PL184659B1

PL184659B1 - Oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd i kodowany przez niego polipeptyd pACT sposób identyfikacji związków hamujących wiązanie pomiędzy białkiem kotwiczącym a partnerem wiązania mutant delecyjny kalcyneuryny sposób wzmagania ekspresji interleukiny sposób izolowania kalcyneuryny sposób hamowania atywności kalcyneuryny i sposób określania zawartości białka wiążącego kalcyneurynę i PKA

Info

Publication number: PL184659B1
Application number: PL95315627A
Authority: PL
Inventors: Lockerbie@Robert@O; Coghlan@Vincent@M; Howard@Monique@L; Gallatin@William@M; Scott@John@D
Original assignee: Icos Corporation; The State Of Oregon Acting By And Through The Ore
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1996-09-23
Publication date: 2002-11-29
Also published as: HU9602311D0; US6107104A; SK95096A3; US5871945A; CN1153830C; AU712168B2; BR9506540A; WO1996016172A3; NO963049D0; HU221881B1; WO1996016172A2; CA2181826A1; SK284105B6; CN1148407A; PL315627A1; NO963049L; FI962932A7; HUT75826A; FI962932A0; EP0748379A1

Abstract

1 .Oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd kodujacy polipeptyd pACT 59 o sekwencji Identyfikatora Sekw. Nr 33. 9. Sposób identyfikacji zwiazków hamujacych wiazanie pomiedzy bialkiem kotwiczacym a partnerem wiazania, znamienny tym, ze obejmuje: inkubowanie bialka kotwiczacego i znakowanego partnera w obecnosci i pod nieobecnosc poszukiwanego zwiazku hamujacego, w warunkach odpowiednich do zwiazania sie bialka kotwiczacego z partnerem, przy czym bialko kotwiczace jest immobilizowane na stalym podlozu; wyplukanie niezwiazanego partnera ze stalego podloza; okreslenie ilosci ligandu zwiazanego z immobilizowanym bialkiem kotwiczacym; porównanie ilosci partnera zwiazanego z bialkiem kotwiczacym w obecnosci zwiazku i ilosci partnera zwiazanego z bialkiem kotwiczacym pod nieobecnosc zwiazku; i okreslenie w ten sposób czy zwiazek zahamowal wiazanie pomiedzy bialkiem kotwiczacym i partnerem wiazania standardowymi sposobami. 18. Sposób wzmagania ekspresji interleukiny 2 przez limfocyty T, znamienny tym, ze obejmuje do- prowadzenie do kontaktu pomiedzy limfocytem T i jednym z nastepujacych peptydów o sekwencjach aminok- wasowych: Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile Albo Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd i kodowany przez niego polipeptyd pACT 59, sposób identyfikacji związków hamujących wiązanie pomiędzy białkiem kotwiczącym a partnerem wiązania, mutant delecyjny kalcyneuryny, sposób wzmagania ekspresji interleukiny 2, sposób izolowania kalcyneuryny, sposób hamowania aktywności kalcyneuryny i sposób określania zawartości białka wiążącego kalcyneurynę i PKA.

Kalcyneuryna jest zależnym od Ca²⁺/kalmoduliny białkiem, fosfatazą, i uczestniczy w wielu szlakach sygnalizacji wewnątrzkomórkowej (Guerini i Klee, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 9183-9187 (1989)). Enzym wykryto w komórkach eukariotycznych w zakresie od drożdży do ssaków (Cyert i Thorner, J. Cell. Biol., 107: 841a (1989); Klee i in., Adv. Enzymol., 61:149200 (1984)). Ponieważ kalcyneuryna może brać udział w wielu szlakach sygnalizacji w jednej komórce, muszą istnieć czynniki swoiście ukierunkowujące aktywność kalcyneuryny. Jednym z komórkowych czynników swoiście ukierunkowujących aktywność enzymatyczną jest kompartmentacja. Rozdziela ona szlaki sygnalizacji i zapewnia swoistość odpowiedzi komórkowej na różne bodźce. Kompartmentacja pewnych enzymów zachodzi przez oddziaływanie ich ze swoistymi białkami kotwiczącymi. Przykładowo, zależna od cAMP kinaza białkowa (PKA) zakotwiczona jest w swoistych miejscach wewnątrzkomórkowych przez wiązanie z białkami kotwiczącymi kinazę A (AKAP). Ponieważ, jak wykazano, AKAP wiąże białka inne niż PKA, rodzinę białek określa się ogólnie jako białka kotwiczące (Hirsch i in., J. Biol. Chem., 267: 2131-2134 (1992)). cAMP pobudza PKA przez wiązanie z podjednostką regulacyjną (R) spoczynkowego holoenzymu PKA i powoduje uwolnienie podjednostki katalitycznie czynnej (C). Występujądwie klasy podjednostki R; RI i RII, które tworzą, odpowiednio, typ I i typ II holoenzymu PKA. Wewnątrzkomórkowe rozmieszczenie tych izoform PKA wydaje się być zróżnicowane. Izoformy RI (RIa i RIP opisywane sąjako głównie cytoplazmatyczne i ograniczone są wyłącznie do przedziału jądrowego, podczas gdy ponad 75% izoform RII (RIIa i RIIp) jest rozproszonych i związanych błoną komórkową, składowymi cytoszkieletu, ziarnistości wydzielniczych, aparatu Golgi'ego, centrosomów i prawdopodobnie jąder.

Białka kotwiczące zostały zidentyfikowane w wielu organizmach. U morskiego bezkręgowca, Aplyia californica, przynajmniej siedem białek wiąże PKA (Cheley i in., J. Biol. Chem., 269, 2911 2920 (1994)). Jedno z tych białek jest szczególnie bogate we frakcjach błonowych i stabilizowanych taxolem mikrotubulach, a więc może kotwiczyć mikrotubule w błonach komórkowych jak również może wiązać PKA. Białko kotwiczące u ssaków jest, jak stwierdzono, spokrewnione z mikrotubulami; białko związane z mikrotubulami 2 (MAP2) łączy PKA z cytoszkieletem (Threukauf i Yallee, J. Biol. Chem., 257: 3284-3290 (1982): DeCamilli i in., J. Cell. Biol., 103: 189-203 (1986)). Miejsce wiążące PKA na MAP2 jest peptydemo 31 resztach aminokwasowych w końcu aminowym cząsteczki (Rubino i in.. Neuron, 3:631-638 (1986); Obar i in., Neuron, 3:639-645 (1989)).

Inne białko kotwiczące związane z mikrotubulami, AKAP 150, gromadzi się w dendrytach w bliskim związku z mikrotubulami (Glantz i in., Mol. Biol. Cell., 3:1215-1228 (1992)). AKAP 150 obecne jest w pewnych typach neuronów i jest członkiem rodziny białek kotwiczących będących głównymi białkami kotwiczącymi w mózgu ssaków. Do innych członków tej rodziny należy AKAP 75 znalezione w mózgu wołu i AKAP 79 odkryte w ludzkim mózgu (Glantz i in., J. Biol. Chem., 268:12796-12804 (1993)). AKAP 75 prawdopodobnie wiąże elementy cytoszkieletu przez dwa nieciągłe regiony w pobliżu swego końca N. AKAP 79 jest obecne głównie w zagęszczeniach postsynaptycznych (PSD) ludzkiego przodomózgowia (Carr i in., J. Biol. Chem., 267:16816-16823 (1992)).

Scharakteryzowano również inne białka kotwiczące.

Ekspozycja komórek warstwy ziarnistej na hormon pobudzający tworzenie pęcherzyków (FSH) i estradiol podwyższa, jak wykazano, ekspresję 80 kDa AKAP (Carr i in., J. Biol. Chem., 268:20729-20732 (1993). Inne AKAP, Ht31, sklonowano z biblioteki ludzkiej tarczycy (Carr i in., J. Biol. Chem., 267:13376-13382 (1992)). Inne białko kotwiczące, AKAP 95, zmienia swe położenie wewnątrzkomórkowe podczas cyklu komórkowego. AKAP 95 jest integralnym białkiem jądrowym podczas interfazy, ale staje się związane z PKA cytoplazmatyeznągdy błona

184 659 jądrowa rozpada się podczas mitozy. Wskazuje to, że AKAP 95 odgrywa rolę w ukierunkowywaniu aktywności pewnych izoform PKA podczas zależnych od cAMP zjawisk związanych z cyklem komórkowym (Coghlan i in., J. Biol. Chem., 269:7658-7665 (1994)). Do innych znanych białek kotwiczących zalicza się 85 kDa AKAP, które łączy PKA z aparatem Golgi'ego (Rios i in., EMBO J., 11:1723-1731 (1992)) oraz 350 kDa AKAP, które łączy PKA z centromerami (Keryer i in., Exp. Cell. Res., 204:230-240 (1993)).

Znane białka kotwiczące wiążą PKA na zasadzie wspólnego mechanizmu. Ponieważ budowa pierwszorzędowa białek kotwiczących nie jest zakonserwowana, każde z nich posiada motyw budowy drugorzędowej obejmujący amfipatyczny region helikalny (Scott i McCartney, Mol.Endo., 8:5-11 (1994)). Wiązanie białka kotwiczącego z podjednostką regulacyjną PKA jest blokowane przez peptyd naśladujący strukturę helikalną regionu wiążącego PKA białek kotwiczących. Zniszczenie struktury helikalnej peptydu przez podstawienie aminokwasu zapobiega blokowaniu wiązania białka kotwiczącego PKA (Carr i in., J. Biol. Chem., 266:14188-14192 (1991)), co wskazuje, że wiązanie PKA zachodzi w amfipatycznej helisie białek kotwiczących i jest spowodowane budową drugorzędową cząsteczek białek kotwiczących. Wewnątrzkomórkowe wiązanie i lokalizacja PKA przez białka kotwiczące powoduje rozdzielenie kinazy, która, jak np. kalcyneuryna, jest wspólna dla wielu szlaków sygnalizacji, co powoduje jej działanie w sposób swoisty dla szlaku.

PKA działa w wielu szlakach wewnątrzkomórkowych. Przykładowo, zahamowanie wiązania pomiędzy AKAP 79 i PKA w neuronach hipokampa powoduje, jak wykazano, zahamowanie receptorów glutaminianowych zależnych od kwasu 0^,-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego/kainianu (Rosenmund i in., Nature, 368:853-856 (1994)). Wskazuje to na regulację tych receptorów przez PKA. PKA reguluje również aktywność fosforylazy glikogenowej przez odwracalną fosforylację enzymu w odpowiedzi na wywołane bodźcem hormonalnym podwyższenie wewnątrzkomórkowego poziomu cAMP (Walsh i in., J. Biol. Chem., 243: 37633765 (1969)). Wykazano również, że cAMP hamuje sygnalizację przez szlaki kinazy MAP (Wu i in., Science, 262:1065-1072 (1993)). Zahamowanie to wywoływane jest aktywacjjiPKA, która hamuje aktywację Raf-1 przez Ras, blokując w ten sposób szlak kinazy MAP (Vojtek i in.. Cell, 74:205-214 (1993); Hafher i in., Mol. Cell Biol., 14:6696-6703 (1994)). Szlaki te są istotne w wielu rodzajach komórek i związane sąz wieloma czynnościami komórek jak aktywacja transkrypcyjna genu interleukiny 2, która jest istotna w aktywacji limfocytów T (Weiss i Littman, Cell, 76:263-274 (1994); Owaki i in., EMBO J„ 12:4367-4373 (1993)).

Podobnie jak PKA, kalcyneuryna związanajest z aktywacją limfocytów T (Clipstone i Crabtree, Nature, 357:695-694 (1992)). W limfocytach T, kalcyneuryna bierze udział w regulacji ekspresji IL-2 w następstwie pobudzenia limfocytów T (Weiss i Litmann, wyżej). Czynnikjądrowy aktywowanych limfocytów T (NFATp) jest, jak wykazano, substratem aktywności fosfatazowej kalcyneuryny. Sugeruje się, że w następstwie pobudzenia limfocytów T, defosforylacja NFATp za pośrednictwem kalcyneuryny umożliwia translokację NFATp z cytoplazmy do jądra gdzie NFATp oddziaływuje z Fos i Jun wywołując ekspresję genu IL-2 (Jain i in., Nature, 365:352-355 (1993)).

Rola kalcyneuryny w aktywacji limfocytów T dostarcza celu dla interwencji terapeutycznej w chorobach, w których biorą udział limfocyty T jak również opracowano wiele leków hamujących kalcyneurynę. W klinice stosuje się dwa z leków hamujących kalcyneurynę: cyklosporynę A (cyklosporynę) i FK506 (Thomson i Starzl, Immunol. Rev., 136:71-98 (1993)). Zarówno cyklosporyna jak i FK506 hamują kalcyneurynę wyłącznie po związaniu z pewnymi białkami wewnątrzkomórkowymi znanymi jak immunofiliny (odpowiednio, cyklofilina i FKBP 12) (Schreiber i Crabtree, Immunology Today, 13:136-142 (1992)). Tak więc, cyklosporyna i FK506 działająjako proleki. Po związaniu z ich odpowiedmąimmunofiliną, kompleksy lek/immunofilina wiążą się z kalcyneuryna, hamując w ten sposób aktywność fosfatazową.

Zahamowanie kalcyneurynyjest najwydajniej wykorzystywane w zapobieganiu odrzucenia przeszczepu po przeszczepieniu narządów. Cyklosporynę i FK506 stosuje się po przeszczepieniu nerek, wątroby, serca, płuc i szpiku (The Canadian Multicentre Transplant Study Group, N. Engl. J. Med., 314:1219-1225 (1986); Oyer i in., Transplant. Proc., 15:Suppl.1:2546-2552 (1983);

184 659

Starzl i in., N. Engl. J. Med., 305:266-269 (1981); The Toronto Lung Transplant Study Group, JAMA, 259:2258-2262 (1988); Deeg i in., Blood, 65:1325-1334 (1985)). Zastosowanie tego leczenia znacząco przedłużyło przeżycie przeszczepu i zmniejszyło śmiertelność w następstwie przeszczepienia (Narajan i in., Ann. Surg., 201:142-157 (1985); Showstack i in., N. Engl. J. Med., 321:1086-1092(1989)).

Cyklosporyna stosowana jest również w wielu chorobach autoagresyjnych. Zapalenie błony naczyniowej oka leczy się w ciągu kilku tygodni leczenia, ale szybko nawraca po odstawieniu cyklosporyny (Nussenblatt i in., Am. J. Ophtalmol., 96:275-282 (1983)). Podobnie, łuszczyca ogólnie poddaje się leczeniu cyklosporyną, ale szybko nawraca po zaprzestaniu leczenia (Ellis i in., JAMA, 256:3110-3116 (1986)). Jeżeli cyklosporynę poda się w ciągu dwóch miesięcy od wdrożenia leczenia insuliną, można wywołać i podtrzymywać okresowy stan niezależności od insuliny zarówno w cukrzycy typu I jak i typu II (Feutren i in.. Lancet, 2:119124 (1986); Bougneres i in., N. Engl. J. Med., 218:663-670 (1988)). Wiele nefropatii, włączywszy ogniskowe nefropatie typu „minimal change”, segmentowe, błonowe i wywołane IgA, mogąbyć wrażliwe na cyklosporynę, jakkolwiek, zmniejszenie proteinurii może być spowodowane zmniejszeniem przesączania kłębuszkowego, a nie wyleczeniem błony podstawnej (Tejani i in., Kidney Intl., 29:206 (1986)). Podawanie cyklosporyny wykazuje również zależny od dawki wpływ na reumatoidalne zapalenie stawów, jednakże takie leczenie związane jest ze znaczną częstościąneffotoksyczności (Forre i in., Arthritis Rheum., 30:88-92 (1987)).

Jak wspomniano wyżej, stosowanie cyklosporyny wiąże się z nefrotoksycznością (Mason, Pharmacol. Rev., 42:423-434 (1989)). Zaburzenie czynności nerek występują u praktycznie wszystkich pacjentów leczonych cyklosporyną (Kahan., N. Engl. J. Med., 321:1725-1738 (1989)). Generalnie, może być ono odwrócone przez zaprzestanie leczenia cyklosporyną. Niestety, u biorców przeszczepów narządowych zastąpienie cyklosporyny innym powszechnie stosowanym lekiem immunosupresyjnym niesie wysokie ryzyko odrzucenia przeszczepu. U pacjentów po przeszczepieniu nerek może to wymagać wdrożenia dializy. U pacjentów którym przeszczepiono serce, płuca lub wątrobę odrzucenie przeszczepu może doprowadzić do śmierci. Jakkolwiek znacznie rzadziej niż nefrotoksyczność, leczenie cyklosporyną może wiązać się z neuro- i hepatotoksycznoścćą(de Groen i in., N. Engl. J. Med., 317:861-866 (1987); Kahan i in., Transplantation, 43:197-204(1987)).

Znaczna toksyczność obserwowanajest również w przebigu stosowania FK506. Podobnie jak cyklosporyna, stosowanie FK506 wiąże się z nefrotoksycznością (Peters i in., Drugs, 4:746794 (1993)). Objawy kliniczne, morfologia zmian i występowanie są niemal równoważne związanych ze stosowaniem cyklosporyny (McCauley, Curr. Op. Nephrol. Hyperten., 2:662-669 (1993)). Ze stosowaniem FK506 wiąże się również neurotoksyczność (Eidelman i in., Transplant. Proc., 23:3175-3178 (1991); Fung i in., Transplant. Proc., 23:3105-3108(1991)). Wprzeciwieństwie do cyklosporyny, FK506 wykazuje wpływ raczej hepatotroficzny niż hepatotoksyczny (Peters i in., wyżej).

W świetle, potencjalnie, znacznej toksyczności leków immunosupresyjnych, jak cyklosporyna czy FK506, oczywistajest potrzeba dodatkowych czynników hamujących kalcyneurynę. Czynniki te powinny być, najkorzystniej, związane z rzadszymi objawami ubocznymi w porównaniu z obecnie dostępnymi lekami i w ten sposób mogłyby zapewnić korzyść leczenia immunosupresyjnego. Dodatkowo, istnieje potrzeba czynników hamujących PKA w limfocytach T, umożliwiających zwiększoną ekspresję interleukiny 2 w tych komórkach. Przedmiotem wynalazku jest czyszczony i wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd pACT 59. Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd pACT 59. Przedmiotem wynalazku jest również sposób identyfikacji związków hamujących wiązanie pomiędzy białkiem kotwiczącym a partnerem wiązania.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest mutant delecyjny kalcyneuryny.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wzmagania ekspresji interleukiny 2 w limfocytach T.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób izolowania kalcyneuryny.

