PL186777B1 - Przeszczepianie komórek nerwowych z użyciem pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego - Google Patents
Przeszczepianie komórek nerwowych z użyciem pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowegoInfo
- Publication number
- PL186777B1 PL186777B1 PL96325646A PL32564696A PL186777B1 PL 186777 B1 PL186777 B1 PL 186777B1 PL 96325646 A PL96325646 A PL 96325646A PL 32564696 A PL32564696 A PL 32564696A PL 186777 B1 PL186777 B1 PL 186777B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- cell
- oncogene
- mhp36
- brain
- Prior art date
Links
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 330
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title description 8
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 30
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 12
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000006727 cell loss Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract 4
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 claims abstract 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 claims abstract 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 35
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 19
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims description 16
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 claims description 14
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 claims 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract 2
- 230000003925 brain function Effects 0.000 abstract 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 50
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 41
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 31
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 29
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 27
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 26
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 23
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 18
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 description 14
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 13
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 13
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 13
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 12
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 10
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 10
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 10
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 8
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 7
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 7
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 7
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 5
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 210000002763 pyramidal cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 4
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 4
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 4
- 102100025038 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Human genes 0.000 description 4
- 101710186825 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 Proteins 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 4
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 4
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 4
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000013016 learning Effects 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012756 BrdU staining Methods 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 2
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000000461 neuroepithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 2
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 210000002385 vertebral artery Anatomy 0.000 description 2
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 208000031091 Amnestic disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 206010013654 Drug abuse Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 208000010496 Heart Arrest Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000740205 Homo sapiens Sal-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 208000006264 Korsakoff syndrome Diseases 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-LBPRGKRZSA-N L-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@H]([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N Lidocaine Chemical compound CCN(CC)CC(=O)NC1=C(C)C=CC=C1C NNJVILVZKWQKPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 208000019430 Motor disease Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 102100037204 Sal-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010049418 Sudden Cardiac Death Diseases 0.000 description 1
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N [9-(dimethylamino)-10-methylbenzo[a]phenoxazin-5-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].O1C2=CC(=[NH2+])C3=CC=CC=C3C2=NC2=C1C=C(N(C)C)C(C)=C2 ZHAFUINZIZIXFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000006986 amnesia Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000007177 brain activity Effects 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 description 1
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000001715 carotid artery Anatomy 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 206010008118 cerebral infarction Diseases 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 1
- 230000007370 cognitive improvement Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N halothane Chemical compound FC(F)(F)C(Cl)Br BCQZXOMGPXTTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003132 halothane Drugs 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229950008325 levothyroxine Drugs 0.000 description 1
- 229960004194 lidocaine Drugs 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 230000011514 reflex Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011669 selenium Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014221 sudden cardiac arrest Diseases 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 description 1
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
- C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
- C12N2501/24—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
- C12N2501/392—Sexual steroids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/395—Thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
- C12N2501/91—Heparin
Abstract
1. Warunkowo niesmiertelna, pluripotencjalna komórka nablonka nerwowego do stoso- wania jako lek. 4. Srodek farmaceutyczny zawierajacy terapeutycznie skuteczna ilosc substancji czynnej i farmaceutycznie dopuszczalny nosnik, znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera warunkowo niesmiertelne, pluripotencjalne komórki nablonka nerwowego. 7. Zastosowanie warunkowo niesmiertelnych, pluripotencjalnych komórek nablonka nerwowego do wytwarzania leku do przeszczepiania domózgowego dla przywracania funkcji mózgu uszkodzonego w wyniku utraty komórek lub uszkodzenia komórek u ssaka, zwlaszcza u czlowieka. PL PL PL PL
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy korygowania zaburzeń zachowania i/lub psychicznych poprzez domózgowe przeszczepianie -komórek nerwowych, jak również stosowanych komórek i leków. Niniejszy wynalazek dotyczy również sposobów wytwarzania i utrzymywania linii komórkowych.
Zaburzenia zachowania i/lub psychiczne są powodowane przez wiele chorób i mogą również wystąpić po urazie mózgu. Dla przykładu zaburzenia motoryczne są jednym z objawów choroby Parkinsona. Do chwili obecnej w większości przypadków brak jest satysfakcjonujących sposobów leczenia tych zaburzeń.
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobu leczenia zaburzeń zachowania i/lub psychicznych, na którą składa się domózgowe wszczepianie terapeutycznie skutecznej ilości pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego.
Niniejszy wynalazek jest w części oparty na obserwacji, że gdy pluripotencjalne komórki nabłonka nerwowego zostaną wszczepione do uszkodzonego lub objętego procesem chorobowym mózgu, wydają się one odpowiadać na sygnały dochodzące z uszkodzonego lub obję186 777 tego procesem chorobowym -mózgu poprzez przyjmowanie fenotypu, który jest w stanie zastąpić' lub skompensować funkcjonalne zaburzenia, do których w normalnym przypadku prowadzi uraz lub choroba.
Pojęcie „pluripotencjalne” jest stosowane tutaj w celu oznaczenia niezróżnicowanej komórki nabłonka nerwowego, mającej zdolność różnicowania się w różne rodzaje lub różne fenotypy komórek, szczególnie w komórki charakteryzujące się zamierzonym fenotypem. Rodzaj komórki lub fenotyp, do jakiego taka pluripotencjalna komórka ulega zróżnicowaniu, jest co najmniej częściowo zależny od warunków, w jakich ta komórka żyje lub się znajduje.
Do zastosowania w niniejszym wynalazku, komórki nabłonka nerwowego powinny mieć zdolność różnicowania się w komórki odpowiednie dla naprawy lub kompensacji uszkodzenia lub procesu chorobowego w docelowym obszarze mózgu. Należy zwrócić uwagę, że stosowane do przeszczepu komórki nie muszą mieć zdolności do różnicowania się we wszystkie rodzaje lub fenotypy komórek nerwowych. Komórki te mogą być np. bipotencjailne. Jednakże zazwyczaj korzystna jest możliwość wielokierunkowego różnicowana, ponieważ pozwala to na osiągnięcie większej plastyczności i szerszych możliwości przeszczepiania w różne okolice mózgu.
Do odpowiednich komórek pluripotencjalnych należą tak zwane „komórki pnia” (stem cells), jak również tak zwane „komórki prekursorawe”.
Pluripotencjalne komórki nerwowe są korzystnie, i ogólnie będą, warunkowo nieśmiertelne.
Leczeniu można poddawać dowolne ssaki, ale niniejszy wynalazek odnosi się przede wszystkim do leczenia ludzi, a zwłaszcza do leczenia za pomocą ludzkich komórek oraz ludzkich komórek i linii komórkowych.
Niniejszy wynalazek obejmuje ssaka, który został poddany leczeniu zgodnie z niniejszym wynalazkiem.
Niniejszy wynalazek obejmuje wyizolowane ludzkie pluripotencjalne komórki nabłonka nerwowego.
Niniejszy wynalazek obejmuje zwłaszcza ludzkie, warunkowo nieśmiertelne, pluripotencjalne komórki nabłonka nerwowego.
Niniejszy wynalazek obejmuje również warunkowo nieśmiertelną, pluripotencjalną linię komórkową komórek nabłonka nerwowego, w szczególności przeznaczoną do zastosowania terapeutycznego, a zwłaszcza do leczenia zaburzeń zachowania i/lub psychicznych.
Komórki według wynalazku, po implantacji do uszkodzonej części ludzkiego mózgu, mają zdolność korekcji zaburzeń zachowania i/lub psychicznych. Stosowane tutaj określenie, „uszkodzenie” obejmuje osłabienie lub utratę funkcji. Uszkodzenie może być spowodowane szeregiem czynników, włączając uraz fizyczny, hipoksję (brak tlenu), środki chemiczne (uszkodzenie może być np. wynikiem nadużywania leków) oraz chorobę. Następujące choroby oraz stany patologiczne stanowią przykłady chorób lub stanów, mogących prowadzić do zaburzeń zachowania i/lub psychicznych, które mogą być leczone zgodnie z niniejszym wynalazkiem: pourazowe uszkodzenie mózgu, udar mózgowy, niedokrwienie okołoporodowe, włączając porażenie mózgowe, chorobę Alzheimera, Picka i podobne neurodegeneracyjne choroby przebiegające z demencją, demencja związana z rozsianym zawałem mózgu, choroba Parkinsona i choroby typu choroby Parkinsona, choroba Huntingtona, choroba Korsakowa oraz choroba Creutzfelda-Jacoba. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem można również leczyć niepamięć, szczególnie następującą po przejściowym globalnym niedokrwieniu, jak też po nagłym zatrzymaniu krążenia lub chirurgicznym wytwarzaniu przeszczepów omijających tętnic wieńcowych.
Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobu wytwarzania ludzkich, warunkowo nieśmiertelnych, pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego, obejmującego następujące etapy:
(a) uzyskania komórek nabłonka nerwowego z płodu ludzkiego, przy czym komórki te są w wystarczająco wczesnym etapie rozwoju, aby miały zdolność różnicowania się w szereg różnych typów komórek mózgu,
186 777 (b) wprowadzania do tych komórek DNA zawierającego sekwencję powodującą, że komórki stają się warunkowo nieśmiertelne, pod kontrolą odpowiednich elementów kontrolnych, oraz (c) utrzymywania tych komórek in vitro w odpowiednich warunkach.
Sposób ten może ponadto obejmować etap klonowania komórek dla uzyskania jednej lub większej liczby linii komórkowych.
Kolejny aspekt niniejszego wynalazku dostarcza pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego, ewentualnie w postaci wyizolowanej, przeznaczonych do zastosowania terapeutycznego, przede wszystkim u ludzi. Zastosowaniem terapeutycznym może być leczenie zaburzeń zachowania i/lub psychicznych.
Kolejny aspekt niniejszego wynalazku dotyczy warunkowo nieśmiertelnych, pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego, stosowanych dla celów terapeutycznych, szczególnie u ludzi. Celem terapeutycznym może być leczenie behawioralnych i/lub psychologicznych ubytków.
Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego, ewentualnie w postaci wyizolowanej, do wytwarzania leku stosowanego w leczeniu zaburzeń zachowania i/lub psychicznych. Podawany lek zawiera pluripotencjalne komórki nabłonka nerwowego.
Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności zastosowania warunkowo nieśmiertelnych, pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego do wytwarzania leku stosowanego w leczeniu zaburzeń zachowania i/lub psychicznych. Podawany lek zawiera warunkowo nieśmiertelne, pluripotencjalne komórki nabłonka nerwowego .
Warunkowo nieśmiertelne komórki zgodnie z wynalazkiem i stosowane w wynalazku mogą pochodzić z klonalnych linii komórkowych lub mogą pochodzić z mieszanych populacji. Komórki z klonalnych linii komórkowych mogą być korzystne. Można stosować komórki pochodzące z jednej linii komórkowej lub mieszaninę komórek z dwóch lub większej liczby linii komórkowych.
Wyndazek dostarcza ponadto środka farmaceutycznego zawierającego komórki według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik.
