CN1148407A - 锚定蛋白功能的调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于分离神经钙蛋白并抑制神经钙蛋白活性的组合物和方法。所述组合物是含有与AKAP79的神经钙蛋白结合区同源的区域的肽。还提供了确定细胞中是否含有结合神经钙蛋白和结合PKA的锚定蛋白的方法。该方法有助于识别同时与神经钙蛋白和PKA结合的其它蛋白。另一方面，本发明也提供了增加T细胞的白细胞介素2表达的方法。

Description

锚定蛋白功能的调节剂
本申请是共同未决美国专利申请系列No.08/503,226(1995年7月17日申请的)的接续申请，08/503,226是08/404,731(1995年3月15日申请)的接续申请，08/404,731依次又是共同未决美国专利申请No.08/344,227(1994年11月23日)的接续申请。
本发明领域
本发明主要涉及调节神经钙蛋白的磷酸酶活性和调节由T细胞所进行的白细胞介素2的表达。更具体地说，本发明涉及用特定的肽抑制神经钙蛋白的磷酸酶活性以及通过用特定的其他肽处理细胞而提高T细胞表达白细胞介素2的能力。
本发明背景
神经钙蛋白是Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白磷酸酶，而且是许多细胞内信号途径的参与者(Guerini and Klee，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：9183-9187(1989))。已从酵母到哺乳动物的真核细胞中鉴定了所述酶。  (Cyert andThorner，J.Cell.Biol.107：841a(1989)and Klee et al.，Adv.Enzymol.，61：149-200(19840))。由于神经钙蛋白在相同细胞中可以参与许多的信号途径，那么肯定存在一些神经钙蛋白活性特异性目标确定方式。一种特异性酶活性的目标确定细胞方式是分区化。分区化将信号途径分成不同的部分，从而促进对不同刺激的细胞应答的特异性。通过酶与特异性锚定蛋白的相互作用而产生特定酶的分区化。例如，cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)通过与A激酶锚定蛋白(AKAP)的结合而锚定在特定的细胞内位点。由于已经表明AKAP可与PKA以外的蛋白质结合，所以在本文中，通常将该蛋白质家族称为锚定蛋白。(Hirsch et al.，J.Biol.Chem.267：2131-2134(1992))。cAMP通过与PKA全酶的调节亚单位(R)结合而激活PKA，然后引起活性催化亚单位(C)的释放。存在两类R亚单位：分别形成I型和II型PKA全酶的RI和RII。这些PKA异构体的亚细胞分布看起来是不同的。据报道RI异构体(RIα和RIβ)明显属于胞质的，而且被排除在核区外，而高达75％的RII异构体(RIIα或RIIβ)是颗粒状的，而且与质膜、细胞骨架组分、分泌性颗粒、高尔基体、中心体，也可能与核有联系。
已经在许多器官中鉴定了锚定蛋白。已经鉴定了至少七种与加州海兔，(一种海洋无脊椎动物)中的PKA调节亚单位结合的蛋白(Cheley et al.，J.Biol.Clhem.，269：2911-2920(1994))。这些蛋白质之一被富集在粗膜组分和紫杉酚固定的微管中，而且可以由此将微管锚定到细胞膜上并结合PKA。已经鉴定的一种哺乳动物锚定蛋白就是与微管有关的；微管相关蛋白2(MAP2)将PKA附着到细胞骨架上(Threurkauf and Vallee，J.Biol.Chem.，257：3284-3290(1982)and DeCamilli et al.，J.CellBiol.，103：189-203(1986))。在MAP2上的PKA结合位点是位于该分子氨基末端区域的31个残基的肽(Rubino etal.，Neuron，，3：631-638(1989)and Obar et al.，Neuron，3：639-645(1989))。
与微管有关的另一锚定蛋白，AKAP 150，积累在与微管紧密相关的树突中(Glantz et al.，Mol.Biol.Cell，3：1215-1228(1992))。AKAP 150位于数种神经元细胞中，而且是该锚定蛋白家族是锚定蛋白家族的成员哺乳动物脑中主要锚定蛋白质的。该家族的其他成员包括在牛脑中发现的AKAP 75和在人脑中发现的AKAP 79(Glantz et al.，J.Biol.Chem.，268：12796-12804(1993))。AKAP 75通过两个靠近AKAP 75 N末端的不连续区而与细胞骨架元件结合。AKAP 79明显存在于人前脑突触后密质(PSDs)中(Carr et al.，J.Biol.Chem.，267：16816-16823(1992))。
也已被其他锚定蛋白表征了。已经表明粒层细胞暴露于滤泡刺激激素和雌二醇可以提高80kDa AKAP的表达(Carr et al.，J.Biol.Chem.，268：20729-20732(1993))。已经从人甲状腺cDNA文库中克隆了另一AKAP，Ht31(Carret al.，J.Biol.Chem.，267；13376-13382(1992))。另一锚定蛋白AKAP95在细胞周期中改变其细胞内位置。AKAP95是分裂间期的完整核蛋白，但在有丝分裂期间，当核膜分裂时，AKAP95与胞质PKA有关。这表明在与细胞周期相关的cAMP应答事件中，AKAP95在以PKA特定异构体的活性为靶的过程中起作用(Coghlan et al.，J.Biol.Chem.，269：7658-7665(1994))。其他已知的锚定蛋白包括将PKA与高尔基体相连的85 kDa AKAP(Rois et al.，EMBO J.，11：1723-1731(1992))和将PKA与中心体结合的350 kDa AKAP(Keryer et al.，Exp.Cell Res.，204：230-240(1993))。
已知的锚定蛋白通过一种普通的机制结合PKA。尽管锚定蛋白的一级结构不是保守的，  但是都有包括一个两亲的螺旋区的二级结构基元(Scott andMcCartney，Mol.Endo.，8：5-11(1994))。模拟锚定蛋白PKA结合区螺旋结构的肽可以阻断锚定蛋白与PKA调节亚单位的结合。通过氨基酸取代破坏所述肽的螺旋结构会破坏其对PKA-锚定蛋白结合的阻断作用(Carr et al.，J.Biol.Chem.，266：14188-14192(1991))，这表明PKA结合发生在锚定蛋白的两亲螺旋区，而且由锚定蛋白分子二级结构控制。PKA通过锚定蛋白的细胞内结合和定位为分离象神经钙蛋白这类激酶提供了方法，所述激酶在可能以途径特异性方式起作用的许多信号途径中是共通的。
PKA在许多细胞内途径中起作用。例如，在海马神经元中AKAP79和PKA之间结合的抑制已表明是抑制α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异噁唑-丙酸/卡英酸谷氨酸盐受体。(Rosenmund et al.，Nature，368：853-856(1994))。这表明PKA调节这些受体。通过可逆地磷酸化糖原磷酸化酶以应答激素诱导的细胞内cAMP的增加，PKA还可调节糖原磷酸化酶的活性(Walsh et al.，J.Biol.Chem.，243：3763-3765(1969))。已表明cAMP还抑制通过MAP激酶途径传递信号(Wu et al.，Science，262：1065-1072(1993))。通过激活抑制经Ras的Raf-1活化作用的PKA，可以阻断MAP激酶途径，从而介导上述抑制作用(Vojtek et al.，Cell，74：205-214(1993)and Hafner et al.，Mol.CellBiol.，14：6696-6703(1994))。这些途径在许多细胞类型中是重要的，而且意味着许多细胞功能，例如白细胞介素2基因的转录激活在T细胞活化中是重要的(Weiss and Littman，Cell，76：263-274(1994)；Owaki et al.，EMBOJ.，12：4367-4373(1993))。