184 659

Przedmiotem wynalazku jest również sposób hamowania aktywności kalcyneuryny w komórce.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób określania zawartości białka wiążącego kalcyneurynę i PKA.

Niniejszy wynalazek opiera się częściowo na odkryciu, że kalcyneuryna wiąże się z AKAP 79. Przez związanie zarówno PKA jak i kalcyneuryny, AKAP 79 umiejscawia równocześnie kinazę i fosfatazę, które mogą regulować przepływ informacji przez swoisty szlak sygnalizacji. Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycji i sposobów izolowania kalcyneuryny jak również hamowania aktywności kalcyneuryny w komórce. Sposoby izolacji obejmują doprowadzenie do kontaktu frakcji komórkowej z AKAP 79 albo jego fragmentem wiążącym kalcyneurynę, immobilizowanym na podłożu stałym, a następnie wypłukiwanie z niego kalcyneuryny. Sposoby hamowania kalcyneuryny obejmują doprowadzenie do kontaktu pomiędzy komórką a AKAP 79 albo jego fragmentem wiążącym kalcyneurynę. Najkorzystniej, peptyd wiążący kalcyneurynę nie wiąże równocześnie PKA. Korzystne peptydy zawierają następującą sekwencję aminokwasową:

Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Se'r-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro (Identyfikator Sekw. Nr 1)

Zamienne peptydy użyteczne w sposobach zahamowania kalcyneuryny, według niniejszego wynalazku, obejmują:

Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln (Identyfikator Sekw. Nr 2) oraz

Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys (Identyfikator Sekw. Nr 3)

Peptydy te są homologiczne z wiążącymi kalcyneurynę sekwencjami aminokwas owymi AKAP 79. Jakkolwiek, peptydy te są podobne do wiążącego kalcyneurynę regionu FKBP 12, w przeciwieństwie do hamowania kalcyneuryny przez kompleks FK506/FKBP 12, peptydy te hamują aktywność kalcyneuryny bez koniecznego oddziaływania z inną cząsteczką.

Peptydy mogą być modyfikowane w celu ułatwienia wnikania do komórki, przez, przykładowo, sprzęganie z cząsteczką rozpuszczalną w lipidach. Przykładowo, peptydy mogą być skonjugowane z kwasem mirystylowym. Ewentualnie, peptydy mogą być zamykane w liposomach, które mogą ulegać fuzji z błonami komórkowymi i uwalniać peptydy do komórek.

Innym przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby określania czy komórka zawiera białko kotwiczące wiążące kalcyneurynę lub wiążące PKA. Sposób, ogólnie, obejmuje rozbicie komórki z wytworzeniem lizatu; inkubowanie lizatu z podłożem stałym, które posiada immobilizowane na sobie cząsteczki kalcyneuryny; wypłukiwanie lizatu z podłoża stałego; doprowadzenie do kontaktu podłoża stałego ze znakowanymi podjednostkami regulacyjnymi PKA; odpłukanie nie związanych podjednostek regulatorowych z podłoża stałego; wykrywanie znacznika na podłożu stałym i określenie na tej podstawie obecności w komórce białek kotwiczących wiążących kalcyneurynę i wiążących PKA. Alternatywnie, podjednostka regulatorowa PKA może być immobilizowana na podłożu stałym zaś cząsteczką znakowaną może być kalcyneuryna. Ogólnie, podjednostka regulatorowa PKA powinna być podjednostka RII.

Sposoby te sąużyteczne do identyfikacji dodatkowych białek wiążących zarówno PKAjak i kalcyneurynę. Identyfikacja takich białek może dostarczyć swoistych tkankowo celów do interwencji terapeutycznej.

Niniejszy wynalazek obejmuje również sposoby identyfikacji związków modulujących wiązanie pomiędzy kalcyneuryną i białkiem kotwiczącym kalcyneurynę. Zarówno kalcyneuryna jak i białko kotwiczące może być związane z podłożem stałym. Niezwiązana cząsteczka wiążąca jest znakowana w sposób umożliwiający wykrycie. Obie cząsteczki wiążące się są inkubowane w obecności badanego związku. Wpływ badanego związku na wiązanie pomiędzy kalcyneuryną i białkiem kotwiczącym kalcyneurynę określany jest przez obserwację ilości znacznika związanego z immobilizowaną cząsteczką wiążącą. Zmniejszenie ilości związanego znacznika w obecności badanego związku w porównaniu z ilością znacznika związanego pod nieobecność badanego związku

186 (659 wskazuje, że badany związek jest inhibitorem wiązania pomiędzy kalcyneuryną i białkiem kotwiczącym kalcyneurynę. Mogą być również zastosowane inne testy jak np. test scyntylacyjny.

Jeszcze jednym przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób wzmagania ekspresji interleukiny 2 przez limfocyty T. Zahamowanie aktywności kinazowej PKA czy lokalizacja PKA w limfocytach T wzmaga ekspresję białek znajdujących się pod kontrolą elementów promotorowych regulujących transkrypcję genu interleukiny 2. Sposoby te, ogólnie, obejmują doprowadzenie do kontaktu limfocyta T z jedną z następujących sekwencji aminokwasowych:

Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile (Identyfikator Sekw. Nr 5) albo

Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-He-Val-Asp-Ala-Val-IleGlu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr (Identyfikator Sekw. Nr 9)

Peptyd o Identyfikatorze Sekw. Nr 5 jest peptydem hamującym aktywność kinazowąPKA. Peptyd o Identyfikatorze Sekw. Nr 9 jest peptydem homologicznym do regionu wiążącego PKA białka kotwiczącego HT31. Peptydy te mogą zmodyfikowane w celu ułatwienia wnikania do komórek albo zamykane w liposomach jak to opisano wyżej. Wynalazek obejmuje liczne zastosowania sposobów użycia peptydów. Przykładowo, sposoby mogą być zastosowane w celu pobudzenia odpowiedzi odpornościowej, pobudzenia aktywowanych limfocytów T do ekspansji klonalnej lub zwiększenie odpowiedzi limfocytów T na bodźce doświadczalne w celu badania wczesnych zjawisk w biologii limfocytów T i aktywacji odpowiedzi odpornościowej.

Figura od 1A do 1B przedstawiają zahamowanie aktywności fosfatazowej kalcyneuryny przez AKAP 79 pełnej długości i przez wiążący kalcyneurynę fragment AKAP 79.

Figura od 2A do 2C przedstwiają wewnątrzkomórkową lokalizację PKA typu II i kalcyneuryny jak również wspólne umiejscowienie PKA typu II i kalcyneuryny.

Figura 3 przedstawia homologię pomiędzy klonem 11.1 i izoformą 11.1 ludzkiej kalcyneuryny.

Figura 4 przedstawia zwiększenie wewnątrzkomórkowego stężenia cAMP wywołanego przez działanie forskolinem i IBMX na komórki Jurkat.

Fig. od 5A do 5H przedstawiają wydruki z FACS pokazujące wpływ zahamowania i delokalizacji PKA na transkrypcję białka kontrolowaną przez promotor interleukiny 2.

Peptydy wykorzystane w sposobach według niniejszego wynalazku mogąbyć syntetyzowane w roztworze albo na podłożu stałym według standartowych technik jak opisane w publikacjach Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis, wyd. 2., Pierce Chemical Company, (1984) albo Tam i in., J. Am. Chem. Soc., 105:6442 (1983), które to zamieszczono tu jako odnośniki. Peptydy mogąbyć mirystylowane technikami standartowymi jak to opisano w Eichholtz i in., J. Biol. Chem., 268:1982-1986 (1993). Zamykanie w liposomach może być również wykonane standartową technikąjak to opisano w patentach USA Nr 4,766,046, 5,169,637, 5,180,713, 5,185,154, 5,204,112 i 5,252,263 i zgłoszeniu PCT Nr 92/02244, wszystkie zamieszczone tu jako odnośniki.

Poniższe przykłady przedstawiono w celu zobrazowania a nie ograniczania. Przykład 1 opisuje powiązanie kalcyneuryny z AKAP 79 i PKA. Przykład 2 dotyczy zahamowania aktywności kalcyneuryny przy użyciu peptydów uzyskanych z sekwencji aminokwasowej AKAP 79. Przykład 3 odnosi się do wewnątrzkomórkowego rozmieszczenia PKA typu II i kalcyneuryny. Przykład 4 opisuje dwuhybrydowy test pokazujący fizjologiczne połączenie pomiędzy AKAP 79 i kalcyneuryną. Przykład 5 dotyczy analizy wiązania AKAP 79 z kalcyneuryną. Przykład 6 opisuje zastosowanie mutantów kalcyneuryny w celu określenia miejsca wiązania AKAP 79. Przykład 7 dotyczy oddziaływania pomiędzy AKAP 79 i podjednostkąRI PKA. Przykład 8 opisuje sposób przeszukiwania w celu wykrycia inhibitorów kompartmentacji PKA. Przykład 9 opisuje udział białek kotwiczących w modulacji ekspresji IL-2. Przykład 10 dotyczy identyfikacji innych białek wiążących AKAP 79. Przykład 11 opisuje oddziaływanie pomiędzy AKAP 79 i PKC. Przykład 12 odnosi się do potencjalnych zastosowań klinicznych białek kotwiczących.

184 659

Przykład 1

Ten przykład pokazuje występujące naturalnie powiązanie kalcyneuryny z AKAP 79 i PKA. AKAP 79 działa więc umiejscawiając wspólnie powszechnie występującą kinazę i powszechnie występującą fosfatazę. To wspólne umiejscowienie może zapewniać swoistą regulację enzymów w szlaku sygnalizacji przez fosforylację i defosforylację enzymów.

Immunoprecypitację kalcyneuryny (CaN) z ekstraktu mózgu wołu oczyszczonego na agarozie sprzężonej z kalmoduliną uzyskano przy zastosowaniu oczyszczonych powinowactwem przeciwciał swoistych dla CaN A lub CaN B, jak to opisano ogólnie w Halowe. i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), z wyjątkiem dodanego ostatniego płukania przy użyciu buforuA(10MHEPESpH7.9, 1.5mMMgCl₂, 10mMKCl, 1 mM PMSF i 10 MIBMX) + 0.4 M NaCl. Aktywność PKA została zmierzona jak to opisano w publikacji Scott i in.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4379-4383 (1985), załączonej tu jako odnośnik, po elucji immunoprecypitatu przy użyciu 0.1 mM cAMP. Fosforylację immunoprecypitowanych białek zapoczątkowano przez dodanie 0.1 /mM ³²P-ATP (1.5 x 105 cpm/nmol) i, po 30 min. w 30°C reakcję przerwano przez dodanie buforu do nakładania z SDS i poddano SDS-PAGE. Podjednostkę R PKA oczyszczono z frakcji 30-60% (NH₄)₂SO₄ ekstraktu mózgu przy użyciu cAMP/agarozy metodą opisanąw publikacji Coghlan i in., J. Biol. Chem., 269:7658-7665 (1994) (załączonej tujako odnośnik) z wyjątkiem tego, że białko eluowano 0.5 mM peptydem Ht3 1 (Identyfikator Sekw. Nr 4). Badanie metodą „Western błot” i nakładki PKA RII wykonano jak to opisano w Coghlan i in., wyżej. Aktywność kinazową wykrywano w ekstraktach oczyszczonych kalmoduliną, wzbogacono ją 123-r3.6-kiOt.nie (± odchylenie standartowe; n=3) w immunoprecypitacie CaN i była swoiście zahamowana peptydem PKI (Identyfikator Sekw. Nr 5) hamującym aktywność kinazową PKA, co wskazuje, że podjednostka katalityczna (C) PKA była składnikiem wyizolowanego kompleksu. Wołowy homolog AKAP 79 (AKAP 75) i RII, oba będące substratami podjednostki C, były również obecne w immunoprecypitacie i były fosforylowane po dodaniu cAMP i ³²P-ATP. W dodatkowych doświadczeniach, podjednostkę R PKA wyizolowano z surowych ekstraktów mózgu wołu, przez chromatografię powinowactwa na agarozie'/cAMP. Traktowanie kolumny powinowactwa peptydem Ht31 swoiście eluowało AKAP 75 z RI związanej z cAMP i również uwalniało podjednostki CaN A jak i CaN B. Około 5% całkowitego CaN obecnego w lizacie było, jak stwierdzono w badaniu metodą “Western błot”, związane z AKAP 75 i RII. Podsumowując, wyniki te wskazująna równoczesne powiązanie pomiędzy PKA i CaN oraz białkiem kotwiczącym.

Przykład 2

Przykład ten pokazuje zahamowanie aktywności fosfatazowej kalcyneuryny przez peptydy pochodzące z AKAP 79.

W celu określenia czy wiązanie peptydów AKAP 79 było hamujące, aktywność kalcyneuryny (CaN) badano w obecności rekombinowanego AKAP 79. Pokrótce, rekombinowane AKAP 79 poddano ekspresji w E. coli, jak to opisano w publikacji Carr i in., J. Biol. Chem., 267:16816-16823 (1992), załączonej tujako odnośnik. CaN i konstytutywnie czynnego, okrojonego mutanta CaN:™ (okrojoną, niezależną od Ca2⁺/kalmoduliny konstytutywnie czynną postać CaN (Perrino i in., J. Biol. Chem., w druku)) poddano ekspresji w komórkach Sf9 i oczyszczono na Sepharozie/kałmodułinie, jak to opisano w Perrino i in., J. Biol. Chem., 267:15965-15969 (1992), załączone tujako odnośnik. Aktywność fosfatazowa w stosunku do znakowanego 32p substratu peptydowego RII mierzona byłajak to opisano w Perrino i in., wyżej CaN (30 nM), kalmodulinę (100 nM) i peptyd RII znakowany 32p (22 pM) inkubowano z białkiem AKAP 79 i peptydem AKAP 79 (Identyfikator Sekw'. Nr 1 - aminokwasy od 81 do 102) w zakresie stężeń pokazanym na fig. 1B. W testach z CaN420 pominięto kalmodulinę. 32p uwalniany z substratu był mierzony w próbkach w potrójnym powtórzeniu w trzech niezależnych doświadczeniach przez pomiar scyntylacji. Stała zahamowania (Ki) rekombinowanego AKAP 79 dla CaN oznaczona została analizą regresji liniowej danych. Wartości K, dla peptydu AKAP 79 określono przez oznaczenie IC50 przy użyciu stałego stężenia substratu K_m (42^M).

Figura 1A przedstawia wykres Lineweavera-Burka zahamowania AKAP 79 zarówno CaN pełnej długości (zależne od Ca2⁺/kalmodubny) (kółka) i CaN420 (kwadraty) w sposób niekompe10

184 659 tycyjny w odniesieniu do fosforylowanego substratu peptydu RII. Symbole otwarte przedstawiają aktywność fosfatazowąpod nieobecność AKAP 79, zaś symbole wypełnione przedstawiają aktywność fosfatazowąw obecności AKAP 79. Syntetyczny peptyd, odpowiadający peptydowi AKAP 79 hamował zarówno CaN pełnej długości (wypełnione kółka) jak i CaN,^, podczas gdy peptyd Ht31 nie był inhibitorem CaN (Fig. 1B). Obserwowane zahamowanie było swoiste dla kalcyneuryny; peptyd AKAP 79 nie zakłócał znacząco aktywności fosfataz białkowych 1 (otwarte romby) czy 2A (krzyżyki) w stężeniach peptydu rzędu nawet 0.4 mM. Jakkolwiek, miejsca wiązania CaN na AKAP 79 i FKBP 12 sąpodobne, ich różnice mogąmieć znaczenie funkcjonalne: FK506 (2 μΜ) nie wpływał na siłę zahamowania zaś rekombinowane AKAP 79 nie wykazywało aktywności izomerazy peptydylowo-prolilowej w stosunku do znakowanego fluorescencyjnie substratu peptydowego. Ponadto, podjednostka B CaN, która jest niezbędna do oddziaływania FK506/FKBP z podjednostką. A CaN, nie jest niezbędna do oddziaływania AKAP 79 z podjednostką A CaN. Również, podczas gdy oddziaływanie FK506/FKBP z CaN A jest zależne od wapnia/kalmoduliny, zahamowanie aktywności kalcyneuryny przez AKAP 79 jest niezależne od wapnia/kalmoduliny. Podsumowując, powyższe odkrycia wskazują, że CaN w swym nieaktywnym stanie umiejscowione jest przez AKAP 79 w sposób analogiczny do związanej z białkiem kotwiczącym PKA.

Przykład 3

Przykład ten pokazuje rozmieszczenie wewnątrzkomórkowe PKA typu II i kalcyneuryny w różnych tkankach.

Wewnątrzkomórkowe położenie wielu kinaz białkowych i fosfataz białkowych jest określone przez skojarzenie z podjednostkami docelowymi. AKAP 79 stanowi nowy element tej klasy białek regulatorowych, ponieważ pełni podwójną rolę umiejscawiając zarówno PKA jak i CaN.

Komórki hodowano, utrwalano formaliną i barwiono immunologicznie jak to opisano w Rosenmund i in., Nature, 368:853-856 (1994). Do barwienia na RII użyto znakowanych FITC wtórnych surowic odpornościowych przeciw-kozich. Do barwienia CaN użyto biotynowanych surowic wtórnych przeciw-króliczych i kompleksu streptawidyna-Tereas-Red (Jackson). Obraz uzyskano przy użyciu układu laserowego mikroskopu konfokalnego Biorad MRC-600 (filtry A1 i A2) z mikroskopem Nikon optophot 2 wyposażonym w obiektyw do immersji 60x planappo chromat (1.6 NA). Skrawki konfokalne miały grubość od 1,5 do 2 μm.