Przeszczepianie jednogatunkowej płodowej tkanki nerwowej do uszkodzonego mózgu badano w eksperymentach prowadzonych na zwierzętach i na poziomie neuroanatomicznym, fizjologicznym i behawioralnym obserwowano następnie poprawę (Dunnet i Bjorklund, 1994). Wyniki tej pracy znalazły zastosowanie w leczeniu zaburzeń ruchowych w chorobie Parkinsona (Lindvall, 1994), ale powszechne stosowanie tej metody jest ograniczone przez konieczność posiadania tkanki pochodzącej z jednogatunkowego mózgu płodowego.
Wymagana tkanka płodowa musi być odpowiednia w stosunku do rodzaju uszkodzenia, które zamierza się naprawić i musi zostać pobrana na konkretnym, czasowo ograniczonym etapie rozwoju mózgu, różniącym się w zależności od regionu mózgu, jak i od rodzaju komórek. Prowadzi to do problemów natury zarówno technicznej, jak i etycznej.
Praca nad przeszczepianiem płodowej tkanki (Sinden, 1995) w poszczególnych rodzajach uszkodzenia wykazała, że do osiągnięcia poprawy funkcji poznawczych niezbędne jest bardo dokładne dopasowanie rodzajów komórek.
Odkryliśmy, że po wszczepieniu warunkowo nieśmiertelnych pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego do uszkodzonego mózgu, ulegają one zróżnicowaniu we właściwe rodzaje komórek, jaki jest wymagany do naprawy uszkodzenia, a zróżnicowane komórki są zdolne do wytwarzania właściwych połączeń niezbędnych do poprawy funkcji. Fenotyp zróżnicowanych komórek może być taki sam, jak fenotyp komórek zniszczonych lub utraconych. Komórki zróżnicowane mogą mieć jednakże inny fenotyp, lub nawet szereg różnych fenotypów. W każdym przypadku komórki przyjmują fenotyp pozwalający na funkcjonalną integrację i kompensację zniszczonych lub utraconych komórek. Towarzyszy temu, jak odkryliśmy, skłonność komórek do migracji i poszukiwania uszkodzonej tkanki.
Zastosowanie pluripotencjalnych komórek oznacza, że za pomocą jednej klonalnej linii komórkowej możliwa nest naprawa uszkodzenia w wielu różnych okolicach mózgu. Oznacza to również, że w przypadku, gdy do naprawy uszkodzenia w danym miejscu potrzeba więcej
186 777 niż jednego konkretnego rodzaju komórek, komórki jednej linii komórek pluripotencjalnych będą zdolne do zróżnicowania się w różne rodzaje potrzebnych komórek.
Warunkowo nieśmiertelne komórki to komórki, które są nieśmiertelne w pewnych sprzyjających warunkach, ale nie są nieśmiertelne w warunkach niesprzyjających. W obecnym przypadku oznacza to, że poprzez warunkowe unieśmiertelnianie pluripotencjalnych komórek prekursorowych, uzyskiwanych z płodowej tkanki i utrzymywanych w sprzyjających warunkach możliwe jest zatrzymanie rozwoju komórek prekursorowych na wybranym etapie i ich utrzymywanie przez dłuższe okresy czasu. Zastosowanie warunkowego unieśmiertelniania pozwala na opracowanie linii komórkowych, które są łatwo rozszerzalne in vitro. W przypadku, gdy warunki, w jakich utrzymywane są komórki, zostaną zmienione na niesprzyjające, umożliwiony zostaje rozwój komórek. Jeżeli zapewnione zostaną właściwe warunki, komórki będą nadal rozwijać się i ulegną zróżnicowaniu.
Unieśmiertelnione komórki przygotowuje się zazwyczaj poprzez transdukcję onkogenu do komórek. Istnieje zatem ryzyko rozwoju nowotworu po upływie pewnego czasu, dlatego nie preferuje się stosowania takich komórek w niniejszym wynalazku.
Warunkowo nieśmiertelne komórki mają zalety komórek nieśmiertelnych, polegające na „zamrożeniu” ich rozwoju w odpowiednim stadium, łatwo je utrzymać i dobrze się dzielą w sprzyjaj ących warunkach, ale mogą być stosowane w przeszczepach, o ile środowisko, do jakiego są przeszczepiane, charakteryzuje się warunkami niesprzyjającymi. W przypadku komórek według wynalazku, gen stosowany do zapewnienia warunkowej nieśmiertelności powinien być wybrany tak, aby . warunki panujące w mózgu odpowiadały warunkom niesprzyjającym.
Zwykłym sposobem . unieśmiertelniania komórek jest transdukcja onkogenu. Stosowanie warunkowo nieśmiertelnych komórek oznacza, że w warunkach niesprzyjających komórki nie wykazują właściwości onkogennych, a zatem wykluczona jest możliwość dokonania przeszczepu komórek, prowadzącego do rozwoju nowotworu.
Jeżeli stosowane są komórki nie-nieśmiertelne, to mogą być one utrzymywane in vitro na podłożach wzrostowych z dodatkiem czynników wzrostowych.
Gen stosowany dla zapewnienia warunkowej nieśmiertelności może być włączony do komórek po ich wydobyciu z płodu zwierzęcego. Alternatywnie można przygotować i hodować zwierzęta transgeniczne, inne niż człowiek, których nerwowe komórki nabłonkowe zawierają gen zapewniający warunkową nieśmiertelność. W przypadku hodowli zwierząt transgenicznych, komórki uzyskane z płodowej tkanki zwierzęcej są już zazwyczaj warunkowo nieśmiertelne i nie wymagają dalszej obróbki.
Komórki stosowane w leczeniu ludzi powinny korzystnie pochodzić z komórek ludzkich dla zmniejszenia problemów związanych z odrzucaniem przeszczepu. Wymaga to stosowania tkanek płodowych. Zastosowanie warunkowo nieśmiertelnych komórek odznacza, że po jednorazowym założeniu hodowli komórek nie jest już więcej potrzebne korzystanie z tkanek płodowych. Na przykład, komórki zostają pobrane z płodu ludzkiego na odpowiednim etapie rozwoju, a niezbędne dla spowodowania warunkowej nieśmiertelności DNA zostaje do nich wprowadzone. Komórki te można dalej hodować bądź klonować oraz wybierać indywidualne linie komórkowe. Utrzymywanie mieszanych populacji i/lub wybranych linii komórkowych zapewnia stałe źródło materkłłu do przeszczepów.
Do leczenia chorego zazwyczaj trzeba wiedzieć, gdzie wystąpiło uszkodzenie mózgu. Po ustaleniu, że uszkodzenie rzeczywiście występuje, niezależnie, czy dotyczy ono jednej czy wielu okolic, można przeprowadzić leczenie dokonując przeszczepu komórek do uszkodzonego obszaru. Jednakże w wielu przypadkach umiejscowienie i/lub rodzaj uszkodzonej tkanki mogą nie być znane Iub być tylko niedokładnie scharakteryzowane. Na przykład, choroby neurodegeneracyjne mogą prowadzić do uogólnionego uszkodzenia różnych rodzajów komórek. Leczenie takiego uszkodzenia również jest możliwe, a pomocnym jego elementem jest zdolność pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego do intensywnej migracji po wszczepieniu i kierowania się w uszkodzone obszary. Pluripotencjalne komórki mogą zostać wszczepione w jedno miejsce, Iub korzystniej w wiele miejsc i mają zdolność do migracji do miejsca (miejsc) uszkodzenia oraz różnicowania się w odpowiedzi na lokalne mikro6
186 777 środowisko w fenotyp lub fenotypy niezbędne dla uzyskania poprawy bądź przywrócenia funkcji. Badania pośmiertne mózgów szczurów, które otrzymały przeszczepy komórek z linii warunkowo nieśmiertelnych pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego wykazały, że komórki gromadziły się raczej w rejonie uszkodzonej tkanki niż tkanki nieuszkodzonej. Pluripotencjalne właściwości tych komórek i ich powinowactwo do uszkodzonej tkanki oznaczają, że leczenie komórkami pochodzącymi z pojedynczej linii komórkowej komórek o dużym potencjale rozwojowym może doprowadzić do kompensacji uogólnionego uszkodzenia wielu różnych rodzajów komórek.
Po leczeniu poprawę funkcji chorego można monitorować za pomocą testów behawioralnych i/lub psychologicznych i/lub, jeżeli jest to potrzebne, badań służących do monitorowania aktywności mózgu w wybranych jego okolicach. Można np. przeprowadzić badania funkcji poznawczych przed i po dokonaniu przeszczepu.
Korzystnie, leczenie spowoduje znaczącą poprawę w przypadku zaburzeń zachowania i/lub psychicznych. Może to jednakże nie zawsze okazać się możliwe. Leczenie zgodnie z niniejszym wynalazkiem i z zastosowaniem objętych wynalazkiem komórek, leków i preparatów farmaceutycznych, może prowadzić do poprawy funkcji bez jej całkowitej naprawy. Taka poprawa będzie warta wysiłku i będzie miała znaczenie.
Liczba stosowanych komórek będzie się zmieniała w zależności od rodzaju i zasięgu uszkodzonej tkanki. Typowo liczba komórek stosowanych do przeszczepu będzie rzędu od około stu tysięcy do kilku milionów. Leczenie nie musi ograniczać się do pojedynczego przeszczepu. W celu uzyskania dalszej poprawy funkcji można dokonywać kolejnych przeszczepów.
Niniejszy wynalazek ilustrują badania, jakie wykonaliśmy na szczurach z uszkodzeniem mózgu. W opisanych poniżej eksperymentach warunkowo nieśmiertelne komórki stosowane do przeszczepu pochodzą od transgenicznych myszy H-2Kb-tsA58, opracowanych przez M. Noble i współpracowników w Ludwig fnstitute for Cancer Research (Jat i wsp., 1991). Wszystkie komórki tych myszy zawierają wrażliwy na temperaturę onkogen (tsA58, wrażliwy na temperaturę mutant dużego antygenu SV40 T pod kontrolą indukowanego interferonem promotora H-2Kb), co sprawia, że dzielą się w sprzyjającej temperaturze (niższej niż temperatura ciała, 33°C), ale ulegają różnicowaniu jedynie po przywróceniu temperatury ciała myszy (38°C - 39°C). Właśnie ta cecha powoduje, że komórki te są warunkowo nieśmiertelne. Pozwoliło to nam na sklonowanie i powiększenie linii komórkowych in vitro, które uległy następnie zróżnicowaniu po wszczepieniu do mózgu biorcy. Z populacji komórek pobranych pierwotnie z transgenicznych myszy, a dokładnie z hipokampa w 14 dniu rozwoju płodowego (E 14), uzyskano szereg linii komórkowych. Badaliśmy szczury, które otrzymały przeszczep tych komórek, przez okres co najmniej ośmiu miesięcy i w żadnym z przypadków przeszczepione komórki nie spowodowały rozwoju nowotworu. Ponadto, w przeprowadzonych badaniach pośmiertnych, przeszczepione komórki (oznaczone przez uprzednią transfekcję genem reporterowym lac-z) miały morfologię komórek zróżnicowanych w sposób właściwy dla układu nerwowego gryzoni.
