze pokojowej (22°C) i otrzymaną zawiesinę mieszano przez 5 minut. Dodano do reaktora 25% (wagowo) roztwór metylanu sodu w metanolu (52,8 ml) i całość mieszano przez 10 minut w temperaturze pokojowej, pod189 459
191 czas czego mieszanina reakcyjna zmieniła się w jasnobróoowy p-zzzzoczysty roztwór i zzuwazono lekkie wydzielanie ciepła (2-3°C). Prędkość dodawania regulowano, aby zapobiec przekroczeniu w reaktorze temperatury 30°C. Następnie mieszaninę ogrzano -o wαznnaąw temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin (około 67°C) i kontynuowano og-zzwzniz w tzDazratu-zz wrzenia wobec powrotu skroplin p-zez 16 godzin. Potem pobrano próbkę i znzlizowznz konwersję p-zez HPLC. Reakcję kontynuowano w teDperzturzz wrzenia wobec powrotu skroplin, zż pozostały -iketon niz stanowił więcej niż 3% zzłz-nnan -iketonu. Podczas ogrzzwaniz w temperaturze wrzenia wobzc powrotu skroplin -o rzzktorz 4N HCl (120 ml), powz-ując wytwarzanie HCN, który został pochłonięty w skrubz-zz.
Po zakończeniu reakcji o--zstylowzno 90-95% rozpuszczalnika, metanolu z mieszaniny reakcyjnej pad ciśnieniem atmosferycznym. Tempe-atu-a głowicy w czzsiz destylacji zmieniała się zd 67-75°C i destylat, który zawierał HCN, prze- z-rzncznizD traktowano wada-atlznkiem sadu i ś-z-kizm bielącym. Po usunięciu Dztznzlu mieszaninę reakcyjną ocbło-zana do temperatury pokojowej, p-zy czym stały pro-ukt zaczynał się wytrącać, g-y mieszanina ochłodziła się dz zakresu 40-45°C. Do «chłzdzonej zawiesiny wa-owa-zono wodny rzetwózzwiz-ająoy ewentualnie 5% (wzgowz) kwaśnego węglanu so-u (1200 d1) w tempe-atu-zz 25°C i otrzymaną mieszaninę ochłodzona pztzD dz temperatury 0°C w ciągu okzło 1 gadziny. Traktowzniz kwaśnym węglanem so-u miała na celu usunięcie pozostałego nizpzzz-zαgawznega -iketonu z mieszaniny reakcyjnej. Zawiesinę mieszano w tzmipzraturzz 0°C przez 2 go-ziny -a zakończenia wytrącania i krystalizacji, pa czym stały prz-ukt, ^^-iZ^iton 11α,17αsdibydroksy-3-aksoprzgn-4-zno-7α,21--iazrbokselann wa-orz-metylowego odebrano a-zze filtrację i przemyto placek filtracyjny wodą (100 ml). Produkt suszono w tempe-aturze 80-90°C po- zmniejszonym ciśnieniem 660 dd Hg -a stałego ciężaru. Zawz-tość wody pa suszeniu wynosiła poniżej 0,25% wagowz. Ska-ygawana wydajność Dalowz wyniosła okzło 77-80% wagowo.
P-zykład 34
Schemat 1:
Etzp 3A:
Metada D:
Wytwarzanie γ-iakΐonu 11 α,17α-aiaedroksy-3-oksopregn-4-znos7α,71s-laαI'baksylznu wo-o-o-metylowego
Diketon wytworzony zgo-niz z a-zykłaaąm 31 (1 równoważnik) poddano reakcji z mztylanem so-u (4,8 równoważnika) w rozpuszczalniku metanolu w obecności jadku cynku (1 równoważnik). Obróbka pro-uktu reakcji była albo zgo-nz zz sposobem ekstrakcyjnym opisanym tutaj, albo przy użyciu sposobu nizzkstr7koyjnzoo, w którym wyeliminowano etapy ekstrakcji chlorkiem metylenu, Dyciz solanką i wz-zrotlznaizD so-u orzz suszenia siarczanem sadu. Również w tym nizzkstraacyjnym sposobie toluen zastąpiono 5% (wagowz) -oos twa-zm kwaśnego węglanu sodu. Jzko produkt wyodrębniano y-i^ł^iton 11α,17α--ibydzoasy-3-okszarzgn-4-znz-7α,71 --ikz-baksylanu wzdo-o-metylowego.
P-zykład 35
Schemat 1:
Etap 3C:
Meto-a C:
Wytwarzanie ydaktonu 17αs-iby-rzksy-3iOksoprzon-4,9( 11 ^-ΐζ^^α^ 1 s-iazrbzksys lanu wo-orz-metylawzgo
Hyd-oksyester wytworzony jzk w przykładzie 34 (1,97 g) połączono z tetrahy-rofU-Zs nem (20 ml) i ztrzymzną mizszzninę ochładzano -z temperatury -70°C. Do-ano chlorek sulfu-ylu (0,8 d1) i całość mieszano azozz 30 minut, pa czym -odzno iDiazool (1,3 g). Mieszaninę reakcyjną zgrzano -o temperatury pakajzwej i mizszzno p-zez dodatkowe 2 gadziny. Następnie mieszaninę rozcieńczono chlorkiem metylenu i zkst-zhowana wodą. Warstwę argznicznó zatężona, zt-zyDując surowy prz-ukt ydaktan 17α-dlhya-oksy-3-aksoarzon-4,9(11)--izaa-7α,21-dikα-boksylanu wa-oro-Dztylowzga (1,97 g). Małą próbkę surowego p-a-uktu analizowana p-zy użyciu HPLC. Analiza wykazała, żz stosunek 9,11-olzfina : 11,12-olzfina : 7,9-laktan wynosił 75,5 : 7,2 : 17,3. Kiedy prawadzano ją w temperaturze 0°C, ale inaczej niz opisano wyżej, reakcja dała pro-ukt, w którym rozkład 9,11-olzfina : 11,12iolzfinz : 7,9-1;Α192
189 459 ton wynosił 77,6 : 6,7 : 15,7. Ta procedura włączała do jednego etapu wprowadzenie grupy opuszczającej i usunięcie jej dla wprowadzenia struktury 9,11-olefiny enestru, to znaczy reakcja z chlorkiem sulfurylu powodowała, ze grupa lla-hydroksy hydśokyyestśu o wzorze V była zastąpiona przez halogenek i potem następowało usunięcie chlorowcowodoru do struktury δ9,'ι. Tak więc tworzenie enestru zachodzi bez użycia mocnego kwasu (takiego jak mrówkowy) lub czynnika suszącego jak bezwodnik octowy. Także wyeliminowano etap ogrzewania w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin alternatywnego sposobu, który wytwarza momotlemek węgla.
Przykład 36A
Schemat 1:
Etap 3C:
Metoda D:
Wytwarzanie y--aktonu 17αlhydśoksy-3-oksopregna-4,9(11)-dleno-7α,21-ólkaśboksylαnu wodoro-metylowego
Hyóroksyester (20 g), wytworzony jak w przykładzie 34 i chlorek metylenu (400 ml) wprowadzono óo czystej, suchej trójszyjnej kolby okśągłpdenmeJ zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, wkraplacz i termoparę. Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze otoczenia óo uzyskania całkowitego rozpuszczenia. Roztwór ochłodzono do temperatury 5°C, stosując łaźnię lodową. Do roztworu CH2O2, zawierającego hwdśoksyester, dodano chlorek metanosulfonylu (5 ml), po czym szybko nastąpiło powolne wkroplenie trietyloaminy (10,8 ml). Prędkość dodawania tak regulowano, aby temperatura reakcji nie przekroczyła 5°C. Reakcja była bardzo egzotermiczna; dlatego potrzebne było chłodzenie. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze około 5°C przez 1 godzinę. Po całkowitym zajściu reakcji (analiza HPLC i TLC) sαtszono mieszaninę w temperaturze około 0°C przy 660 mm Hg, az stała się gęstą zawiesiną. Uzyskaną zawiesinę rozcieńczono CH2O2 (160 ml) i zatężono mieszaninę w temperaturze około 0°C przy 660 mm Hg do otrzymania koncentratu. Znaleziono, że koncentrat (mesylan, produkt o wzorze IV, gózie R3 = H i oba -A-A- i -B-B- oznaczają -CH2-CH2-, to znaczy y--akton 11α,17α-dihyóśoksy-3-oksopśegm-4-enOl7α.21-dikaśboksylanu wodorometylowego przeszedł w Y-^lton l7α-hydroksy-3-oksopregn-4,9(ll)-dleno-7α,21-ólkaśboksylanu wodoro-metylowego) wykazał czystość 82% (% powierzchni zgodnie z HPLC). Ten materiał używano do następnej reakcji bez wyodrębniania.
Do czystego suchego reaktora zaopatrzonego w mechaniczne mieszaóło, chłodnicę, termoparę i płaszcz grzejny wprowadzono mrówczan potasu (4,7 g), kwas mrówkowy (16 ml) i bezwodnik octowy (8 ml, 0,084 mola). Otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze 70°C i mieszano przez około 4-8 godzin. Dodawanie bezwodnika octowego jest egzotermiczne i wytwarza się gaz (CO), a więc prędkość dodawania trzeba było dostosować, kontrolując jednocześnie temperaturę i wydzielanie gazu (ciśnienie). Czas reakcji do wytworzenia aktywnego reagenta eliminującego zależy od ilości wody obecnej w reakcji (kwas mrówkowy i mrówczan potasu zawierały około 3-5% wody każdy). Reakcja eliminacji jest wrażliwa na ilość obecnej wody; jeśli znajduje się > 0,1% wody (KF), poziom zanieczyszczenia 7,9-laktonu może wzrosnąć. Ten produkt uboczny jest trudny do usunięcia z produktu końcowego. Kiedy KF pokazywał <0,1% wody, aktywny czynnik eliminujący przeniesiono do koncentratu mesylanu (0,070 mola) wytworzonego w poprzednim etapie. Uzyskany roztwór ogrzano óo temperatury 95°C i lotny materiał oddestylowano i zebrano w nasadce Deana Starka. Kiedy wydzielanie lotnego materiału ustało, nasadkę Deana Starka zastąpiono chłodnicą i mieszaninę reakcyjną ogrzewano dodatkową godzinę w temperaturze 95°C. Po zakończeniu (analiza HPLC i TLC; < 0,1% wyjściowego materiału) zawartość ochłodzono do temperatury 50°C i wykonano destylację pod zmniejszonym ciśnieniem (660 mm Hg/50°C). Mieszaninę zatężono óo otrzymania gęstej zawiesiny i potem ochłodzono do temperatury pokojowej. Uzyskaną zawiesinę rozcieńczono octanem etylu (137 ml) i mieszano roztwór przez 15 minut, po czym rozcieńczono wodą (137 ml). Warstwy rozdzielono i niższą wodną warstwę znów ekstrahowano octanem etylu (70 ml). Połączone roztwory octanu etylu przemyto raz roztworem solanki (120 ml) i ówa razy 1N roztworem NaOH (po 120 ml) ochłodzonym lodem. Zmierzono pH wodnego roztworu i jeśli końcowe przemywki wykazywały pH < 8, warstwę organiczną myto powtórnie. Gdy pH końcowych przemywek było > 8, warstwę octanu etylu przemyto raz roz189 459
193 two-em solanki (120 ml) i oatężoao do sucha na wyparce obrotowej, stosując łaźnię wodną o temperaturze 50°C. Uzyskany eaesaer, produkt stały to znaczy ^-ι^Ι^^οι 10k-hydroksy-3-oks sopIegna-4,9(11)-dieao-0k,21sdlkarboksyl7ns wodoio-metylowego ważył 92 g (00% molowej wydajności).
Przykład 36B
Wytwarzanie Y--aktonu 10α-hyaioksy-3-oksopregna-4,9(11)-di-no-0k,21-dik7iboksylanu wodoro-metylowego
Do czystej, suchej trójszyjnej kolby οΑ^Ιο-ζιω-] o pojemności 250 ml, zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, wkraplacz. i termoparę wprowadzono 25 g (53,12 mmola) hydroksyestiu γ-laktonu 11α,10αsdihydroksys3soksopIzga7s4szaos0α,21sdik7rboksyl7au wodoro-mes tyłowego wytworzonego jak w przykładzie 34, potem 150 ml chlorku metylenu (Burdick & Johnson). Ot-z.ymaną mieszaninę mieszano w temperaturze oaocozaia do uzyskania jasnej zawiesiny. Roztwór ochłodzono do temperatury -5°C, stosując łaźnię lodową. Do roztworu chlorku metylenu, zawierającego hydroksyester, dodano chlorek mea7aosulfonylu (0,92 g, 69,06 mmola) (Aldrich), po czym zaraz nastąpiło powolne wkroplznie trietyloamlny (0,53 g) (Aldilch). Prędkość dodawania tak regulowano, aby temperatura reakcji nie przekroczyła 0°C. Reakcja była bardzo zkooazrmicona; dlatego potrzebne było chłodozaie. Czas dodawania wyniósł 35 minut. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze około 0°C proeo dodatkowe 45 minut. Po całkowitym zajściu reakcji (oznaczono mniej niż 1% pozostałego hydroksyesaru analizą HPLC i TLC) o7aęzono mieszaninę preeo odpędz-nie około 110-125 ml rozpuszczałnika, chlorku metylenu pod ciśnieniem atmosferycznym. Podczas odpędzania tempe-atuia w reaktorze osiągnęła w przybliżeniu 40-45°C. Jeśli i-akcja nie zakończyła się po dodatkowych 45 minutach, można dodać do reaktora dodatkowo 0,1 równoważnika chlorku metanosulfony^ oraz dodatkowo 0,1 równoważnika ari-tyłoammy i sprawdzono dojście reakcji do końca. Otrzymana mizszanlna zawierała surowy produkt, y-l^ton 10α-hydroksy-11α-(m-tyłosslfoaylo)oksy-3-oksopr-kn-4--aos0k,21-dlkaIboksyłans wodoro-mztylowego. Ten materiał używano do następnej reakcji bez wyodrębniania.
Do diugiego czystego suchego reaktora o pojemności 250 ml, zaopatrzonego w mechaniczne mieszadło, chłodnicę, termoparę i płaszcz grzejny wprowadzono bezwodny octan sodu (™,0 g) (Malllnkrodt), lodowaty kwas octowy (42,5 ml) (Fisher) i bezwodnik octowy (0,5 ml). Otrzymany loztwói ogrzewano w temperaturze 90°C i mieszano pro-o około 30 minut. Dodawanie bezwodnika octowego j-st zgoot-rmicoa-, a więc prędkość dodawania trzeba było dostosować, kontrolując jednocześnie temperaturę i ciśnienie. Bezwodnik octowy dodano, zeby zmniejszyć zawartość wody w roztworze do dopuszczalnego poziomu (mniej niz około 0,1%). Kiedy Kf pokazywał <0,1% wody, roztwór kwasu octowego pro-ai-slono do konc-ntiatu mesylanu wytworzonego jak omówiono w pi-iwszym paragrafie tego przykładu. Po przealeslznls temperatura otrzymanego roztworu wyniosła około 55-60°Ο. Proeo użycle kwasu octowego i octanu sodu zamiast kwasu mrówkowego i mrówczanu potasu jak w przykładzie 3 6 A, ograniczono wytwarzanie gazu.
Mieszaninę ogrzano do temperatury 135°C i utrzymywano w tej temperaturze przez około 60-90 minut do ustania wydoi-ł7aia lotnego materiału. Lotny materiał oddestylowany z mieszaniny zebrano w nasadce Deana Starka. Po zakończeniu (< 0,1% materiału wyjściowego według analizy TLC i HPLC) usunięto źródło ciepła. Gdy temperatura mieszaniny osiągnęła ™0°C, dodano wolno 150 ml wody do mieszaniny piz-z 60-90 minut. Po zakończeniu dodawania wody, mieszaninę ochłodzono do temperatury około 35-45°C i zaczęła się tworzyć zawiesina. Mieszaninę ochłodzono dalej do temperatury 15°C i utrzymywano w tej temp-iaturze pizez około 30-60 minut.
Mieszaninę przesączono pIozz szklany sączek. Pizesącz przemyto 100 ml wody. Następni- pizesącz przemyto drugi raz dodatkowo 100 ml wody. Uzyskany przesącz suszono w temperaturze 00°C pod omaiejsoonym ciśnieniem, otrzymując 25,0 g suchego produktu, -aesans, 7--11^01111 10k-hydroksy-3soksoprekn7-4,9(11)sal-nos0k,21-dlkarboksyłaau wodoro-metylowego. Oznaczenie HPLC wykazało 00% żądanej 9,11-olefiny, 15% 11,12-ołefiay i 5% 0,2-laktoas.
Metoda miała koizystny wynik (wobec podobnych sposobów) pod względem (i) zmal-jseeala objętości rozpuszczalników, (li) ograniczenia ilości oadolełnych etapów ope194
189 459 rąoyjayoh, potrzebnych do wytworzenia eneetru z hydrokeydstru. (iii) ograniczenia potrzebnego przemywania, (iv) zastąpienia ekstrakcji wytrącaniem wodą przy oddzieleniu końcowego pro-uktu i (v) uydliminouąniu sprawy bezpieczeństwa poprzednio związanej z tworzeniem mieszanego bdzwodniką i wytwarzaniem gazu, gdy używano kwasu mrówkowego zamiast kwasu octowego.
Przykład C7A
Schemat 1:
Etap CC:
Metoda E:
Wytwarzanie Y-hikU-nu 17α-hγ-roksy-c-oksopregna-4,9((11)-dieno-7α,21-dikąrUoksylanu uo-oro-mdtylouego
Do trójszyjnej okrągło-ennej kolby o pojemności 2 litrów, zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, wk-aplacz i termoparę wprową-ooao hydrokeyester (100 g; 0,22 mola), uytuorzony jak w przykładzie C4. Używano obiegowej łaźni chłodzącej z automatyczną kontrolą temperatury. Przed reakcją kolbę wysuszono ze względu na wrażliwość chlorku mdtąaoeulfol nylu na wodę.
Do kolby wprowadzono chlorek metylenu (1 litr) i hy-rokeyester rozpuścił się w nim przy mieszaniu. Roztwór ochłodzono -o temperatury 0°C i przez wk-aptecz dodano -o kolby chlorek metanosulfonylu (25 ml; 0,C2 mola). Do reaktora dodano przez u·krąpląco trietyloaminę (50 ml; 0,59 mola) i wkraplacz przemyto dodatkowo chlorkiem metylenu (C4 ml). Dodanie Metyloaminy było bardzo egzotermiczne. Czas ao-ąuąaią wyniósł około 10 minut przy mieszaniu i chłodzeniu. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i utrzymywano w tej temperaturze przy mieszaniu przez dodatkowe 45 minut, podczas gdy górną przestrzeń kolby reakcyjnej przedmuchano azotem. Próbkę mieszaniny reakcyjnej analizowano potem przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej i wysok-sprawnej chromatografii cieczowej -la eprąwdodaią zakończenia reakcji. Mieszaninę następnie mieszano w temperaturze 0°C przez dodatkowe C0 minut i ponownie sprawdzono zakończenie reakcji. Analiza wykazała, ze reakcja istotnie zakończyła się w tym punkcie; rozpuszczalnik chlorek metylenu o-pę-zono w temperaturze 0°C przy 660 mm Hg. Analiza przez chromatografię gazową destylatu wykazała obecność zarówno chlorku mdtąnosulfoaylu, jak Metyloaminy. Potem dodano -o reaktora chlorek metylenu (800 ml) i powstałą mieszaninę mieszano przez 5 minut w temperaturze w zakresie 0-15°C. Rozpuszczalnik znów odpędzono w temperaturze 0-5°C przy 660 mm Hg, uzyskując mesyhm o wzorze IV, w którym R oznacza H, -A-A- i -B-B- oznaczają -CHz-CHa-, a R1 oznacza mdtokeykąrUoayl. Czystość produktu wynioeSą 90-95 w % powierzchni.