Homologi AKAP 79 obserwowano w mózgach wołu, świni, królika i myszy. Wskazuje to, że wspólne umiejscowienie PKA i CaN może być powszechnym zjawiskiem dostosowującym neurony do swoistych zjawisk przekazywania sygnału. Przy użyciu metod immunocytochemicznych, badano rozmieszczenie wewnątrzkomórkowe PKA typu II i CaN w hodowanych neuronach hipokampa. Wzorzec zabarwienie dla RII (zielony znacznik na fig. 2A) i CaN (czerwony znacznik na fig. 2b) był rozproszony regionalnie i nakładał się w neurytach (na fig. 2C RII jest czerwony zaś CaN zielony). Wyniki te są zgodne ze wspólnym umiejscowienieniem PKA typu II i CaN przez białko kotwiczące i sugeruje rolę kompleksu czwartorzędowego w regulacji przewodzenia synaptycznego. Jest to zgodne z doświadczeniami pokazującymi wspólne umiejscowienie RII i AKAP 79 w tych komórkach oraz badaniami pokazującymi, że AKAP 79, PKA typu II i CaN są składnikami zagęszczeń postsynaptycznych. Potencjalnym substratem dla umiejscowionego czwartorzędowego kompleksu transdukcyjnego mogą być receptory AMPA/kainianowe, modulowane kierowaną białkiem kotwiczącym PKA.

Przykład 4

Przykład ten pokazuje oddziaływanie pomiędzy AKAP 79 i kalcyneurynąw dwuhybrydowym teście z użyciem drożdży. Używając AKAP 79 jako „przynęty”, odkryto, że kalcyneuryna kodowana przez cDNA z biblioteki mysich limfocytów T wiąże się z AKAP 79.

Test wykonano, ogólnie, jak to opisano w publikacji Durfee i in., Genes and Developinent 7:555-567 (1993), załączone tu jako odnośnik. „Celem” i „przynętą” były dwa plazmidy, z których każdy zawierał część czynnika transkrypcyjnego Gal-4. Plazmid-„przynętę” (pAS1) stanowił plazmid z promotorem ADH połączonym z podjednostką wiążącąDNA czynnika Gal-4 (aminokwasy od 1 do 147, opisane w Keegan i in., Science, 231:699-704 (1986), załączone tu

184 659 jako odnośnik), po której następował znacznik hemaglutyniny (HA), miejsce klonowania i terminator ADH. Selekcji dokonywano w pożywce SC-Trp. Kostrukt-„cel” stanowił plazmid leu2, zawierający promotor i terminator ADH z aktywująca transkrypcję domeną II Gal-4 (aminokwasy od 768 do 881, jak to opisano w Mma i Ptashne, Cell, 48:847-853 (1987), załączone tu jako odnośnik), po której następowało miejsce klonowania. Wektor ten, pACT, zastosowano do wykonania fuzyjnej biblioteki cDNA mysich limfocytów T. Saccharomyces cerevisiae y190 zastosowane do przesiewania zmieniono wprowadzając do ich genomu dwa geny reporterowe. Geny te znajdują się pod kontrolą promotora Gal-1 zawierającego miejsca wiązania Gal-4. Jeżeli białka kodowane przez plazmid-„przynętę” i plazmid-„cel” połączą się, podjednostki czynnika transkrypcyjnego Gal-4 są zbliżane do siebie i działają zapoczątkowując transkrypcję genów reporterowych.

Z plazmidu pET11d wyizolowano fragment NcoI/BamHI, wielkości 1.3 kb, kodujący AKAP 79 i ligowano do pAS1 aby działał jako „przynęta” do przesiewania. Jednym mikrogramem konstruktu transformowano y190a MATa i y190 MATa przy użyciu standartowej techniki transformacji z octanem litu-PEG. Cztery izolaty każdego z typów rozmnażania (y190A pAS1 AKAP 79 1-4 i y190 pASI AKAP 79 1-4) zbadano w kierunku ich zdolności do oddziaływania z konstruktem fuzyjnym pACT-RII zawierającym podjednostkę regulacyjną PKA (aminokwasy RII od 1 do 89). Uzyskano to przez krzyżowanie szczepów na podłożu YEPD (1% ekstrakt drożdżowy Bacto, 2% pepton Bacto, 2% dekstroza i 2% agar Bacto) przez noc w temperaturze 30°C i selekcję diploidów na płytkach z pożywką SC-Leu-Trp. Następnie, gen lac Z E. coli działając jako reporter może być badany na podstawie aktywności β-galaktozydazowej. Skrzyżowane szczepy replikowano na płytki SC-Leu-Trp przykryte filtrami Hybond-N (Amersham) i hodowano przez noc. Filtry umieszczano w ciekłym azocie na jedną minutę w celu rozerwania drożdży. Krążek z papieru 3MM nasączony ok. 3 ml 0.1 % X-gal w 60 mM Na₂HPO₄,40 mM NaH₂PO₄, 10 mM KC1 i 10 mM MgSO₄. Filtr z rozerwanymi drożdżami umieszczono na krążku i pozostawiono do wywołania w 30°C przez 1-2 godziny. Szczepy diploidalne zawierające zarówno fbzje pAS1 AKAP 79 jak i pACT RH, które były pozytywne pod względem aktywności (β-gal widoczne były z powodu zmiany koloru kolonii drożdży na niebieski. Plazmid-„przynęta” AKAP 79 pozostał biały po skrzyżowaniu z pustą kontrolą pACT.

Wykrywanie białka fuzyjnego Gal-4 AKAP 79 wykonano przez hodowanie y190A AKAP 79 (izolaty 1i 2) z y190a AKAP 79 (izolaty 1 i 2) w gęstości 2x10⁷ komórek/ml w 50 ml pożywki SC-Trp. Komórki żwirowano przy 3000 xg przez 10 minut i poddano lizie przy użyciu 200 gl perełek szklanych (wielkości 425-600 mikronów) w buforze do lizy 25 mM Tris pH 8.5, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 2 mM O-fenantrolinie, 1 mM DTT, 25 pM chlorowodorku 4-(2-aminoetylo)-benzenosulfonylo fluorku, ciężar cząsteczkowy 239.5 (AEBSF), 1 mM benzanidynie, 1 pg/ml PLACC (pepstatyna, leupeptyna, aprotynina, kalpaina I i II) oraz 20 pg/ml bestatyny. Komórki na zmianę wytrząsano przez minutę i trzymano na lodzie przez minutę w ciągu 24 minut (12 cykli). Określono stężenia białek i nałożono 30 pg białka całkowitego na 10% żel SDS-PAGE. Rozdzielone białko przeniesiono na mokro na Immobilon-P (Millipore) i wykrywano standardowymi sposobami przy użyciu przeciwciała monoklonalnego 12CA5 przeciwko HA (Bab Co., Berkeley, CA) i wtórnej koziej surowicy przeciwko mysim IgG skonjugowanej z fosfatazą alkaliczną (Biorad, Hercules, CA). Białko fuzyjne Gal-4 AKAP 79 o ciężarze ok. 100 kDa było widoczne wskazując na istnienie produktu o prawidłowej wielkości w tych szczepach.

Izolat 1 y190A pAS1 AKAP 79 wybrano do przesiewania biblioteki cDNA mysich limfocytów w pACT. 500 ml hodowli w SC-Trp (OD₆₀₀=O.6-0.8) zebrano, przepłukano 100 ml wody destylowanej i ponownie żwirowano. Do peletki dodano 50 ml LiSORB (100 mM octan litu, 10 mM Tris pH 8.1,1 mM EDTA pH 8 i 1M sorbitol) przeniesiono do 11 butelki i wytrząsano przy 220 rpm w trakcie 30 min. inkubacji w 30°C. Komórki żwirowano i zawieszono w 625 pl LiSORB i trzymano na lodzie w trakcie przygotowywania DNA.

DNA przygotowano do transformacji przez zagotowanie 400 pl 10 mg/ml DNA ze spermy łososia przez 10 minut, po czym dodano 500 pl LiSORB i pozostawiono do ostyjgmęęcia do temperatury otoczenia. Dodano DNA z biblioteki mysich limfocytów T (40-50 pg) z roztworu podstawowego 1 mg/ml. Schłodzoną hodowlę drożdży rozdzielono do 10 probówek Eppendorfwraz

184 659 z 120 gl przygotowanego DNA. Probówki inkubowano w 30°C przy 220 rpm. Po 30 minutach do każdej z probówek dodano 900 gl 40% PEG₃3₅₀ w 100 mM octanie litu, 10 mM Tris pH 8 i 1 mMm EDTA pH 8, i inkubowano przez dalsze 30 minut. Próbki połączono i pobrano małe porcje (5 ul) w celu zbadania wydajności transformacji i wysiano na płytki SC-Leu-Trp. Pozostałość komórek dodano do 100 ml pożywki SC-Leu-Trp-His i namnażano przez 1 godz. w 30°C wytrząsając (220 rpm). Zebrane komórki zawieszono w 5.5 ml pożywki SC-Leu-Trp-His z dodatkiem 50 mM 3 AT (3-amino triazol) i wysiewano porcje po 300 gl na 150 mm płytki SC-LeuTrp-His+50 mM 3AT i pozostawiono do wzrostu przez tydzień w 30°C.

Po czterech dniach, płytki do miareczkowania zliczano i przesiewano 1.1x105 kolonii. Na płytkach z biblioteką wykonano duże badanie (β-gal i wyizolowano 10 pozytywnych klonów jako pojedyncze kolonie. Jedną z kolonii, która rosła znacznie szybciej niż pozostałe nazwano 11.1. Ze szczepów tych wyizolowano całkowite DNA i plazmid leu2. „Uratowany” plazmid został użyty do ponownej transformacji wyjściowych szczepów-przynęt y190A AKAP 79 i y190a. Wyłącznie klon 11.1 pozostawał pozytywny pod względem aktywności β-galaktozydazowej w y 190A pAS 1 AKAP 79. y 190a zawierający pACT klon 11.1 pozostawał biały służąc jako kontrola negatywna.

Trawienie restrykcyjne endonukleazaXhoI uwolniło wstawkę wielkości 2.3 kb zaś plazmid sekwencjonowano w obu kierunkach. Reakcje wykonane przy użyciu zestawu Dye Deoxy Terminator Cycle Seguencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) w oparciu o symetryczną reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) na dwuniciowych matrycach analizowano na urządzeniu do automatycznego sekwencjonowania ABI 373A (Applied Biosystems, Inc.). Sekwencje z klonu 11.1 wykazały otwartąramkę odczytu długości 487 aminokwasów (Identyfikator Sekw. Nr 6), która była prawidłowo zfuzowana z domeną aktywującą Gal-4 pACT. Przeszukano bazę danych sekwencji NIH i stwierdzono, że sekwencja jest homologiczna z ludzką zależną od kalmoduliny fosfataząbiałkową, kalcyneuryną. Analiza komputerowa klonu 11.1 i ludzkiej izoformy A1 wykazała 80% identyczność na poziomie kwasu nukleinowego i 93% identyczność na poziomie aminokwasów (fig. 3). Pierwsze 10 aminokwasów i wstawka 18 aminokwasów w ludzkiej sekwencji jest ni obecna w sekwencji mysiej 11.1. Klon 11.1 jest blisko spokrewniony z sekwencją mysiej kalcyneuryny A β, ale różni się końcem karboksylowym. Podobnie, izoformy ludzkiej kalcyneuryny A1 i A2 sąbardzo homologiczne ale różniiisię od siebie swoimi końcami 3'.

Swoistość oddziaływania pomiędzy AKAP 79 i kalcyneuryną wykazano krzyżując szczep zawierający pACT z kalcyneurynąz innymi niespokrewnionymi szczepami-przynętami. Krzyżowanie wykonano jak to opisano wyżej ze szczepami zawierającymi pAS1 zluzowany z RII (1-89), kinazą kazeinową 1, fosfodiesterazą 32 (HDUN2) i AKAP Ht31. Aktywność β-galaktozydazowa była negatywna we wszystkich tych szczepach diploidalnych.

Przykład 5

Wcelu dalszego badania istoty oddziaływania AKAP 79 z klonem 11.1, skonstruowano szereg mutantów delecyjnych kalcyneuryny 11.1 i każdy z plazmidów badano w układzie dwuhybrydowym.

Przy użyciu tego samego oligonukleotydu 5' (MH47) i czterech oligonukleotydów 3' (MH48, MH49, MH50 i MH51) nastawiono reakcje PCR w celu amplifikacji regionów kalcyneuryny 11.1 kodujących, odpowiednio, aminokwasy 1-104,1 -204,1 -312 i 1 -400. Fragmenty te trawiono BglII i klonowano do pACT. Położenie potwierdzono mapowaniem trawieniem restrykcyjnym i określono błędy PCR sekwencjonowaniem. Plazmidy, które, jak stwierdzono, prawidłowo kodowały zamierzonego mutanta delecyjnego transformowano do yl.90)MATa i y190MATo. Szczepy drożdży krzyżowano z y190apAS1 i y190apAS1 AKAP 79 równocześnie z oryginalnym klonem pACT 11.1 kodującym aminokwasy 1 - 487 z Identyfikatora Sekw. Nr 6. Powstała z krzyżowania płytka była badana filtrem, jak to opisano wyżej, i obserwowano, że tylko białko fuzyjne kodujące aminokwasy 1- 400 albo 1-487 były zdolne do inicjacji transkrypcji genu reporterowego. Obserwacja, że białko fuzyjne zawierające aminokwasy 1-312 było niezdolne do inicjacji transkrypcji wskazuje, że wiązanie AKAP 79 wymaga reszt aminokwasowych pomiędzy 313 i 400. Region ten, jak to uprzednio wykazano, zawiera domenę wiążącą

184 659

FKBP/FK506 jak również domenę wiążącą kalcyneurynę (Husi i in., J. Biol. Chem., 269:1419914204 (1994)).

W celu bardziej precyzyjnego zdefiniowania sekwencji aminokwasowych niezbędnych do wiązania AKAP 79, skonstruowano dalsze mutanty delecyjne i badano na wiązanie z AKAP 79.

Wytworzono konstrukty ekspresyjne kodujące domeny 332-441, 332-487 i 442-487, kodowanej przez pACT kalcyneuryny 11.1. Jak poprzednio, każdy konstrukt sekwencjonowano i określano ekspresję prawidłowego mutanta przed transformowaniem do drożdżowego szczepu pAS1 AKAP 79.

Jednakże, po transformacji nie stwierdzono żadnej ekspresji genu reporterowego, co wskazywało, że mutanty były niezdolne do oddziaływania z AKAP 79. Jednym z możliwych tłumaczeń braku wiązania AKAP 79 jest utrata struktury drugorzędowej białka niezbędnej do wiązania z powodu okrojenia klonów, albo że pewna aminokońcowa sekwencja może być również konieczna do wiązania.

Poprzednie obserwacje wskazywały, że oddziaływanie pomiędzy kompleksem immunofiliny FKBP/FK506 z kalcyneurynąA wymaga kalcyneuryny B (Haddy i in., FeBS 314:37-40 (1992)). W celu zbadania, czy kalcyneury naB ekspresjonowana egzogennie w szczepie drożdży yl90 uczestniczy w obserwowanym wiązaniu AKAP 79/kalcyneuryna, wykorzystano szczep kalcyneuryna B’ oznaczony y 153b (Mat a gal 14 gal 80 his3 trpl-901 ade2401 ura3-52 leu2-3112+URA::GAL—>lacZ, LYS2::GAL—>HIS3cnblAl::ADE2) w celu wykluczenia możliwości uczestniczenia kalcyneuryny B w wiązaniu kalcyneuryną A/AKAP 79. Początkowo y153b transformowano pAS1 i pAS1 AKAP 79 i badano na aktywność β-gal pod nieobecność plazmiducelu. Nie stwierdzono żadnej ekspresji genu reporterowego co wskazuje, że ekspresja genu reporterowego po transformacji klonem 11.1 powinna wynikać z wiązania AKAP 79/11.1. Plazmidy pACT kodujący kalcyneurynę 11.1 i pACT kodujący kalcyneurynę 1-400 wprowadzono osobno do yl53bl pAS1 AKAP 79 standardową techniką. Aktywność β-gal obserwowano w szczepach transformowanych każdym z plazmidów co wskazuje, że oddziaływanie pomiędzy AKAP 79 i kalcyneurynąA nie wymaga kalcyneuryny B. Ten wynik dalej wskazuje, że wiązanie kompleksu immunofiliny FKBP/FK506 z kalcyneuryną A jest różne od wiązania AKAP 79.

Przykład 6

W celu spróbowania bardziej precyzyjnego zdefiniowania regionu wiązania AKAP 79 z kalcyneuryną 11.1, skonstruowano dodatkową serię plazmidów kodujących mutanty delecyjne, różne od opisanych wyżej albo mutanty punktowe.

A. Delecje końcowe

Ten przykład pokazuje, że oddziaływanie pomiędzy AKAP 79 i kalcyneuryną 11.1 wymaga reszt 30-336 kalcyneuryny. Pokrótce, zaprojektowano startery do różnych regionów kalcyneuryny 11.1 do zastosowania w reakcjach PCR w celu stworzenia swoistych delecji Ni C-końcowych jak to opisano w tabeli 1. Produkty PCR wytworzono przez zmieszanie 1 pg każdego ze starterów 3' i 5' z 200 pg każdego z dNTP i 1 ng matrycy plazmidowej z buforem PCR #2 (zawierającym 20 mM Tris-HCl, pH 8.75, 10 mM KCl, 10 mM (NH^SO^ 2 mM MgSO4, 0.1 % Triton Χ-100 i 100 pg/ml BSA) (Stratagene) oraz 2.5 jednostki polimerazy DNA Pyrococcus furiosus (Pfu) (Stratagene) w objętości 100 pl . Przeprowadzono trzydzieści cykli reakcji, każdy po jednej minucie w temp. 95°C, dwie minuty w temp. 50°C i cztery minuty w temp. 72°C. Produkty amplifikacji oczyszczono i wklonowano w miejsce BglII pACT. Powstałe konstrukty analizowano w kierunku błędów PCR i położenia przy użyciu sekwencjonowania, jak to opisano wcześniej.

Każdy konstrukt transformowano indywidualnie do szczepów y190a, y190a pAS 1 AKAP 79 i yl53b pAS1 AKAP 79, opisanych w przykładzie 4A, po czym przeprowadzano badanie (β-galaktozydazy filtrami jak to opisano uprzednio. Wyniki z zastosowania pierwszego zestawu wektorów kodujących delecję C-końcową zdefiniowały obszar pomiędzy aminokwasami 312400 niezbędny do wiązania AKAP 79. Pozytywne testy z użyciem filtrów z transformantów y 153b pAS1 AKAP 79 również potwierdzdy. że kalcyneuryna B niejest konieczna do wiązania AKAP 79.