W warunkach in vitro linie klonowanych komórek wykazują zdolność do różnicowania się w więcej niż jeden fenotyp, np. w fenotyp komórek astrogleju, jak i fenotyp komórek nerwowych (patrz poniższy przykład 4).
Model uszkodzenie-i-zachowanie, w którym zademonstrowaliśmy, że linie klonowanych komórek są zdolne do przywrócenia funkcji w uszkodzonym mózgu, jest intensywnie przez nas uprzednio badanym modelem z użyciem jednogatunkowych przeszczepów tkanki płodowej (patrz Sinden i wsp., 1995). W modelu tym wykorzystuje się szczury, u których metodą okluzji czterech naczyń (4 VO), stymulującej atak serca, powoduje się wystąpienie względnie ogramczonego i swoistego uszkodzenia komórek piramidowych CA 1 grzbietowej części hipokampa, oraz ubytek funkcji poznawczych, manifestujący się w trudności zlokalizowania zanurzonej i niewidocznej platformy znajdującej się w basenie. Ten model uszkodzenia i zachowania stanowi model zaburzenia funkcji poznawczych, jakie występują w wyniku powszechnych form uszkodzenia mózgu, to znaczy przejściowej utraty krążenia mózgowego, jaka np. może wystąpić podczas nagłego zatrzymania krążenia.
186 777
Zademonstrowaliśmy poprzednio, że aby przeszczepy stanowiące zawiesiny komórek płodowych przywracały czynność, muszą być wysoce swoiste dla uszkodzenia spowodowanego przez 4 VO: przeszczepy zawierające komórki piramido we CA 1 są skuteczne; przeszczepy zawierające komórki cholinergiczne z podstawnej części przodomózgowia, komórki ziarniste z zakrętu zębatego, a nawet inną klasę komórek piramido wych (CA 3) z hipokampa nie są skuteczne. Poniższe przykłady 5-8 przedstawiają eksperymenty, w których zarówno klonałne linie komórkowe, jak i mieszane populacje komórek nabłonka nerwowego E 14 hipokampa, pobrane od transgenicznych myszy H-2Kb-tsA58, stanowią przeszczepy skuteczne w przywracaniu funkcji poznawczych w tym modelu.
Odkryliśmy, że dwie z trzech badanych klonalnych linii komórkowych, to znaczy linia komórkowa MHP36 (poprzednio znana jako linia komórkowa C36) oraz linia komórkowa MHP3, są równie skuteczne w przywracaniu funkcji poznawczych co płodowe przeszczepy szczurze, zawierające komórki piramido we CA 1. Trzecia badana linia komórkowa, linia MHP15 (poprzednio znana jako linia komórkowa Cl5) prowadzi do poprawy funkcji, ale poprawa ta nie jest tak znaczna, jak w przypadku komórek MHP36 i MHP3. Szansa, że przypadkowo udało nam się natrafić na linie komórkowe ulegające zróżnicowaniu do komórek piramido wych CA 1, niezależnie od rodzaju środowiska panującego w mózgu biorcy, są niewielkie. Wydaje się zatem, że te linie komórkowe mają zdolność odpowiadania na związane z uszkodzeniem sygnały, które powodują ich różnicowanie do komórek jednego lub większej liczby typów, które mają zdolność do przywrócenia niezbędnych połączeń i przejęcia fdnkcji uszkodzonej tkanki mózgowej. To właśnie ta zdolność stanowi podstawę zarówno strategiczną, jak i materiałową leczenia uszkodzenia mózgu wszczepianiem komórek, w którym szeroka gama zaburzeń zachowania i/lub psychicznych wynika z równie szerokiej gamy postaci uszkodzenia ludzkiego mózgu. Metoda ta pozwala również na ominięcie etycznych i praktycznych problemów związanych ze stosowaniem płodowych tkanek ludzkich.
Dwie z linii komórkowych, które, jak dotychczas, wykazały najlepsze zdolności przywracania utraconej funkcji są liniami odpowiadającymi na FGF2, to znaczy, że w znaczący sposób zwiększają proliferację zarówno w sprzyjającej, jak i niesprzyjającej hodowli w obecności tego czynnika wzrostu, podczas gdy trzecia linia komórkowa odpowiada na ten czynnik jedynie w niewielkim stopniu. Komórki i linie komórkowe wykazujące znacząco zwiększoną proliferację w odpowiedzi na dodanie czynnika wzrostu do hodowli są zatem ogólnie preferowane. Komórki można badać w warunkach sprzyjających i/lub niesprzyjających. Ogólnie preferowane są komórki wykazujące największy wzrost proliferacji. Czynnik wzrostu stosowany do badania komórek powinien być korzystnie odpowiedni dla obszaru mózgu, w którym zamierza się stosować te komórki, to znaczy być czynnikiem wzrostu wydzielanym w tym Obszarze. Na przykład komórki, które mają być stosowane w naprawie tkanki hipokampa, mogą być badane za pomocą FGF2 (znanego również jako bFGF). Ogólnie korzystne są komórki odpowiadające na FGF2. W badaniu komórek można stosować inne mitogenne czynniki wzrostu, w tym EGF i NGF.
Wynalazek dostarcza zatem sposobu testowania, polegającego na utrzymywaniu populacji linii komórkowej warunkowo nieśmiertelnych pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego in vitro i hodowaniu części komórek w sprzyjających warunkach, w obecności lub przy braku czynnika wzrostu, np. FGF2, oraz określeniu proliferacji komórek. Korzystnie, komórki są również badane w niesprzyjających warunkach. Komórki odpowiadające, to znaczy takie, które wykazują znacząco zwiększoną proliferację w obecności czynnika wzrostu v/ warunkach sprzyjających, a korzystnie również w warunkach niesprzyjających, wydają się być komórkami szczególnie przydatnymi w stosowaniu w sposobie leczenia według wynalazku. Czynnik wzrostu można stosować np. w stężeniu 10 ng/ml.
Wrażliwy na temperaturę onkogen, zapewniający warunkową nieśmiertelność komórek pochodzących z transgenicznych myszy FI-2Kb-tsA58, można wprowadzić do komórek ludzkich in vitro. Istnieją dobrze znane metody wprowadzania egzogennego DNA i mogą być stosowane. Na przykład gen może zostać wprowadzony poprzez transfekcję komórek. Można zastosować zwykłe techniki przesiewowe sprawdzające, czy gen został włączony do komórki; można np. stosować technikę Southern biot w celu przesiewu w kierunku miejsc wprowadzę8
186 777 nia DNA. W niektórych przypadkach można stosować znaczniki lub, jeżeli stosowany jest duży antygen ts SV40 T, komórki mogą być poddane przesiewowi w temperaturze sprzyjającej ekspresji SV40, jak opisano w przykładzie 4.
Należy zrozumieć, że chociaż opisane w poniższych przykładach eksperymenty zostały przeprowadzone z użyciem genu dużego antygenu ts SV40 T dla zapewnienia warunkowej nieśmiertelności komórek, można stosować dowolny inny gen, mający zdolność powodowania warunkowej nieśmiertelności. Takie geny mogą być konstruowane ze znanych onkogenów. Na przykład gen powodujący warunkową nieśmiertelność został skonstruowany z onkogenu c-myc i jest opisany przez Hoshimaiuaru i wsp., 1996.
W przeprowadzonych na szczurach eksperymentach opisanych w poniższych przykładach 6,7 i 8 zastosowano warunkowo nieśmiertelne pluripotencjalne komórki w celu naprawy wysoce swoistego rodzaju uszkodzenia. Zastosowania komórek według wynalazku nie są ograniczone do naprawy tego konkretnego rodzaju uszkodzenia. Przeszczep wykonany w dowolnej okolicy mózgu jest związany z uzyskaną poprawą funkcji.
Części płodowego mózgu, z których pobierane są komórki nabłonka nerwowego oraz dokładny czas (stadium i rozwój) mogą się różnić. Jeżeli jednak pożądane są komórki pluripotencjalne, komórki należy pobierać w wystarczająco wczesnym etapie rozwoju, tak, aby posiadały one zdolność do różnicowania się w pożądane typy i/lub fenotypy różnych rodzajów komórek mózgowych. Na przykład, gdy komórki są pobierane z płodowego hipokampa myszy, można je pobierać od 14 do 15 dnia rozwoju płodowego. Komórki ludzkie można pobierać na odpowiadającym stadium rozwoju. Na przykład można pobierać komórki z około ośmiotygodniowych płodów ludzkich.
Usunięte komórki można poddać przesiewowi in vitro, aby upewnić się, że wciąż mają one zdolność do różnicowania się, a w szczególności do różnicowania się we właściwy rodzaj Iub fenotyp komórek. Uszkodzone okolice mózgu o różnej lokalizacji mogą produkować różne sygnały, np. czynniki wzrostu i/lub różne rodzaje uszkodzenia tej samej okolicy mogą powodować wytwarzanie różnych sygnałów. Zdolność komórek do różnicowania się można określić in vitro w obecności odpowiedniego sygnału, np. odpowiedniego czynnika wzrostu. Poniżej przedstawiony przykład 4 opisuje procedurę, w której pokazano zdolność komórek do różnicowania się w fenotypy komórek nerwowych i gleju.
Niektóre zaburzenia zachowania i/lub psychiczne powodowane są brakiem jednej Iub większej liczby substancji chemicznych w skądinąd zdrowym mózgu. Uprzednio sugerowano, że wszczepianie transgenicznych komórek mogłoby być stosowane w celu dostarczenia brakujących substancji chemicznych. Niniejszy wynalazek nie obejmuje konkretnie tych problemów. Pomimo, że komórki według wynalazku mogą być modyfikowane genetycznie tak, aby zawierały dodatkowe geny kodujące pożądane produkty, nie jest to zazwyczaj potrzebne, ponieważ komórki stosowane zgodnie z wynalazkiem ulegają po wszczepieniu zróżnicowaniu i następnie funkcjonują w pełni zastępując utracone Iub zniszczone komórki. Komórki osiągają integralność funkcjonalną i zastępują Iub kompensują brakujące Iub zniszczone komórki. Stają się one raczej funkcjonalną częścią mózgu, a nie tylko wyrafinowaną metodą podawania leków. Genetyczna modyfikacja komórek będzie zatem zazwyczaj ograniczona do wprowadzenia genów niezbędnych dla zapewnienia warunkowej nieśmiertelności i klonowania. Genami koniecznymi do klonowania mogą być np. gen powodujący oporność na wybrany antybiotyk, co pozwala na dokonanie selekcji. Genetyczna modyfikacja w celu umożliwienia wydzielania substancji farmakologicznych nie jest korzystna.