Aby wytworzyć reagent eliminujący zmieszano mrówczan potaeu (2C,5 g; 0,28 mola), kwas mrówkowy (80 ml) i Udouodaik octowy (40 ml) w oddzielnym suchym reaktorze. Kwas mrówkowy i bezwodnik octowy przepompowano -o reaktora i podczas dodawania bdzuo-ail ka octowego utrzymywano temperaturę nie wyższą niż 40°C. Mieszaninę stanowiącą reagent eliminujący ogrzewano do temperatury 70°C, aby pozbyć eię wody z układu reakcyjnego. Tę reakcję kontynuowano, aż zawartość wody była nizsza niż 0,C% wagowo, jak mierzono przy pomocy analizy Karla Fishera. Roztwór reagenta eliminującego przeniesiono następnie do reaktora, zawierającego stężony roztwór surowego mesylanu, uytuorooay jak opisano wyżej. Otrzymaną mieszaninę ogroduąao -o temperatury najwyżej 95°C i odbierano lotny destylat, az destylat juz się nie tworzył. Destylację przdruąao w temperaturze około 90°C. Po zakończeniu destylacji mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 95°C przez dodatkowe 2 godziny i zakończenie reakcji eprąuazoao przez chromatografię cienkowarstwową. Gdy reakcja zakończyła się, ochłodzono reaktor do temperatury 50°C i usunięto z mieszaniny reakcyjnej kwas mrówkowy oraz rozpuszczalnik przy 660 mm Hg w temperaturze 50°C. Koncentrat ochło-zono do temperatury pokojowej, dodano potem octan etylu (688 ml) i mieszaninę octanu etylu i koncentratu mieszano przez 15 minut. Wtedy wprowadzono 12% roztwór solanki (688 ml), zeby pomóc w usunięciu zanieczyszczeń rozpuszczalnych w wo-zie z fazy orgąaiooadj. Następnie pozostawiono fazy -o odstania na 20 minut. Warstwę wodną przdaidsiono do innego naczynia, do którego wprowadzono dodatkową ilość octanu etylu (C50 ml). Powtórną ekstrakcję warstwy wodnej wykonano przez C0 minut, po czym pozostawiono fazy -o o-stania i połączono warstwy octanu etylu. Do połączonych warstw octanu etylu -odano
189 459
195 nasycony roztwór chlorku sodu (600 ml) i prowadzono mieszanie przez 30 minut. Potem fazy pozostawiono do odstania. Warstwę wodną usunięto. Wykonano dodatkowe mycie chlorkiem sodu (600 ml). Fazę organiczną oddzielono od drugich końcowych przemywek. Następnie fazę organiczną przemyto 1N wodorotlenkiem sodu (600 ml) przy mieszaniu przez 30 minut. Fazy oaetawaly się przez 30 minut, zeby usunąć wodną warstwę. Sprawdzono pH wodnej warstwy i znaleziono, że wynosi > 7. Prowadzono dalsze mycie nasyconym roztworem chlorku sodu (600 ml) przez 15 minut.
Ostatecznie zatężono fazę organiczną przy 660 mm Hg w temperaturze 50°C i produkt odzyskano przez filtrację. Końcowy produkt był piankowatym brązowym ciałem stałym, które suszono. Dalsze suszenie w temperaturze 45°C pod zmniejszonym ciśnieniem przez 24 godziny dało 95,4 g produktu, enestru, γ-hktonu Ι7α-hydrokey-C-oksopregna-4,9(ΙΙ)-dienOl -7α,21-dikαrbokeylanu wodoro-metylowego, w którym oznaczono 68,8%. Molowa wydajność wyniosła 74,4% skorygowana dla wyjściowego hydroksyeetru i końcowego rnretru.
Przykład 37B
Wytwarzanie 17-metylo-ClOkso- Ι8-norpregnal4,9(ΙΙ),ΙC-trienOl7α,21 lwodorodikarboksylanu 7-metylowego
COOH
Kolbę reakcyjną załadowano 5,5 g mesylanu wytworzonego, jak w przykładzie 23, 55 ml 94,3% kwasu mrówkowego i 1,38 g mrówczanu potasu. Mieszaninę ogrzewano i mieszano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin (104°C) przez dwie godoJiny. W końcu okresu dwóch godzin oddestylowano kwas mrówkowy pod zmniejszonym cienieniem. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto 10% roztworem węglanu potasu (50 ml). Uzyskana część wodna miała żółty kolor. Octan etylu przemyto 5% wodorotlenkiem sodu (50 ml). Części wodne połączono i zakwaszono rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym, materiał nierozpuszczalny ekstrahowano octanem etylu. Octan etylu odparowano do sucha pod zmniejszonym cienieniem, uzyskując 1,0 g pozostałości, 17-metylo-C-okeo-Ι8lnorpregna-4,9( 11), 13-^^-7^21 lwodorodikαrboksylanu 7lmetylowego.
NMR ‘H (CDCl3) ppm: 1,5 (s, 3H), 14 (s, 3H), 3,53 (s, 3H), 5,72 (m, 1H).
NMR I3C (CDCla) ppm: 25,1 i 25,4 (18CH3 i 19CH3), 40,9 (10C), 48,5(17C), 51,4 (OCHj), 118,4 (11CH), 125,4 (4CH), 132,4 (9C), 138,5 i 139,7 (13C i 14C), 168,2 (5C), ‘72,4 (700), ‘79,6 (22CO), 198,9 (3CO).
Przykład 37C
Wytwarzanie y--aktonu 5βplCyjαnOl17-hydroksy-3-okso-Ι7αlprrgn-1ΙlenOl7α,21-wodOl roaikarboksylanu 7-metylowego
196
189 459
Kolbę reakcyjną załadowano 5,5 g mpsylanz w9twpropaegp jak w przykładzie 23, 55 ml 94,3% kwasu mrówkowego i 1,38 g mrówczanu potasu. Mieszaninę ogrzewano i mieszano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin (104°C) przez, -wiz godziny. W kończ okrzsu dwóch godzin oddest9lpwano kwas mrówkowy pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w octanie etylu i przemyto 10% roztworem węglanu potasu (50 ml). Uzyskana część wodna miała żółty kolor. Octan etylu przemyto 5% wodorotlenkiem so-u (50 ml). Octan etylu odparowano do sucha pod omaezJdzoa9m ciśnieniem, co dało 3,7 g pozostałości. Porcję 3,4 g pozostałości cbromatog2afpwaap aa 267 g zelz k2oemioakpwegρ Merckt (40-63 μ). Produkt odzyskano przy użyciu układu elzcyjnego octanu etylu i toluenu 37:63 (objętościowo). Po wysuszeniu tego produktu otrzymano 0,0698 g pozostałości, y-kiktonu 5|ł-cyjano-17-hy'a-oksy-3-okso-17α-p-egn-11 ^^^,21 -wodorodikarboksylaaz 7-met9lpwego.
NMR 1H (CDCl3) ppm: 1,03 (s, 3H), 1,22 (s, 3H), 3,70 (s, 3H), 5,60 (d, 1H, J10), 5,98 (-, 1H, J10). ,
MIR cm-1 2229 (CN), 1768 (lakton), 1710 (ester).
Przykład 37D
Wyodrębnianie bid(γ--ιtłtoaz) kwasu 9α-ϊ7łdihydroksy-3-okso-ϊ7α-przgn-4-eno-7α,21-dika2boks9lowego
Bis(γ--aktoa) kwasu 9α-ϊ7-dih9-2pkdy-3-okso-ϊ7α-ρrzgn-4-eao-7a,2ϊ--ikt2Uoks9lowego jest produktem ubocznym eliminacji ϊϊ-medylanu. Oddoieloap oo9dtą próbkę z mieszaniny reakcyjnej z przykładu 37Ana drodzz preparatywnej chromatografii cieczowej, następnie p-eptratywnej HPHC z odwrotną fazą. Tak więc 73 g pozostałości ch2pmatpg2afpwanp na 2,41 kg żelu krzemionkowego Me-cka (40-63 μ,) z gradientem układu zlucy-jnego octanu etylu i toluenu (20:80, 30:70, 40:60, 60:40, objętościowo). Wzbogaconą mizdotaeaę (10,5 g) enaminy' i 7,9-laktoau otrzymano we frakcjach 60:40. Postęp oczyszczania oUderwpwano przez THC na płytkach EMF przy eluencie 60:40 (objętościowo) octan ztylu, toluen i wizualizacji przez kwas dia-kpwy, SWUV. Porcję (10,4 g) mieszaniny ocoydzooaao -alej na drodze HPHC z odwrotną fazą na Kromadilu C8 (7 μ.) i ruchomą fazą 30:70 (oUJętoSoepwp) z wody milliQ i acetonitrylu. 7,9-lakton (2,27 g) wyo-2ęUaipap w postaci kr9dotałów z fazy ruchomej.
MIR cm-1: 1762 (7,9-^^ i 17-lakton), 1677, 1622 (3-kpto^4’5).
NMR ’H (CDCl3) ppm: 1,00 (s, 3H), 1,4 (s, 3H), 2,05 (d, 1H), 2,78 (d, 1H), 5,87 (s, 1H).
NMR 13C (CDCl3) ppm: 13,2, 19,0, 22,2, 23,2, 26,8, 28,8, 29,5, 30,8, 33,1, 34,4, 35,1, 42,5, 43,6, 43,9, 45,0, 45,3, 89,9, 94,7, 129,1, 161,5, 176,0, 176,4, 196,9.
Teoria: C 71,85 i H 7,34;
Znaleziono: C 71,68 i H 7,30.
189 459
197
Przykład 37E
Wyodrębnianie y-Aktonu 5-cyjano-17-hydroksy-3-okso-17α-pregn-11 -eno^^ 1 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego
Związek y--^!^t^<^^u- 5 -cyj ano-17-hydroksy-3 -okso-17α-pregn-11 -eno^^ 1 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego wydzielono po wielokrotnej preparatywnej chromatografii cieczowej mieszaniny reakcyjnej otrzymanej po eliminacji grupy 11-mesyloksy (przykład 24). Był on częścią grupy mniej polarnych zanieczyszczeń, jak zobaczono przez TLC na płytkach eMf z układem elucyjnym 30:70 (objętościowo) octan etylu i chlorek metylenu, wizualizowanych przez kwas siarkowy, SWUV. Generalnie te mniej polarne zanieczyszczenia oddzielano z surowej enaminy na drodze preparatywnej chromatografii cieczowej. Specyficznie 9,6 g roztworu surowej enaminy chromatografowano na 534 g zelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ). stosując gradient układu elucyjnego octanu etylu i toluenu (20:80, 30:70, 40:60, 60:40, objętościowo). Mniej polarne zanieczyszczenia były stężone we frakcjach 30:70. Próbkę zbiorczą 12,5 g mniej polarnych zanieczyszczeń zebrano w ten sposób. Materiał ten dalej chromatografowano na 550 g żelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ), stosując gradient układu elucyjnego octan etylu i chlorek metylenu (5:95, 10:90, 20:80, 30:70, objętościowo). Wzbogacona porcja z frakcji 20:80 dała 1,2 g pozostałości. Dodatkowa chromatografia 1,2 g pozostałości na 53 g zelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ), stosując gradient układu elucyjnego aceton i chlorek metylenu (3:97, 6:94, 10:90, 15:85, objętościowo) dała 0,27 g y-LAtonu 5-cyjano-l7lhydroksy-3-okso-l7α-pregn-1l-eno-7α,2l-wodorodikarboksylanu 7-metylowego ze wzbogaconej porcji z frakcji 10:90.
MS M + 425, obliczone dla C25H31NO5 (425,52).
MIR: 2222 cm-1 (nitryl), 1767 cm- (lakton), 1727 cm-1 (ester i 3-keton).
NMR 'H (CDCls) ppm: 0,92 (s, 3H), 1,47 (s, 3H), 2,95 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 5,90 (m, 1H).
HC NMR (CDCls) ppm: 14,0 (18CH3), 23,5 (15CH2), 27,0 (19CH3), 37,8, 38,5 i 40,9 (7, 8 i 14CH), 52,0 (OCH3)), 95,0 (17C), 121,5 (23CN), 123,5 (11CH), 135,3 (9C), 174,2 i 176,2 (22 i 24 CO), 206 (3CO).
Przykład 37F
Wytwarzanie 17-hydroksy-3-okso-11 α-(2,2,24πΠ noro-1 -oksoetoksy)-17α-pregn-4-eno-7α,21 - wodorodikarboksylanu 7-metylowego
198
189 459
Do czystej, suchej trój szyjnej pkśągłodenneJ kolby zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, zawierającej 40 ml chlorku metylenu wprowadzono hydroksycster (2,0 g, 4,8 mmola) wytworzony, jak w przykładzie 34. Następnie do roztworu dodano Metyloaminę (0,61 g,
6,10 mmola) i bezwodnik trAfluorooctowy (1,47 g, 7,0 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze otoczenia.
Następnie mieszaninę rozcieńczono dodatkowo 40 ml chlorku metylenu. Mieszaninę przemyto potem kolejno 40 ml wody, 40 ml 1N HCl i 40 ml 1N roztworu NaOH. Otrzymany roztwór wysuszono potem nad siarczanem magnezu i zatsżpnp do sucha, uzyskując 3,2 g jasnobrązowego ciała stałego, 17-hyótOksy-3-okso-11a-(2,2,2-Mfiuoro-1-oksoetoksyj-l7a-pregm-4-enOl7α,21 -woóorodikaśbokswlamu 7-metwlowegO'
Pozostałość dalej analizowano i oczyszczano przez chromatografię. Warunki HPLC: kolumna - Waters Symmetry C18 (150 mm x 4, 6 mm średnicy wewn., rozmiar cząstek 5 μ); temperatura kolumny - pokojowa; faza ruchoma acetonitryl/woda, 30/70 objętościowo; prędkość przepływu 1,0 ml/minutę; objętość wstrzyknięcia - 20 mikrolitrów; stężenie próbki - 1,0 mg/ml; detekcja UV w 210 nm; ciśnienie - 1Ο341θ0θ Pa; czas przebiegu - 45 minut. Warunki TLC: adsorbent - Merck Silica Gel 60 F254; układ rozpuszczalnika - octan etylu/toluen, 65/35 objętościowo; wizualizacja techniczna - krótkie fale; ilość nanoszona - 100 mikśogramr\v.
Przykład 37G
Wytwarzanie y-hiktonu 11αl(acetylpksy)l17-hydroksy-3-okso-17αlprtgn-4ltmo-7,21lwoóoroóikarboksylanu 7-metylowego
Do czystej, suchej trój szyjnej pkśągłpdenmej kolby zaopatrzonej w mieszadło mechaniczne, zawierającej 15 ml chlorku metylenu wprowadzono hydrokswesteś (2,86 g, 6,87 mmola) wytworzony, jak w przykładzie 34. Następnie do roztworu dodano Metyloaminę (1,39 g, l3,7 mmola), dimetwloamimopiśwdymę (0,08 g, 0,6 mmola) i bezwodnik octowy (1,05 g, 10,3 mmola). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze otoczenia.
Następnie mieszaninę rozcieńczono 150 ml octanu etylu i 25 ml wody. Ten roztwór octanu etylu przemyto potem 25 ml roztworu kwasu cytrynowego. Roztwór wysuszono potem nad siarczanem magnezu i zatężono do sucha, uzyskując 3,33 g Jasnobśązdiwego ciała stałego, γ--aktomu 11 a-(acetyloksy)-17-hyóroksy-3-okso-17α-pśegn-4-eno-7,21 lwodośoóikaśboksylanu 7-metylowego.
Pozostałość dalej amalizowαmp i oczyszczano przez chromatografię. Warunki HPLC: kolumna Waters Symmetry C18 (150 mm x 4,6 mm średnicy wewnętrznej, rozmiar cząstek 5 μ); temperatura kolumny - pokojowa; faza ruchoma acttonitśyl/wpda, 30/70 objętościowo; prędkość przepływu 1,0 ml/minutę; objętość wstrzyknięcia - 20 mikrolitrów; stężenie próbki - 1,0 mg/ml; detekcja UV w 2l0 nm; ciśnienie - 10341000 Pa; czas przebiegu - 45 minut. Warunki TLC: adsorbent - Merck Silica Gel 60 F254; układ rozpuszczalnika - chlorek metylenu/metanol, 95/5 objętościowo; wizualizacja techniczna - krótkie fale; ilość nanoszona - 100 mikrogramów
189 459
199
Przykład 37H Schemat 1:
Etap 3C:
Metoda F:
Wytwarzanie γ-kiktonu 17-hydroksy-3-okso-17a-pregn-4,9(1 Ι)ldieno-7,2Ι-wodoroaikarboksylanu 7-metylowego
Do czystego, suchego reaktora o pojemności 250 ml, zaopatrzonego w mechaniczne mieszadło, chłodnicę, termoparę i płaszcz grzejny wprowadzono mrówczan potasu (1,5 g, 0,018 mola), kwas mrówkowy (60 ml, 1,6 mola) i bezwodnik octowy (29,5 ml, 0,31 mola). Następnie roztwór mieszano w temperaturze 70°C przez 4 godziny i ochłodzono do temperatury otoczenia, aby otrzymać reagent eliminujący, użyteczny w celu konwersji mesylanu o wzorze IV na produkt z tego przykładu.
Utworzony przedtem reagent eliminujący, TFA/TFA bezwodnik, dodano do 70,0 g (0,142 mola) mesylanu wytworzonego, jak w przykładzie 23. Powstałą mieszaninę ogrzewano w 95-105°C przez 2,5 godziny, przy czym stopień konwersji sprawdzano okresowo przez TLC lub HPLC. Otrzymaną pozostałość ochłodzono do temperatury 50°C, rozcieńczono wodą z lodem (1,4 litra) i mieszano przez 1 godzinę. Mieszaninę pozostawiono przez noc w temperaturze otoczenia. Warstwy rozdzielono i wodną fazę ponownie ekstrahowano octanem etylu (75 ml). Następnie roztwór octanu etylu kolejno myto mieszaniną woda/solanka (70 ml), drugą mieszaniną woda/solanka (60 ml), 1N wodorotlenkiem sodu (60 ml) i trzecią mieszaniną woda/solanka (60 ml). Stężenie solanki wynosiło 12% wagowych. Następnie roztwór octanu etylu suszono nad siarczanem sodu, odsączono i zatężono do sucha na wyparce obrotowej, uzyskując 4,5 g mieszaniny obu żądanych produktów i nieznanego zanieczyszczenia. Stosunek zanieczyszczenie/produkt zgodnie z powierzchnią według HPLC wynosił odpowiednio około 50/15. Głównym produktem tej reakcji było zanieczyszczenie, które zidentyfikowano jako γ-lakton 17-hydroksy-3-okso-Ι7α-pregn-4,9(11)ldieno-7,2Ι-woaoroaikarbokeylαnu 7-metylowego.
Mieszaninę oczyszczono przez chromatografię na kolumnie, uzyskując 1,9 g czystego analitycznie f-kAtonu 17-hydrokey-C-okso-17α-pregn-4,9(11 )-dieno-7,21 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego.
Pozostałość dalej analizowano i oczyszczano przez chromatografię. Warunki HPLC: kolumna Waters Symmetry C‘8 (150 mm x 4,6 mm średnicy wewn., rozmiar cząstek 5 μ); temperatura kolumny - pokojowa; faza ruchoma acetonitryl/woda, 30/70 objętościowo; prędkość przepływu 1,0 ml/minutę; objętość wstrzyknięcia - 20 mikrolitrów; stężenie próbki - 1,0 mg/ml; detekcja UV w 2‘0 nm; cienienie - ‘0341000 Pa; czas przebiegu - 45 minut. Warunki TLC: adsorbent - Merck ^1^4 Gel 60 F254; układ rozpuszczalnika - chloroform/eter metylowo-tert-butylowy/izopropanol, 70/28/2 objętościowo; wizualizacja techniczna - 50% (objętościowo) wodny H2SO4/LWUV i 50% (objętościowo) H2bO4/kwae fosfomolibdenowy; ilość nanoszona ‘00 mikrogramów.
200
189 459
Przykład 371
Wytwz-zzniz γ-iakίonn 17-byaraksy-3,11 --ioksz-17α-pzzgnzs4-zno-7α,71 -μό-οζο^ζζboksylrnu 7-mztylowzgo
Sporzą-eono zzzgznt Jonzsz azząz rozpuszczenie 6,7 g bezwodnika chromowego (C-O3) w 6 d1 stężonego kwasu siarkowego i ostrożnie rozcieńczono tę mieszaninę do 50 d1 wodą destylowaną. Jz-zn d1 tzgo reagenta wystarcza do utlenienia 2 moli dzugozzę-owzgo alkoholu do ketonu.
Hy-roksyzstzz (10 g, 24,0 ddoIz) wytworzony jak w a-oykłzaoią 34 rozpuszczono/zzwizszono w 1200 ml acetonu. Do tej mieszaniny -o-ano 8,992 d1 rzzgzntr Jonesa i połączone mieszaniny mieszano arzzo 10 minut. Próbkę mieszaniny reakcyjnej po potraktowaniu wodą i ekstrakcji chlorkiem metylenu, analizowano nz -ro-zz HPLC (kolumna: Pzckmzn Ultzasabzrz ODS C18, 4,6 mm x 250 dd, 5 mikronów; g-a-ient zozpnszczzlaekz: acztonitzyl/woda = 1/99 -o 100/0 w ciągu 20 minut przy prę-kości przepływu 1,5 ml/minutę; detektor: UV 210 nm). Rzzkcjz byłz zakończona, co się uwidoczniło pzzzz brak istotnej ilości dztzzizłu wyjściowego w mieszaninie reakcyjnej. Czzs retencji HPLC -lz Dztzrizłu wyjściowego (hydroksyzster) wynosił 13,37 minuty, z -lr produktu ketonowego wynosił 14,56 ιππη^'.
Reakcję pzowz-oono, -o-ając 200 d1 wody i 300 d1 cblozan metylenu. Warstwę organiczną o--zizlono od warstwy wo-nzj i przemyto znowu 200 d1 wody Wrzstwę ozgzniczną o-dzizlono o- warstwy wodnej i suszono na- sIzrczrnzD magnezu. Rozpuszczalnik o-parowano, uzyskując 9,52 g białawego ciałz stałego (wy-ajność 95,6% surowego a-oanatn), γ-iakt.onu 17-hy-roksy-3,11 iaiokso-17α-prągnz-4-ąno-7α,71 -wo-oro-ia7zboksylann 7smztylowzgo.
Ustalenie struktury było oparte na wi-miz masowym (d/ζ 414), NMR H (DMF-d7) i NMR C (DMF--7). W NMR H stwierdzono nieobecność charakterystycznego piku -la hydroksyzstru 11-H (4,51 ppm, dublet, J = 5,8 Hz). WNMRC pik pojawił się przy 208,97 ppm., czego oczekiwano -lz węglz H-keto.