184 659

Poprzednie badania wskazywały, że wiązanie kalcyneuryny B wymaga aminokwasów 348,349,355 i 356 (Watanabe i in., J. Biol. Chem., 270:456-460 (1995)), domena samohamująca kalcyneuryny obejmuje aminokwasy 442-487 zaś wiązanie z FKBP/FK506 wymaga aminokwasów 350, 353 i 359 (Kawamura i Su, J. Biol. Chem., 270:15463-15466 (1995)). Dodatkowe konstrukty kalcyneuryny 11.1, kodujące dalsze delecje C-końcowe wykazały, że wiązanie kalcyneuryna 11.1/AKAP 79 wymaga aminokwasów 1-336. Delecje te pokazują, że domena wiążąca kalmodulinę [GDZIE JEST TA DOMENA?], domena samohamująca i domena wiążąca kalcyneurynę B nie są konieczne do tworzenia kompleksy AKAP 79/kalcyneuryna A.

Wyniki wiązania dla wszystkich delecji przedstawiono w tabeli 1. Delecję końca aminowego wskazywały, że przynajmniej jeden obszar niezbędny do wiązania AKAP 79 leży pomiędzy resztami aminokwasowymi 30-99. Jak poprzednio, transformanty y153b pAS1 AKAP 79 ekspresjonujące delecje N-końcowe nie wymagały kalcyneuryny B do wiązania.

Tabela 1

Wiązanie AKAP 79/immunofiliny z mutantami delecyjnymi kalcyneuryny

Delecja kalcyneuryny (oznaczenia według starterów* zastosowanych do konstrukcji plazmidów ekspresyjnych)	Sekwencja aminokwasową	Wiązanie AKAP 79	Wiązanie immunofiliny
MH52-MH58	1-487	+	N.D.
MH52-MH48	1-400	+	N.D.
MH52-MH49	1-312	-	N.D.
MH52-MH50	1-204	-	N.D.
MH52-MH51	1-104	-	N.D.
MH66-MH58	332-487	-	N.D.
MH59-MH58	441-487	-	N.D.
MH66-MH57	332-441	-	N.D.
MH52-MH75	1-375	+	+
MH52-MH74	1-354	+	-
MH76-MH75	30-375	+	+
MH77-MH75	98-375	-	-
MH52-MH93	1-347	+	N.D.
MH52-MH94	1-340	+	N.D.
MH52-MH95	1-330	-	N.D.
MH52-MH96	1-320	-	N.D.
MH52-MH107	1-338	+	N.D.
MH52-MH108	1-336	+	N.D.
MH52-MH109	1-334	-	N.D.
MH52-MH110	1-332	-	N.D.
MH52-MH111	1-335	-	N.D.

* startery zastosowane do konstruowania plazmidów ekspresyjnych:

MH48 (Identyfikator Sekw. Nr 10) 5'-GTATTAGCAGGAGATCTTCCTACTTC-3' MH49 (Identyfikator Sekw. Nr 11 ) 5' -GTGTGTGTAGATCTGGTGAAAGTCC-3 MH50 (Identyfikator Sekw. Nr 12 ) 5-ATTGTAGAGATCTAAGTAATTAGGTGCCG-3' MH51 (Identyfikator Sekw. Nr 13 ) 5'-GCCAATTGCTCAGATCTTGTTTCTTATG-3'

184 659

MH52 (Identyfikator Sekw. Nr 14 ) 5'-GGAATTCGGATCCTCGAGAGATCTCGCCG-3'

MH57 (Identyfikator Sekw. Nr 15 ) 5'-CCACTTTGAGATCTCTACCGTCCTCCAGCC-3'

MH58 (Identyfikator Sekw. Nr 16 ) 5'-CCCTGAGATCTTCAGCTGCTAAGAC-3'

MH59 (Identyfikator Sekw. Nr 17 ) 5'-GGCTGAGATCTGGCAGACCTTGCAAAGTGG-3'

MH66 (Identyfikator Sekw. Nr 18 ) 5-GTGATGAAGATCTTACAGTTTAATTGCTCTCC-3 MH74 (Identyfikator Sekw. Nr 19) 5'-TTCTCCAGATCTTGGTAAGGACCATG-3'

MH75 (Identyfikator Sekw. Nr 20) 5'-CACCTTCTGTAGATCTTTCATCATCAGAAC-3'

MH76 (Identyfikator Sekw. Nr 21) 5'-CATCGGCAGATCTCTGAAGAAGTG-3'

MH77 (Identyfikator Sekw. Nr 22) 5'-CCAf(3GCCA,AfrTTA(fATCTCGA'fGAAAC-3'

MH93 (Identyfikator Sekw. Nr 23) 5-GGACCATGAGATCTAATCCATAAAATTGGG-3'

MH94 (Identyfikator Sekw. Nr 24) 5'-AAATGGGAGATCTAATAAGGATGTGGAGAGC-3'

MH95 (Identyfikator Sekw. Nr 25) 5'-GGAGAGCAATTAAAGATCTAAATGTTCATCAC-3'

MH96 (Identyfikator Sekw. Nr 26) 5'-TTTTCATAGATCTATACAAGCAGCTT-3'

MH107 (Identyfikator Sekw. Nr 27) 5'-CAACCAGATCTAATGTGGAGAGCAATTAAACTGTCG-3' MH108 (Identyfikator Sekw. Nr 28) 5'-CCAATAAGAGATCTAAGAGCAATTAAACTGTCG-3'

MH109 (Identyfikator Sekw. Nr 29) 5'-TGTGAGATCTAATTAAACTGTCGAATGTTCATCAC-3' MH110 (Identyfikator Sekw. Nr 30) 5'-GGAGAGCAGATCTACTGTCGAATGTTCATCAC-3'

MH111 (Identyfikator Sekw.. Nr 31) 5'-AAGGATAGATCTAGCAATTAAACTGTCGAATGTTCATCAC-3'

B. Mutacje punktowe

W celu precyzyjnego zbadania, które aminokwasy uczestniczą w wiązaniu AKAP 79, wytworzono, w oparciu o strategię PCR, mutacje punktowe kalcyneuryny 11.1. Wytworzono trzy mutanty alaninowe, Cys³³⁵—>Ala, Ser³³⁶—>Ala i Pro³³⁹—>Ala, i badano pod kątem modulacji wiązania AKAP 79 w układzie dwuhybrydowym. Żaden z tych mutantów nie zapobiegał wiązaniu AKAP 79 z kalcyneuryną, co wskazuje, że modyfikacja tych reszt nie jest wystarczająca do rozerwania wiązania z AKAP 79.

Przyk;ład 7

W celu identyfikacji innych białek wiążących AKAP 79 wykonano dodatkowe przesiewanie przy użyciu biblioteki DNA mysich limfocytów T i szczepu-przynęty pAS 1 AKAP 79. Wynikiem przesiania ok. 211000 kolonii był jeden pozytywny klon oznaczony pACT2-l, który pozostał pozytywny w następstwie „ratowania” i ponownej transformacji. Sekwencję biblioteki pozyskano z plazmidu przez trawienie XhoI i stwierdzono, że wstawka jest długości 1200 bp. Sekwencjonowanie i przeszukiwanie bazy danych wykazało, że klon wykazuje 91% identyczność z podjednostką regulacyjną typu 1 α szczurzej kinazy białkowej A (RI).

Bibliotekę przesiano ponownie i z użyciem tej samej „przynęty” AKAP 79 i stwierdzono obecność 15 pozytywnych klonów wśród 520000 transformantów. Spośród tych piętnastu jedenaście było, jak stwierdzono, homologiczne do podjednostki regulacyjnej typu I szczurzej PKA. Każdy z tych izolatów zfuzowano z nie ulegającym translacji regionem 5'RI i pozostawiono otwartym dzięki kodonowi metioniny. Na podstawie analizy trawieniem restrykcyjnym i danych z sekwencjonowania wyizolowano dziewięć pojedynczych klonów, włączywszy oryginalny izolat pACT2-1.

Wyniki tejako pierwsze pokazująbiałko kotwiczące, które wiąże się z podjednostkami regulacyjnymi RI i RII pKa, co było nieoczekiwane w świetle różniącej się budowy pierwszorzędowej obu podjednostek.

W celu dalszego zdefiniowania sekwencji oddziaływania pomiędzy RI i AKAP 79 oraz w celu określenia czy oddziaływanie jest unikalne dla AKAP 79 stworzono nowy szczep drożdży. Przy użyciu miejsca BglII w pierwszych 400 zasadach RI, wyizolowano z pACT72 fragment kodujący aminokwasy 1-80 i ligowano go do pASI i pACT. Położenie potwierdzono analizą trawienia restrykcyjnego. Z zastosowaniem standardowych procedur transformacji drożdży, DNA plazmidowe wprowadzono do yl90MATa i badano transformowane drożdże na aktywność β-gal. Okrojony produkt fuzyjny był, jak określono, niezdolny do zapoczątkowania ekspresji genu reporterowego. Transformowane szczepy były następnie wykorzystane w szeregu doświadczeń mających na celu sprawdzenie czy okrojona postać RI może oddziaływać z AKAP 79.

Ekspresję genu reporterowego obserwowano w podwójnie transformowanych szczepach drożdży, co wskazuje, że wiązanie RI/AKAP 79 zachodzi dzięki pierwszym 80 aminokwasom RI.

184 659

Na koniec, w celu określenia czy zdolność do wiązania zarówno podjednostki RI jak i RII jest unikalna dla AKAP 79, badano AKAP z ludzkiej tarczycy (Carr i in., J. Biol. Chem., 267:133376-133382 (1992)), produkt genowy pACT Ht31, w układzie przesiewania dwuhybrydowego, z użyciem wyżej opisanego okrojonego peptydu RI zawierającego aminokwasy 1-80 i kodowanego przez plazmid pASl(l-80). Obserwowane wiązanie Ht31/RI, w połączeniu z poprzednimi obserwacjami, że Ht31 wiąże RII, wskazuje, że wiązanie białek kotwiczących przez zarówno RI jak i RII nie jest unikalną cechą AKAP 79.

Przykład 8

W świetle faktu, że AKAP 79, jak wykazano, wiąże zarówno podjednostkę RI jak i RII PKA, zastosowano technikę przesiewania w oparciu o scyntylację zbliżeniową aby zidentyfikować swoiste inhibitory hamujące umiejscawianie PKA przez zakłócanie wiązania AKAP 79 z PKA.

Początkowo, skonstruowano plazmid ekspresjonujący białko fuzyjne tioredoksyna (TRX) /AKAP 79 (patrz, LaVallie i in., BIO/TECHNOLOGY 11:187-193 (1993). Pokrótce, fragment XbaI/HindIII tioredoksyny wklonowano do plazmidu pUC19 zawierającego gen lacZ i promotor tacZ. Powstały plazmid nazwano TRXF/SpL'C19. W celu wprowadzenia sekwencji kodującej AKAP 79 do TRXF/SpUC19, stworzono miejsce NcoI przy użyciu oligonukleotydu (Identyfikator Sekw. Nr 32) zawierającego końcowe sekwencje SpeI i HindIII. Po trawieniu SpeI/HindIII, oligonukleotyd wprowadzono do wektora i ligowano fragment N^L/KLol kodujący AKAP 79 w jednej ramce z genem tioredoksyny. Białko fuzyjne poddano ekspresji w E. coli i immobilizowano na 96-studzienkowych płytkach ScintiStrip (Wallac, Turbu, Finlandia) zawierających scyntylator zamknięty w podłożu stałym. Płytki uprzednio opłaszczono króliczym przeciwciałem przeciw-mysim, które służyło immobilizacji mysiego przeciwciała monoklonalnego swoistego dla TRX. Białko fuzyjne TRX/AKAP 79 zostało zatrzymane na płytkach przez przeciwciało przeciwko-TRX po czym do płytek dodano ³H-RII w obecności lub pod nieobecność inhibitora odniesienia, przykładowo, nie znakowanej RII. Gdy ³H-RII związała się z AKAP 79 znacznik był wystarczająco blisko zamkniętego w podłożu scyntylatora, co powodowało emisję wykrywaną przez licznik scyntylacji MicroBeta.

Wyniki tego badania wskazują że nieznakowana RII i peptyd Ht31, opisany wyżej, zdolne były do zahamowania wiązania RII/AKAP 79 z IC₅0 rzędu, odpowiednio, 1 mM i 50 nM. Wyniki te są zbliżone do opisywanych wartości dla innych białek kotwiczących (Carr i in., J. Biol. Chem., 267:13376-13382 (1992)). Peptyd Ht31 z podstawionąproliną również opisany wyżej, nie blokował wiązania AKAP 79/RII. Ponieważ, wyniki te były zgodne z obserwowanymi w badaniu metodą Western biot i badaniach nakładania, uważa się, że ta technika pozwoli na szybkie przesiewanie potencjalnych inhibitorów wiązania AKAP 79/RII, jak również inhibitorów wiązania AKAP 79 przez inne znane fizjologiczne ligandy, przykładowo kalcyneurynę i kinazę białkową C.

Przykład 9

Przykład ten pokazuje, że związek PKA z białkiem kotwiczącym w limfocytach T moduluje aktywność PKA w aktywacji NFAT, modulując w ten sposób produkcję interleukiny 2.

Ekspresja genu interleukiny 2 jest ściśle związana z aktywacją limfocytów T. Badano transkrypcję IL-2 w następstwie pobudzenia przy użyciu PMA i jonomycyny. Te dwa czynniki znane są ze swego, odpowiednio, wzmagania działania kinazy białkowej C i odpowiedzi na wapń jako wtórny sygnał (second messenger) (w tym również aktywację CaN). Kinaza białkowa C aktywuje szlak Ras-Rafl-Mek-kinaza MAP, który bierze udział w indukcji składnika jądrowego NFAT. Podwyższone stężenie wapnia aktywuje kalcyneurynę, która z kolei aktywuje składową cytoplazmatyczną NFAT i umożliwia translokację do jądra. Ta aktywacja składowych NFAT powoduje ekspresję genu IL-2. W celu zmierzenia transkrypcji, linię komórkową limfocytów T Jurkat (NFATZ) transfekowano stabilnie wektorem zawierającym trzy kopie tandemowe miejsca wiązania NFAT oraz minimalny promotor IL-2 zfuzowany z genem kodującym β-galaktozydazę ((β-gal). Pomiar transkrypcji IL-2 uzyskano przez analizę aktywności β-gal na sorterze komórkowym aktywowanym fluorescencją (FACS).

184 659

1x106 komórek NFATZ w 1 ml pożywki preinkubowano przez 60 minut w 37°C z różnymi stężeniami cyklosporyny i mirystylowanych peptydów włączywszy peptyd 81-108 AKAP 75 (Identyfikator Sekw. Nr 8; opisany w Glantz i in., J. Biol. Chem., 268:12796-12804 (1993)), PKI (inhibitor peptydowy PKA (GRRNAIHDI - Identyfikator Sekw¹. Nr 5)) oraz peptyd pochodzący z Ht31 (Identyfikator Sekw·'. Nr 9; aminokwasy 493-515 białka Ht31 pełnej długości opisanego przez Carr i in., J. Biol. Chem., 267:13376-13382 (1992), blokujący oddziaływanie białka kotwiczącego z podjednostką RII PKA). Każdy z peptydów był mirystylowany jak to opisano w Eichhottz i in., J. Biol. Chem., 268:1982-1986 (1993).

W doświadczeniach z cyklosporyną PKI (Identyfikator Sekw'. Nr 5) i peptydem Ht31 (Identyfikator Sekw. Nr 9) po inkubacji z cyklosporyną i odpowiednim peptydem następowała dalsza 30-minutowa inkubacja z forskolinem (25 μM) i izobutylo-metylo-ksantyną (IBMX; 0.1 mM). Inkubacja z forskolinem/TBMX podnosiła wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP (fig. 4) aktywując w ten sposób PKA. Na koniec, dodano 12-mirystylo-13-actanu forbolu (PMA) (10 ng/ml) i jonomycyny (2 μM) i kontynuowano inkubację przez 4 godziny. Kontrole inkubowano z PMA/jonomycyną samymi lub forskolinem/IBMX i PMA/jonomycyną w warunkach, jak wyżej. Podczas 20 minut inkubacji z PMA/jonomycyną, dodano chlorokwiny (300 (μM) w celu zahamowania endogennej aktywności lizosomalnej β-gal. Komórki zwirowano i zawieszono w 50 μl pożywki hodowlanej do której dodano 50 μl di-βrD-galaktopiranozydu fluoresceiny (FDG) (stężenie końcowe 0.1 mM; Molecular Probes). Wstrząs osmotyczny kontynuowano przez 75 sekund po czym przywrócono komórki do warunków izotonicznych przez dodanie 1 ml zimnego buforu FACS (zawierającego chlorokwinę). Aktywność lacZ mierzono cytometrią przepływową ustawioną na analizę fluorescencji.

Figury od 5A do 5H pokazują wyniki tego doświadczenia. Fig. 5A i 5B są wykresami z FACS pokazującymi fluorescencję tła badania z i bez dodatku barwnika. Fig. 5C pokazuje, że działanie PMA/jonomycyną na komórki NFATZ Jurkat wywołuje 6-7-krotne zwiększenie aktywności β-gal. Cyklosporyna (CsA) całkowicie znosi tą aktywność jak należało oczekiwać w przypadku istotnej roli CaN w transkrypcji IL-2 (Fig. 5D) . Mirystylowany peptyd AKAP 75 (Identyfikator Sekw. Nr 8) użyty w stężeniu 10 μM w pożywce zmniejszał, jak stwierdzono, wywołaną PMA/jonomycyną aktywność β-gal o 40-50%.

Figura 5E pokazuje, że forskolin i IBMX zmniejszają wywołaną PMA/jonomycyną aktywność β-gal o ok. 50%. Blok ten był całkowicie odwracany przez zarówno 100 μM peptyd PKI (Identyfikator Sekw·'. Nr 5) jak i 100 μM mirystylowany peptyd Ht31 (Identyfikator Se'kw. Nr 9) (figury 5f i 5G). Fig. 5H pokazuje, że mirystylowany peptyd Ht31 z podstawioną proliną, co, jak wiadomo czyni ten peptyd nieaktywnym w blokowaniu zakotwiczenia PKA, nie wpływał negatywnie na blokadę forskolinem/IBMX. Wyniki te wskazuj ą na istotną rolę PKA i jej umiejscowienia przez białko kotwiczące w regulacji ekspresji IL-2. Jak to opisano wyżej, zakłócanie aktywności albo umiejscowienia PKA może być stosowane w celu wzmagania odpowiedzi odpornościowej, aktywacji limfocytów T w celu selektywnej ekspansji klonalnej albo badania wczesnych zjawisk w aktywacji limfocyta T.