Osobom znającym przedmiot znane są metody przeszczepiania komórek ludziom i zwierzętom; są one również opisane w literaturze. Stosowane tutaj pojęcie „przeszczepienie” obejmuje przeszczepianie hodowanych in vitro komórek, które mogły zostać genetycznie zmodyfikowane, jak również przeszczepianie materiału uzyskanego od innego organizmu. Komórki mogą zostać przeszczepione poprzez wszczepienie drogą infuzji z użyciem mikrostrzykawki znanej liczby komórek do docelowej okolicy, gdzie w normalnych warunkach ulegają rozproszeniu wokół miejsca iniekcji. Mogą one również zostać wszczepione do wnętrza komór mózgu. W przypadku wszczepienia noworodkowi, mogą one ulec rozproszeniu po całym mózgu.
186 777
Używane tutaj pojecie „przeszczepianie domózgowe” obejmuje przeszczepianie do dowolnej części mózgu. Przeszczepianie nie jest ograniczone do czołowej i większej części mózgu.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady nie ograniczające jego zakresu.
Figury 1-20 przedstawiają wyniki eksperymentów opisanych w przykładach 3 i 5-8.
Opisano je następująco:
Figura 1 przedstawia proliferację komórek MHP15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM.
Figura 2 przedstawia proliferację komórek MHP15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem γ (12 U/ml).
Figura 3 przedstawia proliferację komórek MHP 15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM zFGF2 (10 ng/ml).
Figura 4 przedstawia proliferację komórek MHP 15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem γ(12 U/ml) i FGF2 (10 ng/ml).
Figura 5 przedstawia proliferację komórek MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM.
Figura 6 przedstawia proliferację komórek MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem γ (12 U/ml).
Figura 7 przedstawia proliferację komórek MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z FGF2 (10 ng/ml).
Figura 8 przedstawia proliferację komórek MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem γ (12 U/ml) i FGF2 (10 ng/ml).
Figura 9 przedstawia latencję szczurów w labiryncie wodnym Morrisa w czasie dla kontrolnych szczurów jedynie z uszkodzeniem mózgu, które otrzymały kontrolne przeszczepy (CON), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały kontrolne przeszczepy (ISC), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały implant komórek CA 1 (CA 1), komórek CA 3 (CA 3) lub mieszaną populację warunkowo nieśmiertelnych komórek prekursorowych hipokampa, pobranych od transgenicznych myszy H-2Kb-tsA58 (tsA58).
Figura 10 przedstawia latencję szczurów w labiryncie wodnym Morrisa w czasie dla kontrolnych szczurów jedynie z uszkodzeniem mózgu, które otrzymały kontrolne przeszczepy (CON), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały kontrolne przeszczepy (ISC), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały implant komórek CA 1 (CA 1), komórek linii komórkowej MHP36 (MHP36) lub mieszaną populację warunkowo nieśmiertelnych komórek prekursorawych hipokampa, pobranych od trrnsgenicznych myszy H-2Kb-tsA58 (tsA58).
Figura 11 przedstawia latencję szczurów w labiryncie wodnym Morrisa w czasie dla kontrolnych szczurów jedynie z uszkodzeniem mózgu, które otrzymały kontrolne przeszczepy (CON), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały kontrolne przeszczepy (ISC), oraz szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały implant komórek linii komórkowej MHP36 (przejście 24 do 32)(MHP36).
Figura 12 przedstawia latencję szczurów w labiryncie wodnym Morrisa w czasie dla kontrolnych szczurów jedynie z uszkodzeniem mózgu, które otrzymały kontrolne przeszczepy (CON), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały kontrolne przeszczepy (ISC), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały implant komórek linii komórkowej MHP36 (MPH36), komórek linii komórkowej MHP 15 (MHP 15) lub komórek linii komórkowej MHP3 (MHP3).
Figura 13 przedstawia proliferację komórek MHP15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM, jak na fig. 1, ale dla dni od 0 do 6.
Figura 14 przedstawia proliferację komórek MHP15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem- γ (12 U/ml), jak na fig. 2, ale dla dni od 0 do 6.
Figura 15 przedstawia proliferację komórek MHP 15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z FGF2 (10 ng/ml), jak na fig. 3, ale dla dni od 0 do 6.
Figura 16 przedstawia proliferację komórek MHP 15 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem γ (12 U/ml) i FGF2 (10 ng/ml), jak na fig. 4 , ale dla dn.i od 0 do 6.
Figura 17 przedstawia proliferację MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM, jak na fig. 5, ale dla dni od 0 do 6.
Figura 18 przedstawia proliferację komórek fMHP36 w temperaturze 33°C ϊ 39°C w SFM z interferonem γ (12 U/ml), jak na fig. 6, ale dla dni od 0 do 6.
186 777
Figura 19 przedstawia proliferację komórek MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z FGF2, jak na fig. 7, ale dla dni od 0 do 6.
Figura 20 przedstawia proliferację komórek MHP36 w temperaturze 33°C i 39°C w SFM z interferonem γ (12 U/ml) i FGF2 (10 ng/ml), jak na fig. 8, ale dla dni od 0 do 6.
Przykład 1
Przygotowanie hodowli mieszanych populacji
Hipokampy wycięto z myszy El4 H-2Kb-tsA58. Zawiesinę komórek przygotowano po tmisynizacji oraz mechanicznej dysocjacji, a komórki naniesiono w stężeniu od 45 x 103 do 50 x 10' komórek/ml na płytki do hodowli o powierzchni 10 cm2. Komórki hodowano w DMEM: podłożu bez surowicy F12 (SFM) z następującymi dodatkami: albumina surowicy bydlęcej (0,0286%); transferyna (0,1 mg/ml); putrescyna (16,2 pg/ml); insulina (5 pg/ml); progesteron (0,062 pg/ml); selen (0,0383 (pg/ml); L-glutamina (2 mM); L-tyroksyna (0,4 pg/ml); trijodotyronina (0,337 pg/ml); heparyna (10 USP jednostek/ml); penicylina/streptomycyna (10000:1000 jednostek/ml); wszystkie odczynniki otrzymano z firmy Sigma. Ponadto, do komórek dodano podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów, uprzednio znanego jako bFGF, a obecnie jako FGF2 (FGF2 - 10 ng/ml) oraz interferon γ (g-lFN 1 12 U/ml) i komrrki inkbtowaio w Imnperaturze 33°C w 5% CO2. Co 2-3 dni wymieniano połowę podłoża oraz całość FGF2 i g-lFN.
Przykład 2
Wytwarzanie linii klonalnych
Plazmid pPGKB-geo (otrzymany od P. Soriano), składający się z fuzji lacZ i oporności na neomycynę, napędzany poprzez promotor pGK, hodowano przez noc w temperaturze 37°C w bulionie Luria Bertmi, a następnie oczyszczono z użyciem dostępnego w handlu zestawu (Qiagen, Niemcy). Oczyszczony plazmid DNA poddano linearyzacji za pomocą enzymu restrykcyjnego Sal 1 (Promega, Wielka Brytania) a następnie wysterylizowano i zawieszono w buforze TE w stężeniu końcowym 1 mg/ml. Mieszaną populację komórek nabłonka nerwowego hipokampa, przygotowaną w przykładzie 1, poddano elektroporacji w celu wprowadzenia do komórek genu fuzyjnego lac-Z.
Komórki wysiano następnie w stężeniu od 105 do 106 komórek/płytkę w SFM (z dodatkami wymienionymi w przykładzie 1), z odpowiednimi dodatkami w postaci FGF2 i g-lFN. Po 24 godzinach podłoże zastąpiono SFM zawierającym G418 (antybiotyk neomycynopodobny) (200 (pg/ml), co pozwoliło na przeżycie jedynie tych komórek, do których poprawnie został wprowadzony plazmid i które mogły wytworzyć oporność na G418. Podłoże zmieniano
2-3 razy na tydzień, a komórki pozostawiono na okres 4-6 tygodni, aby umożliwić wytworzenie klonów
Wybrane klony były od siebie oddzielone; zostały pobrane za pomocą szklanych pierścieni do klonowania, zanurzonych uprzednio w smarze silikonowym. Komórki klonalne przeniesiono do płytki 24-studzienkowej po krótkiej, pięciominutowej inkubacji w roztworze EDTA/EGTA (1:100) w temperaturze 37°C. Po kilku dniach komórki stały się konfluentne i zostały przeniesione do płytek sześciostudzienkowych, a następnie do płytek do hodowli o powierzchni 10 cm2 po czym potraktowano je dokładnie tak samo, jak miesznną populację linii nie trarnsfekowanych, jak opisano powyżej, z wyjątkiem dodatku G418. Z zebranych 32 klonów 9 wytworzyło stałe linie komórkowe.
Wykazano, że wszystkie z tych klonalnych linii komórkowych hipokampa były warunkowo nieśmiertelne; liczenie komórek w próbie barwnej z MTT wykazało 1-2 x 103-większy wzrost proliferacji w porównaniu z wyjściową gęstością komórek na płytce w sprzyjających warunkach na podłożu bez surowicy, bez dodatku FGF2 od 2 do 6 dnia hodowli in vitro (dalej zwane DIV), oraz gwałtowny spadek liczby komórek na płytkach w niesprzyjających warunkach (39°C, γ-lFN). Populacja komórek nabłonka nerwowego hipokampa, z których pochodziły komórki tych linii, do proliferacji wymagała jednakże dodatku FGF2. Ponadto, dwie z dziewięciu linii odpowiadały na FGF2, znacząco zwiększając szybkość proliferacji komórek zarówno w sprzyjających, jak i niesprzyjających warunkach hodowli w obecności tego czynnika wzrostu.
Linie utrzymywano w celu umożliwienia wielokrotnych przeniesień do świeżej pożywki, a zamrożone pnie odmrażano i hodowano bez zmiany fenotypu.
186 777
Przykład 3
Proliferacja klonalnych linii mhp15 i mhp36 in vitro (Linie komórkowe MHP36 i MHP15 były uprzednio znane jako, odpowiednio, C36 i C15. Oznaczenia C36 i C15 były używane w zgłoszeniu, z którego niniejszemu zgłoszeniu przysługuje pierwszeństwo. Linie komórkowe pozostają te same, zmieniły się jedynie ich nazwy).
Komórki z dwóch stałych linii komórkowych naniesiono w gęstości 8-12 x 103 komórek/studzienkę, na płytki 96-studzienkowe zawierające podłoże bez surowicy (SFM) DMEM:F12, z dodatkiem podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (FGF2 - 1θ ng/ml) i interferonu y (12 U/ml) i inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 33°C w 5% CO2. Po tym okresie usunięto całe podłoże, FGF2 oraz interferon y, a do każdej kolumny, składającej się z ośmiu studzienek, dodawano:
(i) SFM bez dodtticów;
(ii) SFM z interferonem γ (12 U/ml);
(iii) SFM z L C^F^2 (10 ng/nd); lub (iv) SFM z interferonem γ (12 U/ml) i FGF2 (10 ng/ml) i inkubowano przez 2, 4, 6, 8 i 14 dni in vitro w temperaturze 33°C Iub 39°C. Komórki liczono w każdym unnkcic'czasowym w każdej temperaturze i dla każdego dodatku do podłoża w próbie barwnej z MTT. Obie linie komórkowe wykazały wyraźną wrażliwość na temperaturę w SFM zarówno z interferonem y, jak i bez interferonu y; komórki ulegają gwałtownej proliferacji (do 200-krotnie większej gęstości na płytce) w sprzyjającej temperaturze (33°C), ale wykazują minimalną proliferację w temperaturze niesprzyjającej (39°C). Dodatek FGF2 nasila prohferację linii MHP36 przy obu wartościach temperatury, wywiera jednakże jedynie nieznaczny wpływ na linię MHP 15, co wskazuje, że te linie różnią się pomiędzy sobą wrażliwością na ten czynnik wzrostu.