象PKA一样，神经钙蛋白与T细胞活化有关(Clipstone andCrabtree，Nature，357：695-697(1992)；O’Keefe et al.，Nature，357：692-694(1992))。在T细胞中，神经钙蛋白参与T细胞受激后IL-2表达的调节(Weiss and Littman，同上文)。已经表明活化T细胞的核因子(NFATP)是神经钙蛋白磷酸酶活性的底物。已经表明在T细胞激后，神经钙蛋白介导的NFATP去磷酸化使得NFATP从胞质易位到核，在那里NFATP与Fos和Jun相互作用诱导IL-2基因的表达(Jainetal.，Nature，365：352-355(1993))。
神经钙蛋白在T细胞激活中的作用提供了治疗上和各种药物的对象，用来治疗已证明抑制神经钙蛋白的T细胞介导的失调。已在临床中使用了两种神经钙蛋白抑制药物，环孢菌素A(环孢菌素cyclosporin)和FK506(Thomsonand Starzl.Immunol.Rev.，136：71-98(1993))。只有在与称为免疫亲和蛋白(chclophilin and FKBP 12，分别)的不同细胞内蛋白质结合后，环孢菌素和FK506  才会抑制神经钙蛋白(Schreiber and Crabtree，ImmunologyToday，13：136-142(1992))。因此，环孢菌素和FK506起前药作用。在与其相应的免疫亲和蛋白结合后，药物/免疫亲和蛋白复合物结合神经钙蛋白，由此抑制磷酸酶活性。
在器官移植后的移植排异治疗中，已经最有效地使用了神经钙蛋白抑制作用。已经在肾、肝、心、肺和骨髓移植中使用了环孢菌素和FK506。加拿大多中心移植研究组，N.Engl.J.Med.，314：1219-1225(1986)；Oyer etal.，Transplant Proc.)15：Suppl 1：2546-2552(1983)；Starzl et al.，N.Engl.J.Med.，305：266-269(1981)；多伦多肺移植组，JAMA，259：2258-2262(1988)；和Deeget al.，Blood，65：1325-1334(1985)。在移植后，这些药物的使用显著地延长了移植存活并降低了发病率(Najarian et al.，Ann.Surg.，201：142-157(1985)and Showstack et al.，N.Engl.J.Med.，321：1086-1092(1989))。
还在各种自体免疫相关的疾病中使用了环孢菌素。眼色素层炎在治疗后几周内得到改善，但在不连续使用环孢菌素后很快复发(Nussenblatt et al.，Am J.Ophthalmol.，96：275-282(1983))相似地，用环孢菌素治疗，牛皮癣通常得到改善，但在治疗后，很快复发(Ellis et al.，JAMA，256：3110-3116(1986))。当在两个月的胰岛素治疗中施用环孢菌素，在I型和II型糖尿病初期，可以诱发并延长胰岛素非依赖的“蜜月”期(Feutren et al.，Lancet，2：119-124(1986)and Bougneres et al.，N.Engl.J.Med.，318：663-670(1988))。各种肾病，包括minimal-change focal和segmental，膜性和IgA介导的肾病对环孢菌素也是敏感的，尽管观察到的蛋白尿降低可能是由于肾小球过滤速率的降低而不是基膜的愈合引起的。(Tejani et al.，Kidney Intl.，29：206(1986))。环孢菌素的施用对类风湿性关节炎还有剂量依赖作用，尽管这种施用与高发生率的肾中毒有关(F O rre et al.，Anthritis Rheum.，30：88-92(1987))。
正如上面提到的，环孢菌素与肾中毒有关(Mason，Pharmacol.Rev.，42：423-434(1989))。实际上所有用环孢菌素治疗的患者都会发生肾功能降低(Kahan，N.Engl.J.Med.，321：1725-1738(1989))。但在终止环孢菌素治疗后这种情况一般可以得到回复。不幸的是，在器官移植受体中，其他常用的免疫抑制剂代替环孢菌素会带来高移植排异风险。在肾移植患者中，这可以用透析来得到控制。在已经接受了心、肺或肝移植的患者中，移植排异可能是致命的。尽管通常比肾中毒的发生率低，但神经中毒性和肝毒害性还是与环孢菌素治疗有关(de Groen et al.，N.Engl.J.Med.，317：861-866(1987)and Kahan et al.，Transplantation，43：197-204(1987))。
在施用FK506时，毒性也变得明显。象环孢菌素一样，FK506也与肾中毒有关(Petersetal.，Drugs，4：746-794(1993))。临床表现，损伤形态和发生率均与环孢菌素的相似(McCauley，Curr.Op.Nephrol.Hyperten.，2：662-669(1993))。神经毒性也与FK506有关(Eidelman et al.，Transplant.Proc.，23：3175-3178(1991)and Fung et al.，Transplant.Proc.，23：3105-3108(1991))。与环孢菌素相反，FK506有亲肝作用而不是肝毒害作用(Peters et al.，同上文)。
从免疫抑制剂，例如环孢菌素和FK506的显著潜在毒性可以清楚地看出，本领域需要其他抑制神经钙蛋白的试剂。这些试剂最好具有比现有的试剂更低的副作用，并因此可以改进免疫抑制剂治疗。另外，还需要在T细胞中抑制PKA的试剂，以便提高所述细胞表达白细胞介素2的水平。
发明综述
本发明部分基于神经钙蛋白结合AKAP 79的发现。通过结合PKA和神经钙蛋白，AKAP 79共定位可以通过特定信号途径调节的激酶和磷酸酶。由此，本发明提供了分离神经钙蛋白以及抑制细胞中神经钙蛋白活性的的组合物和方法。所述分离方法包括将细胞组分与固定在固体底物上的AKAP 79或其神经钙蛋白结合片段接触，然后从中洗脱神经钙蛋白。神经钙蛋白抑制方法包括将细胞与AKAP79或其神经钙蛋白结合片段接触。优选地，神经钙蛋白结合的肽不与PKA结合。优选的肽含有下列氨基酸序列：
Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro(SEQ ID NO：1)
在本发明神经钙蛋白抑制方法中可选的肽包括：
Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln(SEQ IDNO：2)
和
Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys(SEQ IDNO：3)
这些肽与结合神经钙蛋白的AKAP79的氨基酸序列同源。尽管这些肽与FKBP12的神经钙蛋白结合区相似，但是与FK506/FKBP12复合物的神经钙蛋白抑制作用不同，这些肽不需要与另一分子作用就可以抑制神经钙蛋白。
可以对这些肽进行修饰，例如与脂溶性部分结合，以便于进入细胞。例如，这些肽可以与肉豆蔻酸结合。另外，可以将这些肽包装在可以与细胞膜融合并将所述肽释放到细胞中的脂质体中。
本发明的另一方面是确定细胞是否含有神经钙蛋白结合及PKA结合锚定蛋白的方法。所述方法通常包括裂解细胞以形成裂解产物；将裂解产物与固体支持物保温，所述固体支持物含有固定于其上的神经钙蛋白分子；从固体支持物上洗脱裂解产物；将所述固体支持物与标记的PKA调节亚单位接触，从固体支持物上洗掉未结合的调节亚单位；检测保留在固体支持物上的标记；由此确定在细胞中是否存在神经钙蛋白结合的和PKA结合的锚定蛋白。另外，可以将PKA调节亚单位固定在固体支持物上，神经钙蛋白可以作为标记的分子。通常，PKA调节亚单位是RII亚单位。
这些方法对于鉴定与PKA和神经钙蛋白二者都结合的其它蛋白质也是有用的。其它所述蛋白质的鉴定为治疗提供了组织特异性靶。
本发明还包括鉴定调节神经钙蛋白和神经钙蛋白锚定蛋白之间结合化合物的方法。神经钙蛋白或锚定蛋白可以与固体底物结合。用可检测标记方法标记未结合的配对物。在存在待测化合物的条件下，保温结合的配对物。通过观察与固定的结合配对物相结合的标记物的量来确定待测化合物对神经钙蛋白和神经钙蛋白锚定蛋白质之间结合的作用。存在待测化合物时结合的标记量比没有待测化合物时结合的标记量减少，说明了待测化合物是神经钙蛋白和神经钙蛋白锚定蛋白之间结合的抑制剂。其它的检测方法也可能被采用，例如闪烁近似检测法。