Przykład 10

Zidentyfikowano dwa dodatkowe unikalne izolaty, pACT59 i pACT74, kodujące ten sam region innego białka. Sekwencje obu klonów podane są, odpowiednio, w Identyfikatorze Sekw. Nr 33 i 34. Wyniki poszukiwań wskazują znaczną homologię aminokwasów z trzema produktami genowymi o nieznanej funkcji: C. elegans (białko o 319 aminokwasach, oznaczone w wydruku bazy danych Nr U00032), sekwencja ekspresjonowana w płodowym ludzkim mózgu (białko o 97 aminokwasach, oznaczone 08697) i sekwencja ekspresjonowana przez HL60 (białko o 90 aminokwasach, oznaczone D20731). Stwierdzono homologię z produktem genowym 5. pombe, oznaczonym PAD 1 + (białko o 308 aminokwasach oznaczone D31731), które, jak wykazano, jest dodatnim regulatorem PAP1+, czynnika transkrypcyjnego przypominającego AP-1.

Dodatkowo, w przesiewaniu tym wykryto dwa inne pozytywne klony; pACT36, kodujący otwartą ramkę odczytu o 143 aminokwasach prawidłowo zfuzowaną z Gal4, i pACT60, kodujący nieco krótszy region wynikły z delecji. Sekwencje tych klonów podane są odpowiednio,

184 659 w Identyfikatorze Sekw. Nr 35 i 36. Te dwa izolaty były unikalne i nie wykazywały podobieństwa z żadną znaną sekwencją w bazie danych NIH.

Przykład 11

Poprzednie prace sugerowały, że AKAP 79 jest wielofunkcyjnym białkiem kotwiczącym, które jest zdolne do łączenia się z przynajmniej dwoma enzymami sygnałowymi; PKA i fosfatazą zależną od Ca²⁺/kalmoduliny - kalcyneuryną (CaN). Każdy z enzymów sygnałowych wiąże się z innym regionem białka kotwiczącego i każdy z enzymów hamowany jest podczas zakotwiczenia. Dodatkowo, wykazano, że zależna od Ca2⁺/fosfolipidu kinaza białkowa C (PKC) wiąże się również z AKAP 79, w regionie różnym od miejsc wiązania PKA i CaN. Podobnie jak PKA i CaN, aktywność PKC jest zahamowana przez połączenie z białkiem kotwiczącym. Miejsce wiązania PKC zawarte jest w pierwszych 75 resztach białka kotwiczącego zaś badania z użyciem peptydów wykazały, że fragment obejmujący aminokwasy 31-52 AKAP 79 hamuje aktywność PKC. Ponadto, istnieją dowody sugerujące, że wiązanie kalmoduliny (CaM) z białkiem kotwiczącym może uwalniać aktywność PKC co sugeruje współzawodnictwo o sekwencję AKAP 79. W celu pełniejszej charakterystyki oddziaływania PKC z AKAP 79, wykonano doświadczenie w celu charakterystyki miejsca wiązania PKC, izolacji kompleksu PKC/AKAP z mózgu wołu i określenia czy CaM jest fizjologicznym regulatorem oddziaływania PKC/AKAP 79.

Nakładanie PKC wykonano początkowo na lizatach mózgu wołu przy użyciu PKC z mózgu królikajako sondy. Wiązanie PKC wykryto przy pomocy przeciwciała monoklonalnego (M7), które rozpoznaje izoformy PKC α i β. Wykryto kilka białek wiążących PKC w zakresie wielkości od 50 do 300 kDa, w tym białko migrujące z podobną ruchliwością co główne białko wiążące RII wielkości 75 kDa. Doświadczenia kontrolne potwierdziły, że wiązanie PKC było swoiste i mogło być stwierdzone wyłącznie w obecności 1.2 mM CaCf i 20 gg/ml fosfatydyloseryny i kiedy do mieszaniny reakcyjnej dodano PKC.

W celu określenia czy zidentyfikowane białko 75 kDa może być wołowym homologiem AKAP 79, wykonano badanie nakładania PKC w celu wysondowania AKAP 79 i pokrewnych fragmentów·'. Pokrótce, białka rozdzielono przez elektroforezę na żelu SDS-poliakrylamidowym (SDS-PAGE) i przeniesiono na nitrocelulozę w oparciu o standardową procedurę. Próbki wyblokowano w Blotto (1 mg/ml albuminy surowicy wołu (BSA), 5% hudego mleka w proszku w roztworze soli zbuforowanym Tris (TBS)) i inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej w buforze testowym (TBS zawierającym 1 mg/ml BSA, 1.2 mM wapń, 1 mM EGTA, 20 gg/ml fosfatydyloseryny (PS), 2 gg/ml leupeptyny, 2 (gg/ml pepstatyny i 3 gg/ml częściowo oczyszczonej PKC mózgu królika). Związaną PKC wykrywano przeciwciałem monoklonalnym M7, rozpoznającym PKC α i β, w oparciu o standardowe metody wykrywania chemiluminescencji.

PKC wiązała rekombinowane białko AKAP 79 pełnej długości jak również rekombinowane fragmenty obejmujące pierwsze 75 reszt białka wiązało PKA, w przeciwieństwie do fragmentu C-końcowego obejmującego regiony wiązania CaN i RII. Doświadczenia kontrolne wykazały, że znakowana 32P RII wiąże się z zarówno AKAP 79 pełnej długości jak i fragment C-końcowy. Wyniki te wskazują, że AKAp 79 jest białkiem wiążącym PKC oraz, że główne miejsce wiązania znajduje się w pierwszych 75 aminokwasach białka.

Poprzednie badania białek wiążących PKC wskazywały, że zasadowe i hydrofobowe regiony miejsc wiążących PKC uczestniczą w tworzeniu mostka fosfolipidowego z enzymem. Pierwsze 75 reszt AKAP 79 zawiera zasadowy i hydrofobowy region pomiędzy aminokwasami 31 a 52 i istnieją dowody, że ten odgrywa głtówn^ą rolę w kontakcie z PKC. Syntetyczny peptyd o amonokwasach od 31 do 52 blokował oddziaływanie PKC/AKAP 79 jak stwierdzono w teście nakładania.

W celu zbadania zdolności tych peptydów do modulowania aktywności PKC wykonano następujący test w obecności i pod nieobecność fragmenty peptydowego AKAP 79. PKC (50nM rozpuszczona w 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM MgC^, 1.2 mM CaC^, 1 mM DTT, 1 mM EGTA i 100 gg/ml PS) inkubowano z substratem receptora EGF (5 (gM) w 30°C przez pięć minut. Reakcję fosforylacji zapoczątkowano przez dodanie 100 (gM 32P-ATP (500 cpm/pmol) i po184 659 zostawiono do przereagowania przez 10 minut w 30°C. Pobrano porcje mieszaniny reakcyjnej i nałożono na filtr papierowy P81, po czym przerwano reakcję przez przepłukanie filtru dużą ilością 7 5 mM kwasu fosforowego (trzy płukania po trzy minuty każde). Po końcowym przepłukaniu etanolem, filtry P81 osuszono i mierzono radioaktywność przez pomiar scyntylacji.

Peptyd zawierający reszty od 31 do 52, jak również rekombinowany fragment pierwszych 75 aminokwasów AKAP 79, był silnym inhibitorem aktywności PKC z IC5₀ równą, odpowiednio, 2 pM i 25 nM. Bardziej dokładna analiza kinetyki wykazała, że peptyd 31-52 AKAP 79 wykazywał mieszane zahamowanie aktywności PKC o K, rzędu 1.411 ±0.28 pM z użyciem peptydu receptora naskórkowego czynnika wzrostowego (EGF)jako substratu. Dodatkowo, region ten przypomina domenę wiążącą CaM, zaś inkubacja rekombinowanego fragmentu 1-75 lub peptydu 31 -52 z CaM (15 (pM) zapobiegała zahamowaniu PKC w obecności nadmiaru Ca⁷-'. Ponieważ AKAP 79 jest białkiem wiążącym CaM, odkrycie to sugeruje, że Ca2+/CaM może regulować wiązanie PKC z białkiem kotwiczącym.

Podsumowując, wyniki te sugerują, że PKC łączy się z AKAP 79 in vivo, miejsce wiązania PKC znajduje się w pierwszych 75 resztach aminokwasowych AKAP 79 i peptydy obejmujące reszty 31-52 hamują aktywność PKC. Wyniki wskazująrównież, że oddziaływanie PKC/AKAP 79 może być regulowane przez CaM, ponieważ inkubacja z nadmiarem Ca2+/CaM zapobiega zahamowaniu PKC przez peptyd 31-52 (fig.3). W celu bardziej pełnego zrozumienia istoty oddziaływania PKC/AKAP 79, zaprojektowano doświadczenie w celu 1) identyfikacji reszt odpowiedzialnych za wiązanie PKC z AKAP 79, 2) wyizolowanie kompleksy PKC/AKAP 79 z komórek i 3) ustaleniu, czy CaM reguluje oddziaływanie PKC/AKAP 79.

Analiza sekwencji kilku białek wiążących PKC wskazuje, że bardzo silny powierzchniowy ładunek dodatni może być konieczny dla połączenia z PKC. Z tą hipotezą zgadzają się wyniki poprzednie, według których peptydowy fragment AKAP 79 o aminokwasach 31-52, które obejmują przedział zasadowych i hydrofobowych reszt, hamował aktywność PKC (K i rzędu 1.4±0.28 pM) zaś rekombinowany fragment tego regionu był jeszcze silniejszym inhibitorem kinazy (IC50=25±5 nM). W celu oceny roli zasadowych łańcuchów bocznych umiejscowionych pomiędzy resztami 31 a 52 AKAP 79 jak determinant zahamowania PKC wytworzono całą rodzinę mutantów AKAP 79 w rekombinowanym peptydzie AKAP 79 zawierającym aminokwasy 1-75 i badano właściwości każdego z mutantów metodą nakładania oraz wpływ na zmiany siły hamującej w stosunku do PKC βΐ.

Skonstruowano pięć mutantów AKAP 79, w których przedziały reszt zasadowych zamienione zostały na alaninę. Wziąwszy pod uwagę dużągęstość dodatniego ładunku, możliwe jest, że może być konieczne równoczesne podstawienie kilku zasadowych łańcuchów bocznych zanim odnotowane zostaną istotne zmiany powinowactwa wiązania PKC. Stąd, podstawiano liczne reszty zasadowe. Wytworzono punktowe mutanty w sekwencji AKAP 79, metodą skanującej mutagenezy alaninowej, w oparciu o sposób opisany przez Hausken i in., J. Biol. Chem., 269:24245-24251 (1994). Każde z białek AKAP 79 poddano ekspresji jako białko fuzyjne ze znacznikien His i oczyszczono do homogennosci chromatografią, powinowactwa do niklu. Peptydy - mutanty alaninowe przedstawiono poniżej. Identyfikator Sekw. Nr 37 jest natywną sekwencją AKAP 7 9.

AKAP 79 (37-50) FXRRKKAAKALAPK (Identyfikator Sekw. Nr 37)

AKAP 79 AA38,39 FAARKKAAKALAPK (Identyfikator Sekw. Nr 38)

AKAP 79 AAA40-42 FKRAAAAAKALAPK (Identyfikator Sekw. Nr 39)

AKAP 79 4A28-42 FAAAAAAAKALAPK (Identyfikator Sekw. Nr 40)

AKAP 79 AA45,50 FKRRKKAAAALAPA (Identyfikator Sekw. Nr 41)

AKAP 79 A37-50 FAAAAAAAAALAPA (Identyfikator Sekw. Nr 42)

Białko PKC (I poddano ekspresji w bakulowirusie i użyto przeciwciał M4 i M7 w celu wykrycia izoform α i β PKC według poniższej metody.

Dodatkowo, każdy zmutowany fragment AKAP 79 badany był w kierunku zdolności do zahamowania PKC według opisanej wyżej metody.

184 659

Ponieważ wstępne dane wskazywały, że PKC i AKAP 79 wiązały się in vitro, powinno być możliwe wyizolowanie kompleksu AKAP 79/PKC z komórek, j eżeli to samo wiązanie zachodzi in vivo. W celu izolacji kompleksu PKC/AKAP 79, lub trzeciorzędowego kompleksu PKC/AKAP 79/CaM z mózgu wołu, użyto dwóch niezależnych podejść biochemicznych, które uprzednio przyniosły sukces w izolacji kompleksu AKAP 79/CaN in vivo. Techniki te opisano pokrótce niżej.

Początkowe badania stosowały immunoprecypitację homologa AKAP 79, AKAP 75 z mózgu wołu, przy użyciu przeciwciała monoklonalnego MC 16 skierowanego przeciwko AKAP 79. Równoczesna izolacja PKC pozwalała wykryć ją w immunoprecypitatach metodą Western blot przy użyciu króliczej surowicy poliklonalnej, rozpoznającej główne izoformy mózgowej PKC α, pI, PIII i γ. Alternatywnie, PKC współprecypitowano z ekstraktów mózgu wołu przy użyciu przeciwciała monoklonalnego M7 rozpoznającego izofermy mózgowe α i, β, i oczyszczane równocześnie AKAP 75 wykrywano nakładaniem RII lub metodą Western blot. Na koniec, identyczne próbki immunoprecypitowane przeciwciałami przeciwko PKC sondowano w kierunku CaM, przy użyciu przeciwciała C24 rozpoznającego podjednostkę A CaN. Doświadczenia te mogą ustalić czy tworzony jest trzeciorzędowy kompleks AKAP 79/PKC z CaN.

Zamiennie, wykonywane jest oczyszczanie przez powinowactwo w celu izolacji trzeciorzędowych kompleksów RII, AKAP 79 i PKC z mózgu wołu. Podjednostka R PKC oczyszczana jest chromatografią powinowactwa na cAMP-agarozie, po czym przesiewa się eluaty w kierunku obecności PKC i AKAP metodą Western blot z użyciem, odpowiednio, przeciwciał M7 i MC16. Ponieważ rekombinowane* AKAP 79 i PKC nie wiążą cAMP-agarozy, wykrycie któregokolwiek z białek w eluatach cAMP potwierdza tworzenie kompleksu obu kinaz z białkiem kotwiczącym. Potwierdzenie istnienia kompleksów trzeciorzędowych uzyskano przez elucję PKC i AKAP 79 z cAMP-agarozy z użyciem nadmiaru peptydu będącego inhibitorem kotwiczenia. Peptyd ten, jak wykazano uprzednio, usuwa kompleks AKAP 79/CaN z RII immobilizowanej na cAMP-agarozie.

Przykład 12

Poprzedzające dowody, że AKAP 79 wiąże kalcyneurynę, pozostajjąprawdziwe w świetle faktu, że kalcyneuryna jest celem dwóch silnych i użytecznych klinicznie środków immunosupresyjnych, cyklosporyny i FK506, które to oba hamują aktywność kalcyneuryny. Jak opisano poniżej, zarówno cyklosporynajak i FK506 sąkorzystne w leczeniu wielu chorób, ale posiadąjąistotne, ograniczające stosowanie efekty uboczne. Prawdopodobnie, czynniki modulujące wiązanie białko kotwiczące/kalcyneuryna, mogą wyłącznie modulować aktywność kalcyneuryny w sposób podobny do działania cyklosporyny i FK506. Identyfikacja takich modulatorów, w szczególności wykazujących mniejsze objawy uboczne niż obecnie stosowane środki immunosupresyjne, znalazłaby prawdopodobnie szerokie zastosowanie w leczeniu wielu chorób leczonych obecnie cyklosporyną lub FK506.

Opisywane są liczne wskazania kliniczne dla cyklosporyny i FK506. Przykładowo, cyklosporynę określa się jako standard w immunosupresji po przeszczepie, co czyni możliwym przeszczepianie wątroby, płuc, jelit i trzustki, mimo iż FK506 jest ogólnie uważany z silniejszy lek immunosupresyjny. Pacjenci po przeszczepie, którzy nie tolerują lub nie reagują na cyklosporynę czy FK506, są czasami z sukcesem leczeni innymi lekami.

Jako inny przykład, zapalenie jelita grubego (IBD) jest wspólnym określeniem dla dwóch chorób o różnym obrazie klinicznym, choroby Crohna i wrzodziejącego zapalenia jelita grubego (UC) . Cyklosporynę stosuje się z sukcesem w leczeniu choroby Crohna, z wynikami statystycznie znamiennymi, polepszającymi przynajmniej jeden wskaźnik aktywności choroby (Brynskov i in., Dan. Med. Buli., 41:332-344 (1994)). Inne wskaźniki, jednakże, dobrze korelujące ze zdrowieniem z ostrej choroby, nie wykazują znaczącego trendu w kierunku poprawy. Cyklosporyna nie działa w ciężkich, ostrych przypadkach niewrażliwego na sterydy UC (dane nie są istotne z powodu zakończenia prób ze względów etycznych). Inne badanie na pacjentach z twardniejącym zapaleniem przewodów żółciowych i UC wykazało graniczną istotność w kierunku łagodzenia przebiegu UC. Nawroty są powszechne po odstawieniu leczenia zaś samo leczenie ograniczone było z powodu toksyczności (Coi i Targan, Dig. Dis. and Sci., 39:1885-1892

184 659 (1994)). Na dodatek, w IBD zastosowano z powodzeniem inne leki immunosupresyjne, jak metotreksat, azatiopryna czy 6-MP.