Na fig. 1-4 przedstawiono wyniki dla linii komórkowej MHP 15 przez okres do 14 dni, a na fig. 11-16 przedstawiono w bardziej szczegółowy sposób wyniki dla dni 0 do 6. Na fig. 5-8 przedstawiono wyniki uzyskane dla linii komórkowej MHP36 przez okres do 14 dni, a na fig. 17-20 przedstawiono w bardziej szczegółowy sposób wyniki dla dni 0 do 6.
Przykład 4
Klonalne linie komórkowe mhp15 i mhp36 posiadają właściwości tworzenia komórek glejowych i neuronowych, gdy ulegają różnicowaniu in vitro.
Komórki przygotowano do immunocytochemii z użyciem szeregu znaczników zarówno w warunkach sprzyjających (33°C plus interferon y z dodatkiem FGF2), jak i niesprzyjających (39°C) w SFM z dodatkiem środka różnicującego, dibutyrylo cAMP (1 mM). 50-100x 103 komórek z każdej linii naniesiono na szkiełka pokryte fibronektyną w SFM z FGF2 i interferonem y w temperaturze 33°C i inkubowano przez 48 godzin. Połowę skrawków utrwalono na tym etapie, a w drugiej połowie usunięto podłoża i zastąpiono je podłożami zawierającymi 1 mM di^i^t^ty^ilo cAMP i uhrzy^^y^tu^o w tt^^^<er^t^t^iri^ 39°C. Skrawki te utrwalono po 2 do 8 dniach in vitro za pomocą 4% paraformaldehydu. W tabeli podano odsetki wszystkich komórek w 5 przypadkowo wybranych polach, w których ulega ekspresji znacznik komórek progenitorowych, Nestin; znacznik neuronów, enolaza swoista dla neuronów (NSE); znacznik gleju, kwaśne białko włókienkowe gleju (GFAP) i znacznik antygenu genu powodującego nieśmiertelność, SV40. Obie linie komórkowe wykazują fenotypy komórek nerwowych i komórek glejowych po, ale nie przed, różnicowaniem.
Klonalna linia MHP 15
| Dni in vitro temperatura | Nestin % oznakowanych komórek | NSE % oznakowanych komórek | GFAP % oznakowanych komórek | SV40 % oznakowanych komórek |
| 2 -33°C | 100 ±0 | 0±0 | 0±0 | 10D±0 |
| 2 -39C° | 100 ±0 | 12,4 ±2,2 | 3,8 ± 1 | 100 ±0* |
* Ekspresja SV40 ulega zmniejszeniu po czterech dniach in vitro w linii MHP15.
186 777
Klonalna linia MHP36
| Dni in vitro temperatura | Nestin % oznakowanych komórek | NSE % oznakowanych komórek | GFAP % oznakowanych komórek | SV40 % oznakowanych komórek |
| 2 -33°C | 100 ±0 | 0 ± 0 | 0±0 | 100 ±0 |
| 2 -39°C | 100 ±0 | 59,3 ± 7,0 | 12,2 ± 3,3 | 38,6 ± 16,1 |
Dalsza charakterystyka klonalnej linii MHP36
Linia komórkowa MHP36 została dalej określona po 2 DIV hodowli zarówno w warunkach sprzyjających, jak i niesprzyjających. Okazało się, że komórki były w >95% oznaczone X-gal (to znaczy wykazały histochemiczną reakcję ze znacznikiem transdukcji β-gal) w warunkach sprzyjających. Komórki badano także z użyciem dwóch innych przeciwciał, jednego dla neuronalnego znacznika PGP 9.5 (Wilson i wsp., 1988), a drugiego dla bromodeoksyurydyny (BrdU) po jednogodzinnej inkubacji z podłożem znakującym BrdU jako znacznikiem dzielących się komórek. W hodowli sprzyjającej komórki oznakowane BrdU znajdowano w całej hodowli. W hodowli sprzyjającej nie było komórek PGP 9.5.
Po zmianie warunków na niesprzyjające w podłożu bez surowicy (SFM) bez dodatków, ta linia komórkowa przestała się dzielić, a większość komórek obumarła bez różnicowania się w fenotypy dojrzałych neuronów lub komórek glejowych. Jednakże w obecności forskoliny lub kwasu retinowego (oba są środkami powodującymi różnicowanie się) hodowle mogły być utrzymywane przez dłuższy czas (5-14 DIV), a pewien odsetek komórek wykazywał fenotyp komórek nerwowych lub glejowych po 2 DIV. Komórki MHP36 wykazywały morfologię płaskokomórkową w obecności kwasu retinowego (10'9 M) z pewną liczbą GFAP-dodatnich komórek włókienkowych; ekspresja SV40 zmniejszyła się do 30%, a zabarwienie BrdU do 5% komórek; nie znaleziono komórek zabarwionych PGP 9.5. Jednakże w obecności forskoliny (10’8 M), często znajdywano dwubiegunowe komórki PGP 9.5-dodatnie, a wiele komórek posiadało długie wypustki neurytyczne. W hodowlach nie znajdowano włókienek zabarwionych GFAP, ekspresja SV40 była zmniejszona (do 42% wszystkich komórek), a zabarwienie BrdU stwierdzono u 4% komórek w hodowli. Odkrycia te potwierdzają, że MHP36 jest linią komórkową pluripotencjalnych prekursorowych komórek nerwowych, których kierunek różnicowania jest co najmniej częściowo zdeterminowany przez sygnalizację indukującą.
Przykład 5 * U
Przeszczepione komórki prekursorowe H-2K -tsA58 z hipokampa, podobnie jak zawiesina komórek CA1, przywracają uczenie przestrzenne i pamięć szczurom z niedokrwiennym uszkodzeniem CA1.
Badano efekt przeszczepu zawiesiny komórek E19 CA1 (CA1), E19 CA3 (CA3), oraz rozszerzonych hodowli transgenicznych komórek neuroepitelialnycn z hipokampa E14 H-2Kb-tsA58 (pobranych podczas piątego przesiewu) na odnajdywanie położenia ukrytej platformy w labiryncie wodnym Morrisa po 15 minutach niedokrwienia z powodu 4VO (ISC), wytwarzającego wybiórcze uszkodzenie CA1. O ile nie zostało to specjalnie zaznaczone, w doświadczeniu przestrzegano metod opisanych w pracy Sinden i wsp., 1995, a zwłaszcza metod opisanych w sekcji 9 tej pracy. Praca podaje szczegóły metody stosowanej do wywoływania niedokrwienia, metod przeszczepów oraz zastosowania testu labiryntu wodnego Morrisa. Poniżej przedstawiono krótkie podsumowanie zastosowanej procedury.
Przejściowe globalne niedokrwienie indukowano metodą 4VO, w której tętnice kręgowe poddawano elektrokoagulacji na pierwszym kręgu szyjnym przez otwór skrzydlaty, w znieczuleniu 2% halotanem (w 70% tlenku azotu i 30% tlenie), a wokół tętnic szyjnych wprowadzono podwiązki i przyciągnięto na powierzchnię. W dwadzieścia cztery godziny później podwiązki zacieśniono i zaciśnięto na 15 minut. Szczury, które nie straciły odruchu pionizacyjnego w ciągu dwóch minut nie zostały włączone do eksperymentów. Rany szybko uszczelniano za pomocą klipsów, a w miejsca cięć podawano lignokainę.
Komórki H-2Kb-tsA58 pobierano ze sprzyjającej hodowli i rozpuszczano w buforowanym roztworze soli fizjologicznej Hanka z 1 mM n-acetylo-L-cysteiną; takie komórki były
186 777 gotowe do przeszczepu. Do komórek dodawano 0,5 (iCi/ml H-tymidyny 48 godzin przed usunięciem.
Przeszczepy wprowadzano obustronnie w grzbietowe pole CA1 (dwa miejsca/półkulę, 2 pl/n^kij.scc, 22K komórek/μΐ dla przeezccepu każdegg roddaju komórek), a szczurom podawano przeszczepy 2 do 3 tygodni po chirurgicznym niedokrwieniu. Szczury, które otrzymały przeszczep komórek tsA58 otrzymywały co drugi dzień przez 14 dni po przeszczepie środek immunosupres^ny, cykIocporynę A (S-uIoz, 2,5 mg/szczura w Cremophore EL, domięśniowo). Treningi (2 próby dziennie) rozpoczęto 12 tygodni po przeszczepie (liczba zwierząt badanych (Ns) = od 7 do 11 na grupę).
Szczury tylko z uszkodzeniem zostały poddane kateteryzacji tętnic kręgowych, ale nie miały ligacji tętnic szyjnych, po czym otrzymały pozorne przeszczepy. Pozorne przeszczepy peeeurιdwadeand udpezpz obniżenie igły iniekcySneS do odpowiedniego miejsca, ale bez wprowadzenia materiału.
Labirynt wodny składał się z czarnego polipropylenowego okrągłego basenu (średnica 2 m, wysokość 0,5 m, z wodą o głębokości 0,25 m i temperaturze 26°C, nieprzezroczystej dzięki edeatOdwi 200 ml mleka). Platformę ucieczki stanowił 9 cm czysty zamknięty cylinder pers^, położony 0,02 m poniżej powierzchni wody na środku północno-zachodniego Owaeeantu basenu. Na początku prób szczury umieszczano w basenie pyskiem w kierunku ściany i pozwolono, aby pływały, dopóki nie znajdą platformy, gdzie pozostawały przez 10 sekund do czasu usunięcia. Szczur, któremu nie udało się odnaleźć platformy przez 60 sekund, był do niej kierowany przez osobę prowadzącą doświadczenie, a maksymalna latencja była punktowana. Pozycje początkowe zostały oznaczone jako Północ, Południe, Wschód lub Zachód oraz, w sposób pceueopezyuaekdwy, każdego dnia stosowano jeden punkt początkowy w pobliżu platformy, a jeden punkt początkowy oddalony od niej. Droga, jaką przepływał szczur była zapisywana przez system analizujący obraz (HVS Image, VP112) oraz cyfrowo przekształcana w zakeec pomiarów nawigacyjnych.