本发明的另一方面还包括提高T细胞白细胞介素2表达水平的方法。，T细胞中PKA激酶活性的抑制或PKA的定位提高了在调节白细胞介素2基因转录的启动子元件的控制下蛋白质的表达。这些方法通常包括将T淋巴细胞与下列氨基酸序列之一接触：
Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile(SEQ ID NO：5)或
Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala-Tyr(SEQ ID NO：9)。
SEQ ID NO：5的肽是抑制PKA激酶活性的肽。SEQ ID NO：9的肽是与HT31锚定蛋白的PKA结合区同源的肽。可以将这些肽进行修饰以便于进入细胞或如上所述包装到脂质体中。本发明设想了使用这些肽的方法的多种用途。例如，可以用所述方法刺激免疫反应，刺激用于选择性克隆扩展的活化的T细胞或提高T细胞对试验性刺激的反应以评价T细胞生物学中的早期过程和免疫反应的激活。
附图的简要说明
图1A-1B说明全序列AKAP79和AKAP79的神经钙蛋白结合片段对神经钙蛋白磷酸酶活性的抑制作用。
图2A-2C说明II型PKA和神经钙蛋白的亚细胞定位以及II型PKA和神经钙蛋白的共定位。
图3说明克隆11.1和人神经钙蛋白异构体11.1之间的同源性。
图4说明用二萜衍生物和IBMX处理Jurkat细胞诱导的细胞内cAMP浓度的增加。
图5A-5H是说明PKA抑制作用和离位作用对由白细胞介素2启动子控制的蛋白质转录的作用的FACS图。
发明的详细描述
按照Stewart和Young(Solid Phase Peptide Synthesis，2nd ed.，PierceChemical Company，(1984))或Tam等人(J.Am.Chem.Soc.，105：6442(1983))(两篇文献均引入本文作为参考)描述的常规技术，在溶液中或固体支持物上，可以合成本发明方法中所用的肽。用Eicholtz等人(J.Biol.Chem.，268：1982-1986(1993))(该文献引入本文作为参考)描述的标准技术可以将所述肽肉豆蔻酸化。按美国专利4,766,046；5,169,637；5,180,713；5,185,154；5,204,112和5,252,263和PCT专利申请92/02244(上述文献引入本文作为参考)中描述的标准技术将所述肽包被在脂质体中。
下列实施例是为了说明而不是限制本发明。实施例1描述了神经钙蛋白与AKAP79和PKA的关系。实施例2涉及用来自AKAP79氨基酸序列的肽抑制神经钙蛋白活性。实施例3说明了II型PKA和神经钙蛋白的亚细胞分布。实施例4描述了说明AKAP79和神经钙蛋白之间生理结合的双杂交试验。实施例5论述了对AKAP79和神经钙蛋白的分析。实施例6描述了用神经钙蛋白突变体定义AKAP79结合位点。实施例7涉及AKAP79和PKA RI亚单位之间的相互作用。实施例8描述了筛选PKA分区化抑制剂的方法。实施例9描述了锚定蛋白在IL-2表达调节中的作用。实施例10涉及其他AKAP79结合蛋白的鉴定。实施例11描述了AKAP79和PKC之间的相互作用。实施例12涉及锚定蛋白潜在的治疗应用。
实施例1
本实施例说明了神经钙蛋白与AKAP79和PKA的天然关系。因此，AKAP79的功能是共定位普遍存在的激酶和普遍存在的磷酸酶。这种共定位通过酶的磷酸化或去磷酸化而提供了酶在信号途径中的特异性调节。
用Harlowe和Lane(Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，Press，ColdSpring Harbor，NY(1988))描述的CaN A或CaN B特异性的亲和纯化的抗体可以从钙调蛋白琼脂糖纯化的牛脑提取物中得到神经钙蛋白(CaN)的免疫沉淀，最后使用缓冲液A(10mM HEPES pH7.9，1.5mMMgCl，10mM KCl，1mM PMSF和10μMIBMX)+0.4M NaCl的洗涤除外。在用0.1mM cAMP洗脱免疫沉淀后，按Scott等人所述的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：4379-4383(1985))测量PKA活性。力加入0.1mM32P-ATP(1.5×105cpm/nmol)引发免疫沉淀的蛋白质的磷酸化，30℃下30分钟后，加入SDS加样缓冲液来终止反应，然后进行SDS-PAGE。按Coghlan等人(J.Biol.Chem.，269：7658-7665(1994))(引入本文作为参考)描述的方法，用cAMP琼脂糖从脑提取物的30-60％(NH4)2SO4级分中纯化PKA R亚单位，用0.5mM Ht31肽(SEQ ID NO：4)洗脱蛋白质这一步外。按Coghlan等人所述方法(同上文)完成Western印迹和PKA RII涂覆(overlay)。
在钙调蛋白纯化的提取物中检测激酶活性，所述提取物在CaN免疫沉淀中被富集123±3.6倍(±标准偏差；n＝3)，其激酶活性被抑制PKA激酶活性的肽，PKI肽(SEQID NO：5)特异性地抑制，表明PKA的催化(C)亚单位是所分离的复合物的成分。AKAP 79(AKAP75)和RII的牛同源物均是C亚单位的底物，而且也存在于免疫沉淀中并在加入cAMP和32P-ATP后被磷酸化。在互补实验中，在cAMP琼脂糖上用亲和层析，从牛脑的粗提取物中分离PKA的R亚单位。用Ht31肽处理亲和柱，特异性地从cAMP结合的RII中洗脱AKAP75，同时释放CaN A和B亚单位。在Western印迹中检测的裂解产物中所有CaN的约5％与一样AKAP75和RII有关。综上所述，这些结果表明PKA和CaN均与锚定蛋白质有关。
实施例2
本实施例表明来自AKAP79的肽对神经钙蛋白磷酸酶活性的抑制作用。
为了确定AKAP79肽结合是否是抑制性的，在存在重组AKAP79的条件下检测神经钙蛋白(CaN)活性。简而言之，按Carr等人(J.Biol.Chem.，267：16816-16823(1992))所述(引入本文作为参考)在大肠杆菌中表达重组AKAP 79。按Perrino等人(J.Biol.Chem.，267：15965-15969(1992))所述(引入本文作为参考)在Sf9细胞中表达CaN和组成型活性截断突变体CaN420(一种截断的，CaN的Ca2+/钙调蛋白非依赖性的组成型活性形式(Perrino et al.，J.Biol.Chem.)，在印刷中)，然后在钙调蛋白琼脂糖上纯化。按Perrino等人所述(同上文)测量对32P RII肽底物的磷酸酶活性。在图1B中注明的浓度范围内，将CaN(30nM)和钙调蛋白(100nM)和32P RII肽(22μM)与AKAP79蛋白和AKAP79肽(SEQ ID NO：1-氨基酸81-102)一起保温。从CaN420检测中略去钙调蛋白。通过闪烁计数，在三个独立的试验中在各三份样品中测量从底物中释放的32P。通过数据的线性回归分析确定重组AKAP 79对CaN的抑制常数(Ki)。用固定在Km(42μM)的底物浓度，通过确定IC50来测定AKAP79的Ki值。
图1A表明就磷酸化的RII肽底物而言，在非竞争性方式中全序列CaN(Ca2+/钙调蛋白依赖的)(圆圈)和CaN420(方块)的AKAP79抑制的Lineweaver-Burk图。空心符号表示在没有AKAP79条件下的磷酸酶活性，实心符号表示存在AKAP79时的磷酸酶活性。对应于AKAP79肽的合成肽抑制全序列CaN(实心圆圈)和CaN420，而Ht31肽不是CaN的抑制剂(图1B)。观察到的抑制作用是神经钙蛋白特异性的：对肽浓度高达0.4mM时，AKAP79肽并不显著地影响蛋白磷酸酶1(空心菱形)或2A(叉)的活性。尽管在AKAP 79和FKBP-12上的CaN结合位点相似，但它们可能在功能上差异显著：FK506(2μM)不影响抑制效力，而重组AKAP79没有表现出对荧光性肽底物的肽基脯氨酰基异构酶活性。此外，FK506/FKBP与CaN A亚单位相互作用所需的CaN B亚单位对于AKAP79与CaN A亚单位相互作用来说，并不是必需的。而且FK506/FKBP与CaN A相互作用是钙/钙调蛋白依赖性的，而AKAP79对神经钙蛋白活性的抑制作用是钙/钙调蛋白非依赖性的。总之，这些发现表明非活性状态的CaN由AKAP79以与结合了锚定蛋白的PKA相类似的方式定位。
实施例3