Jako inny przykład, w kilku badaniach wykazano, że cyklosporynajest efektywna w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów jako lek drugiego lub trzeciego rzutu, tzn. u pacjentów, którzy nie reagowali na inne uznane leczenie rozwijając ciężką chorobę. W badaniach tych, cyklosporyna, jak stwierdzono, była ogólnie równie efektywna i toksyczna jak inne leki drugiego rzutu, jak złoto, leki przeciwmalaryczne, azatiopyna, D-penicylamina i metotreksat (Wells i Tugwell, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1) : 51-56 (1993);

Forre i in., Arth. Rheum., 30:88-92 (1987)). Badania opisują leczenie jedynie „bardzo ciężkiego, niewrażliwego na leczenie RA” z powodu „potencjalnie niemożliwej do opanowania toksyczności” cyklosporyny (Dougados i Torley, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1) :57-59 (1993)). Toksyczność nerkowa, jak się uważa, jest spowodowana przede wszystkim zwężeniem naczyń nerkowych, pogarszającym nefrotoksyczność NSAID i chorobę nerek wywołaną samym reumatoidalnym zapaleniem stawów (Leaker i Caims, Br. J. Hosp. Med., 52:520-534 (1994); Sturrock i in., Nephrol. Dial. Transplant., 9:1149-1156 (1994); Ludwin i Alexopopolou, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 60-64(1993)). Około 10% biopsji nerkowych od pacjentów z RA leczonych cyklosporyną wykazuje morfologiczne cechy toksyczności cyklosporyny (International Kidney Biopsy Registry ofCyclosporin in Autoimmune Diseases, Br. J. Rheum., 32 (suppl. 1): 65-71 (1993)).

Jako dalszy przykład, cyklosporyną, jak się opisuje, jest efektywna w leczeniu sterydozależnej astmy. W jednym badaniu, niewielką.grupę chorych randomizowano do grup otrzymujących cyklosporynę lub placebo, i grupa otrzymująca cyklosporynę wykazywała zwiększony przepływ powietrza i FVC jak również mniej koniecznych kursów prednisolonu.

Jako inny przykład, cyklosporyną, jak wykazano, jest efektywna w leczeniu sterydozależnego zespołu nerczycowego typu „minimal change”. Pacjenci w tym badaniu wykazywali mniejsze zapotrzebowanie na sterydy podczas stosowania małych dawek cyklosporyny ale choroba nawróciła po odstawieniu cyklosporyny. Zależne od sterydów postacie zespołu nerczycowego tylko w 2030% odpowiadają na leczenie cyklosporyną (Mayrier, Nephrol. Dial. Transplant., 9:596-598 (1994); Hulton i in., Pediatr. Nephrol., 8:401-403 (1994)).

W odniesieniu do leczenia tocznia układowego (SLE) jedno badanie opisuje znaczące zmniejszenie czynników aktywności SLE w prospektywnym, nie randomizowanym, nie kontrolowanym badaniu (Tokuda i in., Arthr. Rheumat., 37:551-558 (1994)). Inne badania, jednakże, nie wykazały efektywności w SLE.

Jako jeszcze inny przykład, cyklosporyna, jak wykazano, wywołuje remisje cukrzycy insulinozależnej gdy została wprowadzona krótko po pierwszych objawach klinicznych.

Średnia remisji wynosiła ok. 1 roku, choć odnotowano przypadki remisji trwającej 850 dni (Jenner i in., Diabetologia, 35:884-888 (1992); Bougernes i in., Diabetes, 39:1264-1272 (1990)). W przedłużonej obserwacji w jednym z badań nie stwierdzono długotrwałości efektów cyklosporyny (Martin i in., Diabetologia, 34:429-434 (1991)). W innym badaniu, jednakże, funkcja nerek pogorszyła się podczas 12-18-miesięcznego leczenia i nie powróciła do poziomu grupy kontrolnej co wskazuje, że mogło zajść pewne przewlekłe uszkodzenie nerek (Feldt-Rassmussen i in., Diabetes Medicine, 7:429-433 (1990)). Wczesna interwencja może być konieczna aby wspomóc wpływ leczenia immunosupresyjnego na przebieg cukrzycy insulinozależnej. Niektórzy badacze badająprzesiewowo najbliższych krewnych i z powodzeniem wprowadzają leczenie profilaktyczne u osób z markerami cukrzycy (Elliot i Chase, Diabetologia, 34:362-365 (1991)).

Jako jeszcze inny przykład, łuszczyca jest efektywnie leczona cyklosporyną (Cuellar i in., Baliere’s Clin. Rheum., 8:483-498 (1994; Ellis i in., JAMA. 256:3110-3116 (1986)). Leczenie dużymi dawkami było efektywne w leczeniu łuszczycowego zapalenia stawów, szczególnie ciężkiej postaci uszkadzającego zapalenia stawów ale odstawienie leczenia zwykle powodowało zaostrzenie choroby skóry i stawów. W świetle potencjalnych efektów ubocznych i konieczności ciągłego, długotrwałego leczenia, cyklosporyna wskazana jest wyłącznie dla opornego na leczenie łuszczycowego zapalenia stawów, które nie reaguje na inne formy leczenia.

184 659

Dodatkowo, cyklosporyna, jak wykazano, jest efektywna w leczeniu ciężkiego atopowego zapalenia skóry, w kontrolowanym-placebo, podwójnie ślepym badaniu (Van Joost i in., Br. J. Derm., 130:634-640(1994); Cooper, J. Invest. Derm., 102:128-137 (1994)). Efekty uboczne jak wymioty, dyskomfort w nadbrzuszu, parestezje, cholestaza i niewydolność nerek z powodu leku, były lepiej tolerowane niż objawy nie leczonej choroby. W innym randomizowanym, podwójnie ślepym, kontrolowanym placebo badaniu stwierdzono, że leczenie cyklosporyną znacząco polepszajakość życia pacjentów z ciężkim atopowym zapaleniem skóry (Salek i in., Br. J. Derm., 129:422-430 (1993)). Ubytki skóry nawracały szybko po odstawieniu cyklosporyny ale jakość życia pozostawała lepsza.

Jako jeszcze inny przykład, cyklosporynę stosuje się w leczeniu przewlekłego zapalenia skóry rąk, chorobie o częstości ocenianej na 4-22%, zwykle leczonej miejscowo sterydami, na które nie reaguje wielu pacjentów. Małe dawki cyklosporyny są efektywne, jak wykazano, u 6/7 pacjentów w otwartym badaniu (Reitamo i Granlund, Br. J. Derm., 130:75-78 (1994)). U około połowy pacjentów choroba nawróciła po odstawieniu leku.

Jako jeszcze inny przykład, cyklosporynę stosuje się w leczeniu pokrzywki i obrzęku naczyniowego, idiopatycznych chorób skóry objawiających się pokrzywką i obrzękiem podskórnym. Patologia związana jest z komórkami tucznymi zaś leczenie zwykle jest nieskuteczne. W jednym z badań, trzech pacjentów z oporną pokrzywką i obrzękiem naczyniowym leczono cyklosporyną i wszystkie objawy zniknęły w ciągu tygodnia (Fradin i in., J. Am. Acad. Derm., 25:1065-1067 (1991)). Leczenie wszystkich pacjentów przerwano ze względu na objawy uboczne, zaś objawy choroby nawróciły po zaprzestaniu leczenia.

W odniesieniu do chorób reumatycznych, opisywane sąpróby leczenia mniej powszechnych chorób autoagresyjnych jak choroba Behceta (Pacor i in., Clin. Rheum., 13:224-227 (1994)); ziarnica Wegnera (Allen i in., Cyclosporin A Therapy for Wegner’s Granulomatosis, w ANCAAssociated Yasculitides: Immunological and Clinical Aspects, wyd. Plenum Press (1993)) i trombocytopenii na podłożu immunologicznym (Schułtz i in., “ Blood 85:1406-1408 (1995)).

W wielu opisanych wyżej badaniach zastosowanie cyklosporyny i FK506 wiązało się z wieloma niepożądanymi efektami ubocznymi. Ogólnie, zwiększone ryzyko zakażeń i rozwoju nowotworu związane jest z uogólnioną immunosupresją i nie wydaje się aby czynniki immunosupresyjne pokrewne białkom kotwiczącym niosły podobne zagrożenia. Innych objawów ubocznych można uniknąć lub zmniejszyć je, dzięki swoistości tkankowej białek kotwiczących. Najpoważniejszym objawem ubocznym stosowania cyklosporyny jak i FK506jest nefrotoksyczność, które przynajmniej do pewnego stopnia jest zależna od dawki występuje u wielu pacjentów, zwykle w postaci zmniejszenia tempa filtracji kłębuszkowej w trakcie stosowania leku. Ten objaw uboczny, jednakże, jest przynajmniej częściowo odwracalny po odstawieniu leku (Leaker i Caims, wyżej). Zwykle, nie rozwija się postępująca niewydolność nerek, jednakże, do ostatecznego stwierdzenia wymagana jest dłuższa obserwacja. Przewlekłą niwydolność obserwowano również u pacjentów otrzymujących niskie dawki cyklosporyny (3-4 mg/kg/dzień), około 40% biopsji od tych pacjentów wykazywało zmiany włoknienia śródmiąższowego, atrofii kanalikowej i patologii włośniczkowej (Svarstad i in., Nephrol. Dial. Transplant., 9:1462-1467 (1994); Young i in., Kidney International, 46:1216:1222 (1994)). Zmiany w komórkach śródbłonka widoczne sąrównież w skrawkach histologicznych (Kahan., N. Engl. J. Med., 321:1725-1748 (1989)). Skurcz naczyniowy tętniczek i przewlekłe niedokrwienie niewielkiego stopnia było postulowane jako podstawowa przyczynanefrotoksyczności (Leaker i Caims, wyżej), jednakże wykazano, że leki były również bezpośrednio toksyczne dla komórek kanalików i komórek przydanki naczyń (Platz i in., Transplantation., 58:170-178 (1994)). Niektóre doniesienia wskazują, że występowanie i ciężkość nefrotoksyczności może być nieco wyższa w przypadku FK506 (Platz i in., wyżej).

Inne opisywane toksyczności cyklosporyny i FK506 to neurotosyczność, z objawami klinicznymi obejmującymi napady padaczkowe, zaburzenia orientacji, ślepota, śpiączka, bóle głowy, zespół Parkinsona, parestezje, psychozy, niedobory ogniskowe, mutyzm akinetyczny, drżenia, neuropatia i zaburzenia snu (Shimizu i in., Pediatr. Nephrol., 8:483-385 (1994); Wilson i in., Muscle and Nerve, 17:528-532 (1994); Reece i in.. Bonę Marrow Transpl., 8:393-401

184 659 (1991); Eidelman i in., Transpl. Proc., 23:3175-3178 (1991); de Groen i in., N. Engl. J. Med., 317:861-566 (1987)). Po przeszczepieniu wątroby, stwierdzono neurotoksyczność umiarkowanego i ciężkiego stopnia u 10-20% pacjentów leczonych FK506 i 3-12% pacjentów leczonych cyklosporyną. Neurotoksyczność była związana z anomalą lipidów w surowicy i zaburzeniem funkcji nerek.

Inne objawy uboczne cyklosporyny i/lub FK506 obejmująhepatotoksyczność, nietolerancję glukozy, nadciśnienie, hirsutyzm, objawy żoładkowo-jelitowe, zakrzepicę żylną, zapalenie trzustki i przerost dziąseł (Morris, J. Heart Lung Transplant., 12:3275-3286 (1989); Fung i in., Transplant. Proc., 23:3105-3108 (1991); Mason, Pharmacol. Rev., 42:423-434 (1989); Kahan, N. Engl. J. Med., 321:1725-1738 (1989); Thomason i in., Renal Failure, 16:731-745 (1994)). Stąd, w świetle szerokiego zastosowania cyklosporyny i FK506 oraz związanych z nimi objawów ubocznych, niezwykle korzystne byłoby opracowanie alternatywnych leków immunosupresyjnych.

Przykładowo, możliwa jest, że delokalizacja kalcyneuryny z białka kotwiczącego limfocytów T może zahamować aktywność kalcyneuryny w trakcie aktywacji limfocytów T, zapewniając w ten sposób swoistą dla limfocytów T immunosupresję, posiadającą użyteczność cyklosporyny czy FK506, ale wykazującą mniejsze objawy niepożądane. Poprzednie obserwacje, że usunięcie PKA z białka kotwiczącego limfocyta T zwiększa ekspresję IL-2 w pobudzonych komórkach wskazuje, że umiejscowiona przez białko kotwiczące PKA przyczynia się regulującego wpływu na ekspresję IL-2 w trakcie aktywacji limfocyta T. Swoista dla limfocyta T delokalizacja PKA może dostarczyć sposobu wzmożenia sekrecji IL-2 in vivo, naśladując w ten sposób podawanie rekombinowanej IL-2 i prawdopodobnie zmniejszając opisywanątoksyczność podawania IL-2.

IL-2 została zatwierdzona do leczenia przerzutującego raka nerki i około 15-20% pacjentów z tym nowotworem oraz z czerniakiem odpowiada na leczenia IL-2. Część z tych odpowiedzi jest długotrwała trwając ponad 66 miesięcy (Dillman, Cancer Biotherapy, 9:183-209 (1994); Whittington i Faulds, Drugs 46:446-514 (1993)). Podczas gdy leczenie dużymi dawkami podawanymi w postaci bolusów związane jest z częstymi ciężkimi działaniami ubocznymi (jak to opisano niżej), małe dawki podskórne lub leczenie wlewem ciągłym powoduj e umiarkowany odsetek odpowiedzi 12% przy zmniejszonej toksyczności (Vogelzang i in., J. Clin. Oncol., 11:1809-1816(1993)).

Leczenie IL-2. (z interferonem-α czy innymi lekami lub bez) badano w przypadku innych nowotworów. Przykładowo, utrzymaną odpowiedź kliniczną, ale bez wyleczenia, uzyskano przez bezpośrednie podanie IL-2 do niszy po guzie po resekcji glejaka (Merchant i in., J. Neuro., 8:173188 (1990)). W jeszcze innych badaniach, umiarkowaną efektywność opisywano w leczeniu chłoniaków (Dillman, wyżej); raka jelita grubego i odbytnicy (Whittington i Faulds, wyżej), ograniczonej AML (Brutton i Koeller, Pharmacothe'rapy, 14:635-656 (1994), raka jajnika i wczesnego raka pęcherza moczowego (Whittington i Faulds, wyżej). Liczebność pacjentów w każdym z tych badań była zbyt niska by umożliwić znaczące wnioski dotyczące efektywności.

IL-2 stosowanajest również w skojarzeniu z immunoterapiąadoptywnąi, jak wykazano, jest efektywna w leczeniu przerzutującego raka nerki (Pierce i in., Sem. Oncol., 22:74-80 (1995); Belldegrun i in., J. Urol., 15^:1384-1390 (1993)). Dodatkowo, IL-2 może być efektywna w leczeniu pewnych chorób zakaźnych, przez zmniejszenie ilości bakterii w skórze i poziomu antygenu u pacjentów cierpiących na trąd, po wstrzyknięciujej podskórnie (Kaplan, J. Infect. Dis., 167 (suppl. 1):S18-22 (1993)). Obserwowano również w porównaniu z PPD-dodatnimi zdrowymi, limfocyty od pacjentów chorych na gruźlicę produkują mniejsze ilości IL-2 (Sanchez i in., Inf. Immun., 62:5673-5678 (1994)), co wskazuje, że leczenie IL-2 może być wartościowe w leczeniu zakażeń i mykobakteriami.

Mimo potencjalnej wartości leczniczej IL-2, cytokinajest związana ze znaczną tok- sycznością (jeżeli nie zaznaczono inaczej dane pochodzą z Whittington i Faulds, Dillman i Bruton oraz Koeller, wyżej). Głównym działaniem ograniczającym stosowanie jest zespół przeciekania włośniczkowego. Podanie IL-2 zwiększa przenikalność naczyń powodując obrzęki śródmiąższowe i płuc, i pacjenci rozwijają hipotensję którą, w licznych przypadkach trzeba leczyć podając leki presyjne. Raptowne uzupełnianie płynów może spowodować zagrażający życiu obrzęk płuc. Ponad 20% pacjentów

184 659 może wymagać intubacji i wentylowania mechanicznego. Duże dawki w postaci bolusów powodują cięższe przesiąkanie w porównaniu z małymi dawkami czy powolnym wlewem zaś w niektórych schematach do 100% pacjentów wymaga pomocy w Oddziale Intensywnej Terapii (ICU) podczas leczenia IL-2. Obserwowano również zapalenie mięśnia serca; kardiomiopatie i arytmie. Jako następstwo zespołu przeciekania włośniczkowego i niedociśnienia może wystąpić ostra niewydolność nerek.

IL-2 wywołuje również biegunki z zaburzeniami elektrolitowymi, cholestazę, zaburzenia funkcji tarczycy i ostre zapalenie trzustki. Anemia wymagająca transfuzji krwi konieczna jest u 1520% pacjentów (MacFarlane i in., Cancer 75:1030-1037 (1995)). Może wystąpić trombocytopenia z krwawieniami i zaburzenia krzepnięcia. Ponad 70% pacjentów doświadcza zmian psychicznych, włączywszy urojenia paranoidalne, halucynacje, utratę napędu, zaburzenia snu i parestezje. Opisywane są również śpiączki, zaburzenia widzenia, przejściowy atak niedokr- wienny i parestezje. Te wady związane ze stosowaniem egzogennej IL-2 wskazują, że powinny być zbadane możliwości wdrożenia leczenia alternatywnego, np. modulacji produkcji endogennej IL-2 i wyeliminowania w ten sposób konieczności podawania IL-2.

Dodatkowo, aby dostarczyć sposobów identyfikacji leków immunosupresyjnych i modulatorów produkcji IL-2, identyfikacja białek kotwiczących czyni możliwym regulację innych czynności komórkowych w świetle różnych szlaków metabolicznych, w których biorą udział białka kotwiczące. Przykładowo, AKAP 79 jest ważnym białkiem w regulacji kanałów jonowych sterowanych receptorem glutaminowym w zagęszczeniach postsynaptycznych neuronów', prawdopodobnie przez wiązanie PKA, PKC i kalcyneuryny. PKA reguluje aktywność kanałów sterowanych receptorem AMPA, zaś delokalizacja czy zahamowanie PKA osłabia aktywność kanałów jonowych AMPA. PKC reguluje aktywność kanałów sterowanych rerceptorem NMDA a kalcyneuryna odczula, jak wykazano, receptory NMDA na bodziec. Obserwacje te wskazują, że umiejscowione kinazy (PKA i PKC) mogą regulować aktywność receptorów glutaminowych w neuronach. Defosforylacjaprzez kalcyneurynę jest mechanizmem odwrotnie regulującym receptory NMDA. Model ten pokrywa się ze zjawiskiem drgawek wywoływanych cyklosporyną czy FK506.