NMR C (400 MHz, DMąsa7): 208,97 (n-keto), 197,70 O-keto), 176,00 (72-lakton), 173,34 (7-COOMz), 167,2’ (C5), 125,33 (C4), 93,63 (C17) i inne piki w zzgioniz 15-57 ppm.
Przykład 37J
Wytwarzanie γ--aktonu 11α, 17s-ihy-zoksy-3-okso-17α-pząons4sznos7α,71 --ikarboksylanu -iztylowzgo
189 459
201
Roztwór 3,5 g (8,4 mmola) hy-2okdyedt-u w'ytworz.paego jak w przykładzie 34 w 42 ml metanolu omiesoaao z 4 ml 4N metanolowego roztworu wodorotlenku potasu (8 mmoli). Zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej przez noc i ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin w ciągu 1 goaoin9. Metanol odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość zmieszano z 50 ml octanu etylu. Octan etylu odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość trawiono 50 ml octanu etylu. Suche ciało stałe połączono z 50 ml acetonu i 2 ml jodku metylu (32,1 mmola). Całość mieszano w temperatu-zz pokojowej przez 18 godzin. W tym czasie rozpuściła się znaczna większość ciała stałego. Mieszaninę przesączono i przesącz odparowano do sucha po- zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość trawiono octanem etylu, następnie zsunięto ciało stałe przez filtrację i roopzdoooalaek odparowano p-zez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość oonacopao przez NMR ’H, jako mieszaninę 78:22 (objętościowo) y--aktonu 11α,17--lhy-roksy-3-okso-17α-p-zga-4-erloł7a,21--ikarUoksylanu diet9lpwego i wyjściowego h9droksyest-z. Ta mieszanina była odpowie-nit do użycia jako marker HPLC bez dalszego ooo9docoanea.
NMR Ή (CDCh) poatoz9ł następujące właściwości: ppm 0,93 (s, 3H), 1,37 (s, 3H), 3,64 (s, 3H), 3,69 (s, 3H).
Przykład 37K
Wytwarzanie y--aktonz 11 α, 17łdihy-roksy-3-okso-17α-przgn-4-eao-7a,21 -diktrboksylanu aiet9lpwegp
Do 11,86 g (28,5 mmolt) by-rokdyestrz w9two-opnzgp jak w przykładzie 34 -p-tno 50 ml metanolu i 20 ml 2,5M NaOH. Zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Po 25 minutach porcja wyjściowego estru pozostała nieprozrztgowaaa, jak .stwle-azpno przez HPHC (Zo-baK SB-/C8 150 x 4,6 mm, 2 ml/minutę, gradient liniowy 35:65 A:B do 45:55 A:B p-zez 15 minut, A = acetpmtryl/mettaol 1:1, B = wodt/O,1% kwas trifluρrooctpwy, detekcja w 210 nm) i -pdanp 10 ml 10M NaOH. Po 1,5 go-ziny pozostał ślad nleproereagowtnzgp estru, jak dtwiz--zpao na drodze HPHC. Miedotaeaę reakcyjną ppoosttwioaρ w spokoju w temperaturze około 25°C na 64 gpdziny.
Mieszaninę roooieńcoρaρ 100 ml wody i następnie silnie zakwaszono 20 ml stężonego HCl. Otrzymany kleisty osad mieszano, tż ost- stał się zawiesiną. Ciało stałe oddzielono przez filtrację, znów zawieszono w metanolu i pddączonp, uzyskując 3,75 g ciała stałego barwy brązowej. Materiał rozpuszczono w 8 ml gorącego DMF i mieszaninę roooieńczpnp 40 ml metanolu. Kwas wykrystalizował i o-dzielono go przez filtrację, uzyskując 1,7 g puszystego białego ciała stałego, y-taktonu ϊ1α,17--ihy'droksy-3-υk.so-17α-pregn-4-eno-7α,2ϊ--lkarUpksylanu Metylowego.
NMR *H (400 MHz, deute-o-imetylosulfotlenek) d: 0,80 (s, 3H), 1,25 (s, 3H), 1,2-2,7 (m, 20H), 3,8 (b-s, 1H), 4,45 (m, 1H), 5,50 (s, 1H).
Proton z ka-boksylu nie był zauwazony z powodu obecności piku HOD w 3,4 ppm.
202
189 459
Przykład C8
Schemat 1:
Etap CC:
Metoda G:
Wytwarzanie Ύ-laktont 17-hydroksy-3-okso-17α-pregną-4,9(11)-didno-7.21-wodoro-ikąrboksyląat 7-metylowego
Procedurę z przykładu C7A powtórzono z wyjątkiem tego, ze wielokrotne przemywanie zastąpiono przez traktowanie roztworu reakcyjnego żywicą jonowymienną, zasa-owym tlenkiem glinu lub zasa-owym tlenkiem krzemu.
Warunki obróbki zasa-owym tlenkiem glinu lub zasadowym tlenkiem k-zemu po-ano -alej w tabeli C8. Stwierdzono, ze każdy z tych zabiegów był skuteczny dla usunięcia zanieczyszczeń bez wielokrotnego przemywania z przykładu 44, -la wytuoroenią Y4aktonu 17-hy-roksy-C-okso-17α-pregną-4,9(11)-dieno-7.21lUodoro-ikąrboksyląnu 7lmdtylowdgo.
Tabela 38
Czynnik Nastaw Cel doświadczenia Kluczowy wynik
Zasadowy tlenek glinu 2 g/125g produktu Traktowanie mieszaniny reakcyjnej zasadowym tlenkiem glinu dla usunięcia eoli Et3N · HCl i dla eliminacji mycia 1N NaOH i 1N HCl Wydajność wyniosła 93%
Ząsądowt kIZddioakt 2 g/l25g produktu Traktowanie mieszaniny reakcyjnej zasadową krzemionką, która jest tańsza dla usunięcia soli Et3N HCl i dla eliminacji mycia 1N NaOH i 1N HCl Wydajność wyniosła 95%
Przykład C9
Schemat 1:
Etap CC:
Metoda H:
Wytwarzanie γ-hktonu 17-hydroksy-3-okso-17α-pregną-4,9(11)-dienOl7.21-wo-oro-il karboksylanu 7lmetylouego
W reaktorze o pojemności 100 ml zmieszano octan potasu (4 g) i kwas trlfltoroootouy (42,5 ml). Do mieszaniny dodano bezwodnik (9,5 ml) z kontrolowaną prędkością, aby utrzymać podczas dodawania temperaturę poniżej C0°C. Następnie roztwór ogrzewano w temperaturze C0°C przez C0 minut, aby otrzymać reagent eliminujący, użyteczny w celu konwersji mdeyląau o wzorze IV na enester o wzorze II.
Utworzony przedtem reagent eliminujący, TFA/TFA bezwodnik, dodano -o roztworu mesyląat o wzorze IV wytworzonego poprzednio, jak w przykładzie C7A. Powstałą mieszaninę ogrzewano w temperaturze 40°C przez 4,5 godziny, przy czym stopień konwersji sprawdzano okresowo przez TLC lub HPLC. Po zakończeniu reakcji mieszaninę prodaideioao -o kolby z jedną szyją i zatężono do sucha po- zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej (22°C). Do mieszaniny dodano octan etylu (1C7 ml), uzyskując całkowite rozpuszczenie stałej fazy, po czym do-ano mieszaninę uoaą/soląnką (1C7 ml) i uzyskaną dwufazową mieszaninę mieszano przez 10 minut. Następnie fazy pozostawiono -o roz-zielenia na 20 minut. Stężenie solanki wynosiło 24% wagowych. Wodną fazę skontaktowano z dodatkową ilością octanu etylu (68 ml) i tak wytworzoną dwufazową mieszaninę mieszano przez 10 minut, następnie pozostawiono na 15 minut do roz-oieleaią faz. Połączono warstwy octanu etylu z dwóch ekstrakcji i przemyto 24% (wagowo) solanką (120 ml), -rugą porcją 24% (wagowo) solanki (60 ml), 1N roztworem wodorotlenku sodu (150 ml) i inną porcja solanki (60 ml). Po dodaniu każ-ej wodnej fazy mieszaninę mieszano przez 10 minut i pozostawiano do odstania na 15 minut -la rozdoieldaią. Uzyskany roztwór zatężono -o sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C, stosując wo-ny pochłaniacz. Stały pro-ukt (8,09 g) anali189 459
203 zowano na drodze HPLC i znaleziono, że zawierał 83,4% powierzchni enestru ydaktonu 17-hydroksy-3-okso-17a-pregna-4,9(11)-dieno-7,21lWodorodikarboksylanu 7-metylowego; 2,45% powierzchni 11,12-olefiny; 1,5% 7,9-laktonu i 1,1% nieprzereagowanego mesylanu.
Przykład 40
Schemat 1:
Etap 3C:
Metoda I:
Wytwarzanie ^^-^a^tonu 17-hydroksy-3-okso-17α-pregna-4,9(11 )-dieno-7,21 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego
Mesylan, mający strukturę wytworzoną w przykładzie 23 (1,0 g), octan izopropenylu (10 g) i kwas β-toluenosulfonowy (5 mg) umieszczono w kolbie o pojemności 50 ml i ogrzewano w temperaturze 90°C z mieszaniem. Po 5 godzinach mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem przy 10 mm Hg. Pozostałość rozpuszczono w CH2O2 (20 ml) i przemyto 5% wodnym NaHCO3. Warstwę CILCL zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 1,47 g oleju barwy zółto-brązowej. Materiał ten rekrystalizowano z CH2Cl2 /Et2O, uzyskując 0,50 g enolooctanu o wzorze IV(Z).
Ten materiał dodano do mieszaniny octanu sodu (0,12 g) i kwasu octowego (2,0 ml), którą przedtem ogrzano do temperatury 100°C z mieszaniem. Po 60 minutach mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C i rozcieńczono CILCL (20 ml). Roztwór przemyto wodą (20 ml) i wysuszono nad MgSO4. Czynnik suszący usunięto przez filtrację i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 0,4 g żądanej 9,11-olefiny, y-bktonu 17-hydroksy-3-okso-l7α-pregna-4,9(11)-dieno-7,2l-wodorodikarboksylanu 7-metylowego. Surowy produkt zawierał mniej niż 2% zanieczyszczenia, 7,9-laktonu.
Przykład 41 Termiczna eliminacja mesylanu w DMSO
Schemat 1:
Etap 3C:
Metoda J:
Wytwarzanie ydaktonu 17-hydroksy-3-okso-17α-pregna-4,9( 11 )-dieno-7,21 -wodorodikarboksylanu 7-metylowego
Mieszaninę 2 g mesylanu i 5 ml DMSO ogrzewano w kolbie w temperaturze 80°C w ciągu 22,4 godziny. Analiza HPLC mieszaniny reakcyjnej wykazała brak materiału wyjściowego. Do mieszaniny reakcyjnej dodano wodę (10 ml) i wytrącony osad ekstrahowano trzy razy chlorkiem metylenu. Połączone warstwy chlorku metylenu przemyto wodą, wysuszono nad siarczanem magnezu i zatężono, otrzymując enester, y-kikton 17-hydroksy-3-okso-l7α-pregnal4,9(1l)-dieno-7,2l-wodorodikarboksylanu 7-metylowego.
Przykład 42
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda B:
Synteza y-kiktonu l7-hydroksy-3-okso-l7α-pregna-4,9(ll)-dieno-7,2l-wodorodikarboksylanu 7-metylowego
204
189 459
W gruszkowat-j kolbie o pojemności 50 ml przy mi-so7aiu -11^— o wooroz IIA (1,00 g o zawartości 04,4% -ιι^™), arichłoro7cza7mid (0,32 g), wodorofosfoian dipotasowy (0,00 g) jako ciała stałe zmieszano z chlorkiem metylznu (15,0 ml). Dodano pipetą a7dalznek wodoru (30% wagowych; 5,0 ml) w ciągu 1 minuty. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 6 godzin w temp-iatsro- pokojowej i wtedy analiza HPLC pokazała, ż- stosunek -peksym-ksi-nonu do endsars w mieszaninie reakcyjnej wynosił w przybliżeniu 1:1. Dodano do mieszaniny reakoyJaej dodatkowy triohłero7cetamia (0,32 g) i kontynuowano reakcję przy mieszaniu jeszcze przez ™ godzin, po tym czasie okazało się, że zawartość enestru zmniejszyła się de 10%. Wprowadzono dodatkowy arichloro7ceaamid (0,0™ g) pozostawiono mieszaninę reakcyjną do stania prodo noc, po tym czasie pozostało w miesoaaiaiz tylko 5% nieprodreakowaazko enestru w stosunku do epoksymeksienonu.
Przykład 43
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda C:
Synteza y-łaktonu 9,11k-epoksy-10α-hydroksys3-oksoprega-4-zno-0α,21-dlkarboksylanu wodorometylowego
Do reaktora o pojemności 100 ml wprowadzono zn-ster o woo-oe IIA (5,4 g, o zawartości 04,4% enestru). Do en-stru dodano a-ichloro7czt7mid (4,9 g) i wodorofosforan dipotasowy (3,5 g) oba w stałej postaci, potem chlorek metylenu (50 ml). Mieszaninę ochłodzono do tzmp-iatu-y 15°C i dodano 30% nadtlenek wodoru (25 g) w ciągu 10 minut. Pozwolono dojść mieszaninie r-akcyjn-j do temperatury 20°C i mieso7ao w tej azmperaauroe proeo 6 kodola, po tym czasie sprawdzono konwersję na drodze HPLC. Oznaczono pozostały en-ster jako mniej niz 1% wagowo.
Mieszaninę reakcyjną dodano do wody (100 ml), pozostawiono fazy do rozdzi-lznia i usunięto warstwę chlorku metylenu. Dodano do warstwy chlorku metylenu wodorotlenek sodu (0,5N; 50 ml). Po 20 minutach fazy pozostawiono do rozdzielenia i dodano HCl (0,5N; 50 ml) do warstwy chlorku m-tyl-nu, po czym fazy pozostawiono do roodoieleai7 i fazę oiganiooaą przemyto nasyconą solanką (50 ml). Warstwę chlorku m-tylenu wysuszono nad siarczanem magnezu i usunięto rozpuszczalnik. Otrzymano białe ciało stałe (5,0 g). Wodną warstwę wodorotlenku sodu zakwaszono i ekstrahowano, a ekstrakt poddano obróbcz, otrzymując dodatkowe 0,2 g produktu. Wydajność zpoksymzksrzaoau wyniosła 90,2%.
Przykład 44
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda D:
Synteza tonu 9,11 k-dpoksy-10α-hyaroksy-3-oksoprekn-4szaos0k,21 -dikaiboksylanu wodorom-tylow-go
En-ster o wooroe IIA pIoeksotałooao na zpoksymzksrenon, jak opisano w przykładzie 43, z następującymi różnicami: początkowy załadunek obejmujący enester (5,4 g o zawartości 04,4% en-stru), arichloro7oet7mid (3,3 g) i wodorofosforan dipotasowy (3,5 g). Dodano roztwór naaalznks wodoru (12,5 g). Reakcję prowadzono przez noc w temperaturze 20°C, po czym HPLC wykazała 90% konwersji -n-stiu do epoksymeksrenonu. Dodano dodatkowy tiichloioacetamid (3,3 g) i 30% nadtlenek wodoru (5,0 ml) i reakcję prowadzono przez dodatkowe 6 godoia, w tym punkcie pozostały enester wynosił tylko 2% wobec załadunku enest-u. Po obróbce, jak opisano w przykładzie 43, otrzymano 5,01 g -peksym-ks-nonu.
Przykład 45
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda E:
Synteza 9,11 ksepoksy-10k-hydIoksy-3-oksoprdga-4-eao-0k,21 -dika-boksylanu wodorom-tylowego
En-ster o wzorze IIA prodksotałoono na zpoksymzksrenon, jak opisano w przykładzie 43. W reakcji w tym przykładzie załadunek en-stru wyniósł 5,4 g (o zawartości 04,4% enestiu), załadun-k arlchloro7oet7mlds wyniósł 4,9 g, załadunek nadtlenku wodoru wyniósł 25 g, zała189 459
205 dunek wo-orofosfozznu aipotzsowzgo wyniósł 3,5 g. Reakcja biegła w tzmpz-ztu-zz 20°C wciągu 18 go-zin. Pozostałość znzst-u wyniosła poniżej 2%o. Po obróbce otrzymano 5,71 g zpoksymzksrznonu.
Przykład 46
Schemat 1:
Etzp 3D:
Mzto-a F.
Synteza γ/ιά’·:.^ 9,11 α-zpoksy-17α-bydroksy-3-oksopregn-4sznOs7α,71--ikazboksylanu wo-orometylowzgo
Enzstzr o wzozzz ΠΛ przekształcono na zpoksymzksrznon, jzk opisano w przykładzie 43, z wyjątkiem tzgo, żz temperatura reakcji w tyD p-oyalα-ziz wynosiła 28OC. Materiały załadowane -o -zaktozz obejmowały znzstz- (2,7 g), t-iohloroaozt7Dia (2,5 g), wo-orofosforan dipotasowy (1,7 g), nz-tlznzk wodoru (17,0 g) i cblozzk metylenu (50 d1). Po 4 godeinzcb reakcji pozostałość znzst-u wyniosła poniżej 2% wobec zała-unku znzstru. Po obróbce, jak opisano w przykładzie 43, otrzymano 3,0 g zpoksymzksrznonn.
Przykład 47-1
Schemat 1:
Etap 3D:
Mzto-a G:
Synteza γ-iaktonn 9,11 α-zaoksy-17α-bydroksy-3-olłsoprega-4-eno-7α,21 --iaarboksys lanu wo-orometylowzgo
Enzstzr o wzorzz IIA (40,0 g o zawartości 68,4% znzst-u) zzłz-owano -o reaktora z płaszczem o pojemności 1000 ml i zozpuszczono w 175 d1 chlorku metylenu. Roztwór mizszzno, kiedy -o-zno tzicblozozcztaDia (22,3 g) i wodorofosforzn -ipotasowy (6,0 g) jako ciała stałe. Całość mieszano przy 400 obrotach/minutę i w tempezatuzzą -opzowz-zonzj -o 27°C p-zy stałej temperaturze łaźni kont-olowanzj przez płyn, cy-kulający w płaszczu zzaktorz. Do-ano w ciągu 3-5 minut nadtlenek wodoru (72,8 ml o zawartości 30%). Po do-zniu ιι-tlenku wo-oru mieszzno całość p-zy 400 obrotach/minutę i temperaturze 27°C. Oznaczenie HPLC wykazało, ze reakcja zzszłz w 99% w ciągu 5 go-zin. W końcu 6 go-zin -odzno 72,8 d1 wody. O--eiąlono wo-ny nz-tlznzk wodozu i powtórnie ekstrahowano je-en zrz 50 d1 oblozku metylenu. Połączony chlorek metylenu p-zemyto 6% sizrczynzD so-u (62,3 d1), aby -ozłożyć ewentualnie zawzzty nz-tlenek. Usuwanie chlorku metylenu rozpoczęto pzzez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym i skończono po- zmniejszonym oeśaeenezD. Otrzymano żółtawą pozostałość (48,7 g, 55,4% zawartości). To odpowiz-zło oznaczeniu 94,8% molowej wy-zjnośoi.
Porcję (47,8 g) pozostałości połączono z 498 ml etanolu 3A (95% etanol -enzturowany 5% metanolu). Mieszzninę ogrzewano w temperaturze wzzeniz wobec powrotu skroplin i usunięto 249 d1 destylatu po- ciśnizaieD atmosfz-yczaym. Mieszaninę ochło-zono do tempz-atury 25°C i przesączono. Przemycie etanolem 3A (53 d1) użyto do ułatwienia p-zejścia. Suche ciało stałe ważyło 27,6 g (oznaczono 87,0%), co odpowiadało 91% o-zysku. Porcję ciała stałego (27,0 g) rozpuszczono w 292 d1 ketonu metylowo-etylowego w tzmpzzatu-zz wzzenia wobec powrotu skroplin. Gorący -oztwó- przesączono przez wkłz- solka floc (sp-oszkowanz celuloza) z -rugą porcją 48,6 ml ketonu metylowo-etylowego użytego -o ułatwienia przzjściz. Porcję 146 ml ketonu metylowo-etylowzgo usunięto przez destylację pod ciśniznizD atmosferycznym. Roztwór ochłodzono -o temperatury 50°C i mieszano przzz jzdaą godzinę w mirzę jzk produkt krystalizował. Po 1 godzinie· mieszaninę ochło-zono -o tzmperatuzy 25°C. Mieszznie kontynuowano przzz 1 godzinę i p-zesączono ciało stzłe z 48,6 d1 ketonu Dztylowo-ztylowzgo użytego jzko przzmyciz Ciało stałe wysuszono do stałego cięża-u 20,5 g, który oznaczał 87,2% odzysku z zekzystzlizroji. Wydajność reakcji i o-zysk z etanolu i ketonu metylowo-etylowego dzły łącznie 75% ogólnej wy-ajności.