本实施例说明在各种组织中II型PKA和神经钙蛋白的亚细胞分布。
通过与目标亚单位的关系来限定许多蛋白激酶和蛋白质磷酸酶的亚细胞位置。由于AKAP79在定位PKA和CaN中的双重功能，所以它是这类调节蛋白的一个新成员。
培养细胞，用福尔马林固定，按Rosenmund等人(Nature，368：853-856(1994))所述将其免疫染色。用结合FITC的抗山羊二级抗血清进行RII染色。在CaN的染色中，使用生物素化的抗兔二级抗血清和链霉抗生物素蛋白-Texas-Red(Jackson)。用带有尼康optiphot 2显微镜的Biorad MRC-600共焦点激光扫描系统(A1和A2过滤仪)得到图像，所述显微镜备有60×planappo彩色(1.6NA)浸没透镜。共焦点切片的绝对厚度在1.5-2μm之间。
在牛、猪、兔和鼠脑中观察到AKAP79同源物。这表明PKA和CaN的共定位可能是使神经元适应特异性信号传导过程的一种普遍现象。用免疫细胞化学方法，在培养的海马神经元中研究II型PKA和CaN的亚细胞分布。RII(图2A中绿标记)和CaN(图2B中的红标记)的染色图是区域分布的，而且在轴突处重叠(在图2C中，RII是红的，CaN是绿的)。这些发现与通过锚定蛋白质的II型PKA和CaN的共定位一致，而且表明在调节突触传递中对三元复合物的作用。这与试验表明的RII和AKAP79在这些细胞中的共定位相一致，而且通过研究表明AKAP79，II型PKA和CaN是突触后密质的组分。定位的三元传导复合物的潜在底物可能包括受锚定蛋白定靶的PKA调节的AMPA/kainate受体。
实施例4
本实施例说明在酵母双杂交试验中AKAP79和神经钙蛋白之间的相互作用。用AKAP79为“饵”，发现由来自鼠T细胞文库的cDNA编码的神经钙蛋白与AKAP79结合。
基本按Durfee等人(Gene and Development 7：555-567(1993))所述(该文献引入本文作为参考)完成所述试验。“靶”和“饵”是两个质粒，分别含有部分Gal-4转录因子。“饵”质粒(pAS1)是一个两微米的质粒，带有与Gal-4DNA结合亚单位(Keeganetal.，Science，231：699-704(1986)描述的氨基酸1-147，引入本文作为参考)相连的ADH启动子，其后接有血细胞凝集素(hemagglutin)(HA)片段，多克隆位点和ADH终止子。用SC-Trp培养基保持选择。“靶”构建体是leu2，2微米的质粒，含有携带Gal-4转录活化区II(Ma and Ptashne，Cell，48：847-853(1987)中所述氨基酸768-881，引入本文作为参考)的ADH启动子和终止子，其后接有多克隆位点。在构建小鼠T细胞cDNA融合文库时使用载体pACT。在筛选中使用的啤酒酵母y190的基因组中整合了两个报告基因。所述报告基因位于含有Gal-4结合位点的Gal-1启动子的控制下。如果由饵质粒和靶质粒编码的蛋白质相连，则同时带有Gal-4转录因子的亚单位连在了一起，并使其起到启始报告基因转录的作用。
从pET11d主链中分离含有AKAP79编码区的1.3kb NcoI/BamHI片段，然后与pAS1相连以作为用于筛选的“饵”。用标准的乙酸锂-PEG转化方法，将1μg该构建体转化y190 MATa和y190 MATα中。检测每种接合型(y190A pASI AKAP 791-4和y190αpAS1 AKAP 791-4)中的四个分离物与含有PKA调节亚单位(RII氨基酸1-89)的融合构建体pACT-RII相互作用的能力。于30℃在YEPD(1％Bacto-酵母提取物，2％Bacto-胨，2％右旋糖和2％Bacto琼脂)上过夜接合菌株来完成，然后在SC-Leu-Trp平皿上筛选二倍体。根据半乳糖苷酶活性来检测作为报告基因的E.coli lac Z基因。将接合的菌株复制到已经用Hybond-N(Amersham)滤纸覆盖了的SC-Leu-Trp平皿上，然后过夜生长。将滤纸在液氮中放1分钟以使酵母裂解。用在60mM Na2HPO4，40mM NaH2PO4，10mM KCl和10mM MgSO4中的约3ml 0.1％X-gal饱和3 MM纸圆片。将裂解的酵母滤纸放在圆片的顶上，使其在30℃培养约1-2小时。通过将酵母斑变成蓝色来表明β-gal活性阳性的含有pAS1AKAP 79和pACT RII的二倍体菌株融合。作为对照，与空pACT对照接合时，饵AKAP 79质粒仍为白色。
使y190AAKAP 79(分离物1和2)和y190a AKAP 79(分离物1和2)在每50mlSC-Trp培养基中生长到密度为2×107个细胞/ml来检测Gal-4AKAP 79融合蛋白。以3000×g将细胞离心10分钟，然后在25 mM Tris pH8，5mMEDTA，5mM EGTA，2mM邻二氮杂菲，1mM DTT，25μM 4-(2-氨乙基)-苯磺酰基氟化物-HCl，分子量239.5(AEBSF)，1mM benzanidine，1μg/mlPLACC(胃蛋白酶抑制素，亮肽素，抑肽酶，钙蛋白酶I和II)，20μg/ml抑氨肽酶B素裂解缓冲液中用200μl玻璃珠(大小为425-600微米)裂解。再将细胞旋转1分钟，然后在冰上1分钟，共进行24分钟(12个循环)。确定蛋白质浓度，将总蛋白质中的30μg上样到10％SDS-PAGE凝胶上。将凝胶湿转移至Immobilon-P(Millipore)上，通过使用抗HA单克隆抗体12CA5(Bab Co.，Berkeley，CA)和山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶结合的二级抗血清(Biorad，Hercules，CA)的标准方法检测。约100 kDa的Gal-4AKAP 79融合蛋白是很容易检测到的，这表明在这些菌株中存在大小适当的产物。
选择y190A pAS1 AKAP 79分离物以筛选pACT鼠T细胞cDNA文库。收集500ml SC-Trp培养物(OD600＝0.6-0.8)，用100ml蒸馏水洗涤，然后再沉淀。取出沉淀放在50ml LiSORB(100mM乙酸锂，10 mM Tris pH8，1mM EDTA pH8和1M Sorbitol)中，转移到1升烧瓶中，在30℃以220 RPM振荡培养30分钟。然后沉淀细胞，用625μILiSORB再悬浮，接着放在冰上同时制备DNA。
将400μl 10mg/ml鲑精DNA煮沸10分钟，然后加入500μl LiSORB并使其缓慢冷却到室温。将来自Mu T细胞文库的DNA以1mg/ml加入(40-50μg)。将冰冷的酵母培养物分配到10个含120μl制得的DNA的Eppendorf试管中。在30℃，以220RPM温育试管。30分钟后，900μl在100mM乙酸锂，10mM Tris pH8和1mMEDTA pH8中的40％PEG3350与各培养物混合，然后再培养30分钟。集中样品，取小样(5μl)来检测转化效率并涂布在SC-Leu-Trp平皿上。将剩余的细胞加到100ml SC-Leu-Trp-His培养基中，然后在30℃生长，同时以220 RPM振荡。将收集的细胞再悬浮在5.5mlSC-Leu-Trp-His+50 mM 3AT(3-氨基三唑)培养基中，将300μl的小样涂布在150mm SC-Leu-Trp-His+50mM 3AT上，在30℃使其生长1星期。
约4天后，计数滴定平皿并筛选了1.1×105个菌落。在文库平皿上完成大规模的β-gal试验并从单菌落中分离了10个阳性克隆。这些菌落中的一个实际上生长得比其余的大，并将其命名为克隆11.1.从这些菌株制备总酵母DNA并分离leu2质粒DNA。用“获救”的质粒再转化起始y190ApAS1 AKAP79饵菌株和y190a。在y190ApAS1 AKAP 79中，只有克隆11.1仍为β-半乳糖苷酶活性阳性。作为负对照的含pACT克隆11.1的y190a仍为白色。