Dodatkowo, receptory glutaminowe wiąże się z wieloma chorobami neurologicznymi. Glutaminian i inne pobudzające aminokwasy mogą wywoływać pobudzenia w neuronach zaś nadmierne pobudzanie postsynaptycznych receptorów glutaminowych jest, jak wykazano, toksyczne dla neuronów i powoduje ostrą degenerację neuronalną. Hipoksja (jak w następstwie udaru lub zatrzymania serca) i uraz CN S powodują, jak wykazano, masywne uwalnianie glutaminianu do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, gdzie oddziałuje on z receptorami i wywołuje kaskadę ekscytotoksyczną. Leki uspokajające chronią, jak wykazano, przed uszkodzeniem mózgu na modelu zwierzęcym (Olney, Neurobiology of Ageing, 15:259-260 (1994)). Co ciekawe, antagoniści NMDA są toksyczni dla niektórych rodzajów neuronów co wskazuje, że glutaminian może hamować inne szlaki pobudzające w tych komórkach. Antybiotyki makrolidowe, jak FK506, chronią, jak wykazano, przed ekscytotoksycznościąNMDA, ale nie przed kainianem, w hodowlach neuronów (Manev i in., Brain Res., 624:331-335 (1993)).

Glutaminian jest również związany z chorobą Parkinsona. Antagoniści NMDA chronią neurony dopaminergiczne w istocie czarnej u małp eksponowanych na MPTP, związek wywołujący zespół Parkinsona u ludzi i innych naczelnych. Amantadyna i memantyna są antagonistami NMDA i stosuje się je w Europie w leczeniu choroby Parkinsona., jednakże, wywołują one u niektórych pacjentów psychozy. Istnieją dowody, że neurony glutaminergiczne mogą być nadczynne w chorobie Parkinsona i zahamowanie ich może zmniejszyć objawy motoryczne choroby (Lange i Riederer, Life Sciences 55:2067-2075 (1994)).

Glutaminian odgrywa rolę w chorobach padaczkowych, uczestnicząc w zapoczątkowaniu, rozszerzaniu i utrzymaniu aktywności drgawkowej. NMDA i jego agoniści są silnymi czynnikami przeciwdrgawkowymi (Meldrum, Neurology, 44 (suppl. 8) :S14-S23 (1994)). Receptory AMPA wiąże się z ALS i toczą się obecnie próby z agonistami receptora.

184 659

W świetle wszystkich tych obserwacji, nie jest zaskakujące, że toczą się badania kliniczne nad innymi środkami immunosupresyjnymi. Poniższe dane dotyczące tych badań pochodzą z Haydon i Barnes, Balliere’s Clin. Gastroentero., 8:455-464 (1994); Thomason i Starzli, Immunol. Rev. 1993,71-98 (1993) i Mon^rs, J. Heart Lung Transplant., 12:S275-S286 (1993). Przykładowo, azaspirane jest związkiem f-my SKB hamującym naciek komórkowy w obrębie przeszczepu i indukującym IL-2R, jak również znoszącym produkcję IL-2 i IFN-γ. Prawdopodobnie, azaspirane stymuluje pewne rodzaje komórek supresorowych i istnieją dane, że działa synergistycznie z cyklosporyną.

Jako inny przykład, mycophenolate mofetial jest związkiem f-my Syntex, hamującym syntezę puryn w wywierającym wybiórczy wpływ antyproliferacyjny na limfocyty B i T. Usuwa on przeciwciała, jak również może usuwać cząsteczki adhezyjne z powierzchni komórek. Mimo, że lek wywiera słabą toksyczność może powodować leukopenię i jest stosowany w leczeniu łuszczycy od 20 lat.

Jako inny przykład, mizoribine firmy Sumitomo hamujący syntezę DNA. Mechanizm działania jest identyczny co mycophenolate.

Jako jeszcze inny przykład, brequinar, związek f-my DuPont-Merck, który hamuje syntezę pirymidyn przez blokowanie dehydrogenazy dihydrooratowej. Oczekuje się pełnych danych z prób klinicznych. Lek opisywano jako działający synergistycznie z cyklosporyną ale może on wywoływać trombocytopenię, zapalenie skóry i błon śluzowych.

Jako jeszcze inny przykład, 15-dezoksyspergualina, związek f-my Nippon-Kayaku działający głównie na monocyty/makrofagi, hamując metabolizm tlenowy, syntezę enzymów lizosomalnych, produkcję IL-1 i ekspresję powierzchniową cząsteczek MHC klasy II. Jest on skuteczny w 70-90% w zapobieganiu odrzucania przeszczepu nerek, ale w wyższych dawkach może wystąpić toksyczność szpiku.

Innym przykładem jest leflunomide f-my Hoechst, hamujący syntezę cytokin, blokujący aktywacje limfocytów T i syntezę przeciwciał. Nie jest toksyczny dla nerek i szpiku.

Innym przykładem jest rapamycyna f-my Wyeth-Ayerst spokrewniona z FK506. Jest to prolek, który musi dla swej aktywności związać się z immunofiliną i nie hamuje kalcyneuryny jak również nie blokuje syntezy cytokin przez limfocyty T. W nieznanym mechanizmie, rapamycyna blokuje przejście z fazy G1 do S.

Specjalista w tej dziedzinie wiedzy może dokonać licznych modyfikacji i odmian przedstawionego powyżej wynalazku. Wynalazek ograniczajątylko załączone zastrzeżenia patentowe.

184 659

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY: Lockerbie, Robert Owen, i in.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Związki hamujące kalcyneurynę i białko kotwiczące (iii) LICZBA SEKWENCJI: 42 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Marschall, OToole' Gerstein, Murray i Bonin.

(b) ULICA: 233 South Wacker Drive, 6300 Sears Tower (C) MIASTO: Chicago (D) STAN: Illinois (E) KRAJ: USA (F) KOD: 60606 (v) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: zgodny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: PatentIn #1.0, wer. #1.25 (Vi) DANE DOT. OBECNEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA:

(B) DATA ZGŁOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(vii) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/404,731 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 15 marca 1995 (vii) DANE DOT. POPRZEDNIEGO ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: US 08/344,227 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 23 listopada 1994 (viii) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(A) NAZWISKO: Williams Jr., Joseph A.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 38,659 (C) NUMER SPRAWY: 27866/32861 (ix) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:

(A) TELEFON: 312-474-6300 (B) TELEFAX: 312-474-0448 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 1: Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Gln-Gln-Lys-Pro (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 2:

184 659

Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln (2) (INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW’ Nr 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 3: Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasy (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd , (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 4:

Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Val Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu Glu Val Lys Ala Ala Gly Ala (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 5: Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 2257 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (ix) CECHA:

(A) NAZWA/KLUCZ: CDS (B) POŁOŻENIE: L. 1461 (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 6:

CCG CCC CCG CCC CCG CCC CCA CCG CCC CCT CTC GGG GCC GAC CGC GTC

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Asp Arg Val

5 10 15

GTC AAA GCT GTT CCT TTT CCC CCA ACT CAT CGG CTG ACA TCT GAA GAA

Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Thr His Arg Leu Thr Ser Glu Glu 20 25 30

GTG TTT GAT ATG GAT GGG ATA CCC AGG GTT GAT GTT CTG AAG AAC CAC 144

Val Phe Asp Met Asp Gly Ile Pro Arg Val Asp Val Leu Lys Asn His 35 40 45

TTG GTA AAA GAA GGG CGG GTG GAT GAA GAA ATT GCA CTA AGA ATT ATC

184 659

192

Leu Val Lys Glu Gly Arg Val Asp Glu Glu Ile Ala Leu Arg Ile Ile 50 55 60

AAT GAG GGT GCT GCC ATA CTT CGG CGG GAG AAA ACC ATG ATA GAA GTA 240

Asn Glu Gly Ala Ala Ile Leu Arg Arg Glu Lys Thr Met Ile Glu Val 65 70 75 80

GAA GCT CCA ATT ACA GTG TGT GGT GAC ATC CAT GGC CAA TTT TTT GAT 288

Glu Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp 85 90 95

CTG ATG AAA CTT TTT GAA GTA GGA GGA TCA CCT GCT AAT ACA CGA TAC 336

Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr 100 105 110

Ctt T_TT CTT GGT GAT TAT GTG GAC AGA GGT TAT TTT AGT ATA GAG TGT 384

Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys 115 120 125

GTC TTA TAT TTA TGG GTC TTG AAG ATT CTA TAC CCA AGC ACA TTA TTC 432

Val Leu Tyr Leu Trp Val Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Phe 130 135 140

CTT CTG AGA GGC AAC CAT GAA TGC AGA CAC CTT ACT GAA TAT TTT ACC 480

Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr

145 150 155 160

TTT AAG CAG GAA TGT AAA ATT AAA TAT TCA GAA AGA GTC TAT GAA GCT 528

Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Glu Ala 165 170 175

TGT ATG GAG GCT TTT GAC AGC TTG CCC CTT GCT GCA CTT CTA AAC CAA 576

Cys Met Glu Ala Phe Asp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Leu Asn Gln 180 185 190

CAA TTT CTT TGT GTT CAT GGT GGA CTT TCA CCA GAA ATA CAC ACA CTG 624

Gin Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile His Thr Leu 195 200 205

GAT GAT ATT AGG AGA TTA GAT AGA TTT AAA GAG CCA CCT GCA TTT GGA 672

Asp Asp Ile Arg Arg Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Phe Gly 210 215 220

CCA ATG TGT GAC TTG CTA TGG TCT GAT CCT TCT GAA GAC TTT GGA AAT 720

Pro Met Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Ser Glu Asp Phe Gly Asn

225 230 235 240

GAA AAA TCA CAA GAA CAT TTT AGT CAT AAT ACA GTT CGA GGA TGT TCT 768

Glu Lys Ser Gln Glu His Phe Ser His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser 245 250 255

TAT TTT TAT AAC TAT CCA GCA GTG TGT GAA TTT TTG CAA AAC AAT AAT 816

Tyr Phe Tyr Asn Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln Asn Asn Asn ' 260 265 270

TTG TTA TCG ATT ATT AGA GCT CAT GAA GCT CAA GAT GCA GGC TAT AGA 864

184 659

Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg 275 280 285

ATG TAC AGA AAA AGT CAA ACT ACA GGG TTT CCT TCA TTA ATA ACA ATT 912

Met Tyr Arg Lys Ser Gln Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile 290 295 300

TTT TCG GCA CCT AAT TAC TTA GAT GTC TAC AAT AAT AAA GCT GCT GTA 960

Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val 305 310 315 320

CTA AAG TAT GAA AAT AAT GTG ATG AAC ATT CGA CAG TTT AAT TGC TCT

1008

Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser 325 330 335

CCA CAT CCT TAT TGG TTG CCC AAT TTT ATG GAT GTC TTT ACA TGG TCC 1056

Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser 340 345 350

TTA CCA TTT GTT GGA GAA AAA GTG ACA GAA ATG TTG GTA AAT GTT CTG 1104

Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val Leu 355 360 365

AGT ATT TGT TCT GAT GAT GAA CTA ATG ACA GAA GGT GAA GAC CAG TTT 1152

Ser Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Met Thr Glu Gly Glu Asp Gln Phe 370 375 180

GAT GTA GGT TCA GCT GCA GCC CGG AAA GAA ATC ATA AGA AAC AAG ATC

1200

Asp Val Gly Ser Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ile Ile Arg Asn Lys Ile 385 390 395 400

CGA GCA ATT GGC AAG ATG GCA AGA GTC TTC TCT GTT CTC AGG GAG GAG 1248

Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu 405 410 415

AGT GAA AGC GTG CTG ACA CTC AAG GGC CTG ACT CCC ACA GGG ATG TTG 1296

Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu 420 425 430

CCT AGT GGA GTG TTG GCT GGA GGA CGG CAG ACC TTG CAA AGT GGT AAT 1344

Pro Ser Gly Val Leu Ala Gly Gly Arg Gln Thr Leu Gln Ser Gly Asn 435 440 445

GAT GTT ATG CAA CTT GCT GTG CCT CAG ATG GAC TGG GGC ACA ACT CAC 1392

Asp Val Met Gln Leu Ala Val Pro Gin Met Asp Trp Gly Thr Thr His 450 455 460

TCT TTT GCT AAC AAT ACA CAT AAT GCA TGC AGG GAA CTC CTT CTG CTT 1440

Ser Pne Ala Asn Asn Thr His Asn Ala Cys Arg Glu Leu Leu Leu Leu 465 470 475 480

TTT AGT TCC TGT CTT AGC AGC TGACATATGC AGGGTATTAT GTGATAGGCA

1491

Phe Ser Ser Cys Leu Ser Ser 485

TCTGATTAGT ACCTGGCCAG GGCATAATAT TGATAGAACA AGTTGTCTTT TAACTGAAAA 1551

TAACAATCAG TTTCCCAGAT TTTCATAAGG TGATATGGGG AGCAGCTCAT GTCATAATTC 1611

184 659

CGAAATATTT ATTCATTTGT TTAATGCACC CCTTTCTTTC AAAAGCCTCA GTCAAGAATG 1671

TGAATCAGGG ATATATCTAT ATATCTATTT ACACACATAC ATAAATATAT ATAACTAAAA 1731

TGGAAATGTA ATTCCGAGTT TCTTACTTTT AAAATTTACG TAATTGTATT AGATTTTGCT 1791

TATGTTTTCA AGTATTTATT TTTTGAGTTA AAATTCTGCT TAGGCCCCAA AACTTCCTTT 1851

ATGCACTCAT TTGCCAAAAG ATTTATGCTA AATTTTGTAC CCTGGTAAAT GATTAGAGTT 1911

TGTTTTCTGT GGTGTTTGTC AAACGTTCTA TGTATAATTG ACTGTCTGTA ACATGCTGTT 1971

TCCTTCCTCT GCAGATATAG CTGCTTTCCT AAATCTGTCT GTCTTTCTTT AGGATAGCTG 2031

TATGTCTGTA AATATATGTT CAATTAAATT ACTCTATCAG ACGCTTGTCT GTCTTTTGAT 2091

GTAGAAGCAA CTTTGTAGCA CCTTGATTTT AGGTTTGCTG CATTTGTTGC TGCACTTGGT 2151

TCAGTCTGAA TATGAATGTA ACATTAGATA TTGAGCTATT GTTATAAAGG GTTGAATTTA 2211

AATCATGTAA GTCAAAATTG AAAGGGTGTT ATAAAGTGTG CCTTTA 2257 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 487 aminokwasów (B) RODZAJ: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: białko (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 7:

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Asp Arg Val

10 15

Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Thr His Arg Leu Thr Ser Glu Glu

25 30

Val Phe Asp Met Asp Gly He Pro Arg Val Asp Val Leu Lys Asn His

40 44

Leu Val Lys Glu Gly Arg Val Asp Glu Glu Ile Ala Leu Arg Ile Ile

55 60

Asn Glu Gly Ala Ala Ile Leu Arg Arg Glu Lys Thr Met Ile Glu Val

70 75 80

Glu Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp

90 95

Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr

100 105 110

Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys

115 120 125

Val Leu Tyr Leu Trp Val Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Phe

130 135 140

Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr 145 150 155 160

Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Glu Ala

165 170 175

Cys Met Glu Ala Phe Asp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Leu Asn Gln

180 185 190

Gln Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile His Thr Leu

195 200 205

Asp Asp Ile Arg Arg Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Phe Gly

210 215 220

184 659

Pro Met Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Ser Glu Asp Phe Gly Asn

225 230 235 240

Glu Lys Ser Gln Glu His Phe Ser His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser 245 250 255

Tyr Phe Tyr Asn Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln Asn Asn Asn 260 265 270

Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ala His Glu Ala Gin Asp Ala Gly Tyr Arg 275 280 285

Met Tyr Arg Lys Ser Gin Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile 290 295 300

Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val

305 310 315 320

Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser 325 330 335

Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser 340 345 350

Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val Leu 355 360 365

Ser Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Met Thr Glu Gly Glu Asp Gln Phe 370 375 380

Asp Val Gly Ser Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ile Ile Arg Asn Lys Ile 385 390 395 400

Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu

405 410 415

Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu

420 425 430

Pro Ser Gly Val Leu Ala Gly Gly Arg Gln Thr Leu Gln Ser Gly Asn

435 440 445

Asp Val Met Gin Leu Ala Val Pro Gln Met Asp Trp Gly Thr Thr His

450 455 460

Ser Phe Ala Asn Asn Thr His Asn Ala Cys Arg Glu Leu Leu Leu Leu 465 470 475 480

Phe Ser Ser Cys Lue Ser Ser

485 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGOL liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 8: Ser Ile Lys Arg Leu Val Thr Arg Arg Lys Arg Ser Glu Ser Ser Lys 15 10 15

Gln Gln Lys Pro Phe Lys Ala Lys Leu Gln Ser Glu 20 25 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasy (b) RODZAJ: aminokwas (C) CIOIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 9: Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Ase-Ala-Val-Ile32

184 659

Glu-CIn-Val-Lys-Ala-Ala-Cly-Ala-Tyr

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 10: CTATTACCACCACATCTTCCTACTTC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 11; CTCTCTCTACATCTCCTCAAACTCC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 12: ATTCTACACATCTAACTAATTAGGTCCCC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 13: CCCAATTCCTCACATCTTCTTTCTTATC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 14: CGAATTCCGATCCTCGAGAGATCTCCCCC 2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

184 659 (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 15: CCACTTTGAGATCTCTACCGTCCTCCAGCC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (Xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 16: CCCTGAGATCTTCAGCTGCTAAGAC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 17:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI ; cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 17: GGCTGAGATCTGGCAGACCTTGCAAAGTGG

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 18: GTGATGAAGATCTTACAGTTTAATTGCTCTCC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 19:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 19; TTCTCCAGATCTTGGTAAGGACCATG

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJ (A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy

184 659 (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) ROD2DZCZĄSTECEKJ:-cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr.20:

CACCCCCCGCAGACCCCCCACCACCAGAAC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 21 KACKGGKAGACKCKCGAAGAAGCG

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 29 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 22: CCACGGCCAACTTTAGATCTCGACGAAAC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 23:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 23: GGACCACGAGACCCAACCCACAAAATTGGG

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 24: AAAT GGGAGAT C CAACAAGGAC GT GGAGAGK