Ług mrolz-zysty ketonu metylowo-etylowego aa-zwzł się -o recyklingu z dodanym -oztwozzm chlo-ku metylenu z następnej reakcji. Połączoną mieszzninę chlo-ku metylenu i ketonu Dztylowo-etylowego odparowano -o sucha przzz -zstylację pod ciśnieniem atmosferycznym i po- zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość połączono z 19 objętościami etanolu 3A, opią-ając się nr zawrztości epoksyDeas-zaoan. Połowę rozpuszczalnika usunięto przez -esty206
189 459 lację pod cienieniem atmosferycznym. Po ochłodzeniu do temperatury 25°C odsączono ciało stałe i wysuszono. Suche ciało stałe rozpuszczono w 12 objętościach ketonu metylowo-etylowego w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Gorący roztwór przesączono przez wkład solka floc z 2 objętościami ketonu metylowo-etylowego użytego jako przemycie. Przesącz zatężono przez oddestylowanie pod ciśnieniem atmosferycznym 6 objętości ketonu metylowo-etylowego. Roztwór ochłodzono do temperatury 50°C i mieszano przez 1 godzinę, w miarę jak produkt krystalizował. Po 1 godzinie mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C. Mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę i przesączono ciało stałe z 2 objętościami ketonu metylowo-etylowego użytego jako przemycie. Ciało stałe wysuszono do stałego ciężaru. Włączenie ługu macierzystego ketonu metylowo-etylowego podniosło ogólną wydajność do 80-85%.
Ta metoda okazuje się szczególnie odpowiednia do zwiększonej skali, ponieważ maksymalizuje wydajność i minimalizuje objętość przemywek i straty.
Przykład 47A
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda H:
Synteza -fdaktonu 9,11 a-epoksy-17a-hydroksy-3-oksopregnl4-eno-7a,21 laikarboksylanu wodorometylowego
Enester o wzorze IIA (17 g o zawartości 72% enestru) rozpuszczono w chlorku metylenu (150 ml), po czym dodano trichloro4cetamia (14,9 g) przy wolnym mieszaniu. Temperaturę mieszaniny ustalono na 25°C i roztwór wodorofosforanu aipot4eowego (10,6 g) w wodzie (10,6 ml) zmieszano z roztworem eubetr4tu enestru, mieszając przy 400 obrotach na minutę. Do mieszaniny substr4t/foefor4n/trichloroacetαmia dodano nadtlenek wodoru (roztwór 30% wagowo; 69,4 ml) w ciągu 3-5 minut. Nie zauważono wydzielania ciepła lub wydzielania tlenu. Mieszaninę reakcyjną tak wytworzoną mieszano przy 400 obrotach na minutę w temperaturze 25°C przez 18,5 godziny. Nie zauwazono wydzielania tlenu w przebiegu reakcji, ale analiza zuzycia nadtlenku wodoru wykazała, że tworzyła się pewna ilość tlenu podczas reakcji. Mieszaninę reakcyjną rozcieńczono wodą (69,4 ml) i całość mieszano przy 250 obrotach na minutę przez 15 minut. Przy tej operacji nie była potrzebna kontrola temperatury i prowadzono ją zasadniczo w temperaturze pokojowej (temperatura w zakresie 5-25°C jest dopuszczalna). Wodną i organiczną warstwę pozostawiono do rozdzielenia i usunięto dolną warstwę chlorku metylenu.
Wodną warstwę znów ekstrahowano chlorkiem metylenu (69,4 ml) przez 15 minut, mieszając przy 250 obrotach na minutę. Warstwy pozostawiono do rozdzielenia i usunięto dolną warstwę chlorku metylenu. Wodną warstwę (177 g; pH = 7) poddano oznaczeniu na obecność nadtlenku wodoru. Wynik (12,2%) wskazywał, że 0,0434 mola nadtlenku wodoru zuzyto w reakcji 0,0307 mola olefiny. Nadmiar zużycia nadtlenku wodoru był miarą tworzenia tlenu w reakcji. Powtórna ekstrakcja małą ilością objętości chlorku metylenu była wystarczająca, aby zabezpieczyć się przed stratą epokeymekerrnonu w wodnej warstwie. Wynik ten potwierdzono zastosowaniem drugiej dużej ekstrakcji chlorkiem metylenu, w której odzyskano tylko tr1chloro4cetamia.
Roztwory chlorku metylenu z ekstrakcji opisanych wyżej połączono i przemyto 3% (wagowo) roztworem siarczynu sodu (122 ml) przez co najmniej 15 minut przy około 250 obrotach na minutę. Obserwowano ujemny wynik próby jodkowo-skroblowej (papierki KJ; brak zabarwienia; w pozytywnym wyniku próby purpurowe zabarwienie wykazuje obecność nadtlenku) na końcu okresu mieszania.
Wodną i organiczną warstwę pozostawiono do rozdzielenia i usunięto dolną warstwę chlorku metylenu. Wodną warstwę (pH = 6) odrzucono. Trzeba zauwazyć, że dodanie roztworu siarczynu sodu może powodować lekkie wydzielanie ciepła, tak że takie dodawanie powinno przebiegać pod kontrolą temperatury.
Fazę chlorku metylenu przemyto 0,5N wodorotlenkiem sodu (61 ml) przez 45 minut przy około 250 obrotach na minutę i w zakresie temperatury 15-25°C (pH = 12-13). W tym procesie usunięto zanieczyszczenia pochodzące z trichloroacetamidu. Zakwaszenie alkalicznej
189 459
207 wodnej frakcji i następna ekstrakcja chlorkiem metylenu potwierdziły, że w tej operacji stracono bardzo małą ilość epoksymeksrenonu.
Fazę chlorku metylenu przemyto raz 0,1N kwasem chlorowodorowym (61 ml) przez 15 minut, mieszając przy 250 obrotach na minutę i w zakresie temperatury 15-25°C. Następnie warstwy pozostawiono do rozdzielenia, usunięto dolną warstwę chlorku metylenu i przemyto znów 10% (wagowo) wodnym roztworem chlorku sodu (61 ml) przez 15 minut przy 250 obrotach na minutę i w zakresie temperatury 15-25°C. Znowu warstwy pozostawiono do rozdzielenia i usunięto warstwę organiczną. Organiczną warstwę przesączono przez wkłaó z Solkanoc i następnie odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Suszenie dokończono w temperaturze łaźni wodnej 65°C. Otrzymano białawe ciało stałe (17,95 g) i poddano oznaczeniu przez HPLC. Oznaczono 66,05% tpdksymtksrtmonu. Potwierdzona molowa wydajność wyniosła óla reakcji 93,1%.
Produkt rozpuszczono w gorącym ketonie metylowo-etylowym (189 ml) i powstały roztwór destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym óo usunięcia 95 ml rozpuszczalnika ketonowego. Temperaturę obniżono do 50°C, w miarę jak produkt krystalizował. Mieszanie kontymudwamd w temperaturze 50°C przez l godzinę. Następnie temperaturę obniżono do 20-25°C i mieszanie komtynudwamd przez dalsze 2 godziny. Ciało stałe odsączono, przemyto MEK (24 ml) i suszono ciało stałe do stałego ciężaru 9,98 g, które według oznaczenia HPLC zawierało 93,63% epoksymeksrenonu. Produkt ten znów rozpuszczono w gorącym MEK (106 ml) i gorący roztwór przesączono przez sączek o szczelinach 10 mikronów pod ciśnieniem. Zastosowano jako przemycie inną porcję 18 ml MEK i przesączony roztwór MEK destylowano pod ciśnieniem atmosferycznym do usunięcia 53 ml rozpuszczalnika. Temperaturę obniżono do 50°C, w miarę jak produkt krystalizował; mieszanie kontynuowano w temperaturze 50°C przez l godzinę. Następnie obniżono temperaturę óo 20-25°C i utrzymywano tę temperaturę, podczas gdy mieszanie kontynuowano przez dalsze 2 godziny. Ciało stałe odsączono i przemyto MEK (18 ml). Suszono ciało stałe do stałego ciężaru 8,32 g, które zawierało 99,6% tpdkyymtksśendnu według ilościowego oznaczenia HpLC. Końcowe straty przy suszeniu były mniejsze oó 1,0%. Ogólna wydajność epdksymtksrenonu z reakcji i obróbki w tym przykładzie wyniosła 65,8%. Ta ogólna wydajność oózwierciadla wydajność reakcji 93%, odzysk z początkowej krystalizacji 78,9% i odzysk z krystalizacji 89,5%.
Przykład 47B
Wytwarzanie ydaktonu ila, 12a-epoksy-17-hydroksy-3-okso-17a-prtgnl4-eno-7a.21 -wdóorodikarbdksylanu 7-metylowego
Olefma ΔηΊ2 z enestru jest produktem ubocznym eliminacji 11-mesylanu. Wydzielono czystą próbkę z mieszaniny reakcyjnej wytworzonej jak w przykładzie 37A przez powtarzaną preparatywną chromatografię cieczową. Tak więc 73 g pozostałości (wytworzonej jak opisano w przykładzie 37A) chśomatpgrafowamo na 2,41 kg zelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ) z gradientem układu elucyjnego octan etylu, toluen (20:80, 30:70, 40:60, 60:40, dbJstdściOl wo). Połączono wzbogacone porcje olefiny Δη12 z wybranych frakcji 30:70. TLC na płytkach EMF, stosując octan etylu/toluen 60:40 (dbJętdścidWd) z wizualizacją przy użyciu kwasu siar208
189 459 kowego i SWUV służyła jako wskazówka do wyboru odpowiednich frakcji. 7,9 g surowej oleimy ΔηΊ2 (80% powierzchni według HPLC) otrzymanej po usunięciu rozpuszczalnika, chromatografowano na 51C g zelu krzemionkowego Mercka (40-63 μ) z gradientem układu eltoyjaego octan etylu/chlorek metylenu (10:90, 20:80, C5:65, objętościowo). Czysty γ·^^ 17-hyaroksy-3-okso- 17α-prdgaą-4,11 -dieaol7α,21 -wodoroaikąrUoksyląnu 7-metylouego (C,72 g) otrzymano z wybranych frakcji 20:80. Selekcja frakcji opierała eię na ocenie przez TLC jak w sytuacji poprzedniej.
MIR cm4: 1767 (lakton), 1727 (ester), 1668 i 1616 (C-keto^’5).
NMR *H (CDClc) ppm: 1,05 (s, CH), 1,15 (s, CH), C,66 (s, CH), 5,58 (dd, 1H), 5,80 (e,
1H), 5,88 (-d ,1H).
NMR 1CC (CDClc) ppm: 17,41, 18,58, 21,7C, 28,61, C2,28, CC,6C, C4,91, C5,64, C5,90,
38,79, 42,07, 44,12, 48,99, 49,18, 51,52 9C,81, 126,4C, 126,69, 1CC,76, 166,24, 172,91, 176,64, 198,56.
Roztwór 1,6 g (C,9 mmola) γ-laktoau 17-hy(dIΌksy-3-okso-17α-prdgną-4,11--leno-7α,21-uo-oro-ikąrUokeyląnu 7lmetylouego w 16 ml chlorku metylenu zmieszano z 2,2 ml trichloroacetonitrylu (22,4 mmola) i 0,75 g fosforanu aipotąeouego (4,C mmola). Całość mieszano i połączono z 6,7 ml C0% aąatleaku wodoru (66 mmoli). Mieszanie kontynuowano w temperaturze 25°C przez 45 godzin. Po tym czasie doaąao 28 ml chlorku metylenu i C9 ml wo-y. Część organiczną od-zielono i przemyto kolejno a) 74 ml C% siarczynu sodu, b) 62 ml 1N wodorotlenku sodu, c) 74 ml 1N kwasu chlorowodorowego i d) C1 ml 10% solanki. Znów oddzielono część organiczną, wysuszono nad siarczanem magnezu i odparowano -o sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. 1,25 g pozostałości chromątogrąfouąao na 1C8,2 g żelu kroemioakouego Mercka (40-6C μ), stosując gradientowy układ eter metylouo-tert-Uutylowy, toluen (40:60, 60:40, 75:25, objętościowo). Odpowiednie części frakcji 60:40 i 75:25 połączono po ocenie przez TLC, otrzymując 0,66 g czystego Y-diakOnu 11α,12α-epokeyll7lhyaroksy-C-okso-17a-prdgal4lea0l7a,21 lUodorodikąrUoksyląau 7-meeyktwego. Stotoow^no TLC na płytkach EMF z układem elucyjnym eter metylow0ltdrt-Uttylowy, toluen 75:25 (objętościowo) i wizualizacją kwasem siarkowym i SWUV.
NMR 'H (CDClc) ppm: 1,09 (s, CH), 1,C0 (e, CH), C,05 (ABn’12, 2H), C,67 (S, CH), 5,80 (e ,1H).
NMR 1CC (CDClc) ppm: 14,2, 18,0, 21,2, 28,8, C1,9, CC,5, C4,6, C4,7, C5,1, C5,5, C7,4,
C8,C, 41,8, 46,0, 47,2, 50,4, 51,7, 56,7, 94,0, 126,7, 165,2, 172,5, 176,7, 198,1.
Teoria: C 69,54 i H 7,30;
Znaleziono: C 69,29 i Η 7Ί7.
Przykład 47C
Wyodrębnianie Y-JakU-nu 4α,5α:9α,11αldiepoksy-17-hydroksy-C-okso-17αlpregaąao-7a,21 luodoro-ikąrboksyląnu 7lmetylowego
O
189 459
209
Surowy epokdymekdreaon (157 g) wytworzony z 200 g enestru jtk w przykładzie 26, pp-aaap cbromttpgrtfpwtaiu na 4,4 kg żelu krzemionkowego Mzrckt (40-63 μ). Porcję 88,1 g uzyskano stosując układ zlzcyjny acetonk-yl, toluen 10:90 (objętościowo). Wydzielone ciało stałe rozpuszczono w 880 ml gorącego ketonu metylowo-etylowego i przesączono p-zez wkład solka floc. D-zgie 88 ml ketonu metylowo-etylowego zżyto jako p-zemycie. Przesącz oatężpno przez zsunięcie 643 ml rozpuszczalnika i mieszaninę ochłodopao -o temperatury pokojowej. Ciało stałe p-sącoono i p-zzmyto ketonem metylowo-etylowym. Po suszeniu pt-z9mtno 60,2 g epokd9meksrenonu ρzntczpaego jako 96,8% przez HPLC. Przesącz zatężono -o sucha po- zmniejszonym ciśnieniem. 9,3 g ppoodtałoSce rekr9staliopwaap z 99 ml ketonu metylpwp-et9lowegp, otrzymując 2,4 g suchego ciała stałego. Porcję 400 mg ciała stałego po-dano p-epartt9wazJ HPHC z odwrotną fazą na kolumnie YMC ODS AQ. Czysty Y--likton 4α, 5α: 9α, 11 α-dieppkdy-17-h9drρkd9-3 -okso-17a-p-egatnp-7a,21 -wodorodiktrbokd9ltau 7-mpt9lowegp (1°3 mg) wydzielono, stosując układ elzcyjny acetonitryl (24%), metanol (4%) i woda (72%).
NMR Ή (CDCl3) ppm: 0,98 (s, 3H), 1,32 (s, 3H), 2,89 (m, 1H), 3,07 (s,d, 2H), 3,73 (s, 3H).
MS, M + 430, oblicopae -lt C24H3°O7 (430,50).
P - z y k ł a d 47D
Wyodrębnianie y--aktonz ϊ7-hydroksy-3,12-diokso-17α-p2egna-4,9(ϊϊ)ł-ieao-7α,Rϊłwp-orpdiktrbpkdylaaz 7-metylowego
Ług macierzysty ketonu metylowo-etylowego otrzymany jtk w przykładzie 26, p-ptrpwano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Porcję 4,4 g pozostałości ppd-aao chromatografii na 58,4 g BTR Zorbax LP (40 μ). Elucja gradientem ketonu metylowo-etylowego i chlorku metylenu (25:75 do 50:50 objętościowo) dała 1,38 g substancji. Porcję 1,3 g tej substancji oczyszczano -alej przy użyciu przparatywnej HPLC z odwrotną fazą na kolumnie YMC ODS AQ (10 μ, stosując jako fazę ruchomą acetpaet-9l (30%), metanol (5%) i wodę (65%). Produkt otrzymano ze wzbogaconej f-akcji przez ekstrakcję chlorkiem metylenu. Chlo-ek metylenu odparowano -o sucha i 175 mg pozostałości oczyszczano ponownie przy użyciu p-epa-atywnej HPLC z odwrotną fazą na kolumnie YMC ODS AQ, stosując jako fazę ruchomą acztonitryl (24%), metanol (4%) i wodę (72%). Ekstrakcja cblp2kiem metylenu wzbogaconej frakcji dała 30,6 mg czystego y--aktonz 17-hydroksy-3,ϊ2-dioksp-ϊ7α-p-egaa-4,9(11 )łdieao-7a,2ϊ-wρ-prodlka-bokd9lanu 7-met9lowegp
NMR ’H (CDCl3) ppm: 1,17 (s, 3H), 1,49 (s, 3H), 3,13 (m, 1H), 3,62 (s, 3H), 5,77 (s, 1H), 5,96 (s,lH).
NMR „C (CDCI3) ppm: 13,1, 21,0, 28,0, 29,4, 33,1, 33,4, 33,9, 35,5, 36,7, 40,3, 41,5, 43,0, 43,4, 52,0, 55,0, 91,0, 123,7, 126,7, 163,2, 167,9, 171,8, 176,8, 197,4, 201,0.
Przykład 47E
Wytwarzanie diwo-oiaau soli dipotasowej kwasu 9,ϊϊα-epokdy-17-hydrokdy-3-okso-17a-p-egn-4-eno-7a, 21 -dikarUpkdylρwego
210
189 459
Sporządzono zawiesinę zawierającą 2,0 g (4,8 mmola) epoksymeksrenonu wytworzonego jak w przykładzie 43, 10 ml wody, 3 ml dioksanu i 9,3 ml 1,04 N wodnego wodorotlenku potasu (9,7 mmola). Całość mieszano w temperaturze 25°C przez 3 godziny. Podczas początkowych dwóch godzin utworzył się żółty jednorodny roztwór. Podniesiono temperaturę do 70°C i kontynuowano mieszanie w ciągu dodatkowych 3 godzin. Rozpuszczalnik usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość oczyszczono przy użyciu chromatografii z odwrotną fazą na 90 g żelu krzemionkowego C18, stosując wodę jako eluent. Żądane frakcje połączono po przeglądzie przez TLC na płytkach EMF, stosując chlorek metylenu, metanol jako eluent i SWUV do wizualizacji. Połączone frakcje zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość poddano oczyszczeniu z odwrotną fazą powtarzanemu, jak poprzednio opisano. Żądane frakcje zatężono do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w etanolu. Dodano octan etylu do punktu zmętnienia, potem dodano heptan do całkowitego wytrącenia. Wydzielono 0,55 g produktu, diwodzianu soli dipotasowej kwasu 9,11 α-epoksy- 17-hydroksy-3-okso-17α-pregnl4-eno-7a,21 -dikarboksylowego jako żółte ciało stałe.
Analiza węgla odpowiadała strukturze uwodnionej C23H28K2 · 1,75 H2O:
Teoria: C 52,50 wobec 55,85 dla bezwodnej postaci;
Znaleziono: C 52,49.
Po TLC na płytkach EMF z chlorkiem metylenu, metanolem, wodą (6:3:0,5, objętościowo) jako eluentem i wizualizacją przez SWUV, obserwowano Rf 0,29.
Przykład 47F
Wytwarzanie soli disodowej kwasu 9,1lα-epoksy-l7-hydroksy-3-okso-l7αlpregn-4-eno^^ 1 -dikarboksylowego
Około 5 mg (0,01 mmola) epoksymeksrenonu wytworzonego jak w przykładzie 43 zawieszono w około 100 |l metanolu w fiolce 4 ml i rozcieńczono około 200 μΐ 2,5N NaOH. Powstała mieszanina była żółta i jednorodna. Następnie mieszaninę ogrzewano na łaźni olejowej w temperaturze 70°C. Po 10 minutach próbka 1 z mieszaniny analizowana przez HPLC (Zorbax SB-C8 150 x 4,6 mm, 2 ml/minutę, gradient = 35 : 65 (objętościowo) A:B, A = acetonitryl/metanol (1:1), B = woda/0,1% kwas trifluorooctowy, detekcja w 210 nm) wykazała dwie substancje o czasie retencji 4,86 i 2,93 minuty, składające się odpowiednio z hydroksykwasu (otwarty lakton) i otwartego laktonu kwasu 7-karboksylowego. Po 30 minutach pobrano drugą próbkę (0,05 ml) i zakwaszono 0,05 ml 3N HCl, po czym zobojętniono około 0,5 ml kwaśnego węglanu sodu. Analiza HPLC jak wyżej pokazała oczekiwane steroidy o zamkniętych pierścieniach z czasem retencji 6,59 i 10,71 minuty. Stosunek y-Lktonu 9,11 α-epoksy-l7l
189 459
211
-hydrdksy-3-okso-17α-pśegnl4-eno-7α,21-woddrodikarboksylamu 7lmttylpwegp (10,71 minut) do ddpowitóniegp kwasu 7-karboksylowegp wyniósł 7:89. Selektywna hydroliza laktonu była możliwa w łagodnych warunkach. Sporządzono órugą fiolkę 4 ml jak wyżej, ale nie ogrzewano. Mieszaninę poddano działaniu dźwięków przez 5 minut. Próbkę 0,05 ml rozcieńczono 0,5 ml mieszaniny 1:1 (objętościowo) metamol/acetonitśwl i analizowano przez HPLC bez uprzedniego zakwaszenia. Otrzymany otwarty lakton 7-estru kwasu karboksylowego miał czas retencji 4,85 minuty, jak zaobserwowano wyżej i nie był zanieczyyzczpmy kwasem 7-karboksylowym.