用核酸内切酶XhoI进行限制消化，释放出一个2.3kb的插入片段，以向前和相反的反向将所述质粒测序。在ABI373A自动测序仪(AppliedBiosystems，Inc.)上分析使用在双链模板上的对称聚合酶链反应(PCR)的染料脱氧终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Inc.Foster City，CA)之反应。来自克隆11.1的序列有一487个氨基酸长(SEQ ID NO：6)的开放阅读框架，它正好与pACT的Gal-4活化区融合。检索NIH序列数据库，  发现该序列与人钙调蛋白依赖的蛋白质磷酸酶(神经钙蛋白)非常同源。克隆11.1和人A1异构体之间的计算机分析表明：在核酸水平有80％的一致性，在氨基酸水平有93％的一致性(图3)。在小鼠11.1序列中没有人序列中的前10个氨基酸和18个氨基酸的插入片段。克隆11.1与小鼠神经钙蛋白Aβ序列很相近，但在C末端明显不同。同样，人神经钙蛋白A1和人神经钙蛋白A2异构体非常同源，但在其3’末端却彼此不同。
通过将含神经钙蛋白pACT的菌株与不相关的饵菌株接合来说明AKAP79与神经钙蛋白之间相互作用的特异性。用含有与RII(1-89)，酪蛋白激酶1，磷酸二酯酶32(HDUN1)和AKAPHt31融合的pAS1的菌株，按上述方法完成交换。在所有这些二倍体菌株中，β-半乳糖苷酶活性均为阴性。
实施例5
为了进一步评价AKAP 79与克隆11.1相互作用的性质，构建一系列神经钙蛋白11.1缺失突变体并在双杂种系统中检测各质粒。
用相同的5’寡核苷酸(MH47)和四个3’寡核苷酸(MH48，MH49，MH50和MH51)完成PCR反应以扩增神经钙蛋白11.1中分别编码氨基酸1-104，1-204，1-312和1-400的区域。用BglII消化这些片段，然后将其克隆到pACT中。用酶切图谱确定方向，用自动测序确定PCR错误。确定正确编码所需缺失突变体的质粒被转化到y190MATa和y190MATα中。将酵母菌株与y190apAS1和y190apAS1 AKAP 79以及编码SEQ ID NO：6中氨基酸1-487的起始克隆pACT11.1一起接合。所得的接合平皿按上述过滤检测，观察到只有编码氨基酸1-400或氨基酸1-487的融合蛋白质才能启始所述报告基因的转录。含有氨基酸1-312的融合蛋白质不能启始转录的观察结果表明AKAP 79的接合需要氨基酸313-400之间的残基。该区域已被证明含有FKBP/FK506结合区以及神经钙蛋白B结合区[Husi，et al.，J.Biol.Chem.，269：14199-14204(1994)]。
为了更精确地限定AKAP 79结合所需的氨基酸序列，构建并检测用于AKAP 79结合的其他缺失突变体。用编码神经钙蛋白11.1区332-441，332-487和442-487的pACT产生表达构建体。象以前一样，在转化到pAS1 AKAP 79酵母菌株之前，将各构建体测序并确定其是否表达正确的突变体。
但转化后，未检测到报告基因表达，这表明突变体不能与AKAP 79相互作用。没有AKAP 79结合的一种可能的解释是这些截断的克隆丢失了结合所必需的二级结构，或某些氨基末端序列可能是结合所必需的。
以前的观察已经表明免疫亲和蛋白复合物FKBP/FK506与神经钙蛋白A的相互作用需要神经钙蛋白B[Haddy，et al.，FEBS 314：37-40(1992)]。为了确定在酵母菌株y190中内生表达的神经钙蛋白B是否参与观察到的AKAP79/神经钙蛋白A结合，用称为y153b(Mat a gal14 gal80 his3 trp1-901 ade2-101ura3-52 leu2-3-112+URA∷GAL--＞lacZ，LYS2∷GAL--＞HIS3cnb1Δ1∷ADE2)的神经钙蛋白B-菌株来消除神经钙蛋白B参与神经钙蛋白A/AKAP 79结合的可能性。先用pAS1和pAS1 AKAP 79转化y153，然后检测在没有牺牲质粒(prey plasmid)情况下的β-gal活性。未检测到报告基因的表达，这表明用克隆11.1转化后，报告基因的表达是AKAP 79/11.1结合的必然结果。再通过标准方法，将质粒pACT神经钙蛋白11.1和pACT神经钙蛋白1-400分别导入到y153b1 pAS1 AKAP 79中。在用各质粒转化的菌株中观察到的β-gal活性表明AKAP 79和神经钙蛋白A之间的相互作用不需要神经钙蛋白B。这样的结果进一步说明免疫亲和蛋白复合物FKBP/FK506和神经钙蛋白A的结合与AKAP 79的结合截然不同。
实施例6
为了更精确地限定在神经钙蛋白11.1上的AKAP 79结合区，构建另一系列编码缺失突变体(与上述的不同)或点突变的质粒。
A.末端缺失
本实施例说明AKAP 79与神经钙蛋白11.1之间的相互作用需要神经钙蛋白的残基30-336。简而言之，设计在PCR反应中所用的对各神经钙蛋白11.1区的引物以产生如表1中所示的特定N末端和C末端缺失。在100μl反应体积中，通过将各1μg的3’和5’引物与各200μg dNTPs和1ng质粒模板和PCR缓冲液#2(含20mM Tris-HCl，pH 8.75，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，和100μg/mlBSA)(Stra片段ene)，和2.5单位Pyrococus Furiosus(Pfu)DNA聚合酶(Stra片段ene)混合以产生PCR产物。在95℃一分钟，在50℃2分钟，在72℃4分钟完成30个循环。纯化扩增产物并将其克隆在pACT的BglII位点。分析所得构建体的PCR错误，如前述经测序确定方向。
将各构建体逐个转化到y190α，y190a pASI AKAP 79和y153b pASIAKAP79酵母菌株中，分别在实施例4A中进行了描述，并按前述完成β-半乳糖苷酶过滤检测。用编码C末端缺失的第一组载体的结果确定了AKAP79结合所需的氨基酸312-400之间的区域。来自y153bpASI AKAP79转化体的阳性过滤检测还证实AKAP 79结合不需要神经钙蛋白B。
以前的研究还表明神经钙蛋白B的结合需要氨基酸348，349，355和356[Watanabe et al.，J.Biol.Chem.270：456-460(1995)]，神经钙蛋白自主抑制区包括氨基酸442-487，FKBP/FK506结合需要氨基酸350，353和359[Kawamura and Su，J.Biol.Chem.270：15463-15466(1995)]。其他编码另外的C末端缺失的神经钙蛋白11.1构建体表明神经钙蛋白11.1/AKAP79结合需要氨基酸1-336。这些缺失表明神经钙蛋白结合区[所述区在哪儿？]，自主抑制区和神经钙蛋白B结合区对于AKAP79和神经钙蛋白A形成复合物不是必需的。
在表1中列出了所有缺失的结合结果。氨基缺失表明AKAP79结合所需的至少一个区位于残基30-99之间。象以前一样，表达N末端缺失的y153bpASI AKAP79转化体不需要神经钙蛋白B结合。
表1
与神经钙蛋白缺失突变体结合的AKAP79/免疫亲和蛋白
神经钙蛋白缺失(由用于构建体表达质粒的引物来命名)   氨基酸序列   AKAP 79结合 免疫亲和蛋白结合
  MH52-MH58     1-487     +     N.D.
  MH52-MH48     1-400     +     N.D.
  MH52-MH49     1-312     -     N.D.
  MH52-MH50     1-204     -     N.D.
  MH52-MH51     1-104     -     N.D.
  MH66-MH58     332-487     -     N.D.
  MH59-MH58     441-487     -     N.D.
  MH66-MH57     332-441     -     N.D.
  MH52-MH75     1-375     +     +
  MH52-MH74     1-354     +     -
  MH76-MH75     30-375     +     +
  MH77-MH75     98-375     -     -
  MH52-MH93     1-347     +     N.D.
  MH52-MH94     1-340     +     N.D.
  MH52-MH95     1-330     -     N.D.
  MH52-MH96     1-320     -     N.D.
  MH52-MH107     1-338     +     N.D.
  MH52-MH108     1-336     +     N.D.
  MH52-MH109     1-334     -     N.D.