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa

184 659 (ii) RODZDJ CZĄSTLCEKI: ci)\D (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 25: GCACACKAACCAAACACKCAAACCCCKACKAK INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 26: CCCCKACACACKCACAKAACKACKCC 2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 27 CAACCAGΛCCCAACGCGGAGAGKΛACCAAACTGCCG INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 28 KKAACAACACACKCAACAGKAACTAAAKCCCKC 2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 29: TGTGAGATCCAATTAAACCGTCGAACGCCCATCAC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 pary zasad, (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (d) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW Nr 30: CCACACKACACKCAKCCCKGAACCCCKACKAK

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad

184 659 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 31:

AAGGATAGATCTAGCAATTAAACTGTCGAATGTTCATCAC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 32:

(i) CHAR/AKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 54 pary zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: po_jedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI i cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 32:

TACAACTAGTACCATGGTCGATGGTCGACAGATCTCTCGAGAAGCTTAGCTAGC

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 981 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (c) NICIOWOŚĆ: pooedyncca (D) TOPOLOGIA: Urnown (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 33:

CAGAGTATCG AOGAAAOCOA CAAAOAOGAC AAAAAACAAC AACAAGAAAT CCTGGCGGCG

AAACCCTGGA COAAGGAOCA CCACOACOOO AAAOACOGCA AAAOCOCAGC AOOGGCOCOA

120

COGAAAAOGG OGAOGCAOGC CAGGTCAGGA GGCAACTTGG AAGOGAOGGG OOOGAOGCOC 180

GGGAAAGTCG ACGGCGAGAC CAOGAOCAOC AOGGACAGOO OCGCOOOGAC OGOAGAGGGC 240

ACAGAAACTC GAGOAAAOGC TCAAGCTGCT GCGOAOGAGO AOAOGGCOGC AOACAOAGAA 300

AATGCCAAAC AGGOOGGCCG CCOOGAGAAO GCAAOCGGOO GGOAOCAOAG CCACCCTGGT 360

OATGGCOGCO GGCTCTCCGG GAOOGAOGOO AGTACACAGA TGCTGAACCA GCAGOOOCAA 420

GAACCAOOOG mGIAC/roGT GAOOGAOCCA ACCAGAACAA OCOCOGCAGG AAAAGOGAAO 480

CTTCGCCCCO OOACGACAOA OCCAAACCGC TACAAACCTC COGAOGAAGC ACCOOCOCAG 540

OACCACACOA OCCCACCOOA AOAAAAOAGA AGAOOOCCCC GOCCACOGAA ACAAOAOOAO 600

GCCOOACAAG OCOCAOAOOO CAAAOCAOCO OCCAOCCOAA ACOACOOGAG COOOGCOCCA 660

ATAAAOACOG GGOGAAOACC COGACOCCOC OAGCOOCCOO ACOAAOGCAG ACTACACCAC 720

ACCCCACCOC OOGAOOOGOC OGACAACOOA CAGCAGOCGG AACCCCAACO GGGACGOCGC 780

ACOOOCAOCO OCCCCOOAGA AACACATGAC CGCAAGOCCG AAGACAAACT OGCCAAAGCO 840 '

ACTAGAGACA CCOCOAAAAC CACCAOAGAA GCCACCAOCG ACOCAOGOCO CAGGOOAOOA 900

ACCAOAAACO COOOAAOCAG AOOAACCOOC OOACOOACCA CCACGOACOO COCAAAGOGG 960

184 659

TGTGTGGAAG GAAAAGAGCT C 981

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 919 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (i) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 34:

AAACCCTGGA CTAAGGATCA CCACTACTTT AAATACTGCA AAATCTCAGC ATTGGCTCTA 60

CTGAAAATGG TGATGCATGC CAGGTCAGGA GGCAACTTGG AAGTGATGGG TTTGATGCTC

120

GCCAAAGTCC ACGGGGAGAC CATGATCATC ATGGACAGTT TCGCTTTGCT GTAGAGGGCA 180

CAGAAACTCG AGTAAATGCT CAAGCTGCTG CGTATGAGTA TATGGCTGCA TACATAGAAA 240

ATGCCAAACA GGTTGGCCGC CTTGAGAATG CAATCGGTTG GTATCATAGC CACCCTGGTT 300

ATGGCTGCTG GCTCTCCGGG ATTGATGTTA GTACACAGAT GCTGAACCAG CAGTTTCAAG 360

AACCATTTGT AGCAGTGGTG ATTGATCCAA CCAGAACAAT CTCTGCAGGA AAAGTGAATC 420

TTGGCGCCTT TAGGACATAT CCAAAGGGCT ACAAACCTCC GATGAAGGAC CTTCTGAGTA 480

CCAGACTATC CCACCTTAAT AAAATAGAAG ATTTGGGCGT GCACTGAAAC AATATTATGC 540

CTTAGAAGTC TCATATTTCA AATCATCTTG GATCGTAAAC TACTTGAGCT TTGGTGGAAT 600

AAATACTGGG TGAATACCCT GAGTCCTCTA GCTTGCTTAC TAATGCAGAC TACACCACAG 660

GCCAGGTGTT GATTTGTCTG AGAAGTTAGA GCAGTCGGAA GCCCAACTGG GACGTGGCAG 720

TTTCATGTTG GGCTTAGAAA CACATGACCG CAAGTCGGAA GACAAACTTG CCAAAGCTAC 780

TAGAGACAGC TGTAAAACCA CCATAGAAGC CACCATGGAC TGATGTCTCA GGTTATTAAG 840

GATAAACTGT TTAATCAGAT TAACGTTGTT AGTTACCACC ACGTACTTCT CAAAGTGGTG 900

TGTGGAAGGA AAAGAGCTC 919

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 541 par zasad (b) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 35:

GACCACCGAG ATGCCAATTC CAGTGTCATG AGATTTCTGC GAGACCTCAT CCACACAGGA

GTAGCCAATG ATTTATCTGT TTTCTTACAG CATGAAGAAG ATTTTGTTGC GGAAGGAACT

120

AATTGGACAG GTGATGAGCC AGCTTGGGCA GCAACTTGTC AGCCAGCTGC TCCACACATG 180

CTGCTTTTGG TTCCCCCCTA CACCCTACCC CACCTGGTTG AAGTGCTCTG GGAGATCATG 240

184 659

CAGGTTGACA GACCGACTTT CTGTCGGTGG CTAGAGAATT CCTTGAAAGG TTTGCCAAAA 300

GAGACCACAG TGGGAGCTGT CACAGTGACA CATAAACAAC TTACAGATTT CCACAAGCAA 360

GTCACTAGTG CCGAGGAATG TAAGCAAGTT TGCTGGGCCT TGAGAGACTT CACCAGGTTG 420

TTTCGATAGC TCAAGCTCAC ACTCCTGCAC TGTGCCTGTC ATCCAGGAAT GTCTTTTTTT 480

ATTAGAAGAC AGGAAGAAAA CAACCCAGAC TGTGTCCCAC AATCAGAAAC CTCTGTTGTG

540 G

541

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 519 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 36:

CGAGATGCCA ATTCCAGTGT CATGAGATTT CTGCGAGACC TCATCCACAC AGGAGTAGCC

AATGATCATG AAGAAGATTT TGAATTGCGG AAGGAACTAA TTGGACAGGT GATGAGCCAG 120

CTTGGCCAGC AACTTGTCAG CCAGCTGCTC CACACATGCT GCTTTTGTCT TCCCCCTACA 180

CCCTACCCGA CGTGGTTGAA GTGCTCTGGG AGATCATGCA GGTTGACAGA CCGACTTTCT 240

GTCGGTGGCT AGAGAATTCC TTGAAAGGTT TGCCAAAAGA GACCACAGTG GGAGCTGTCA 300

CAGTGACACA TAAACAACTT ACAGATTTCC ACAAGCAAGT CACTAGTGCC GAGGAATGTA 360

AGCAAGTTTG CTGGGCCTTG AGAGACTTCA CCAGGTTGTT TCGATAGCTC AAGCTCACAC 420

TCCTGCACTG TGCCTGTCAT CCAGGAATGT CTTTTTTTAT TAGAAGACAG GAAGAAAACA 480

ACCCAGACTG TGTCCCACAA TCAGAAACCT CTGTTGTGG 519 (2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 37:

Phe Xaa Arg Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys 1 5 10

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI:

(xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 38:

184 659

Phe Ala Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys 1 5 10

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 39:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 39:

Phe Lys Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys 1 5 10

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) dCIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 40: Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys 2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) RODZAJ: aminokwas (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZEK : peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 41: Phe Lys Arg Arg Lys Lys Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ala 1 5 10

2) INFORMACJA DO IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (b) (B) RODZAJ: aminokwas (C) dCIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW Nr 42: Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ala 1 5 10

184 659

102

388 409

CaN-binding site miejsce wiązania Ca

AKAP 79(88-102) AK AP75(88-102) FKBP-12(32 -47)

PKA₇binding miejsce wiązania PKA

RRKRSESS

RRKRSESS dg1k ΚΓΠϋ

FI G. 1A

184 659

AKAP 79 peptide ( jjM) AKAP 79 peptyd (μΜ) pmol c AMP/10 θ cells komórek

TIME (mmutes)

Czas (minuty)

FI G. 4

184 659

FIG. 2

184 659

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

HAAPEPARAA

PPPPPPPPPP

11ADRWKAV PEPPTSRLTS eevfdM5g5? : SADKWKAV BFPPTHRŁTS · EEUTD l· Odp

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

RVDVLXNBLY KEGRTDŁEIA LRUNEGAAI LRREKXMIEV EAPITVCGOX KTOVŁKNEŁV KECIWDEEIA LRUHEGAAI LRSEKIH1EV EM>XTVCC3I

100

Mu klon 11·1 Hu kalcyneuryna Al

EitKŁ EŁVGG5PAMX RYLFLGDXVD RCYFS ίΣΤΟΕΗΠ FEVGCSPANT RYLFLGDYTO EGYTSIPfc hŁElI— nffii ρτ

TEDTSINPH

12Q

150

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

NNINECYU ϊΰ HVLKXuTPSX LFLLRGUH£C RHŁXŁXFXTK QECKIKYSEK YŁ HVŁm.YPST ŁEUiSCHHEC BgŁXEYTXFE OECKIKYSEB

172

200

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

YYEACHEATD SIBUALLłlQ OTLCTHCGLS BEIHIŁODIR RLDBFKEPPA ΥΧΕΑ0Μ2ΑΠ5 SLPŁAALŁHQ OflCBSGGLS PEIETŁDDIR RLDRFKEPPA

222

250

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

PGPMCDLLWS DPSEDFCUEK SOŁHFSKNSW SGCSWYHYS AWCZTLOKłiK PC2KCDŁLWS DPSEDFGSEK SOEEFSENTY RCCSmOOT A.VCZFLQNHN

272

300

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

ŁŁSXIRA£EA QDAGXFiiXRK 5QXXSXPSŁI IXFSAPNXLD VXWNKAAVLK LLSIIRAEEA ODAGTPHYRK SOTTGFPSŁI TITSABHYLD VWIKAAVLK

322

350

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

XEHHVMHIAQ FNCSPHPYHu ΡΝΓΚΟΥΠΗ5 LPFYGŁKYTT MŁVHVLSICS rEHNVMNIRQ FNC3PEPYHL PNTŁEDYTTHS ŁPFVGEKVTE KLVHVLSICS

372

400

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

Mu klon ll.i Hu kalcyneuryna Al

Mu klon 11.1 Hu kalcyneuryna Al

ΚΕΙΙΚΗΚΧΒΑ XGKKAKVFSV LREESESVLl1 EEnSHKISA ICKHAKWTSY LREESESVLTj

DDELMTEGED

33AAAK

SSAAAR

422

449

472

499

4Ξ7

514

FIC. 3

184 659 ędna liczba komórek Względna liczba komórek Względna liczba komórek elative cell number Relative cell number Relative cell number

Fluorescence insensity Natężenie fluorescencji

FIG. 5B

Pm α / i on o m y c i n pma/jonomycyną

FIuorescence insensity Natężenie fluoreescencj:

FIG. 5C

184 659

Względna liczba komórek Względna liczba komórek Względna liczba komórek

Relative cell number Relative cell number Relative cell number

Fluorescence insensity Natężenie fluorescencji

FIG. 5D

Fluorescence insensity Natężenie fluorescencji

FIG. 5E jonomycyna

Pmo /inomycm + PK I

Fluorescence insensity Natężenie fluorescencji

FIG. 5F

184 659 (_

Względna liczba komórek Względna liczba komórek

Relative cell number Relative cell numbe jonomycyna Pmo /inomycin ♦anchoring peptide peptyd kotwiczący + forsk/ ibmx

Fluorescence intensity

Natężenie fluorescencji jonomycyna

Pma/ionomycin ♦ proline substituted anchoring peptide peptyd + forsk/ibmx kotwiczący podstawiony proliną

Fluorescence intensity

Natężenie fluorescencji

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zl.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1 .Oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd pACT 59 osekwencji Identyfikatora Sekw. Nr 33.
2.Polipeptyd pACT 59 kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 1.
3.Oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd pACT o sekwencji

Identyfikatora Sekw. Nr 34.
4. Polipeptyd pACT 74 kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 3.
5. Oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd pACT 36 o sekwencji Identyfikatora Sekw. Nr 35.
6. Polipeptyd pACT 36 kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 5.
7. Oczyszczony i wyizolowany polinukleotyd kodujący polipeptyd pACT 60 o sekwencji Identyfikatora Sekw. Nr 36.
8. Polipeptyd pACT 60 kodowany przez polinukleotyd według zastrz. 7.
9. Sposób identyfikacji związków hamujących wiązanie pomiędzy białkiem kotwiczącym a partnerem wiązania, znamienny tym, że obejmuje:

inkubowanie białka kotwiczącego i znakowanego partnera w obecności i pod nieobecność poszukiwanego związku hamującego, w warunkach odpowiednich do związania się białka kotwiczącego z partnerem, przy czym białko kotwiczące jest immobilizowane na stałym podłożu;

wypłukanie niezwiązanego partnera ze stałego podłoża;

określenie ilości ligandu związanego z immobilizowanym białkiem kotwiczącym; porównanie ilości partnera związanego z białkiem kotwiczącym w obecności związku i ilości partnera związanego z białkiem kotwiczącym pod nieobecność związku;

i określenie w ten sposób czy związek zahamował wiązanie pomiędzy białkiem kotwiczącym i partnerem wiązania standardowymi sposobami.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że partner wiązaniajest znakowany radioaktywnie.
11. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że partner wiązania jest znakowany fluoroforem.
12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że partnerem wiązania jest podjednostka regulacyjna typu I PKA.
13. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że partnerem wiązania jest podjednostka regulacyjna typu II PKA.
14. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że partnerem wiązania jest AKAP 79.
15. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że partnerem wiązania jest polipeptyd kalcyneuryna.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że polipeptyd kalcyneurynajest mutantem delecyjnym wybranym spośród grupy obejmującej polipeptydy kalcyneuryny zbudowane z aminokwasów 1- 487, 1-400, 1-31^, 1-204,1-104,332 -487,441-487,332-441,1-375,1-354,30184 659

375, 98-375, 1-347, 1-340, 1-330, 1-320, 1-338, 1-336, 1-334, 1-332 i 1-335 Identyfikatora Sekw. Nr 7.
17. Mutant delecyjny kalcyneuryny wybrany spośród grupy składającej się z polipeptydów kalcyneuryny zbudowanych z a-minokwasów 1-487,1-4(00 1-312,1-204, 1-104. 332-487,441487, 332-441, 1-375, 1-354, 30-375, 98-375, 1-347,1-340, 1-330, 1-320, 1-338, 1-336, 1-334, 1-332 i 1-335 Identyfikatora Sekw. Nr 7.
18. Sposób wzmagania ekspresji interleukiny 2 przez limfocyty T, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu pomiędzy limfocytem T i jednym z następujących peptydów o sekwencjach aminokwasowych:

Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile albo

Asp-Leu-Ile-GluGju-i-Ala-Ala-S<rr-ArgIlle-Val-Asp-Ala-Val-ne-Cjlu-Gln-Val-Lys-Ala-AlaGly-Ala
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że peptyd ma sekwencję aminokwasową:

Gly-ArgrArgrAsn-AlarIlerHisrAsprIle
20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowajest mirystylowana.
21. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że peptyd ma sekwencję aminokwasową:

Asp-Leu-Πe-Glu-GlurAla-Ala-Ser-AJ·grf^erVal-AsprAlarVal-Ile-Glu-GlnrValrLysrAlarAlar

Gly-Ala
22. Sposób według zastrz. 21, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowąjest mirystylowana.
23. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że obejmuje jeszcze aktywowanie limfocytów T 12-mirystyniano-13-octanem forbolu i jonomycyną.
24. Sposób izolowania kalcyneuryny z zawierającej ją frakcji komórkowej, znamienny tym, że polega na doprowadzeniu do kontaktu frakcji komórkowej z AKAP 79 lub jego fragmentem wiążącym kalcyneurynę, unieruchomionym na podłożu stałym i eluowaniu z niego kalcyneuryny.
25. Sposób hamowania aktywności kalcyneuryny w komórce, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórki z peptydem wiążącym kalcyneurynę, zawierającym następującą sekwencję aminokwasową:

ArgrArgrLySrArgrSer-Gln-SerrSer-Lys-Glu-Glu-LysrPro
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że peptyd ma sekwencję:

ArgrArg-Lys-Arg-SerrGln-Ser-Ser-Lys-GlurGlu-Lys-ProrLeurGln
27. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że peptyd ma sekwencję:

ArgrArgrLysrArg-Ser-Gln-SerrSerrLys-Glu-Glu-Lys-Pro-PherLys
28. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że peptyd nie wiąże się z PKA.
29. Sposób określania czy komórka zawiera białko wiążące kalcyneurynę i wiążące PKA, znamienny tym, że obejmuje.

rozbicie komórki z wytworzeniem lizatu;

inkubowanie lizatu z podłożem stałym, które posiada immobilizowane na sobie cząsteczki kalcyneuryny;

wypłukiwanie lizatu z podłoża stałego;

doprowadzenie do kontaktu podłoża stałego ze znakowanymi podjednostkami regulacyjnymi PKA wiążącymi się z białkiem kotwiczącym;

odpłukanie niezwiązanych podjednostek regulatorowych z podłoża stałego;

wykrywanie znacznika na podłożu stałym standardowymi sposobami; i określenie na tej podstawie obecności w komórce białek kotwiczących wiążących kalcyneurynę i wiążących PKA standardowymi sposobami.

* *

*

184 659