Przykład 47G
Wyodrębnianie y--aktonu 9a, 11 β, 17-trihydroksy-3-okso-17a-pregn-4-emo-7a,21 -woóośodikarbdksylanu 7-metwlowtgd
oraz y--aktonu 12a, 17-óihyóroksy-3-dksdl17alprtgma-4,9(11)-diemp-7a,21 -woóośddikaśbol ksylanu 7-metwldwego
y-lakton 9a, 11 β ,17-trihydroksy-3-dksd-17a-pśegnl4-tmo-7a,21 -wddorpóikarbdksylamu 7lmetwldwego i y--aktom 12α,17-dihyóśoksyl3-oksol17α-pregna-4,9(11)-óiemp-7α,21-woóorodikarboksylanu 7-metwlowegp wydzielono po preparatywnej chromatografii cieczowej ługu macierzystego z 2lbutamomu odzyskanego po epoksydowaniu enestru, jak opisano w przykładzie 26 (protokół z trichlρrpacetonitśwlem). Tak więc pierwszą krystalizację przeprowadzono, stosując 2-butanon, jak podano. W rekrystalizacji jednak użyto 2^1^^ (10 objętości na gram) zamiast acetonu. Otrzymano tak pozostałość 2,8 g i oczyszczano ją przez preparatywną HPLC z odwrotną fazą. Jako fazę stacjonarną użyto Cromasil C8 (10 μ), z fazą ruchomą złosdną z wody milliQ i acetonitrylu w stosunku 70:30 (objętościowo). Zaobserwowano krystalizację w jednej ze wzbogaconych frakcji. Wydzielono ciało stałe (46,7 mg) i zidentyfikowano jako γlιt^1l·dm 90,11 β, 17ltrihyóroksWl3lOksd-17alpśtgn-4-enp-7a.21 lwodpśodikarboksylamu 7-ś0etylowego. Ług macierzysty odparowano óo sucha pod zmniejszonym ciśnieniem i pozo212
189 459 stałość (123 mg) zidentyfikowano jako y--akton 12k,10sdihydroksy-3-okso-10kspregnas
-4,9(11)-aieaos0k,21-wodorodikarboksyl7nu 0smeaylowego, y-kilton 9k, 11 β, 10-arihyaroksy-3sokso-10klpregn-4-enos0k,21 -woaoIodikarboksylaas
-0-mdtylowego:
MS M + 432, obliczone dla Cie^iOj (432,51).
NMR *H (CDC13) ppm: 1,23 (s, 3H), 1,54 (s, 3H), 3,00 (m, 1H), 3,14 (m, 1H), 3,04 (s, 3H), 5,14 (s, 1H, wolno wymienialny), 5,09 (s, 1H).
NMR 13C (CDCI3) ppm: 16,™, 22,0, 24,™, 29,0, 29,3, 32,1, 34,1, 34,0, 35,2, 35,0, 36,™,
40.0, 43,0, 45,0 45,9, 52,9, 02,™, 00,4, 95,9, 120,4, 163,0, 106,0, 107,3,199,4.
ydakton 12k, 1 0--Λ-'-ιο15--3-ο18Ο- 10ksβreka7s4,9(11 )-dieaos0k,21 s'WΌdorodikarboksylanu 0smdtylowego:
MS M + 44’, obliczone dla C24H30O6 (414,50).
NMR Ή (CDCI3) ppm: 0^0 (s, 1H), 1,40 (S,1H), 3,05 (m,1H), 3,63 (s, 3H), 3,99 (m, 1H),5,02 (s ,1H), 5,96 (m, 1H).
NMR ’3C (CDCI3) ppm: 14,™, 24,0, 26,1, 29,0, 33,6, 34,0, 36,3, 30,0, 30,4, 40,0, 40,9,
43& 4™,1, 69,1, 95,5, 122,7,126,3, 145,9,164,5, 103,2,100,6,198,2.
Przykład 40H
Wytwarzanie y-Laktonu 9,11 k-zpoksys3-etoksy-10shydroksy-10k-pregas4-eaos0k,21 -wodoroalk7rboksylaau 0-mdtylowego
oraz 7--111101^ 6e,10-dlhydroksy-9,11k-epoksy-3-okso-10ksprdgn-4szno-0k,21-wodorodlkarl boksylanu 0smetylowego wzór s302 ydakton 9,11 a-epoksy-3 - cttal. sy- - 7-hydroO ky- - 7a-ppegn-4-eno-7a,211wodorodikaaboksylanu 0smeayloweko wytworzono okodaie z mztodą R. M. Weizra i L. M. Hoffmanna (J. Med. Chzm., 1900, 1304), którą włączono jako odnośnik. 14™ g (350 mmoli) y-laktoau 9,11 k-epoksys3-eaoksy-10-hydroksy-3-okso-10kspIdkns4seao-0k,21swodorodikarboksyl7au 0-mzaylowego wytworzonego jak w przykładzie 43 połączono z 311 ml absolutnego etanolu i 155 ml (932 mmolt) arlzayloortomIÓwcz7au. Zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej i jako katalizator dodano 10,4 g (54,0 mmola) kwasu toluenosulfonowego (monohydratu). Mleso7ale kontynuowano przez 30 minut i reakcję zgaszono dodaniem, 41,4 g (505 mmoli) sproszkowanego octanu sodu i 20,0 ml (256 mmoli) pirydyny. Ciało stałe (00,2 g) usunięto piz-z filtrację i przesącz zatężono do sucha pod omaizjsooaym ciśnlenitm. Pozostałość trawiono 300 ml octanu etylu i 9,™ g ciała stałego usunięto proeo filtrację.
Przesącz zatężono do sucha i pozostałość trawiono 100 ml metanolu o7wierąjącego 2 ml pii'ydyny. 29,0 g ciała stałego usunięto przez filtrację. Dodatkowe wytrącanie zauważono w piz-sączu. Toteż przesącz znów przesączono, usuwając dodatkowe 21,9 g ciała stałego. Przesącz zatężono do sucha i pozostałość tiawiono 50 ml metanolu oawieIąjącego 1 ml pirydyny. Wyazleloao piO-z filtrację 33,™ g ciała stałego. Jakościowa HPLC wykazała, że ostatnia
189 459
213 porcja ciała stałego była dostatecznie czysta (90% powierzchni Ydiaktonu 9,11a-epokey-3-etokey-17lhy-rokey-17a-pregn-4-dao-7a,21-uo-oro-ikąrboksyląnu 7-metylowego) do użycia w następnym etapie reakcji.
Y-Lakton 9,11 a-epoksy^-et-key-1 7^υ-π-!,υ- 17a-pregnl4leaol7a,21 -wo-oro-ikarboksylanu 7-metylouego:
NMR ‘H (CDClc) ppm: 1,02 (s, CH), 1,27 (s, CH), 1,30 (t, CH), 3,12 (m, 1H), C,28 (m, 1H), 3,66 (s, CH), 3,78 (m, 2H), 5,20 (s, 1H), 5,29 (d, 1H).
Porcję 8 g enoloeteru (Y--aktoni.i 9,l1alepoksy-3-etoksy-17-hydrokey-17a-pregn-4lenOl -7a,21-wodoro-ikąrUoksyląau 7-metyloudgo) (18 mmoli) wytworzonego w poprzednim etapie rozpuszczono w 120 ml M-dioksanu. Roztwór połączono z mieszaniną 6,8 g 53% kwasu m-chloroaą-bdnooeeouego (20,9 mmola), 18,5 ml 1,0 N wodorotlenku sodu (18,5 mmola) i 46 ml mieszaniny diokeąa/uodą (9:1). Utrzymywano temperaturę -C°C i całość mieszano przez 2 go-z.my. Temperaturę podniesiono -o 25°C i kontyauouąao mieszanie przez dalsze 20 go-zin. Mieszaninę połączono z 400 ml zimnej wo-y (10°C) i 2C,5 ml 1,0 N wodorotlenku so-u (23,5 mmoła). Mieszaninę ekstrahowano cztery razy porcjami po 100 ml chlorku metylenu. Połączone porcje chlorku metylenu suszono na- eiąrooąadm magnezu i stpdmątąat rozpuszczalnika usunięto przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem. 13,9 g pozostałości roztarto z 50 ml eteru etylowego, uzyskując 2,9 g białego ciała stałego. Porcję 2,4 g ciała stałego ohromątogrąfowąao na 100 g żelu krzemionkowego Mercka (60 μ). Po początkowym przemyciu 1 litrem 1: 1 octanu etylu/heptąau, produkt dluouąao mieszaniną octan dtylt/heptąn w stosunku 7:C. Wzbogacone frakcje połączono na podstawie oceny TLC (płytki EMF; eluent octan dtylt/łleptąn 7:C (objętościowo); wizualizacja SWUV). Tak więc otrzymano 0,85 g wzbogaconego materiału i rekrystąlizouąao go z 10 ml iz-propanolu, uzyskując 0,7 g γ-laktoau 6β, 17-dihyaroksy-9,11 a-epoksy^-okso-17alprdga-4-en0l7a,213uodorodikąrbokeyl lanu 7-metylowdgo. Bardziej zanieczyszczone frakcje połączono i otrzymano 0,87 g surowego γ-laktoat 6β, 17-dihyarokey-9,11 αlepokeylClOkso-17αlprdga-4-enOl7α,21 -wodorodikarbokeylanu 7-mdtylowdgo. Ten materiał chromatograf-wano na 67,8 g żelu krzdmioakoudgo Mercka (40-6C μ). Dodatkowe 0,69 g priohuctu odzyskano -zr^zy użyciu toluenu, ągwierająegoo 0.5l2,5% metanolu.
Y--akton 6 β, 17-dihydrokey-9,11 αlepokey-3-okso-17α-prdgn-4ldno-7α,21 -wo-orodikarbokeyląat 7lmetylowego:
Teoria: C 66,96 i H 7,,^^;
Znaleziono: C 66,68 i H 77,1^.
NMR ‘H (CDClc) ppm: 1^6 (e, CH), 1,36 (dm, 1H), 1,63 (s, CH), 2,92 (m, 1H), C,02 (aa, 1H), 3,12 (d, 1H), 3,64 (s, CH), 4,61 (d, 1H), 5,96 (s, 1H).
NMR ‘CC (CDClc) ppm: 16,17, 21,32, 21,79, 24,C6, 27,99, 28,94, C0,86, 31,09, C2.75. 33,19, 34,92, 36,77, 39,16, 43,98, 47,74, 51,56, 51,66, 65,36, 72,23, 94,79, 165,10, 171,36, 176,41, 199,59.
Przykład 471
Wytw'ąrząald ^^-oa^i^itnu 9,11 a-epoLey-C-ek-key-17lhydroksy-3-okso-17alpregn-4len0l -7β,21 lwodorodikąrbokeyląau 7lmetylowdgo
214
189 459
Do 2 g (4,8 mmola) -/daktonu 9,1Ια-epokey-17-hydroksy-3-okso-Ι7αlpregnl4lenOl -7β,21lwoaorodikarbokeylanu 7-metylowego wytworzonego jak w przykładzie 43 dodano 3,3 ml (14,4 mmola) 25% metoksylanu sodu w metanolu. Otrzymaną żółtą zawiesinę ogrzewano w temperaturze 50°C. Ciało stałe nie rozpuściło się. Do mieszaniny dodano 3,3 ml metanolu (bezwodnego Aldrich). Mieszaninę ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin (65°C) i stała się jednorodna. Po 30 minutach wytrącone ciało stałe wstrzymało mieszanie. Dodano około 25 ml bezwodnego metanolu i mieszaninę przeniesiono do kolby o 100 ml. Mieszaninę ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin przez 16 godzin, w tym czasie mieszanina stała się ciemna i jednorodna. Mieszaninę ochłodzono do temperatury 25°C i dodano 70 ml 3N HCl (wydzielanie ciepła). Kilka gramów lodu dodano dla ochłodzenia mieszaniny i roztwór ekstrahowano dwiema kolejnymi porcjami po 25 ml chlorku metylenu. Ciemny roztwór wysuszono nad siarczanem sodu i przesączono przez warstwę 2,5 cm żelu krzemionkowego (E. Merck, 70-230 mesz 60 A rozmiar porów). Krzemionkę eluowano ‘ 00 ml chlorku metylenu. Wymyty chlorek metylenu zatężono następnie pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 1 g brązowej pianki, która krystalizowała po dodaniu octanu etylu. Warstwę krzemionki eluowano drugi raz 100 ml 10% mieszaniny octan etylu/chlorek metylenu i wymyty roztwór zatężono, uzyskując 650 mg brązowej pianki. Chromatografia cienkowarstwowa (E. Merck 60 F-254 żel krzemionkowy 0,25 mm, toluen/octan etylu (1:1, objętościowo) wykazała obecność ^dal^l^onu 9,ΙΙa-epokey-Ι7-hyaroksyl3lOkeo-17alpregn-4-eno-7a,2ΙlWodoroaikarbokeyl4nu 7-metylowego, γ'-aktonu 9,‘1a-epoksylΙ7-hyaroksy-3-okso-Ι7αlpregn-4-enOl7β,21l\gΌdoroalkarbok.syΊanu 7-metylowego w obu próbkach, chociaż bardzo mało 7αlkarboksyepimeru znajdowało się w pierwszej próbce. Pierwszą próbkę roztarto z gorącym octanem etylu (77°C) i pozostawiono do ochłodzenia do temperatury 25°C. Mieszaninę potem przesączono, uzyskując 400 mg białawego ciała stałego o temperaturze topnienia 254-258°C. H,‘3c i ‘3C-ApT były zgodne z określoną struktura. Mała ilość octanu etylu pozostała w próbce, ale nie wykazano materiału wyjściowego za pomocą HPLC (Zorbax SB-C8 150 x 4,6 mm, 2 mL/minutę, izokratyczny 40:60 (objętościowo) A:B, A = acetonitrył/metanol (1:1), B = woda/0,1% kwas trifluorooctogy, detekcja w 210 nm) (HPLC wykazała 98,6% powierzchni) i TLC (toluen/octan etylu 1:1, objętościowo).
FAB-MS potwierdziła ciężar cząsteczkowy 414 z M + H w 415,2.
NMR 1h (400 MHz, deuterochloroform) δ: 0,95 (s, 3H), 1,5° (s, 3H), 1,45 (m, 3H), 1,55-2,7 (m, 15H), 2, 85 (t, J = 13,1H), 3,25 (d, J = 6,1H), 3,65 (s, 3H), 5,78 (s, 1H).
Przykład 47J
Wytwarzanie γ-kiktonu kwasu 9,ΙΙαlepoksy-Ι7-hydroksy-3-okso-Ι7α-pregnl4-eno-7a,2 ‘ -alkarboksylowego
Do 774 mg (‘,82 mmola) γ--ί4ίtonu 9,1‘a-epokeyl17lhyaroksy-3-okso-17a-pregnl4-enol7a,2‘lwoaorod1karbokeylanu 7-metylowego wytworzonego jak w przykładzie 43 i zawieszonego w 3 ml acetonitrylu, dodano 3 ml (7,5 mmola, 2,0 równoważniki) 2,5M wodorotlenku sodu. Mieszanina stała się żółta i po 10 minutach była jednorodna.
Dla monitorowania postępu reakcji jednakowe próbki (0,1 ml) mieszaniny gaszono w 0,0‘ ml 3M kwasu siarkowego i ekstrahowano w szklanych 4 ml fiolkach octanem etylu
189 459
215 (0,2 ml). Fazy rozdzielono przez usunięcie pipetą niższej wodnej warstwy. Odpędzono fazę organiczną i pozostałość analizowano przez HPLC, stosując metodę opisaną w przykładzie 47H. Po 50 minutach w temperaturze 25°C zaszła mała zmiana w składzie mieszaniny.
Mieszaninę ogrzewano w warunkach temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin (około 90°C) przez 50 minut. Analiza mieszaniny przez HPLC pokazała 6% powierzchni pozostałego wyjściowego materiału. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 65 godzin. Zakwaszenie, ekstrakcja i analiza HPLC próbki, jak opisano wyżej, potwierdziły brak pozostałego wyjściowego materiału.
Mieszaninę mocno zakwaszono dodatkiem około 4 ml 3M kwasu siarkowego i ekstrahowano dwiema porcjami (około 10 ml) chlorku metylenu. Fazy organiczne połączono i wysuszono nad siarczanem sodu. Zatęzenie na wyparce obrotowej dało 780 mg ciała stałego. Ciało stałe rekrystalizowano z dimetyloformamidu/metanolu, uzyskując 503 mg (67%) krystalicznego ciała stałego barwy zółto-brązowej. Próbka topiła się z wydzieleniem gazu w temperaturze około 260°C, kiedy ogrzewano szybko. Próbka powoli ciemniała, ale pozostała ciałem stałym, kiedy wolno ogrzewano ją do temperatury 285°C.
NMR Ή (dimetylosulfotlenek d-6, 400 MHz) δ: 0,85 (s, 3H), 1,4 (s, 3H), 1,3-2,9 (m, 19H), 3,15 (m, 1H), 5,55 (s, 1H), 11,8 (br, 1H).
Przykład 47K
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda I:
Synteza y--aktonii 9,11 α-epoksy-17α-hydroksy-3-oksopregn-4-eno-7α,21 -dikarboksylanu
0,2M roztwór enestru o wzorze IIA w chlorku metylenu połączono z 2 równoważnikami fosforanu dipotasowego rozpuszczonego w równym ciężarze wody (50% (wagowo) wodny roztwór), 3 równoważnikami chlorodifluoroacetamidu i 22 równoważnikami nadtlenku wodoru (dodanego jako 30% wodny roztwór). Całość mieszano w temperaturze 25°C przez 23 godziny. Środowisko reakcji rozcieńczono ilością wody równą załadunkowi nadtlenku wodoru i oddzielono chlorek metylenu. Porcję chlorku metylenu przemyto raz 3% roztworem siarczynu sodu (objętość równa 1,75 załadunku nadtlenku wodoru). Oddzielono porcję chlorku metylenu i wysuszono nad siarczanem sodu. Roztwór zatężono przez destylację pod ciśnieniem atmosferycznym, aż temperatura głowicy osiągnęła 70°C. Pozostałość oceniono przez HPLC, ’H i 13C NMR (CDCI3). Wydajność epoksymeksrenonu oznaczono jako 54,2% powierzchni przez HPLC.
Przykład 47L
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda J:
Synteza y4aktonu 9,1 lα-epoksy-l7αlhydroksy-3-oksopregn-4-eno-7α,2l-dikarboksylanu wodoro-metylowego
Procedurę z przykładu 47K powtórzono, stosując heptafluorobutyroamid (CF3CF2CF2CONH2) zamiast chlorodifluoroacetamidu. Wydajność epoksymeksrenonu oznaczono jako 58,4% powierzchni przez HPLC.
Przykład 48
Epoksydowanie enestru o wzorze IIA przy użyciu toluenu
Schemat 1:
Etap 3D:
Metoda K:
Synteza y-LAtonu 9,11 α-epoksy-17αlhydroksy-3-oksopregn-4-eno-7α,21 -dikarboksylanu wodoro-metylowego
Enester o wzorze IIA przekształcono w epoksymeksrenon metodą generalnie opisaną w przykładzie 46, z wyjątkiem tego, ze użyto toluenu jako rozpuszczalnika. Materiały załadowane do reaktora obejmowały enester (2,7 g), trichloroacetamid (2,5 g), wodorofosforan dipotasowy (1,7 g), nadtlenek wodoru (17,0 g) i toluen (50 ml). Pozwolono na wydzielanie się ciepła w reakcji do temperatury 28°C i zakończyła się po 4 godzinach. Otrzymaną trójfazową
216
189 459 mieszaninę ochłodzono do temperatury 15°C, przesączono, przemyto wodą i suszono pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując 2,5 g pro-uktu.
Przykład 49
Schzmzt 4:
Mztodz A:
Epoksydowanie 9,11 --ienonu
Związek oznaczony XVIIA (związek XVII, w którym obz -Λ-Λ- i sB-B- oznaczają -CH2-CH2-) (40,67 g) rozpuszczono w chlorku Dztylenu (250 d1) w trój szyjnej kolbiz o pojemności 1 litra i ochło-zono zewnątrz mieszaniną lo-u z solą. Do-zno fosforan -ipotasowy (22,5 g) orzz tziohlorozcetonitryl (83,5 g) i mieszaninę ochłodzono -o temperatury 2°C, po czym wolno -odzno 30% na-tlznek wodozu (200 g) w ciągu 1 go-ziny. Mieszzninę reakcyjną mieszano w temperaturze ^C proąo 8 godzin i 14 godzin w tempezaturzz pokojowej. Pobrano kroplę warstwy organicznej, zbz-zno na wyjściowy enon i znaleziono < 0,5%. Dodano wo-ę (400 d1), mieszzno p-zez 15 minut i rozdzielono warstwy. Wzzstwę organiczną p-zemyto kolejno 200 ml jo-ku potasu (10%), 200 d1 tiosiarczanu so-u (10%) i 100 d1 nasyconego roztworu kwzśnzgo węglanu so-u, zoo-zielaJąc warstwy za każ-yD razem. Warstwę o-ganiczną wysuszono nad siazczaneD magnezu i zztężono, uzyskując surowy epoksyd (41 g). P-o-ukt krystalizował z mieszaniny octan etylu : chlorek metylenu, ot-zyDując 14,9 g czystej substancji.