  MH52-MH110     1-332     -     N.D.
  MH52-MH111     1-335     -     N.D.
用于构建表达质粒的引物：
MH48  (SEQ ID NO： 10) 5’-GTATTAGCAGGAGATCTTCCTACTTC-3’
MH49  (SEQ ID NO： 11) 5’-GTGTGTGTAGATCTGGTGAAAGTCC-3’
MH50  (SEQ ID NO： 12) 5’-ATTGTAGAGATCTAAGTAATTAGGTGCCG-3’
MH51  (SEQ ID NO： 13) 5’-GCCAATTGCTCAGATCTTGTTTCTTATG-3’
MH52  (SEQ 1D NO： 14) 5’-GGAATTCGGATCCTCGAGAGATCTCGCCG-3’
MH57  (SEQ ID NO： 15) 5’-CCACTTTGAGATCTCTACCGTCCTCCAGCC-3’
MH58  (SEQ ID NO： 16) 5’-CCCTGAGATCTTCAGCTGCTAAGAC-3’
MH59  (SEQ ID NO： 17) 5’-GGCTGAGATCTGGCAGACCTTGCAAAGTGG-3’
MH66  (SEQ ID NO： 18) 5’-GTGATGAAGATCTTACAGTTTAATTGCTCTCC-3’
MH74  (SEQ ID NO： 19) 5’-TTCTCCAGATCTTGGTAAGGACCATG-3’
MH75  (SEQ ID NO： 20) 5’-CACCTTCTGTAGATCTTTCATCATCAGAAC-3’
MH76  (SEQ ID NO： 21) 5’-CATCGGCAGATCTCTGAAGAAGTG-3’
MH77  (SEQ ID NO： 22) 5’-CCATGGCCAATTTTAGATCTCGATGAAAC-3’
MH93  (SEQ ID NO： 23) 5’-GGACCATGAGATCTAATCCATAAAATTGGG-3’
MH94  (SEQ ID NO： 24) 5’-AAATGGGAGATCTAATAAGGATGTGGAGAGC-3’
MH95  (SEQ ID NO： 25) 5’-GGAGAGCAATTAAAGATCTAAATGTTCATCAC-3’
MH96  (SEQ ID NO： 26) 5’-TTTTCATAGATCTATACAAGCAGCTTT-3’
MH107 (SEQ ID NO： 27) 5’-CAACCAGATCTAATGTGGAGAGCAATTAAACTGTCG-3 ’
MH108 (SEQ ID NO： 28) 5’-CCAATAGAGATCTAAGAGCAATTAAACTGTCG-3’
MH109 (SEQ ID NO： 29) 5’-TGTGAGATCTAATTAAACTGTCGAATGTTCATCAC-3’
MH110 (SEQ ID NO： 30) 5’-GGAGAGCAGATCTACTGTCGAATGTTCATCAC-3’
MH111 (SEQ ID NO： 31) 5’-AAGGATAGATCTAGCAATTAAACTGTCGAATGTTCATCAC
B·点突变
为了更精确地评估哪个氨基酸参与AKAP79结合，用PCR为基础的策略产生神经钙蛋白11.1点突变。产生三个丙氨酸突变，Cys335→Ala，Ser336→Ala和Pro339→Ala，并根据在双杂交系统中调节AKAP 79结合的情况来进检测。这些突变体中没有一个能够防止AKAP79与神经钙蛋白结合，这表明仅仅对这些残基进行修饰不足以破坏AKAP79结合。
实施例7
完成用pACT Mu T细胞文库DNA和pASI AKAP79饵菌株进行的另一筛选以便用上述方法鉴定其它AKAP 79结合蛋白。来自约211000个克隆的筛选结果是得到了一个称为pACT2-1的阳性克隆，在获救(rescue)和再转化后仍为阳性。用XhoI消化从质粒中去除文库序列，表明是一个1200bp的插入片段。测序和随后的数据库检索表明该克隆与大鼠1α型蛋白激酶A(RI)的调节亚单位有91％的一致性。
用相同的AKAP 79饵再筛选所述文库，从约520000个转化体中得到15个阳性克隆。在这15个中，发现其中的11个与大鼠PKA调节亚单位I型同源。将这些分离物中分别与RI的5’非翻译区融合，通过启始甲硫氨酸时保持开放。在酶切分析和测序数据的基础上，分离了9个单个的克隆，包括起始pACT2-1分离物。
这些结果首次说明了锚定蛋白同时与PKA的RII和RI调节亚单位结合，意想不到的是，两个亚单位之间的一级结构不同。
为了进一步确定RI和AKAP79之间相互作用的序列，并确定这种相互作用对于AKAP79是否是特有的，开发了新的酵母菌株。利用在RI前400bp内的BgIII位点，从pACT72中分离了编码氨基酸1-80的片段，并将其与pAS1和pACT相连。通过酶切分析确定方向。用标准的酵母转化方法，将质粒DNA导入到y190MATa中，然后检测被转化酵母的β-gal活性。确定截断的RI融合产物不能启动报告基因的表达。然后用转化的酵母菌株进行一系列的试验以确定截断的RI是否与AKAP79发生相互作用。
在双倍转化酵母菌株中观察到报告基因的表达，这表明RI/AKAP79结合受RI前80个氨基酸的影响。
最后，确定与RI和RII亚单位的结合是否是AKAP79特有的，用上述含氨基酸1-80并由质粒pASI(1-80)编码的截断的RI肽通过双杂交筛选检测人甲状腺AKAP[Carr.et al.，J.Biol.Chem.267：13376-13382(1992)]，pACT Ht31的基因产物。观察到的Ht31/RI结合与以前Ht31结合RII的观察结果表明锚定蛋白与RI和RII的结合并不是AKAP79特有的。
实施例8
根据AKAP79与PKA的RI和RII均会结合这一事实，研制了闪烁近似(proximity)筛选技术以鉴定通过干扰AKAP79与PKA的结合而破坏PKA定位的特异性抑制剂。
首先构建硫氧还蛋白(TRX)-AKAP79融合蛋白表达质粒。主要参见LaVallie等人，BIO/TECHOLOGY 11：187-193(1993)。简而言之，将Xbal/HindIII硫氧还蛋白片段亚克隆到含有一个lacZ基因和一个tacZ启动子的pUC19中。所得的质粒称为TRX F/S pUC19。为了将AKAP79编码序列插入到TRXF/SpUC19中，用含有末端SpeI和HindIII序列的寡核苷酸(SEQID NO：32)产生一个NcoI位点。SpeI/HindIII消化后，将所述寡核苷酸插入到所述载体中并将编码AKAP79的NcoI/XhoI片段在框架中与硫氧还蛋白基因相连。在大肠杆菌中表达所述融合蛋白，并将其固定在96孔平皿(Wallac Turbu，Finland)中，所述平皿含有植入固体支持物中的闪烁器。为了固定小鼠TRX免疫特异性单克隆抗体，用兔抗小鼠抗体预涂覆所述平皿。然后经抗TRX抗体将TRX-AKAP79融合蛋白俘获在所述平皿上，存在或不存在参考抑制剂(reference inhibitor)如未结合的RII的情况下将3H-RII加到所述平皿中。当3H-RII与AKAP79结合时，标记被带到充分接近植入支持物中的闪烁器处，用MicroBeta闪烁计数器检测辐射。
来自该试验的结果表明上述未标记的RII和Ht31肽能够分别以1mM和50 nM的IC50抑制AKAP79/RII结合。这些结果与报告的其他锚定蛋白的值相似[Carr，et al.，J.Biol.Chem.267：13376-13382(1992)]。上述脯氨酸取代的Ht31肽并未阻断AKAP79/RII结合。由于这些结果与在以前Western印迹和涂覆试验中观察到的一致，因此，认为这项技术可以迅速筛选AKAP79/RII结合的潜在抑制剂，以及AKAP79与其他已知生理配对物，如神经钙蛋白和蛋白激酶C结合的抑制剂。