Zakres błędu wskazuje dwa błędy standardowe pomiędzy geuu-mi dla inetrakcSi Grupy X Dni analizy wariancji. Latencja w odkrywaniu platformy dla szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały przeszczep komórek CA1 i tsA58 nie różniła się w sposób znaczący od latencji szczurów kontrolnych, bez uszkodzenia mózgu (szczury z pozornym uszkodzeniem, które otrzymały pozorne przeszczepy) (CON), pddczac gdy inne grupy z niedokrwieniem z przeszczepami CA3 lub pozornymi przeszczepami były znamiennie upośledzone w porównaniu z kontrolą, grupami CA1 i tsA58 pod względem latencji i innych parametrów uczenia się przestrzennego. Pośmiertne b-d-nia wykazały podobny wybiórczy ubytek neuronów CA1 (7075%) u biorcy CA1 we wszystkich grupach z niedokrwieniem, włączając każdą z grup z przeszczepem. Przeżywalność przeszczepów była dosOon-ła we wszystkich grupach.
Latencja w labiryncie wodnym Morrisa to czas, w którym badane zwierzę ueeeuływa do ukrytej platformy.
Wyniki przedstawiono n- fig. 9.
Przykład 6
Klonalna linia komórkowa (MHP36), pochodzącą z komórek prekursorowych hipokamp- H-2Kb-tsA58, przywraca przestrzenne uczenie się i pamięć u szczurów z niedokrwiennym uszkodzeniem CA1 .
B-d-no wpływ przeszczepów zawiesin Oomóre) E19 CA1 (CA1), rozszerzonych hodowli transgeniczmych komórek neuroepiteli-lnych hipokampa E14 H-2Kb-tsA58 (tsA58) (pobranych uddczac piątego przesiewu) oraz rdzceeezoneS klonalnej linii komórkowej (MHP36), pochodzącej z popul-cji nieśmiertelnych komórek prekursorowych hiook-mpa E14, n- lokalizację położenia ukrytej platformy w labiryncie wodnym Morris- po 15minutowym niedokrwieniu z powodu 4VO (ISC), wytw-rzającym uszkodzenie CA1. Stosowane metody były takie s-me, ja) dpic-no w przykładzie 5. Komórki MHP36 usunięto ze cpezyS-jącej hodowli i zawipczdnd w roztworze soli fizjologicznej H-nOa z 1 mM n-acetylo-Lcysteiną; takie komórki były gotowe do przeszczepu .
186 777
Podobnie jak w przykładzie 5, przeszczepy wprowadzano obustronnie w grzbietowe pole CA1 (dwa miejsca/półkulę, 2 pl/miejsce, 25K komórek/pl dla przeszczepu każdego rodzaju komórek), a szczurom podawano przeszczepy 7 do 14 dni po niedokrwieniu. Wszystkie szczury w tym doświadczeniu otrzymywały co drugi dzień przez 14 dni po przeszczepie środek immunosupresyjny, cyklosporynę A (Sandoz, 2,5 mg/szczura w Cremophore EL, domięśniowo). Tremngi (2 próby dziennie) rozpoczęto 12 tygodni po przeszczepie (liczba zwierząt badanych (Ns) = od 7 do 11 na grupę). Zakres błędu wskazuje dwa błędy standartowe pomiędzy grupami dla interakcji Grupy X Dni analizy wariancji. Powtarzając nasze pierwsze doświadczenie, latencja w odnajdywaniu platformy u szczurów z niedokrwieniem z przeszczepami CA1 i tsA58 nie różniła się w sposób znaczący od latencji kontrolnych szczurów z pozornym uszkodzeniem, które otrzymały pozorne przeszczepy (CON). Ponadto, grupa, która otrzymała przeszczep komórek klonalnej linii MHP36, nie była również znacząco upośledzona w porównaniu z kontrolą, grupą CA1 i tsA58. Wyniki tych doświadczeń pokazano na fig. 10.
Doświadczenia wykazują, że przeszczepione komórki prekursorowe wydają się odpowiadać na sygnały pochodzące z uszkodzonego mózgu poprzez przyjmowanie fenotypu zdolnego do zastąpienia lub skompensowania funkcjonalnych ubytków, do których w zwykłych warunkach uszkodzenie prowadzi.
Ponadto, analiza wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami wykazała znaczące główne efekty Grup (F4,38 = 2,92, P < 0,05), Bloków (F5,896 = 36,50, P < 0,001) oraz znamienny liniowy współczynnik interakcji (F4,896 = 3,23, P < 0,02). Porównania testu-t pomiędzy współczynnikami liniowymi wykazały, że grupa z niedokrwieniem i pozornym przeszczepem miała znacząco upośledzoną latencję ucieczki w porównaniu z kontrolą i trzema grupami z przeszczepami (minimalne t38 = 2,29, P < 0,05); grupa kontrolna i trzy grupy z przeszczepami nie różniły się znamiennie pomiędzy sobą (wszystkie t38 < 1). ANOVA dystansów pływania dala podobne wyniki do wyników latencji.
Przykład 7
Testy z labiryntem wodnym z przykładów 5 i 6 powtórzono w dalszym zestawie doświadczeń, patrz poniżej. (W tych doświadczeniach wszystkie szczury otrzymywały immunosupresję poprzez domięśniową iniekcję cyklosporyny A (2,5 mg/szczura w Cremophore EL) co drugi dzień przez 15 dni po przeszczepie. Wyniki pokazano na fig. 11. Na tej fig. 11 średni czas, którego potrzebowało zwierzę, aby odnaleźć platformę został wyrażony jako funkcja dwudniowych bloków treningów (4 próby). Zakresy błędu pokazują. 2X s.e.m. dla oddziaływań Grupa X Bloki anr^l^szy wariancji.
Te wyniki potwierdzają, że przeszczepy komórek MHP36 są w stanie odwrócić spowodowane niedokrwieniem ubytki w procesie uczenia się. Zarówno grupy kontrolne (szczury z pozornym uszkodzeniem, które otrzymały pozorne przeszczepy) oraz grupy MHP36 wykazały znacząco krótszą lątencję ucieczki i krótszy dystans pływania do platformy ucieczki w porównaniu z grupą z niedokrwieniem, która otrzymała pozorne przeszczepy.
Grupę z niedokrwieniem, która otrzymała przeszczep komórek MHP36 (P24-32) (N=12) (ciemne kwadraty) porównano z grupą z niedokrwieniem, która otrzymała pozorne przeszczepy (N=10) (ciemne kółka), oraz z grupą z kontrolną z pozornym uszkodzeniem, która otrzymała pozorne przeszczepy (N=10) (jasne kółka) w identycznej procedurze labiryntu wodnego. ANOVA latencji i ucieczek wykazała znaczące główne efekty Grup (F2,29 = 27,80, P < 0,001), Bloków (F5,674 - 54,72, P < 0,001) oraz znaczącą interakcję Grupy X Bloki (F10 674 = 5,81, P < 0,001), ze znaczącym liniowym współczynnikiem interakcji (F2674 =
23,31 , P < 0,001. . Porównania testem-t pomiędyr wppótoznnnikmi i liniowmi wykaoały, że grupa z niedokrwieniem i pozornymi przeszczepami miała znacząco upośledzoną lątencję w porównaniu zarówno z kontrolą oraz grupami, które otrzymały przeszczepy MHP36 (minimalne t29 = 5,54, P < 0,001); grupa kontrolna i grupa MHP36 nie różniły się znacząco (t29 = 1,01). ANOVA przeprowadzone na dystansie pływania oraz innych parametrach przestrzennego uczenia się w labiryncie wodnym były całkowicie zgodne z wynikami dla latencji ucieczki.
186 777
Przykład 8
Powtórzono doświadczenia z przykładu 7, używając przeszczepów komórek z linii komórkowych MHP3 i MHP 15. MHP3 jest jedną z dziewięciu klonalnych linii komórkowych wymienionych w powyższym przykładzie 2 i jest jedną z linii komórkowych, które wykazały wrażliwość na FGF2. Wyniki przedstawiono na fig. 12. Na tej fig. 12 przedstawiono ponadto wyniki dla szczurów kontrolnych (znów szczury z pozornym uszkodzeniem mózgu, które otrzymały pozorne przeszczepy), szczurów z niedokrwieniem, które otrzymały pozorne przeszczepy oraz szczurów z niedokrwieniem, którym wszczepiono komórki linii komórkowej MHP36, jak w powyższym przykładzie 7. Dla linii MHP3 i MHP 15 N=9. Jak widać, przeszczepy komórek MHP3 wywołują równie skuteczne uczenie się co komórki linii MHP36, to znaczy znacząco szybsze niż w przypadku grupy z niedokrwieniem, ale w nie znaczący sposób wolniejsze niż w przypadku grupy kontrolnej. Przeszczepy komórek MHP 15 powodują wystąpienie pośrednich efektów, to znaczy uczenie się jest znacząco szybsze niż w grupie z niedokrwieniem, ale również znacząco wolniejsze niż w grupie kontrolnej.
Przykład 9
Niedokrwienne uszkodzenie mózgu w barwionych fioletem krezylowym wycinkach kory i prążkowia na dwóch poziomach oraz w okolicach CA1-4 hipokampa na dwóch dodatkowych poziomach badało pośmiertnie w eksperymencie 7a niezależnie dwóch badaczy. Za pomocą pięciostopniowej skali nie znaleziono uszkodzenia w żadnym innym regionie niż CA1, za wyjątkiem dwóch szczurów, u których zauważono niewielki ubytek komórek CA3. Niezależnie od okolic, w jakie były przeszczepiane komórki, średnia utrata komórek CA1 na poziomie maksymalnego niedokrwiennego uszkodzenia (5,7 mm do przodu od linii międzyusznej) wahała się od 80% w przypadku grupy z niedokrwieniem i pozornym przeszczepem do 90% w przypadku grupy z niedokrwiniem i przeszczepem komórek CA1, bez znamiennych różnic pomiędzy samym niedokrwieniem (pozorny przeszczep) a niedokrwieniem połączonym z przeszczepem. Przeszczepy płodowych komórek E19 CA1 wytworzyły odgraniczoną masę przeszczepu położoną powyżej zniszczonej okolicy CA1. podobnie jak to było opisywane poprzednio. Komórki rozszerzonej populacji znaczone 3H-tymidyną znajdowano rozproszone po całym hipokampie, spoidle wielkim i otaczającej je korze nowej; pewne grupy znakowanych komórek znajdowano w uszkodzonej warstwie komórek CA1. Przeszczepy X-gal dodatnich komórek MHP36 miały znacznie bardziej ogramczoną dystrybucję: poza śladem po wprowadzeniu igły, występowanie komórek ograniczało się do hipokampa. Odzwierciedla to prawdopodobnie zarówno wyższą czułość znakowania radioaktywnego, jak i spadek ekspresji (β-gal w długim okresie przeżywalności w tych doświadczeniach. Jak wykazały doświadczenia pilotujące, kiedy przeszczepy komórek MHP36 zostały wykonane do nieuszkodzonych hipokampów, X-gal dodatnie komórki integrowały się ze wszystkimi warstwami ciał komórkowych neuronów CA (ale nie w zakręcie zębatym). (Odrębne oznakowane komórki odnajdywano w tkance hipokampa, szczególnie w okolicach CA3 i 4.) Jednakże w przeciwieństwie do przeszczepów wykonanych do nieuszkodzonych hipokampów, w niedokrwionej warstwie komórek CA1 znajdowano gęste agregaty komórek barwionych X-gal. Stopień wszczepienia różnił się dla poszczególnych szczurów, tak że agregaty występowały w małym odsetku w polu CA1, Iub niemalże stanowiły całą populację uszkodzonego pola w danym skrawku, widoczne zarówno na skrawkach barwionych X-gal i nissl. Na przykład, część agregatów znajdywano w tej samej półkuli w różnych punktach wzdłuż osi rostrokaudalnej uszkodzonej warstwy CA1. Wynika stąd, że komórki linii MHP36 mają skłonność do tworzenia agregatów w uszkodzonej warstwie neuronów CA1.