P-zykład 50
Schemat 4:
Mzto-a B:
Epoksydowanie związku XVIIA przy użyciu kwasu m-obloronz-bąnooesowego
Związek XVIIA (18,0 g) rozpuszczono w 250 d1 chlorku metylenu i ochlo-ooao do temperatury 10°C. P-zy mieszaniu -o-zno stały kwas D-chlorona-benzoesowy (o 50-60% czystości, 21,86 g) w ciągu 15 minut. Niz zauważono po-nizsiznir się temperatury. Mieszaninę -ezacyjnó mieszano przez 3 oo-oeay i sprawdzono nz obecność dienonu. Mieszaninę -zakcyjną traktowano kolejno roztworem siarczynu so-u (10%), zoztworzD wo-ozotlenku sodu (0,5N), -oztwo-zm kwasu cblozowoaozoweoo (5%) i na końcu 50 d1 nasyconego roztworu solanki. Po wysuszeniu nz- bzzwo-nym siarczanem magnezu i odparowaniu otzzyDrno 17,64 g epoksydu użytego bezpośrednio w następnym etapie. Znaleziono, że produkt zzwieza produkt utlenienia Paeye-z-Villigera, któzy musiano usunąć p-zez roztarcie z octanem etylu, a następnie krystalizację z chlorku metylenu. Przy skzli 500 g wytrącony kwas msohlo-obzaeoesogy odsączono, po czym po-dano zwykłej obróbce.
Przykład 51
Schemat 4:
Mzto-a C:
Epoksydowanie związku XVIIA pzzy użyciu trichloroacetZDi-n
Związek XVIIA (2 g) rozpuszczono w 25 d1 chlorku metylenu. Do-zno tricblo-oaoztaDi- (2 g), fosforan dipotzsowy (2 g). Przy mieszaniu w temperztu-ze pokojowej dodano 30% nadtlenzk wodozu (10 d1) i mieszanie kontynuowano pzzez 18 go-zin, uzyskując epoksy(1,63 g). Nie utworzył się pro-ukt PaąyązasVelligerz.
Przykład 52
Wo-orotlenzk potasu (56,39 g; 1005,03 mmolz; 3,00 równoważniki) zała-owzno -o kolby o pojemności 2000 d1 i zzwiąsoono w aiDetylosulfotleakn (750,0 d1) w temperaturze otoczenia. Trienon odpowiadający wzorowi XX (w którym R.3 oznaczz H i kzż-y z sAiAi -B-Bs oznacza -CH2-CH2-) (100,00 g; 335,01 DDola; 1,00 równoważnik) wp-owz-eoao do kolby razzD z THF (956,0 d1). Do kolby -odzno Detylosiarczan tziDetylosulfoniowy (126,14 g; 670,02 mmolz; 2,00 równoważniki) i otrzymaną mieszaninę ogrzewano w tempzratuizz wzzeniz wobec powzotu skroplin, 80s85oC przez 1 go-zinę. Konwersję do 17-spirooasemei tylenu spiaw-zano przez HPLC. Około 1 litra THF o-pę-zono z mieszaniny -eaacyjaej pod zmniejszonym ciśnieniem, po czym dodano wo-ę (460 d1) w ciągu 30 minut, podczas gdy mieszaninę -eaacyjaą chłodzono do temperatury 15°C. Otrzymaną mieszaninę przesączono i produkt, stały oksi-an, p-zzDyto -wa zrzy równymi porcjami 200 d1 wo-y. Zaobserwowano, ze p-o-nat był wysocz krystaliczny i łatwo wykonano filtrację. Następnie produkt suszono
189 459
217 pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C. Wydzielono 104,6 g produktu, 3-metylpeaoloetero-Δ-5,6,9,11-17-okdiranodte2oidu.
Przykład 53
Do suchego reaktora o pojemności 500 ml załadowano ztoksylan ^-υ (41,94 g; 616,25 mmola; 1,90 równoważnika) w atmosferze azotu. Dodano -o reaktora etanol (270,9 ml) i powstała zawiesina ptpkdylaau ^-υ w etanolu. Do zawiesiny ^-α^ malonian Metylowy (103,90 g; 648,68 mmola); 2,00 równoważniki), po czym ^-α^ pkderaapdtzroi- wytworzony, jak opisano w przykładziz 52 (104,60 g; 324,34 mmola; 1,00 równoważnik) i otrzymaną mieszaninę ogrzano -o temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin, to znaczy 80-85°C. Ogrzzwaniz kontynuowano przez 4 godziny, po czym zajście reakcji spraw-0pnp przzz HPLC. Do mezdoaain9 reakcyjnej -pdaao wo-ę (337,86 ml) w ciągu 30 minut, ppdcoαd gdy mieszanina była chło-opna -o temperatury 15°C. Mieszanie kontynuowano przez 30 minut i zawiesinę reakcyjną przesączono, tworząc placek filtracyjny, zawierający drobny bezpostaciowy proszek. Placek filtracyjny przemyto dwa razy wodą (po 200 ml) i następnie dudoono w temperaturze otoczenia pod zmniejszonym ciśnieniem. Wydzielono 133,8 g pośredniej pochodnej 3-mztyloenoletzro^-5,6,9,11,-17-dpirolaktonp-21 -etokdykα2Uoa9lρwej.
Przykład 54
Pośrednią pochodną 3-met9loeaoletero-Δ-5,6,9,lllϊl7tspirotakIono-21-etoksykarbonylową (wzór XVIII, gdzie R3 oznacza H i każdy z -A-A- i -B-B- oznacza -CH2-CH2-) 133,80 g; 313,68 mmola; 1,00 równoważnik, jaką wytworzono w przykładzie 53, oała-pwaap -o reaktora o pojemności 2000 ml razem z chlorkiem .sodu (27,50 g; 470,52 mmola; 1,50 równoważnika), dimetyloformamidem (709 ml) i wodą (5 ml) przy mieszaniu. Otrzymaną mieszaninę pg2oewanp w temperaturze wrzenia wobec powrotu dk2pplia, 138-142°C przez 3 godziny, po czym mezdzaaiaę reakcyjną dprawdopao na całkowite zajście reakcji przzz HPLC. Następnie -o mieszaniny -o-ano wodę w ciągu 30 minut, w tym czasie mieszanina była chłodzona -o 15°C. Mizszaniz kontynuowano przez 30 minut i zawiesinę reakcyjną przesączono, odzyskując produkt reakcji, bezpostaciowe ciało stałe jako placek filtracyjny. Placek filtracyjny przemyto dwa razy (-ówne porcje 200 ml wody), po czym go wysuszono. Produkt, 3-met9lpeaolztero-ϊ7-dpirolaktoa wysudopnp, uzyskując 91,6 g (82,3% wydajności; oznaczono 96% powierzchni).
Przykład 55
Ern^ete- wytworzony zgodnie z przykładem 54 (91,60 g; 258,36 mmola; 1,00 równoważnik), etanol (250 ml), kwas octowy (250 ml) i wodę (250 ml) załadowano do reaktora o pojemności 2θ0θ mml i wytworzoną zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez 2 godziny. Wodę (600 ml) dodano w ciągu 30 minut, ppdcoαd gdy mieszaninę reakcyjną ohłpdzonp do temperatury 15°C. Następnie zawiesinę reakcyjną przesączono i placek filtracyjny przemyto dwa razy wodą (równe porcje* 200 ml). Potem wysuszono placzk filtracyjny; wy-ziplono 84,4 g p-odUktu, 3-keto-Λ-4,5,9,lll-17-spirolaktrrau (związek o wzorze XVII, gdzie r3 oznacza H i -A-A- i -B-B- oznacząją-CHR-CHR-; 95,9% wydajapśoi).
Przykład 56
Związek XVIIA (1 kg; 2,81 mola) załadowano -azem z tetraohlprkeem węgla (3,2 litra) do kolby z czterema szyjami o pojemności 22 lit-ów. Do mieszaniny dodano N-U-omosukcynoamid (538 g), potem acetomtryl (3,2 litra). Otrzymaną mezdzaaeaę og2zαap -o temperatury wrzenia wobec powrotu skroplin i utrzymywano w temperaturze reflzksu 68°C p-zzz około 3 godziny, otrzymując przezroczysty pomarańczowy roztwór. Po 5 godzinach ogrzewania roztwór ściemniał. Po 6 godzinach ogrzewania usunięto źródło ciepła i ppUraap próbki z mieszaniny reakcyjnej. Rozpuszczalnik odpędzono pod zmaeejdzpaym ciśnieniem i do pozostałości na dnie kolby destylacyjnej doaanp octan etylu (6 litrów). Mieszano otrzymaną mieszaninę, po czym ^-α^ 5% roztwór kwaśnego węglanu ίη-υ (4 litry) i całość mieszano p-zez 15 minut, po czym pozostawiono fazy do odstania. Usunięto wodną warstwę i -o mieszaniny wprowadzono nαd9opa9 -oztwór solanki (4 litry), po czym mieszano przez 15 minut. Fazy znów rozdzieloap i warstwę organiczną papędzpnp pod zmnieJdzpn9m ciśnieniem, tworząc gęstą zawiesinę. Następnie dodano dimetyloformamid (4 litry) i kontynuowano pdpęazał nie do temperatury 55°C w -eaktorzz. Pozostałość destylacyjną pozostawiono na noc i dpaanp DABCO (330 g) i b-omek litu (243 g). Potem mieszaninę ogrzewano w temperaturze 70°C.
218
189 459
Po półtorej godziny ogrzewania pobrano próbkę do chromatografii cieczowej i po 3,5 godzinach ogrzewania dodatkowo dodano DaBCO (40 g). Po 4,5 godzinach ogrzewania wprowadzono wodę (4 litry) i otrzymaną mieszaninę ochłodzono do temperatury 15°C. Zawiesinę przesączono, placek przemyto wodą (3 litry) i suszono na filtrze przez noc. Wilgotny placek (978 g) załadowano znów do kolby o pojemności 22 litry i dodano dimetyloformamid (7 litrów). Tak wytworzoną mieszaninę ogrzano do temperatury 105°C, w której placek przeszedł całkowicie do roztworu. Usunięto źródło ciepła i mieszaninę w kolbie mieszano i chłodzono. Wprowadzono lód z wodą do płaszcza reaktora, mieszanina w reaktorze ochłodziła się do temperatury 14°C i utrzymywała przez 2 godziny. Otrzymaną zawiesinę przesączono i przemyto dwa razy równymi porcjami 2,5 litra wody. Placek filtracyjny suszono pod zmniejszonym ciśnieniem przez noc. Otrzymano 510 g jasnpbśązowtgo stałego produktu.
Przykład 57
Do kolby z czterema szyjami o pojemności 2 litry załadowano: 9.11-epokyykanrenon. jaki wyprodukowano w przykładzie 56 (100,00 g; 282,1 mmola; 1,00 równoważnik), dimetyloformamid (650,0 ml), chlorek litu (30,00 g; 707,7 mmola; 2,51 równoważnika) i acetonocyjanohyóśyns (72,04 g; 77,3 ml; 846,4 mmola; 3,00 równoważniki). Otrzymaną zawiesinę mieszano mechanicznie i potraktowano tetrametwloguanidwmą (45,49 g; 49,6 ml; 395,0 mmoli; 1,40 równoważnika). Następnie układ przesączono z chłodnicą chłodzoną wodą i chłodnicą z suchym lodem (napełnioną suchym lodem w acetonie), aby zapobiec ucieczce HCN. Wylot z chłodnicy z suchym lodem przechodził óo skrubera wypełnionego dużym nadmiarem wybielacza chlorowego. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 80°C.
Po 18 godzinach otrzymano ciemmocześwomawolbrązdww roztwór, który dchłodsomd. mieszając, do temperatury pokojowej. Podczas procesu chłodzenia przepuszczano azot przez roztwór, aby usunąć resztkowy HCN przez wylot przechodzący do środka bielącego w skr-uberze. Po 2 godzinach roztwór potraktowano kwasem octowym (72 g) i mieszano przez 30 minut. Surową mieszaninę wlano do lodu z wodą (2 litry) przy mieszaniu. Mieszaną zawiesinę potraktowano óalej 10% wodnym HCl (400 ml) i mieszano przez 1 godzinę. Następnie mieszaninę przesączono, otrzymując citmmoceglastocześwpme ciało stałe (73 g). Przesącz umieszczono w rozdzielaczu o pojemności 4 litrów i ekstrahowano chlorkiem metylenu (3 x 800 ml); połączono warstwy organiczne i znów ekstrahowano wodą (1x2 litry). Roztwór chlorku metylenu zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując 61 g ciemnoczerwonego oleju. Następnie wodne przemywki pozostawiono w spokoju przez noc i wytrącił się wyraźny osad. Osaó odebrano przez filtrację i oznaczono, że to był czysty produkt, enamina (14,8 g).
Po wysuszeniu oryginalne czerwone ciało stałe (73 g) analizowano przez HPLC i ϋϋczono, ze głównym składnikiem była 9,11-epoksyenamma. HPLC wykazała dalej, ze enamina była głównym składnikiem czerwonego oleju otrzymanego z obróbki chlorkiem metylenu. Obliczona wydajność molowa wyniosła 46%.
Przykład 58
9.11-epdksyemamins (4,600 g; 0,11261 mola; 1,00 równoważnik), jaką wytworzono zgodnie z przykładem 57 wprowadzono do okśągłodenmej kolby o pojemności 1000 ml. Do mieszaniny dodano metanol (300 ml) i 0,5% (wagowo) wodny HCl (l92 ml), po czym ogrzewano ją w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez 17 godzin. Następnie metanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, redukując ilość materiału w kolbie destylacyjnej óo 50 ml i powodując tworzenie białego osadu. Do zawiesiny dodano wodę (100 ml), potem przesączono, otrzymując biały placek ciała stałego, który przemyto trzy razy woóą. Wydajność stałego produktu, 9, ll-epoksydiketonu wyniosła 3,747 g (81, 3%).
Przykład 59
EpoksydU^on wytworzony zgodnie z przykładem 58 (200 mg; 0,49 mmola) zawieszono w metanolu (3 ml) i do mieszaniny dodano l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-enu (DBU). Po ogrzewaniu w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin w ciągu 24 godzin mieszanina stała się jednorodna. Zatsżdnd ją potem do sucha w temperaturze 30°C na wyparce obrotowej i pozostałość rozłożono między chlorek metylenu i 3,0 N HCl. Zatężenie fazy organicznej dało żółte ciało stałe (193 mg), które oznaczono jako 22% (wagowo) epoksymeksrtmdm. Wydajność wyniosła 20%.
189 459
219
epler enon
Przykład 60
Do 100 mg diketonu (wytworzonego zgodnie z przykładem 58) zawieszonego w 1,5 ml metanolu dodano 10 mikrolitrów (0,18 równoważnika) 25% (wagowo) roztworu metoksylanu sodu w metanolu. Roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin. Po 30 minutach nie pozostał diketon, a pojawił się 5-cyjanoester. Do mieszaniny dodano 46 mikrolitrów 25% (wagowo) roztworu metoksylanu sodu w metanolu. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu skroplin przez 23 godziny, w tym czasie głównym produktem był epoksymeksrenon jak oznaczono przez HPLC.
220
189 459
Przykład 61
Do 2 g diketonu (wytworzonego zgodnie z przykładem 58) zawieszonego w 30 ml suchego metanolu do-ano 0,34 ml Metyloaminy. Zawiesinę ogrzewano w temperaturze wrzenia wobec powrotu ekroplin przez 4,5 godziny. Mieszaninę mieszano w temperaturze 25°C przez 16 go-zin. Otrzymaną zawiesinę przesączono, uzyskując 1,3 g S-cyjan-estru w postaci białego ciała stałego.
Do 6,6 g diketonu zawieszonego w 80 ml metanolu dodano 2,8 ml Metyloaminy. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrodnią wobec powrotu ekroplin przez 4 godziny i mieszano przy 25 obrotach/minutę przez 88 godzin, w tym czasie produkt krystąlizouąS z roztworu. Filtracja i następne przemycie metanolem dały 5,8 g cyjanoestru w poetaci białego proezku. Substancję rekryetąlizouąao z mieszaniny ohloroform/mdtąnol, otrzymując C,1 g krystalicznego materiału, który był jednorodny przy oznaczeniu przez HPLC.
Rozpatrując powyższe widać, że osiągnięto kilka celów wynalazku i uzyskano korzystne wyniki.
W powyższych kompozycjach i procesach można dokonać różnych zmian bez przekiaczania ram wynalazku, uważa się, że cały materiał zawarty w powyższym opisie i pokazany w towarzyszących rysunkach będzie interpretowany jako objąśaiąjący, a nie ograniczający.
189 459
221
222
189 459
FIG. 2
189 459
223
FIG. 3
224
189 459
FIG. 4 OBJĘTOŚĆ RÓŻNICOWA
OBJĘTOŚĆ % o
<nε □
bbco tn
ty m o ó
§ i-4 O vo 'ϋ •cn O
ty £
ty □
N □
ca
ty ‘n 73
ty a>
+ o
<0 ot
04*
E =L
H £
o <
o z
α m
ca
CU i § ca σ>
ε co 73 U C cl ca c
O £
m
OT ε
=>
o o
2’ °* o v
C •cn
O <n o
% co
N
O •c □
<0 n
0-5 b- «
2^ οι ίου cn o c c 2 ε
N c
£ .2 ΰ ·= cd χ ffl N s g o
CL t f> tn 3 > < 5Ć
OT o
CC o 73 c
<0 •cn O ε □ ca '5
ty o* 5* § <u ε
N o ca 24 τ- ο* 73 c
ty >» W 73 O 73 (U u.
>· ·*»* co .2 c 'O · •cn 24
ty <*>* oo tu 8 *4) CD S ‘5 a? to ć ca T3 (U C □ cn
x> U £ Φ o
O O<n s W
O
O cn cn ro tn tn
CM
A
2»
Wielkość um 339.3 no. 3 82.10 29.95 9.659
189 459
225
FIG. 5 OBJĘTOŚĆ RÓŻNICOWA
V
Si tM ss
Si £
3, (— %
o <
o z
Q
LU θ' </0 r» o
v>
CD in n
o «-<
o
CO
E + □ <u - tn 09
T £
O T- OJ co
V o
•CD
O £
P co o n P O
CO . C o. ra w co .z >.
ω
E r ε •w o O Φ*
S’
O
CO JZ >.
W >· ro oo o
o
OT
O σ
£
O
O c—
O*
O o
co c
Φ
N
O
O >· c
'W o
lz cn
O *
co cr* r04 ot ._ Φ .. C Έ ® Φ θ’ co gsi
OT O >
E E S? □ 3
O N- το' o-' co o CO T•o « *<n co co
N
O p
Cć.
co
JO ra ~V)
CL co m r ot r o
•cn o
c c
Φ
E
N gz 'c >..ćo d ·£= ro ^o. E o O- E ·£ ω 3 s < *
E □
CO V CO
CO co co c
CO
P
Φ
E 'c.
to
Φ
1_ cn
JZ
Φ c
□
Φ* P p cnp' s* ϊ ω O o O<0 o
en tn o
o tn w
Wielkość um 363.2 242.8 116.1 37.60 11.32
226
189 459
FIG. 1
ZAWIESINA
KANRENONU
W WODZIE (NIE JAŁOWY)
ANTYBIOTYKI
KANAMYCYNA,
TETRACYKLINA,
CEFALEKSYNA
ZBIORNIK GLUKOZY DO DOKARMIANIA
BIOREAKTOR
PRODUKCYJNY
2000 L LUB 5300 L
PEPTON
DO ODZYSKANIA PRODUKTU
AUTOLIZAT DROZDZOWY GLUKOZA
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł

Claims (9)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania A-4,5-steroidu podstawionago n-keto-7a-alkoksykarbonylem, znamienny tym, ze obejmuje reakcję odczynnika alkilującego z substratem e,5-dihydro-5,0-laktonosteroidu, w obecności zasady, przy czym wymieniony substrat laktenewy podstawiony jest grupą keto lub dialkoksy przy atomie węgla 3 i dodatkowo obejmuje ugrupowanie:
    \l 1/
    C(5)^ę(7) gdzie C(5) reprezentuje atom węgla 5 i C(0) reprezentuje atom węgla 0 struktury steroidowej substratu.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze wymieniony substrat steroidowy obejmuje nasyconą lub nienasyconą strukturę jądrową, zawierającą: ugrupowanie 9,11-epoksydowe lub jego prekursor oraz podstawnik przy atomie węgla 10 wybrany z grupy składającej się ze spirolaktonu, grupy ketonowej lub innego prekursora wobec spirolaktonu.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że wymieniony substrat steroidowy i wymieniony produkt steroidowy są podstawione w pozycji 1θ podstawnikiem spirolaktonowym, odpowiadającym wzorowi XXXIII
    O lilii
    XXXIII
    e. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze substrat steroidowy i produkt steroidowy są podstawione w pozycji 10 podstawnikiem keto.
    5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymieniony substrat laktonowy obejmuje podstawniki 3-dialkoksy.
    6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze wymieniony 5,0-lakton reaguje z halogenkiem alkilu w obecności zasady.