实施例9
本实施例说明在T细胞中PKA与锚定蛋白的结合调节PKA对NFAT活化的活性，由此调节白介素2的产生。
IL-2基因的表达与T细胞活化紧密相连。用PMA和伊屋诺霉素激活后，研究IL-2的转录。已知这两种试剂分别促进蛋白激酶C和钙第二信使反应(包括CaN的活化)。蛋白激酶C激活参与NFAT核成分诱导的Ras-Raf-1-Mek-MAP激酶途径。增加的钙浓度激活了神经钙蛋白，然后神经钙蛋白又激活了NFAT的胞质成分并转移到核中。NFAT成分的活化包括IL-2基因表达。为了定量转录，用一载体稳定转染JurkatT细胞系(NFATZ)，所述载体含3个串联拷贝的NFAT结合位点，和编码β-半乳糖苷酶(β-gal)的lacZ基因融合的哺乳动物IL-2启动子。通过β-gal的荧光激活细胞分类器(FACS)分析来确定IL-2转录的量。
一般情况下，在37℃ 1ml培养基中的1×106NFATZ细胞与不同浓度的环孢菌素，包括AKAP75(SEQ ID NO：8；Glantz等人，J.Biol.Chem.，268：12796-12804(1993)，该文献引入本文作为参考)的氨基酸81-108的肉豆蔻酸化(myristilated)肽，PKI(PKA抑制剂肽)(GRRNAIHDI-SEQ ID NO：5)和Ht31肽(SEQ ID NO：9，Carretal.，J.Biol.Chem.，267：13376-13382(1992)中描述的全序列Ht31蛋白质的氨基酸493-515，它阻断锚定蛋白与PKARII亚单位的相互作用，该文献引入本文作为参考)一起预保温60分钟。按Eichholtz等人(J.Biol.Chem.，268：1982-1986(1993))所述将所述各肽肉豆蔻酸化。
在用环孢菌素，PKI(SEQ ID NO：5)和Ht31肽(SEQ ID NO：9)的试验中，与环孢菌素或相应的肽一起保温后，再与二萜衍生物(25μM)异丁基-甲基-黄嘌呤(IBMX；0.1mM)一起保温30分钟。与二萜衍生物/IBMX一起保温增加了细胞内的cAMAP浓度(图4)，由此激活了PKA。最后加入佛波醇12-肉豆蔻酸酯13乙酸酯(PMA)(10ng/ml)和伊屋诺霉素(2μM)并继续培养4小时。对照只与PMA/伊屋诺霉素或二萜衍生物/IBMX和PMA/伊屋诺霉素在上述条件下培养。在进行PMA/伊屋诺霉素培养的后20分钟，加入氯喹(300μM)以抑制内生溶酶体β-gal活性。将细胞离心并再悬于50μl培养基中，向其中加入50μl荧光素二β-D-吡喃半乳糖苷(FDG)(0.1mM的终浓度；分子探针)。使渗压休克过程持续75秒，然后通过加入1ml冷FACS缓冲液(包括氯喹)而使细胞返回等渗条件。通过用于荧光素分析的流式细胞计数测量lacZ β-gal活性。
图5A-5H说明了本试验的结果。图5A和5B是加入了或未加染料的试验的背景荧光的FACS图。图5C表示用PMA/伊屋诺霉素处理NFATZ Jurkat细胞使β-gal活性增加了6-7倍。正如预期到CaN在IL-2转录中的重要信号作用一样，环孢菌素(CsA)完全破坏了这种活性(图5D)。  当在培养基中使用10μM的肉豆蔻酸化AKAP 75肽(SEQ ID NO：8)时，发现PMA/伊屋诺霉素诱导的β-gal活性降低了40-50％。
图5E表明二萜衍生物和IBMX使PMA/伊屋诺霉素诱导的β-gal活性降低了约50％。用100μM肉豆蔻酸化的PKI肽(SEQ ID NO：5)和100μM肉豆蔻酸化的Ht31肽(SEQ D NO：9)可以完全恢复这种抑制(图5F和5G)。图5H表示带有脯氨酸取代的肉豆蔻酸化的Ht31肽并不影响二萜衍生物/IBMX阻断，已知所述取代使所述肽在阻断PKA锚定时失活。这些结果表明了PKA的重要性以及它通过在调节IL-2基因表达中的锚定蛋白而定位。如上所述，可以用干扰PKA活性或定位来增强免疫反应，激活用于选择性克隆扩展的T细胞或研究T细胞激活的早期过程。
实施例10
鉴定编码另一蛋白质相同区域的两个单独的分离物pACT 59和pACT74。这些克隆的序列分别列在SEQ ID NO：33和34中。胚细胞检索结果表明与三个未知功能的基因产物有显著的氨基酸同源性：C.elegans(319个氨基酸的蛋白质，在数据库目录中称为No.U00032)，人胎儿脑表达的序列片段(97个氨基酸的蛋白质，称为T08697)，和HL60表达的序列片段(90个氨基酸的蛋白质，称为D20731)。还在称为PAD1+的S.pombe基因产物(308个氨基酸的蛋白质，产物D31731)之间发现了同源性，已知所述基因产物是PAP1+的正调节因子，AP-1样转录因子。
另外，用这种筛选方法还鉴定了另两个阳性克隆；pACT36，编码与Ga14正确融合的143个氨基酸的开放阅读框架，和pACT 60，编码因一明显缺失而产生的稍微短一点的区域。分别在SEQ ID NO：35和36中列出了这些克隆的序列。这两个分离物彼此是独特的，而且与在NIH中的任何已知序列均没有一致性。
实施例11
以前的工作表明AKAP79是一个多功能的锚定蛋白，能够与至少两个信号酶发生关联；PKA和Ca2+/钙调蛋白依赖性磷酸酶神经钙蛋白(CaN)。各信号酶与锚定蛋白的不同区结合，锚定后所述酶受到抑制。另外，已经表明Ca2+/磷脂依赖性蛋白激酶C(PKC)在不同于PKA和CaN的区域也与AKAP79结合。象PKA和CaN一样，PKC的活性通过它与锚定蛋白结合而受到抑制。在锚定蛋白的前75个残基内含有PKC结合位点，肽研究表明含有AKAP79残基31-52的片段抑制PKC活性。此外，有证据表明钙调蛋白(CaM)与锚定蛋白结合可以释放PKC活性，这说明AKAP79序列的竞争。为了更全面地表征PKC结合位点，从牛脑中分离PKC/AKAP复合物并确定CaM是否是PKC/AKAP79相互作用的生理调节因子。
用兔脑PKC作为探针，首先在牛脑裂解产物上完成PKC涂覆。用识别PKCα和β异构体的单克隆抗体(M7)检测PKC结合。在50-300kDa内检测到数个PKC结合蛋白，包括与明显的75kDa RII结合蛋白有相似迁移率的蛋白质。对照试验表明PKC结合是特异性的，而且只有存在1.2mM CaCl2和20μg/ml磷脂酰丝氨酸并将PKC加到反应混合物中时，才能检测到。
为了确定鉴定的75kDa蛋白质是否可能是AKAP79的牛同源物，用PKC涂覆试验探测AKAP79和有关的片段。简而言之，用SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质，然后按标准方法印迹到硝酸纤维素膜上。在Blotto[1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，5％在Tris缓冲盐(TBS)中的干奶]中阻断样品，然后在室温检测缓冲液[含1mg/mlBSA，1.2mM钙，1mMEGTA，20μg/ml磷脂酰丝氨酸(PS)，2μg/ml亮肽素，2μg/ml胃酶抑素，和3μg/ml部分纯化的兔脑PKC的TBS]中保温1小时。按标准化学发光检测法，用识别PKCα和β的单克隆抗体M7检测结合的PKC。
PKC与全序列重组AKAP79蛋白质结合，含所述蛋白质前75个残基的重组片段结合PKC，但覆盖CaN和RII结合区的C末端不结合。对照试验表明，32P-放射性标记的RII与全序列AKAP79和C末端都结合。这些结果说明AKAP 79是PKC结合蛋白，而且主要的结合位点在所述蛋白质的前75个氨基酸内。