Radanie przebiegu w czasie migracji oznaczonych przeszczepionych komórek MHP36 u szczurów poddanych niedokrwieniu za pomocą immunohistochemii anty-p-gal w celu zidentyfikowania przeszczepionych komórek wykazało, że migracja do i agregacja w warstwie CA1 jest zakończona przed upływem czterech tygodni po wykonaniu przeszczepu.
186 777
Literatura
Dunnett i Bjorklund 1994, Functional Neural Transplantatton, Raven Press, Nowy Jork
Jat P.S. i wsp., 1991, P.N.A.S. (USA) 88, -str. 5096
Lindvall, 0,1994, w Dunnett i Bjorklund, praca cytowana
Sinden, J.D. i wsp. (1995) Beh. Brain Sci. 18, str. 10
Wilson, P.O.G., Barber, P.C., Hamid, Q., Power, B.F., Dihillon, A.P., Rode, J., Day, l.N.M.,
Thompson, R. J. oraz Polak, J.M., Br. J. Exp. Pathol 69, str. 91-104 (1988)
Hoshimaiuaru, M., Ray, J., Sab, D.W.Y., Gage, F.H., PNAS USA, Vol.93, str. 1518-1523, (1996)
Niniejszy wynalazek nie powinien być ograniczony do zakresu określonego przez powyższe przykłady, przeznaczone do jego zdisttrowania. Różne modyfikacje wynalazku poza tymi, które zostały przedstawione i opisane w niniejszym opisie staną się oczywiste dla osób znających przedmiot i będą objęte zakresem załączonych zastrzeżeń patentowych.
Powyższe pozycje literaturowe podano jako odnośniki.
Ocena liczby komórek MHP15 z użyciem MTT in vitro (ii) DMEM:F12 z interferonem γ (12 U/ml)
. n -> o
-®- W
-n- w39°C
Fig. 2
186 777
Liczba komórek (x 1000) Liczba komórek (x 1000)
Ocena liczby komórek MHP15 z użyciem MTT in vitro
Dni in vitro
-·- w33°C -o- w39°C t?· o
Fig. 3
Ocena liczby komórek MHP15 z użyciem MTT in vitro
w33°C
Dni in vitro -o- w39°C
Fig. 4
186 777
Liczba komórek (x 1000) Liczba komórek (x 1000)
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro
w33°C -o- w39°C Fig 5
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in viłro
-o- w39°C
Fig. 6
186 777
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro (iii) DMEM:F12 z FGF2 (10 ng/ml)
Liczba komórek (χ 1000) Liczba komórek (x 1 θθθ)
-·- w33°C -o- w39°C Fig. 7
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro (iv) DMEM:F12 z FGF2 i interferonem γ (10 ng/ml)
-o- w39°C w33°C
Fig. 8
186 777
CA1
CA3 tsA58
ISC
CON
Latencja (s)
Dni treningów
186 777
Latencja (s) Latencja (s)
Blok treningów
Fig. 11
ISC
MHP36
CON
ISC
MHP15
MHP36
MHP3
CON
Blok treningów
Fig. 12
186 777
Ocena liczby komórek MHP 15 z użyciem MTT in vitro (i) DMEM:F12 bez dodatków (SFM)
Komórki χ 100 000 Komórki χ 100 000
C51 © I—<—1
Dni in vitro Fig- 13
Ocena liczby komórek MHP 15 z użyciem MTT in vitro
Dni in vitro
186 777
Ocena liczby komórek MHP 15 z użyciem MTT in vitro
Komórki χ 100 000 Komórki χ 100 000
Dni in vitro p jg j 5
Ocena liczby komórek MHP 15 z użyciem MTT in vitro
Dni m vitro
186 777
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro
Komórki χ 100 000 Komórki χ 100 000
Dni invitro Fig· 17 σ> &
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro (ii) DMEM:F12 z interferonem γ (12 U/ml)
Dni in vitro
186 777
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro
Komórki χ 100 000 Komórki χ 100 000
Vniinvitro p^. 19
Ocena liczby komórek MHP36 z użyciem MTT in vitro
hCH
Dni in vitro
186 777
Ocena liczby komórek MHP15 z użyciem MTT in vitro (i) DMEM:F12 bez dodatków (SFM)
Liczba komórek (χ 1000)
—©— w33°C —o— w39°C Fig. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Claims (14)
1. Warunkowo nieśmiertelna, pluripotencjalna komórka nabłonka nerwowego do stosowania jako lek.
2. Komórka według zastirzl, znamienna tym, że zawiera onkogen wrażliwy na temperaturę.
3. Komórka według zastrz. 2, znamienna tym, że jako onkogen wrażliwy na temperaturę zawiera duży onkogen T SV40.
4. Środek farmaceutyczny zawierający terapeutycznie skuteczną ilość substancji czynnej i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera warunkowo nieśmiertelne, pluripotencjalne komórki nabłonka nerwowego.
5. Środek farmaceutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że zawiera komórki zawierające onkogen wrażliwy na temperaturę.
6. Środek farmaceutyczny według zastrz. 5, znamienny tym, że zawiera komórki zawierające duży onkogen T SV40 jako onkogen wrażliwy na temperaturę.
7. Zastosowanie warunkowo nieśmiertelnych, pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego do wytwarzania leku do przeszczepiania domózgowego dla przywracania funkcji mózgu uszkodzonego w wyniku utraty komórek lub uszkodzenia komórek u ssaka, zwłaszcza u człowieka.
8. Zastosowanie według zastrz. 7, do wytwarzania leku do leczenia niedokrwienia lub udaru.
9. Zastosowanie według zastrz. 7, do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.
10. Zastosowanie według zastrz. 7, komórek stanowiących komórki ludzkie.
11. Zastosowanie według zastrz. 7, komórek pochodzących z pojedynczej linii komórkowej.
12. Zastosowanie według zastrz. 7, komórek zawierających onkogen wrażliwy na temperaturę.
13. Zastosowanie według zastrz. 12, komórek zawierających duży onkogen T SV40 jako onkogen wrażliwy na temperaturę.
14. Zastosowanie według zastrz. 7 albo 12, komórek pochodzących z linii komórkowej hodowanej w pożywce wolnej od surowicy.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9518606.0A GB9518606D0 (en) | 1995-09-12 | 1995-09-12 | Neural transplantation |
| PCT/GB1996/002251 WO1997010329A1 (en) | 1995-09-12 | 1996-09-12 | Neural transplantation using pluripotent neuroepithelial cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL325646A1 PL325646A1 (en) | 1998-08-03 |
| PL186777B1 true PL186777B1 (pl) | 2004-02-27 |
Family
ID=10780583
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96325646A PL186777B1 (pl) | 1995-09-12 | 1996-09-12 | Przeszczepianie komórek nerwowych z użyciem pluripotencjalnych komórek nabłonka nerwowego |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US7048921B2 (pl) |
| EP (1) | EP0850298B1 (pl) |
| JP (1) | JP4280872B2 (pl) |
| KR (1) | KR19990044606A (pl) |
| CN (1) | CN1193345A (pl) |
| AT (1) | ATE242316T1 (pl) |
| AU (1) | AU711563B2 (pl) |
| CA (1) | CA2231436C (pl) |
| CZ (1) | CZ296669B6 (pl) |
| DE (1) | DE69628566T2 (pl) |
| DK (1) | DK0850298T3 (pl) |
| ES (1) | ES2196172T3 (pl) |
| GB (1) | GB9518606D0 (pl) |
| HK (1) | HK1009154A1 (pl) |
| HU (1) | HUP9802091A3 (pl) |
| NO (1) | NO981072L (pl) |
| PL (1) | PL186777B1 (pl) |
| PT (1) | PT850298E (pl) |
| RU (1) | RU2185833C2 (pl) |
| SK (1) | SK285816B6 (pl) |
| WO (1) | WO1997010329A1 (pl) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2217285T3 (es) | 1994-11-08 | 2004-11-01 | Cellfactors Plc | Metodo para producir una linea celular neural humana. |
| GB9518606D0 (en) | 1995-09-12 | 1995-11-15 | Inst Of Psychiatry | Neural transplantation |
| GB9904281D0 (en) * | 1999-02-24 | 1999-04-21 | Reneuron Ltd | Transplantation |
| GB9907243D0 (en) | 1999-03-29 | 1999-05-26 | Reneuron Ltd | Therapy |
| US6399384B1 (en) * | 1999-09-17 | 2002-06-04 | Reneuron Limited | Conditional immortalization of cells |
| KR100801764B1 (ko) * | 1999-09-17 | 2008-02-05 | 레뉴런 리미티드 | 세포의 조건부 불멸화 |
| US6465215B1 (en) | 1999-12-14 | 2002-10-15 | Reneuron Limited | Identification of cells for transplantation |
| GB0005856D0 (en) * | 2000-03-10 | 2000-05-03 | Reneuron Ltd | Genetic constructs |
| GB0125773D0 (en) * | 2001-10-26 | 2001-12-19 | Reneuron Ltd | Constructs |
| DK1645626T3 (da) | 2004-09-30 | 2008-01-21 | Reneuron Ltd | Cellelinie |
| SG10201509679XA (en) * | 2007-05-29 | 2015-12-30 | Christopher B Reid | Methods for production and uses of multipotent cell populations |
| GB0822246D0 (en) | 2008-12-05 | 2009-01-14 | Reneuron Ltd | Composition |
| GB0902034D0 (en) | 2009-02-06 | 2009-03-11 | Reneuron Ltd | Method |
| GB201011589D0 (en) * | 2010-07-09 | 2010-08-25 | Reneuron Ltd | Therapeutic cells |
| US20150232662A1 (en) * | 2014-02-20 | 2015-08-20 | Sabic Innovative Plastics Ip B.V. | Thermoplastic composition and article |
| US20170173114A1 (en) * | 2014-05-07 | 2017-06-22 | Joslin Diabetes Center, Inc. | Methods and compositions for induction of ucp1 expression |
| CN116590345B (zh) * | 2023-05-06 | 2024-01-30 | 北京中医药大学 | 永生化小鼠足细胞系及其制备方法、分化方法和应用 |
Family Cites Families (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US147873A (en) * | 1874-02-24 | Improvement in nasal yokes for animals | ||
| US203483A (en) * | 1878-05-07 | Improvement in honey-boxes | ||
| US1662A (en) * | 1840-06-27 | ariel nobris | ||
| US146821A (en) * | 1874-01-27 | Improvement in nose-pieces of nail-plate feeders | ||
| US28510A (en) * | 1860-05-29 | John e | ||
| US913443A (en) * | 1908-08-13 | 1909-02-23 | Webster Full Expansion Rotary Engine Company | Rotary engine. |
| NZ226750A (en) * | 1987-10-29 | 1990-09-26 | Amrad Corp Ltd | Immortalisation of neural precursor cells by introducing a retrovirus vector containing a myc-oncogene |
| ATE90724T1 (de) | 1988-04-12 | 1993-07-15 | Massachusetts Inst Technology | Verfahren zur manipulation des zelltyps von eukaryonten. |