    0. Sposób wytwarzania związku e,5sdihydros5,0slaktonosteroidowego, w którym wymieniony laktonosteroid podstawiony jest grupą keto lub dialkoksy przy atomie węgla 3 i obejmuje ugrupowanie \! !/
    C(5)^ę(7) ó— o
    gdzie C(5) reprezentuje atom węgla 5 i C(0) reprezentuje atom węgla 0 struktury steroidu substratu, znamienny tym, ze obejmuje przekształcenie steroidu podstawionego grupą cyjano
    189 459 w pozycji 7 w odpowiedni kwas 7-karboksylowy i potem przekształcenie kwasu 7-karboksylowego w odpowiedni 5,7-lakton.
    8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, ze steroid podstawiony w pozycji 7 kwasem karboksylowym obejmuje steroid 3-keto-A-4,5-7-karboksylowy i tworzy się pośredni ketal, obejmujący 3-dialkoksy-5,7-łakton, przy czym wymieniony 3-dialkoksy-5,7-lakton ulega hydrolizie w warunkach kwasowych, tworząc 3-keto-5,7-lakton.
    9. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi II:
    R reprezentuje alfa-zorientowaną niższą grupę alkoksykarbonylową lub grupę hydroksykarbonylową, R3, R4 i R5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch— iii
    6 7 w której R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz R8 i R9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy albo R8 i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i R9 razem z r6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, znamienny tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wzorze El przez hydrolizę, po czym reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze E1 ma strukturę:
    EI w której -A-A-, R3, R8, R9 * * i -B-B- są takie jak określono powyżej i R17 oznacza grupę C1 do C4 alkilową
    189 459
    10. Sposób według zd^ł^tr/.. 9, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    11. bpoedb uedług ztetrz. 10, znamienny tym, że ktzdy z R4, r5, R- i R- ozntozt ttom uodoru.
    12. bpoedb uytutrztnit związku, odpowiadającego uzoroui IIC:
    IIC u którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R1 reprezentuje alfa-zorientouaną nizezą grupę alkokeykarbonylouą lub grupę hydrokeykarbonylową, RC r4 i R5 wybiera eię niezaleznie z grupy składającej eię z atomu uodoru, fluorouoa, grupy hydrokey, nizezej alkilowej, nizezej alkokey, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, oyjano i arylokey, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β-zorientowaną grupę:
    R' —CH-CH2-CH—
    III w której R6 i R7 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładająoej eię z atomu wodoru, fluorowoa, nizezej alkokey, aoylowej, hydrokyetlkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, alkilowej, tlkokeyktrbonylowej, aoylokeyalkilowej, oyjano i arylokey, znamienny tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wzorze E przez hydrolizę, po czym reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zaeady, przy czym związek o wzorze E ma etrukturę:
    7 i γ w której -A-A-, Rc jeet taki jak określono powyżej i R oznacza grupę Ci do C4 alkilową.
    189 459
    13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że każdy z R4, R5, R6 i R7 oznacza atom wodoru.
    15. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi E:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R3, R4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, R1 7 oznacza grupę Ci do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    Rc —ch-ch2-ch— iii w której R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, znamienny tym, ze obejmuje termiczny rozkład związku, odpowiadającego wzorowi DE2 w obecności halogenku metalu alkalicznego, przy czym wymieniony związek DE2 ma strukturę:
    co2r12
    DE2
    19 117 w której R oznacza grupę Ci do C4 alkilową i -A-A-, -B-B-, R i R są takie jak określono poniżej.
    189 459
    16 Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, ze każdy z R4, R5, r6 i R7 oznacza atom wodoru.
    18. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi DE2:
    co2r12
    DE2 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, Rn i Rn wybiera się spośród grupy C1 do C4 alkilowej, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III • 6 7 w której R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, znamienny tym, że obejmuje kondensację związku o wzorze DE1 z malonianem dialkilu w obecności zasady, przy czym związek o wzorze DE1 ma strukturę:
    DE1 w której -A-A-, -B-B-, R3 i Rn są takie jak określono powyżej.
    189 459
    19 Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, ze każdy z R4, R5, r6 i R7 oznacza atom wodoru
    21. Sposób wytwarzania związku o wzorze odpowiadającym wzorowi DE1:
    DE1 w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R3, r4 i R5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, r17 oznacza grupę C1 do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    Rc
    R' —CH-CH2CH—
    III • 6 7 w której R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, znamienny tym, ze obejmuje reakcję związku o wzorze D z ylidem sulfoniowym w obecności zasady, przy czym wymieniony związek D ma strukturę:
    w której -A-A-, -B-B-, R3 i Rn są takie jak określono powyżej.
    189 459
    22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, ze R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, R6 i r7 oznacza atom wodoru.
    24. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi D:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, R17 oznacza grupę Ci do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch— iii w której R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, znamienny tym, ze obejmuje hydrolizę związku o wzorze C w kwas 7 α-karboksylowy i reakcję w warunkach kwasowych z ortomrówczanem trialkilu, przy czym związek C ma strukturę:
    w której -A-A-, -B-B-, r3 są takie jak określono powyżej.
    25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
    189 459
    27. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi I:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, R'7 oznacza grupę Ci do C4 alkilową, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch— iii
    Z -Ί w której R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej. acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R80 i R9ff wybiera się niezaleznie spośród R8 i R9 odpowiednio; lub Ιν i r90 tworzą razem grupę keto oraz R8 i R9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodom, grupy hydroksy, fluorowca. nizszej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z r6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, znamienny tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wzorze A211 przez reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze A211 ma strukturę:
    [A211]
    1 2Π Qfi w której -A-A-, -B-B-, R , R , R i są takie jak określono powyżej.
    189 459
    28 Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, ze r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, R6 i r7 oznacza atom wodoru;.
    30. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi IE:
    IE w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR.5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, R26 oznacza grupę Ci do C4 alkilową i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III gdzie R6 i r7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, znamienny tym, ze obejmuje alkilowanie związku o wzorze 211 przez reakcję z odczynnikiem alkilującym w obecności zasady, przy czym związek o wzorze 211 ma strukturę:
    w której -A-A-, -B-B- i R3 są takie jak określono powyżej.
    189 459
    31. Sposób według zastrz. 30, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że każdy z R4, R5, R6 i r7 oznacza atom wodoru.
    33. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi A211:
    [A211] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    Rc —ch-ch2-ch—
    III
    6 7 gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz R80 i R90 wybiera się niezaleznie spośród R8 i R9 odpowiednio lub Rgo i r90 tworzą razem grupę keto; oraz R8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo r8 i r9 razem z r6 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, znamienny tym, ze obejmuje utlenianie związku o wzorze A210, przy czym związek o wzorze A210 ma strukturę:
    [A210] w której -A-A-, -B-B-, R3, r80 i r90 są takie jak określono powyżej.
    189 459 ο
    34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, ze R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    35. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
    36. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, ze R80 i R90 łącznie z C(17) obejmują
    Y1 ^2 /C(17).....(CH2)2-Ć=X gdzie X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S, Y1 i Y2 jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- lub =S; albo Yl reprezentuje grupę hydroksy i Y2 reprezentuje grupę hydroksy, niższą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje E2, także niższą alkanoiloksy.
    37. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, ze R80 i R90 łącznie z C(17) obejmują
    38 Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi:
    [A211] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i R wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    Rc
    R' —ch-ch2-ch—
    III gdzie R6 i r7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy; oraz R8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy
    189 459 alkokey, acylowej, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonyloalkilowej, alkokeykarbonyloalkilowej, acylokeyalkilouej. cyjano i arylokey, albo R8 i R9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową, albo r8 i r9 razem z R6 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, znamienny t,m, ze obejmuje reakcję C-keto-Ś^-hemiacetalowego związku pośredniego o wzorze A209C z nadtlenkowym odczynnikiem utleniającym, przy czym wymieniony związek o wzorze A209C odpowiada wzorowi:
    [A209C] w którym -A-A-, -B-B-, R\ r8 i r9 eą takie jak określono powyżej.
    C9. bpoeób według zaetrz. C8 znamienny tym, ze R- i R- łącznie z C(17) obejmują
    Y1\ Ϊ2 /^17).....(CH2)2-C=X gdzie X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okeo lub =b, γ1 i Y2 jednocześnie reprezentują moetek tlenowy -O- lub =b, albo γ1 reprezentuje grupę hydrokey i γ2 reprezentuje grupę hydrokey. nizezą alkokey lub, jeśli X reprezentuje H2, także nizezą alkanoiloksy.
    40. bpoeób według zaetrz. C9 znamienny tym, ze r8 i r9 łącznie z C(17) obejmują o
    41. bpoeób według zaetrz. C8, znamienny tym, że R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    42. bpoeób według zaetrz. 41, znamienny tym, ze każdy z r4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
  4. 4C. bpoeób wytwarzania związku odpowiadającego wzorowi:
    [A210] w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR
  5. 5- lub -CR4=CR5-, rC, r4 i R wybiera eię z grupy obejmującej atom wodoru, fluorowca, grupę hydrokey, nizezą alkilową, nizezą alkok14
    189 459 sy, hydroksyalkilową, alkoksyalkilową, hydreksykarbonylową, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR-CHR0 lub k-albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III
  6. 6 7 · · gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkeksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilo/90 wej, alkoksykarbonylowej. acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz R80 i Ryu wybiera się niezależnie spośród R8 i R9 odpowiednio, lub R™ i R9o tworzą razem grupę keto; oraz R8 i R9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca. nizszej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloali R9 kilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R' obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R™ i r9 razem z R i R0 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D, znamienny tym, że obejmuje reakcję pośredniego 3sketOs5,0-hes miacetalu o wzorze A209 z nadtlenkowym odczynnikiem utleniającym, przy czym wymieniony związek o wzorze A209C odpowiada wzorowi:
    razem 6 [A209C]
    3 8 9 w którym -A-A-, -B-B-, R , R i R są takie jak określono powyżej.
    ee. Sposób według zastrz. e3 znamienny tym, ze Rt i Rt łącznie z C(10) obejmują
    Y1 Ϊ2 /C(17).....(CH2)2-C=X gdzie X reprezentuje dwa atomy wodoru, grupę okso lub =S, Y i Y jednocześnie reprezentują mostek tlenowy -O- lub =S, albo Y1 reprezentuje grupę hydroksy i Y2 reprezentuje grupę hydroksy, nizszą alkoksy lub, jeśli X reprezentuje H2, także niższą alkanoiloksy.
    45. Sposób według zastrz. ee znamienny tym, ze R™ i r9 łącznie z C(10) obejmują
    O □
    e6. Sposób według zastrz. e3, znamienny tym, ze R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHRe-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę sCHR6sCHR0-.
    e0. Sposób według zastrz. e6, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, R6 i R0 oznacza atom wodoru.
    189 459
    48. Sposób wytwarzania związku odpowiadającego wzorowi [A209]:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub a- albo zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch— iii gdzie R6 i r7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej. hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej. acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz r8° i r9° wybiera sie niezaleznie spośród R8 i R9 odpowiednio, lub RS i r9° tworzą razem grupę keto oraz R8 i r9 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z r6 i R7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D i -E-E- wybiera się spośród:
    R· >
    ,21 322
    -c—
    R23
    XLIII
    XLIV
    R· >
    OR'
    I
    -C
    XLV
    OR >24R21
    XLVI
    -CR
    XLVII
    189 459 gdzie R21, r22 i r23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R wybiera się spośród atomu wodoru i niższej grupy alkilowej; znamienny tym, ze obejmuje hydrolizę związku, odpowiadającego wzorowi A208 w którym -A-A-, -B-B-, -E-E-, R3 . R<80 i r0° sątkkiejkk okrellono powyżej , R19 oznccza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy r19O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy; i R20 oznacza grupę C1-C4 alkilową.
    49. Sposób według zastrz. 48, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru
    51 Sposób weóług zasttz. 48, znamienny tym, ze R3 omacza atom wodory -Λ-Aa reprezentuje grupę -CHr9-CHr5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 R22
    XLIII
    ĆR21XLVII
    52 Sposób wytwarzania związku o wzorze [A205]:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej
    189 459 alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-Breprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III
    6 7 gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, r19 oznacza grupę C do C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy i R20 oznacza grupę C1-C4 alkilową oraz przy czym -E-E- wybiera się spośród’
    R21 R22 xc—c/ p23
    XLIII
    R21
    XLIV
    R21 OR' \l 1
    C-c— / l 09
    R22
    XLV
    OR24 R21
    -c—
    R22
    XLVI
    V—CR24/ XLVII
    71 77 71 gdzie R ,R iR wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera si ę spośró d atom u wodoru i nizszej gruyy alkilowej, znamienny tym, ze obejmuje reakcję związku, odpowiadającego wzorowi A204 z nizszym alkoholem i kwasem, przy czym wymieniony związek o wzorze A204 ma strukturę:
    189 459 η
    53. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, ze R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    54. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
    55. Sposób według zastrz. 52, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHr4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 R22 i
    -cR:
    XLIII ;CR21XLVII
    56. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi [A204]:
    odpowiednio z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —CH-CH2CH—
    III gdzie R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, R*9 oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R19O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, przy czym -E-E- wybiera się spośród:
    R‘
    R22 i
    -c—
    R23
    XLIII
    189 459
    R'
    XLIV
    R21 OR24 \l i .C—C— Z R22 K XLV
    OR24 R21
    A22
    XLVI
    -tR21XLVII
    21 22 · 23 · · · gdzie R ,R iR wybiera eię niezaleznie epośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i r24 wybiera eię epośród atomu wodoru i nizezej grupy alkilowej, znamienny tym, ze obejmuje hydrolizę związku, odpowiadającego wzorowi A20C, przy czym wymieniony związek o wzorze A20C ma etrukturę:
    w której -A-A-, -B-B-, -E-E-, RC eą takie jak określono powyżej, Ru oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem moetek OU-okeyalkilenowy.
    57. bpoeób według zaetrz. 56, znamienny tym, ze RC oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    58. bpoeób według zaetrz. 57, znamienny tym, że każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
    59. bpoeób według zaetrz. 56, znamienny tym, ze R oznaczą atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, R5, r6 i r7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera eię epośród:
    R21
    XLIII
    CR
    XLVII i
    189 459
    60. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi o wzorze [A204]:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR.4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i R5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —CH-CH2-CH—
    III gdzie R6 i r7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, R19 oznacza grupę C1 do C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, przy czym -E-E- wybiera się spośród:
    R' >
    322
    R·
    XLIII
    XLIV
    OR‘ i
    -C —
    XLV
    OR24
    R21 i
    XLVI p
    V—CR21/ XLVII
    R21, R22 i r23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej, grupy alkilowej,
    189 459 znamienny tym, ze obejmuje zabezpieczenie podstawników keto związku, odpowiadającego wzorowi A201 przez reakcje alkanolu w warunkach kwasowych w obecności ortomrówczanu. przy czym wymieniony związek o wzorze A201, ma strukturę:
    w której -A-A-, -E-E- i r3 są takie jak określono powyżej, wytwarzając przez pośredni
    3-enoloeter, odpowiadający wzorowi A202:
    w którym -A-A-, -E-E- i R3 są takie jak określono powyżej i R18 oznacza grupę Ci do
    C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy oraz redukcję związku o wzorze A202, z utworzeniem związku odpowiadającego wzorowi A203:
    w którym -A-A-, -B-B-, -E-E-, R3 i Ri są takie jak określono powyżej i hydrolizę wymienionego związku, odpowiadającego wzorowi A203 wytwarzając wymieniony związek o wzorze A204.
    61. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, ze R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
    63. Sposób według zastrz. 60, znamienny tym, ze R oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHr4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    .21
    R22 i
    -Οι
    R'
    XLIII
    O 'CR
    XLVII
    189 459
    64. Sposób wytwarzania związku, odpowiadającego wzorowi [A203]:
    w którym -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hyaroksyalkilowejj 4lkoksyalkilowej, hyarokeyk4rbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo e-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III
    6 7 gdzie R i R wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyarokyealkilowej, 4lkokeyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkokeyk4rbonylowej, acylokeyalkilowee, cyjano i aryloksy, przy czym -E-E- wybiera się spośród:
    R21 r22 cZ R23
    XLIII
    R21
    XLIV
    OR
    I
    -CR22
    XLV
    OR24
    XLVI
    Ω
    V—CR21' XLVII gdzie R10 oznacza grupę C1 do C 4 alkilową lub grupy R18O- w pozycji C-17 tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, R21, R22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru,
    189 459 grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej, znamienny tym, ze obejmuje redukcję związku o wzorze A202:
    [A202] w którym -A-A-, -B-B-, -E-E-, r3 i R18 są takie jak określono powyżej.
    65. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-.
    66. Sposób według zastrz. 65, znamienny tym, ze każdy z R4, r5, r6 i r7 oznacza atom wodoru.
    67. Sposób według zastrz. 64, znamienny tym, ze r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHr4-CHR5- i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    R21
    XLIII /Ć-ĆR21XLVII
    68. Związek odpowiadający wzorowi D:
    znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, R1 7 oznacza nizszą grupę C1 do C4 alkilową i -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III
    189 459 gdzie R6 i R0 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilewej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy.
    69. Związek odpowiadający wzorowi E:
    znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub sCRe=CR5-, r\ r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, Rn oznacza nizszą grupę C1 do Ce alkilową i -B-B- reprezentuje grupę -Chr6-CHR0 lub k- albo P-zorientowaną grupę:
    R*
    R' —ch-ch2-ch—
    III • 6*7 . · · · gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilewej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy.
    00. Związek odpowiadający wzorowi F:
    znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niz189 459 szej alkilowej, nizszej alkoksy, hydrdksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —CH-CH2
    III • 6 · 7 gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy·'.
    71. Związek odpowiadający wzorowi A211:
    [A211] znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, R3, R4 i R5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca. grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydrdksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej. cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7, lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —CH-CH2-CH—
    III z 7 gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hyórokysalkilowej, alkokswalkilowej, hyórokswkarbonwlpwej. alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy, oraz R80 i r9° wybiera się niezaleznie spośród R8 i r9 odpowiednio, lub R8° i r9° tworzą razem grupę keto; oraz R8 i 19i wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, grupy hydroksy, fluorowca, nizszej grupy alkoksy, acylowej, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hyóroksykarbpnyloalkilowej, alkoksykarbonyloalkilowej, acyloksyalkilowej. cyjano i aryloksy, albo r8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową, albo R8 i R9 razem z R6 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.
    72. Związek odpowiadający wzorowi A210:
    [A210]
    189 459 znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, RC, r4 i r5 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydrokey, nizezej alkilowej, nizezej alkokey, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, cyjano i arylokey, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    R' —ch-ch2-ch—
    III gdzie R6 i R7 wybiera eię niezależnie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorouca, nizezej alkokey, acylowej, hydrokyealkilouej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, alkilowej, tlkokeykarbonylouej. acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey; oraz R80 i r9° wybiera eię niezaleznie epośród r8 i R9 odpowiednio; lub r8° i r9° tworzą razem grupę keto; oraz R8 i r9 wybiera eię niezależnie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, grupy hydrokey, fluorowct, nizezej grupy alkokey, arylowej, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonyloalkilowej, alkokeykarbonyloalkilowej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey, albo R8 i r9 razem obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową, albo R8 i r9 razem z R6 i r7 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D.
  7. 7C. Związek odpowiadający uzoroui A209:
    [A209] znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5- - R3 - R - R wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorowct, grupy hydrokey, niżezej alkilowej, nizezej alkokey, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, cyjano i arylokey, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α-albo β- zorientowaną grupę:
    R6s —ch-ch2-ch—
    III gdzie R6 i r7 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorowca. nizezej alkokey, acylowej, hydrokyealkilowej. alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, alkilowej, alkokeykarbonylowej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey. oraz R
  8. 8° i r9° wybiera eię niezaleznie epośród R8 i r9 odpowiednio, lub r8° i R9° tworzą razem grupę keto, oraz R8 i Rwybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, grupy hydrokey, fluorowca nizezej grupy alkokey. arylowej, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonγlotlki lowej, tlkokeykarbonyloalkllouej, acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey, albo R8 · ° —— i R9 razem 6 obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną etrukturę pierścieniową, albo R8 i R9 razem z R
    189 459 • 7 · · · i R obejmują karbocykliczną lub heterocykliczną strukturę pierścieniową połączoną z pentacyklicznym pierścieniem D i -E-E- wybiera się spośród:
    R'
    R21 c—
    XLIII
    R21
    XLIV
    21 qr24
    XLV
    OR24 ,21
    XLVI —bR21XLVII
    21 22 23 gdzie R, R i R wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i r24 wybiera się spośród atomu wodoru i niższej grupy alkilowej.
    74. Związek według zastrz. 73, znamienny tym, ze r3 oznacza atom wodoru, -A-Areprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
    ĆR21XLVII
    R21
    XLIV gdzie R oznacza atom wodoru.
    189 459
    75. Związek według zastrz. 73, znamienny tym, ze r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    21 R22 i
    CR'
    XLIII
    -ĆR21XLVII
    76. Związek odpowiadający wzorowi A208:
    A208 znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i R5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch— iii gdzie R6 i R7 wybiera się niezależnie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, niższej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz R2° oznacza grupę C1-C4 alkilową i -E-E- wybiera się spośród:
    R21
    R22
    XLIII
    189 459
    XLIV
    R21 OR24 \l l .C-C—
    Z l „
    R22
    XLV
    OR24 R21
    XLVI —CR21' XLVII gdzie R'9 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, Rn, R27 i R23 wybiera się niezależnie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
    77. Związek według zastrz. 7(t. znamitn^i^y tym, ze R3 oznacza atom wodoiw, -a-Α- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- repreoentujz grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
    Ω
    ĆR21XLVII
    XLIV
  9. 9 1 gdzie R oznacza atom wodoru.