| US5270191A (en) | 1988-04-12 | 1993-12-14 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for manipulation of the cell types of eukaryotes |
| DE69010388T2 (de) * | 1989-04-27 | 1994-10-20 | Ajinomoto Kk | Demethylallosamidin und ein Verfahren zu seiner Herstellung. |
| US5399493A (en) | 1989-06-15 | 1995-03-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and compositions for the optimization of human hematopoietic progenitor cell cultures |
| WO1991009936A1 (en) * | 1989-12-26 | 1991-07-11 | Hana Biologics, Inc. | Proliferated neuron progenitor cell product and process |
| US5612211A (en) | 1990-06-08 | 1997-03-18 | New York University | Stimulation, production and culturing of hematopoietic progenitor cells by fibroblast growth factors |
| RU2028089C1 (ru) * | 1990-10-16 | 1995-02-09 | Украинский научно-исследовательский институт нейрохирургии | Способ лечения апаллического синдрома |
| EP0594669B9 (en) * | 1991-07-08 | 2008-03-19 | NeuroSpheres Holdings Ltd. | Growth factor-responsive neural progenitor cells which can be proliferated in vitro. |
| US5851832A (en) | 1991-07-08 | 1998-12-22 | Neurospheres, Ltd. | In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny |
| AU680406B2 (en) | 1992-03-04 | 1997-07-31 | Systemix, Inc. | Culturing of hematopoietic stem cells and their genetic engineering |
| JPH08509215A (ja) | 1993-04-13 | 1996-10-01 | アメリカ合衆国 | 移植治療のための神経由来胎児セルラインの使用 |
| US5753491A (en) | 1993-04-13 | 1998-05-19 | Us Health | Use of neuro-derived fetal cell lines for transplantation therapy |
| ES2217285T3 (es) | 1994-11-08 | 2004-11-01 | Cellfactors Plc | Metodo para producir una linea celular neural humana. |
| AU716811B2 (en) * | 1994-11-14 | 2000-03-09 | Neurospheres Holdings Ltd | Regulation of neural stem cell proliferation |
| US5843780A (en) | 1995-01-20 | 1998-12-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Primate embryonic stem cells |
| GB9517263D0 (en) * | 1995-08-23 | 1995-10-25 | Cancer Res Campaign Tech | Expression systems |
| GB9518606D0 (en) * | 1995-09-12 | 1995-11-15 | Inst Of Psychiatry | Neural transplantation |
| US5588692A (en) * | 1995-10-11 | 1996-12-31 | General Motors Corporation | Push-out vehicle side door |
| WO1998007841A1 (en) | 1996-08-19 | 1998-02-26 | University Of Massachusetts | Embryonic or stem-like cell lines produced by cross species nuclear transplantation |
| SE9604322D0 (sv) * | 1996-11-25 | 1996-11-25 | Astra Ab | Bacterial antigens and vaccine compositions II |
| US20020123143A1 (en) | 1997-08-22 | 2002-09-05 | Jean Toma | Multipotent stem cells from peripheral tissues and uses thereof |
| ES2246085T3 (es) * | 1998-05-07 | 2006-02-01 | University Of South Florida | Celulas de medula osea como fuente de neuronas util para reparar la medula espinal y el cerebro. |
| US5958767A (en) | 1998-08-14 | 1999-09-28 | The Children's Medical Center Corp. | Engraftable human neural stem cells |
| GB9904281D0 (en) | 1999-02-24 | 1999-04-21 | Reneuron Ltd | Transplantation |
| GB9907243D0 (en) * | 1999-03-29 | 1999-05-26 | Reneuron Ltd | Therapy |
| US6399384B1 (en) | 1999-09-17 | 2002-06-04 | Reneuron Limited | Conditional immortalization of cells |
| US6465215B1 (en) * | 1999-12-14 | 2002-10-15 | Reneuron Limited | Identification of cells for transplantation |
| JP2004500824A (ja) | 2000-03-09 | 2004-01-15 | クリオ−セル インターナショナル インコーポレーティッド | 脳および脊髄の修復のための神経組織源としてのヒト臍帯血 |
| US7250294B2 (en) | 2000-05-17 | 2007-07-31 | Geron Corporation | Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells |
| WO2001094541A2 (en) | 2000-06-05 | 2001-12-13 | University Of South Florida | Human mesenchymal progenitor cell |
| US7049072B2 (en) * | 2000-06-05 | 2006-05-23 | University Of South Florida | Gene expression analysis of pluri-differentiated mesenchymal progenitor cells and methods for diagnosing a leukemic disease state |
| WO2003029432A2 (en) | 2001-10-03 | 2003-04-10 | University Of South Florida | Human mesenchymal progenitor cell |
| GB0125773D0 (en) * | 2001-10-26 | 2001-12-19 | Reneuron Ltd | Constructs |
| DK1645626T3 (da) * | 2004-09-30 | 2008-01-21 | Reneuron Ltd | Cellelinie |
-
1995
- 1995-09-12 GB GBGB9518606.0A patent/GB9518606D0/en active Pending
-
1996
- 1996-09-12 EP EP96930260A patent/EP0850298B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-12 KR KR1019980701856A patent/KR19990044606A/ko not_active Application Discontinuation
- 1996-09-12 DK DK96930260T patent/DK0850298T3/da active
- 1996-09-12 PL PL96325646A patent/PL186777B1/pl unknown
- 1996-09-12 DE DE69628566T patent/DE69628566T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-12 PT PT96930260T patent/PT850298E/pt unknown
- 1996-09-12 CN CN96196376A patent/CN1193345A/zh active Pending
- 1996-09-12 ES ES96930260T patent/ES2196172T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-12 CZ CZ0055898A patent/CZ296669B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-09-12 SK SK306-98A patent/SK285816B6/sk unknown
- 1996-09-12 JP JP51175697A patent/JP4280872B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-12 AU AU69375/96A patent/AU711563B2/en not_active Expired
- 1996-09-12 WO PCT/GB1996/002251 patent/WO1997010329A1/en active IP Right Grant
- 1996-09-12 CA CA002231436A patent/CA2231436C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-12 RU RU98107327/14A patent/RU2185833C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-09-12 HU HU9802091A patent/HUP9802091A3/hu unknown
- 1996-09-12 AT AT96930260T patent/ATE242316T1/de not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-11 NO NO981072A patent/NO981072L/no not_active Application Discontinuation
- 1998-08-19 HK HK98110007A patent/HK1009154A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-01-12 US US09/760,274 patent/US7048921B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-02-28 US US10/376,119 patent/US20030147873A1/en not_active Abandoned
-
2005
- 2005-07-08 US US11/178,216 patent/US7371374B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2231436A1 (en) | 1997-03-20 |
| US7371374B2 (en) | 2008-05-13 |
| EP0850298A1 (en) | 1998-07-01 |
| US20010001662A1 (en) | 2001-05-24 |
| CZ296669B6 (cs) | 2006-05-17 |
| HUP9802091A3 (en) | 2001-01-29 |
| RU2185833C2 (ru) | 2002-07-27 |
| HK1009154A1 (en) | 1999-05-28 |
| WO1997010329A1 (en) | 1997-03-20 |
| GB9518606D0 (en) | 1995-11-15 |
| JP4280872B2 (ja) | 2009-06-17 |
| ATE242316T1 (de) | 2003-06-15 |
| DK0850298T3 (da) | 2003-09-15 |
| PL325646A1 (en) | 1998-08-03 |
| AU6937596A (en) | 1997-04-01 |
| JPH11513242A (ja) | 1999-11-16 |
| ES2196172T3 (es) | 2003-12-16 |
| EP0850298B1 (en) | 2003-06-04 |
| US20060051326A1 (en) | 2006-03-09 |
| SK285816B6 (sk) | 2007-09-06 |
| CZ55898A3 (cs) | 1998-06-17 |
| AU711563B2 (en) | 1999-10-14 |
| DE69628566D1 (de) | 2003-07-10 |
| SK30698A3 (en) | 1999-01-11 |
| NO981072L (no) | 1998-05-12 |
| DE69628566T2 (de) | 2004-05-06 |
| US20030147873A1 (en) | 2003-08-07 |
| NO981072D0 (no) | 1998-03-11 |
| CN1193345A (zh) | 1998-09-16 |
| KR19990044606A (ko) | 1999-06-25 |
| PT850298E (pt) | 2003-09-30 |
| HUP9802091A2 (hu) | 1998-12-28 |
| CA2231436C (en) | 2007-07-17 |
| US7048921B2 (en) | 2006-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7371374B2 (en) | Neural transplantation using pluripotent neuroepithelial cells | |
| Hammang et al. | Myelination following transplantation of EGF-responsive neural stem cells into a myelin-deficient environment | |
| Sinden et al. | Recovery of spatial learning by grafts of a conditionally immortalized hippocampal neuroepithelial cell line into the ischaemia-lesioned hippocampus | |
| JP4848538B2 (ja) | ヒトｃｎｓ神経幹細胞の培養 | |
| EP0664832B1 (en) | Remyelination using neural stem cells | |
| Doering et al. | Cholinergic expression by a neural stem cell line grafted to the adult medial septum/diagonal band complex | |
| US6913925B1 (en) | Human mesencephalon cell lines and methods of use therefor | |
| Lundberg et al. | Conditionally immortalized neural progenitor cells grafted to the striatum exhibit site-specific neuronal differentiation and establish connections with the host globus pallidus | |
| US6569421B2 (en) | Treatment of brain damage | |
| Gray et al. | Prospects for the clinical application of neural transplantation with the use of conditionally immortalized neuroepithelial stem cells | |
| US20030166276A1 (en) | Cultures of human CNS neural stem cells | |
| Hasegawa et al. | Trauma-induced tumorigenesis of cells implanted into the rat spinal cord | |
| US20050186184A1 (en) | Mammalian pluripotent neural cells and uses thereof | |
| Nakagawa et al. | Generation, Characterization, and Transplantation of Immortalized Human Neural Crest Stem Cells | |
| Aleksandrova et al. | Transplantation of stem/progenitor cells of human brain into adult rat brain | |
| Richardson | Transplantation of adult subependymal zone neuronal progenitor cells to diverse environments of the adult brain |