    78. Związek e,astrz. 7(j, zηπιπίεπ^·' tym. że r3 oenac oa ntom wodorUo -Α-a - reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, r5, R6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    >22
    XLIII
    ĆR2123 i
    XLVII
    189 459
    79. Związek odpowiadający wzorowi A207:
    CO2R25 [A207] znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, RC, r4 i r5 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorouoa, grupy hydrokey, nizezej alkilowej, nizezej alkokeyl, hydrokeyalkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylowej, cyjano i arylokey, -B-B- reprezentuje grupę -CHR-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch—
    III gdzie r6 i R7 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu wodoru, fluorowca, nizezej alkokey, acylowej, hydrokyealkilowej, alkokeyalkilowej, hydrokeykarbonylouej, alkilowej, alkokeykarbonylowej. acylokeyalkilowej, cyjano i arylokey oraz R?° oznacza grupę C1-C4 alkilową i -E-E- wybiera eię epośród:
    R‘ >
    R
    I
    -C— r?23
    K XLIII
    R21 _ i
    -C—
    XLIV
    OR' i
    C—
    R22
    XLV
    OR24 R21 \l 1
    Y—c—
    R22 K XLVI
    -ĆR21XLVII
    189 459 gdzie R’9 oznacza grupętCj-Ce alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, R?! r22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R2e wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
    80. Związew wedłuw zasurz . 79s zn7m ienny tym, ze R3 ozna3za atom wodorm -Λ-At reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -ΟΒ-ΟΒ- i -E-E- wybiera się spośród
    O
    CR21XLVII
    R21
    XLIV • 21 gaeiz R oznacza atom wodoru.
    81. Związew weZłun zasSk. ast, zn7m iennm tyin ze m, ze na3za iitona wodory -A-A - ap-ezznauje grupę -CHR4sCHR5-, -B-B- -epreoenauje grupę -CHR6-CHR0-, każdy z r4, R5, r6 i R0 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 R22 ćZ R23
    ILIII tR21ILVII
    82. Związek odpowiadający wzorowi A206:
    [A206] znamienny tym, że -A-A- reprezentuje grupę sCHR4sCHR5- lub -CR4-CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się meealeoaie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niz32
    189 459 szej alkilowej, niższej alkoksy, hyarokeyalkilowej, 4lkoksyalkilowee, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR -CHR7 lub α-albo β-z.orientowanągrupę:
    —ch-ch2-ch— iii gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyarokye4lkilowee, 4lkokeyalkilowee, hyarokeyk4rbonylowej, alkilowej, alkokeykarbonylowee, 4cylokeyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz r2° oznaczą grupę C1-C4 alkilową i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 R22
    623 κ XLIII /C—G7 XLIV »21
    R^1 OR \l 1 V-c— Z R22 κ XLV
    OR24 R21 \l I /C—cp22 * XLVI
    -CR
    XLVII gdzie RH oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R19O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, r21, r22 i a?c wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
    83. Związek według zastrz. 82, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
    189 459
    CR21XLVII
    XLIV gdzie R21 oznacza atom wodoru.
    84. Związek według zastrz. 82, znamienny tym, ze R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, R5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 r22
    XLIII /Ć—ĆR21' XLVII
    85. Związek odpowiadający wzorowi A205:
    [A205] znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i r5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, niższej alkilowej, niższej alkoksy, hydroksyalkilowej. alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    —CH-CH2
    III gdzie R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hyórokysalkilowej, alkokswalkiίowej. hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy oraz R?° wybiera się spośród grupy C1-C4 alkilowej i -E-E- wybiera się spośród:
    189 459
    R21 r22 \i I zc~?
    R·
    XLIII ,21
    XLIV
    R21 OR24 \l l .C-C — / +,22
    XLV
    OR24 R21
    -c— +>22
    XLVI
    -CR21XLVII gdzie r!9 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R^O- tworzą razem mostek O,O-oksyalkilenowy, R21, R27 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R.24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
    86. Związew wzdłuw zastrz. 85, znamienny tym, ze R3 zznRcoa atom wodom, -A-Ai reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
    O
    CR' ,21.
    XLVII
    R21
    XLIV gdzie R oznacza atom wodoru.
    87. Związek wzekuw zastrz. 8s>, zimmϊοη^- tymy że r3 οζι^ za ntom wodoru, -A-Ai reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, r5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 R22 XC—CZ R23
    -CR21XLIII
    XLVII
    189 459
    88. Związek odpowiadający wzorowi A204:
    [A204] znamienny tym, ze -A-A- reprezentuje grupę -CHR.4-CHR5- lub -CR4=CR5-, r3, r4 i R5 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, grupy hydroksy, nizszej alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub α- albo β-zorientowaną grupę:
    R° —ch-ch2-ch—
    III gdzie R i R wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy i -E-E- wybiera się spośród:
    R21 R22
    V.
    zc i
    -C,23
    XLIII
    R21 . i c—
    XLIV
    R21 OR24
    C zc i
    XLV
    OR24 R21 r22 * XLVI
    CR21i
    XLVII
    189 459 gdzie R19 oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R19O- tworzą razem moetek O,O-okeytlkilenogy, R2i, R22 i R23 wybiera eię niezależnie epośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorouca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera eię epośród atomu wodoru i niżezej grupy alkilowej.
    89. Związek wzdh-w eastg . ae, znamiennm tym, ze m3 oenacza atom wodom, -Λ-a- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera eię epośród
    O
    CR21XLVII
    XLIV gdzie R oznacza atom uoaoru.
    90. Związek iązeb-w dastrz. a8, z.na8nienny tym, że m3 oenacza ntom wodoru, -α-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z R4, R5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera eię epośród:
    R21 R22 »23
    XLIII fcR21XLVII
    91. Związek odpowiada japy wzorowi 203:
    [20C] znamienny tym, że -A-A- reprezentuje grupę -CHR4 -CHR5 - lub -CR4=CR5-, rC, r4 i R5 wybiera eię niezaleznie z grupy ekładającej eię z atomu uoaoru, fluorouca, grupy hydrokey, nizezej
    189 459 alkilowej, nizszej alkoksy, hydroksyalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, cyjano i aryloksy, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7 lub a- albo β-zorientowaną grupę:
    —ch-ch2-ch— iii gdzie R6 i R7 wybiera się niezaleznie z grupy składającej się z atomu wodoru, fluorowca, nizszej alkoksy, acylowej, hydrokysalkilowej, alkoksyalkilowej, hydroksykarbonylowej, alkilowej, alkoksykarbonylowej, acyloksyalkilowej, cyjano i aryloksy i -E-E- wybiera się spośród:
    R21
    R22 i
    XLIII
    R21
    R21 OR' xc—cZ R22
    XLIV ,24
    XLV
    OR24 R21 >
    I
    -CR:
    XLVI
    V—CR21/ XLVII
    18 18 gdzie R oznacza grupę C1-C4 alkilową lub grupy R O- przy C-17 tworzą razem mostek Ο,Ο-oksyalkilenowy, R , R22 i R23 wybiera się niezaleznie spośród atomu wodoru, grupy alkilowej, fluorowca, grupy nitrowej i cyjano i R24 wybiera się spośród atomu wodoru i nizszej grupy alkilowej.
    92. Związek według zastrz. 91, znamienny tym, że R3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CH2-CH2-, -B-B- reprezentuje grupę -CH2-CH2- i -E-E- wybiera się spośród
    O
    -CR21-
    XLIV
    9 ł gdzie R oznacza atom wodoru.
    189 459
    93. Związek według zastrz. 91, znamienny tym, ze r3 oznacza atom wodoru, -A-A- reprezentuje grupę -CHR4-CHR5-, -B-B- reprezentuje grupę -CHR6-CHR7-, każdy z r4, R5, r6 i R7 oznacza atom wodoru i -E-E- wybiera się spośród:
    XLIII feR21XLVII
PL97334084A 1996-12-11 1997-12-11 Sposób wytwarzania delta-4,5-steroidu podstawionego 3-keto-7 alfa-alkoksykarbonylem oraz związki pośrednie i sposoby ich wytwarzania PL189459B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3331596P 1996-12-11 1996-12-11
US4938897P 1997-06-11 1997-06-11
PCT/US1997/023090 WO1998025948A2 (en) 1996-12-11 1997-12-11 Processes for preparation of 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL334084A1 PL334084A1 (en) 2000-01-31
PL189459B1 true PL189459B1 (pl) 2005-08-31

Family

ID=26709541

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97334084A PL189459B1 (pl) 1996-12-11 1997-12-11 Sposób wytwarzania delta-4,5-steroidu podstawionego 3-keto-7 alfa-alkoksykarbonylem oraz związki pośrednie i sposoby ich wytwarzania

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6610844B2 (pl)
EP (1) EP0944644B1 (pl)
JP (1) JP2001509792A (pl)
KR (1) KR100523409B1 (pl)
CN (1) CN100369927C (pl)
AT (2) ATE375992T1 (pl)
AU (1) AU733559B2 (pl)
BR (1) BR9714510A (pl)
CA (1) CA2273343C (pl)
DE (2) DE69716116T2 (pl)
DK (1) DK0944644T3 (pl)
ES (2) ES2186017T3 (pl)
HK (1) HK1043370B (pl)
IL (1) IL130182A0 (pl)
NO (1) NO314149B1 (pl)
NZ (1) NZ336004A (pl)
PL (1) PL189459B1 (pl)
PT (1) PT944644E (pl)
RO (1) RO120710B1 (pl)
RU (1) RU2005121439A (pl)
WO (1) WO1998025948A2 (pl)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA74141C2 (uk) 1998-12-09 2005-11-15 Дж.Д. Сірл Енд Ко. Фармацевтична композиція на основі тонкоподрібненого еплеренону (варіанти), спосіб її одержання та спосіб лікування розладів, опосередкованих альдостероном (варіанти)
EP1505072A3 (en) * 1999-12-08 2006-06-21 Pharmacia Corporation Eplerenone crystalline form exhiniting enhanced dissolution rate
EA008449B1 (ru) * 1999-12-08 2007-06-29 Фармация Корпорейшн Кристаллическая форма эплеренона
EP1580193A3 (en) * 1999-12-08 2010-06-23 Pharmacia Corporation Eplerenone crystalline form
NZ513961A (en) * 1999-12-08 2004-02-27 Pharmacia Corp Eplerenone crystalline form exhibiting enhanced dissolution rate
US6716829B2 (en) 2000-07-27 2004-04-06 Pharmacia Corporation Aldosterone antagonist and cyclooxygenase-2 inhibitor combination therapy to prevent or treat inflammation-related cardiovascular disorders
ES2251505T3 (es) * 2000-08-28 2006-05-01 Pharmacia Corporation Uso de un antagonista del receptor de aldosterona para mejorar la funcion cognoscitiva.
IL155529A0 (en) 2000-10-30 2003-11-23 Pharmacia Corp Aspergillus ochraceus 11 alpha hydroxylase and oxidoreductase
CA2474072A1 (en) * 2002-03-22 2003-10-09 Pharmacia & Upjohn Company Process to prepare eplerenone
US7235655B2 (en) 2002-03-22 2007-06-26 Pharmacia & Upjohn Company Processes to prepare eplerenone
BR0316049A (pt) 2002-11-06 2005-09-13 Pharmacia & Upjohn Co Llc Processos de preparação de esteróides 7-carbóxi substituìdos
CN1694896A (zh) * 2002-11-07 2005-11-09 法马西亚和厄普乔恩公司 制备c－7取代的5－雄甾烯的方法
CL2004000574A1 (es) * 2003-03-21 2005-02-11 Pharmacia Corp Sa Organizada B Proceso para preparar un compuesto 17-espirolactona o la sal de lactona abierta por carbonilacion del correspondiente 17-alquenil o alquinil derivado, los intermediarios que se usan y su proceso de obtencion.
WO2005000869A1 (en) 2003-05-29 2005-01-06 Washington University Neuroactive 13,24-cyclo-18,21-dinorcholanes and structurally-related pentacyclic steroids
CN1934126A (zh) * 2004-03-22 2007-03-21 法玛西雅厄普约翰有限责任公司 9,11环氧甾族化合物的改进制备方法
JP4637178B2 (ja) * 2004-09-21 2011-02-23 ヴィヴェス，ホアン イグレシアス 赤外線を用いた粉末材料の造粒及び／又は乾燥方法及び装置
CA2525205C (en) * 2004-11-08 2013-06-25 Ecolab Inc. Foam cleaning and brightening composition, and methods
HUP0402466A2 (en) * 2004-11-30 2006-07-28 Richter Gedeon Vegyeszet Industrial process for preparing 17-hydroxy-6-betha, 7-betha, 15-betha, 16-betha-bis-methylene-3-oxo-17-alpha-pregn-4-ene-21-carboxylic acid gamma lacton and the main, intermediates of the process
CN1321128C (zh) * 2005-07-15 2007-06-13 浙江医药股份有限公司新昌制药厂 孕甾－4－烯－7，21－二甲酸，9，11－环氧－17－羟基－3－氧代，γ－内酯，甲酯，(7α,11α,17α)－的制备方法
WO2010068500A2 (en) * 2008-11-25 2010-06-17 Evestra, Inc. PROGESTATIONAL 3-(6,6-ETHYLENE-17b-HYDROXY-3-OXO-17a-PREGNA-4-ENE-17a -YL) PROPIONIC ACID g-LACTONES
US8957052B2 (en) 2010-05-10 2015-02-17 Universite Paris Descartes Methods and compositions for the treatment of fluid accumulation in and/or under the retina
WO2011157798A1 (en) 2010-06-16 2011-12-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and compositions for stimulating reepithelialisation during wound healing
CN104844681B (zh) * 2014-02-13 2016-06-01 合肥久诺医药科技有限公司 一种l晶型依普利酮的精制方法
ES2699923T3 (es) 2014-10-17 2019-02-13 Ind Chimica Srl Proceso para la preparación de 7alfa-(metoxicarbonil)-3-oxo-17alfa-pregn-4,9(11)-dien-21,17-carbolactona, un intermedio útil para la síntesis de moléculas con actividad farmacológica
WO2017055248A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of heart failure
EP3362095B1 (en) 2015-10-13 2020-11-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of choroidal neovascularisation
CN105541960A (zh) * 2016-02-22 2016-05-04 浙江仙琚制药股份有限公司 17α-羟基-3-氧代-γ-内酯-孕甾-4-烯-（7α，9α）-二羧酸内酯的制备方法
US20190262363A1 (en) 2016-07-26 2019-08-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Antagonist of mineralocorticoid receptor for the treatment of osteoarthritis
CN106349326A (zh) * 2016-07-29 2017-01-25 北京万全德众医药生物技术有限公司 依普利酮杂质a的制备方法
CN107602652A (zh) * 2017-10-11 2018-01-19 浙江仙琚制药股份有限公司 制备6β‑甲基泼尼松龙的方法
CN108445236B (zh) * 2018-02-07 2021-04-20 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 甾体类衍生物和其保存液以及其应用
CN110698529A (zh) * 2019-11-19 2020-01-17 湖南新合新生物医药有限公司 一种依普利酮中间体△9,11烯酯的制备方法
US20240366632A1 (en) 2021-08-31 2024-11-07 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the treatment of ocular rosacea
CN115433252A (zh) * 2022-08-24 2022-12-06 浙江亚瑟医药有限公司 一种δ9(11)-坎利酮的制备方法

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3053856A (en) * 1958-10-29 1962-09-11 Shell Oil Co Epoxidation of ethylenic compounds with peroxycarboximidic acids
US3200113A (en) 1963-01-09 1965-08-10 Sterling Drug Inc 7-cyano steroids and derivatives thereof
US3300489A (en) 1964-07-24 1967-01-24 Smith Kline French Lab Steroidal c-17 spirolactones and processes and intermediates used in the preparation thereof
US3413288A (en) 1965-07-07 1968-11-26 Parke Davis & Co Process for the production of steroidal c-17 spirolactones
US3759791A (en) 1970-12-10 1973-09-18 Searle & Co Selective microbiological preparation of androst-4-ene-3,17-dione
DE2404948C2 (de) * 1973-02-06 1983-04-14 Roussel-Uclaf, 75007 Paris 7&alpha;-Acylthio-Steroidspirolactonderivate
FR2216273B1 (pl) 1973-02-06 1977-07-22 Roussel Uclaf
GB1455220A (pl) * 1973-09-14 1976-11-10 Searle & Co
DE2349022A1 (de) 1973-09-26 1975-04-10 Schering Ag Neue d-homo-steroide
FR2260569B1 (pl) 1974-02-08 1978-06-16 Ugine Kuhlmann
IE44711B1 (en) 1976-03-05 1982-03-10 Schering Ag 17 -hydroxypropyl-4-3-keto-steroids and esters thereof, and process for their manufacture
YU41412B (en) 1978-08-15 1987-04-30 Gist Brocades Nv Process for obtaining 17 beta-hydroxy -3-dxo-17 alpha-pregn-4-en-21-carboxylic acid
US4270994A (en) 1980-02-20 1981-06-02 G. D. Searle & Co. Electrochemical dehydrogenation of steroidal Δ3,5 enol ethers under basic conditions to provide steroidal Δ4,6 dienones
JPS58179498A (ja) * 1982-04-13 1983-10-20 Dainippon Ink & Chem Inc 微生物による１１α−ヒドロキシル化アンドロスタン系化合物の製造方法
US4559332A (en) 1983-04-13 1985-12-17 Ciba Geigy Corporation 20-Spiroxanes and analogues having an open ring E, processes for their manufacture, and pharmaceutical preparations thereof
EP0123734A1 (en) 1983-04-29 1984-11-07 Gist-Brocades N.V. 17-(Isocyano-sulfonylmethylene)-steroids, 17-(formamido-sulfonylmethylene)-steroids and their preparation
US4670551A (en) * 1984-06-21 1987-06-02 Ciba-Geigy Corporation Epoxy steroids
ES2052550T3 (es) 1986-10-10 1994-07-16 Roussel Uclaf 9-alfa-hidroxiesteroides, procedimiento para su preparacion y procedimiento para la preparacion de los correspondientes derivados 9(11)-deshidro.
US5502222A (en) 1994-06-01 1996-03-26 Schering Corporation Process for preparing delta 9,11 and 21-chloro corticosteroids
EP0973791B1 (en) * 1995-12-11 2007-06-20 G.D. Searle LLC. Process for the preparation of an epoxy compound

Also Published As

Publication number Publication date
CN1253564A (zh) 2000-05-17
ATE375992T1 (de) 2007-11-15
NZ336004A (en) 2001-04-27
RO120710B1 (ro) 2006-06-30
DE69716116D1 (de) 2002-11-07
DE69738225D1 (de) 2007-11-29
EP0944644A2 (en) 1999-09-29
CN100369927C (zh) 2008-02-20
ES2186017T3 (es) 2003-05-01
US20030055274A1 (en) 2003-03-20
RU2005121439A (ru) 2007-01-20
WO1998025948A2 (en) 1998-06-18
US6610844B2 (en) 2003-08-26
WO1998025948A3 (en) 1998-10-15
AU733559B2 (en) 2001-05-17
NO992825D0 (no) 1999-06-10
NO314149B1 (no) 2003-02-03
DK0944644T3 (da) 2003-02-03
DE69738225T2 (de) 2008-07-17
NO992825L (no) 1999-07-29
KR20050009765A (ko) 2005-01-25
EP0944644B1 (en) 2002-10-02
HK1043370B (en) 2008-08-01
AU5798398A (en) 1998-07-03
KR100523409B1 (ko) 2005-10-24
ES2293944T3 (es) 2008-04-01
DE69716116T2 (de) 2003-09-04
PL334084A1 (en) 2000-01-31
CA2273343C (en) 2006-10-10
ATE225367T1 (de) 2002-10-15
BR9714510A (pt) 2000-11-28
IL130182A0 (en) 2000-06-01
CA2273343A1 (en) 1998-06-18
HK1043370A1 (en) 2002-09-13
PT944644E (pt) 2003-02-28
JP2001509792A (ja) 2001-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL189459B1 (pl) Sposób wytwarzania delta-4,5-steroidu podstawionego 3-keto-7 alfa-alkoksykarbonylem oraz związki pośrednie i sposoby ich wytwarzania
EP0973791B1 (en) Process for the preparation of an epoxy compound
WO1998025948A9 (en) Processes for preparation of 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein
US7112669B2 (en) Processes for preparation of 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein
EP1148061B1 (en) Epoxidation process
EP1170299A2 (en) Processes for preparation of 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein
RU2261865C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-КЕТО-7α-АЛКОКСИКАРБОНИЛЗАМЕЩЕННОГО Δ4,5-СТЕРОИДА, СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
CA2347346C (en) Process for preparation of 7 alpha-carboxyl 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein and a general process for the epoxidation of olefinic double bonds
KR100506007B1 (ko) 9,11-에폭시 스테로이드의 제조방법 및 이 제조방법에 유용한 중간체
AU744223B2 (en) Process for the epoxidation of olefinic double bonds
AU2002300873B2 (en) Processes for preparation of 9, 11-epoxy steriods and intermediates useful therein
CA2550659A1 (en) Processes for preparation of 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein
CA2553378A1 (en) Processes for preparation of 7 alpha-carboxyl 9,11-epoxy steroids and intermediates useful therein and a general process for the epoxidation of olifinic double bonds

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20091211