以前对PKC结合蛋白的研究已经说明来自PKC结合位点的碱性和疏水区参与了与所述酶的磷酸脂键的形成。AKAP 79的前75个残基在位置31-52之间含有碱性和疏水区，而一些迹象表明该区域是与PKC接触的主要位点。正如用涂覆试验评估的，残基31-52的合成肽阻断PKC/AKAP 79相互作用。
为了检测这些肽调节PKC活性的能力，在存在和不存在AKAP 79肽片段的条件下，完成下列试验。将PKC[50nM，裂解在50mM Tris-HCl(pH7.4)，5mMMgCl2，1.2mM CaCl2，1mM DTT，1mM EGTA和100μg/mlPS中]与EGF受体肽底物(5μM)在30℃保温5分钟。通过加入100μM32P-ATP(500cpm/pmol)而启动磷酸化反应，使反应在30℃进行10分钟。取反应样品，点到P81滤纸上，用过量75mM磷酸洗涤滤纸而终止反应(洗3次，每次3分钟)。最后用乙醇洗涤，干燥P81滤纸，用液体闪烁计数器测量放射性。
含有残基31-52的肽和AKAP 79前75个氨基酸的重组片段分别是IC50为2μM和25nM的PKC活性的有效抑制剂。更详细的动力学分析表明用表皮生长因子(EGF)受体肽为底物，AKAP79 31-52肽表现出混合的PKC活性抑制作用，Ki为1.411±0.28μM。另外，该区还类似CaM结合区，将重组1-75片段或31-52肽在存在过量Ca2+的条件下，与防止PKC抑制的CaM(15μM)一起保温。由于AKAP 79是CaM结合蛋白，所以这些发现表明Ca2+/CaM可以调节PKC与锚定蛋白的结合。
综上所述，这些结果表明PKC在体外与AKAP79结合，PKC结合位点在AKAP79的前75个残基内，而且含残基31-52的肽抑制PKC活性。结果还表明象与过量Ca2+/CaM保温可以防止31-52肽产生的PKC抑制作用一样，由CaM可以调节PKC/AKAP 79间的作用(图3)。为了更全面地了解AKAP 79/PKC作用的本质，设计实验以1)鉴定对于PKC与AKAP 79结合起重要作用的残基，2)从细胞中分离PKC/AKAP 79复合物和3)确定CaM是否可调节PKC/AKAP 79间的作用。
数种PKC结合蛋白的序列分析表明与PKC结合可能需要高的正表面电荷。这种假设与以前的结果一致，其中含有碱性和疏水残基簇的AKAP79氨基酸31-52的肽片段抑制PKC活性(Ki为1.4±0.28μM)，而该区域的重组片段甚至是更强的所述激酶抑制剂(IC50＝25±5nM)。为了评价位于AKAP 79残基31-52的碱性侧链作为PKC抑制决定簇的作用，在含氨基酸-75的重组AKAP 79多肽中产生一系列的AKAP 79突变体，用涂覆方法和对PKC β I抑制能力的变化来检测各突变体的PKC结合特性。
构建了5个AKAP 79突变体，其中用丙氨酸取代碱性残基簇。假设有高密度的正电荷，在记录到PKC结合亲和性的显著变化前就可能需要同时取代数个碱性侧链。因此，多个碱性残基被取代。利用Hausken等人[J.Biol.Chem.269：24245-24251(1994)]描述的方法，通过丙氨酸扫描诱变产生AKAP 79序列中的点突变。将各AKAP79蛋白表达为His-片段融合蛋白，并用镍亲和层析纯化至均一。下文列出了所述丙氨酸突变肽。SEQ ID NO：37是天然的AKAP 79序列。
AKAP 79(37-50)    FXRRKKAAKALAPK  (SEQ D  NO：37)
AKAP 79 AA38，39  FAARKKAAKALAPK  (SEQ D  NO：38)
AKAP 79 AAA40-42  FKRAAAAAKALAPK  (SEQ D  NO：39)
AKAP 79 4A38-42   FAAAAAAAKALAPK  (SEQ ID NO：40)
AKAP 79 AA45，50  FKRRKKAAAALAPA  (SEQ ID NO：41)
AKAP 79 A37-50    FAAAAAAAAALAPA  (SEQ ID NO：42)
在棒状病毒中表达PKC β I，通过下列方法，用单克隆抗体M4和M7检测PKCα和β异构体。
此外，用上述方法检测各AKAP 79片段突变体抑制PKC的能力。
由于最初的数据表明PKC和AKAP 79体外结合，那么如果在体内发生相同或相似的结合，就有可能从细胞中分离AKAP 79/PKC复合物。为了从牛脑中分离PK/AKAP 79二元复合物或PKC/AKAP 79/CaN三元复合物，使用两种独立的生物化学方法，以前用这些方法成功地分离了体内AKAP 79/CaN复合物。所述技术简述如下。
开始的研究涉及用抗AKAP 79的单克隆抗体MC16免疫沉淀来自牛脑的AKAP79同源物，AKAP 75。用可识别主要的脑PKC异构体α，βI，βIII和γ的免多克隆抗血清，通过Western印迹检测在免疫沉淀物中共纯化的PKC。另外，用识别脑PKCα和β异构体的单克隆抗体M7从牛脑提取物中免疫沉淀PKC，然后用RII涂覆或Western印迹检测共纯化的AKAP75。最后，用识别牛CaN A亚单位的单克隆抗体C24探测用抗PKC抗体免疫沉淀的相同样品中的CaN。这些试验可以确定是否形成了三元AKAP79/PKC和CaN复合物。
另外，完成亲和纯化以便从牛脑中分离RII，AKAP79和PKC的三元复合物。在cAMP琼脂糖上通过亲和层析纯化PKA的R亚单位，分别用M7和MC16单克隆抗体，通过Western印迹筛选洗脱物中存在的PKC和AKAP。由于重组AKAP 79和PKC并不结合cAMP琼脂糖，所以检测在cAMP洗脱物中的蛋白质可以确定是否形成了激酶和锚定蛋白复合物。用过量的锚定抑制肽，通过从cAMP琼脂糖中洗脱PKC和AKA79来确定三元复合物。已表明所述肽从固定在cAMP琼脂糖上的RII中置换AKAP/CaN复合物。
实施例12
已表明AKAP 79结合神经钙蛋白，这是与神经钙蛋白是两种有效且有临床意义的免疫抑制剂，环孢菌素和FK505的靶有关的，所述环孢菌素和FK506均能抑制神经钙蛋白的活性。如上所述，环孢菌素和FK506在各种疾病的治疗中均是有用的，但是有明显的副作用。设想调节锚定蛋白/神经钙蛋白结合的因子可以最终以与环孢菌素或FK506活性相似的方式调节神经钙蛋白活性。所述的调节剂的鉴别，特别是与其他免疫抑制剂相比有较小副作用的那些，就可能在治疗目前用环孢菌素或FK506治疗的许多疾病中有广泛的治疗用途。
已经报告了许多环孢菌素和FK506的临床指征。例如，环孢菌素已被确定为移植后的标准免疫抑制剂，甚至尽管通常认为FK506是一种更强的免疫抑制剂，但仍使肝、肺、肠和胰腺移植成为可能。对于不耐受或不能用环孢菌素或FK506的移植患者有时可成功地换其他药物。
作为另一实例，炎性肠病(IBD)是有两种不同临床表现的疾病，节段性回肠炎和溃疡性结肠炎(UC)的通用术语。已经用环孢菌素成功地治疗节段性回肠炎，在至少一种疾病活性指数上已经有统计意义的显著治疗效果[Brynskov，Dan.Med.Bull.41：332-344(1994)]。然而，与急性恶化情况的解决最相关的其他指数并没有明显改善的迹象。环孢菌素还在严重的急性抗类固醇UC中有活性(由于伦理上的原因而终止了试验，所以数据不显著)。患硬化胆管炎和UC的患者的试验表明对UC缓和期来说界限显著。在中止并因毒性而限制治疗后常常复发[Choi and Targan，Dig.Dis.and Sci.39：1885-1892(1994)]。另外，在IBD中还成功地使用了其他免疫抑制剂，如氨甲蝶呤，硫唑嘌呤和6-MP。
作为另一实例，在一些试验中，当用环孢菌素作为疾病的第二或第三线治疗方法时，即用其他成熟的治疗方法不成功并且有严重的疾病的患者，环孢菌素在治疗类风湿性关节炎中是有效的。在这些试验中，发现环孢菌素与第二线药物，如金、抗疟药，硫唑嘌呤，D-青霉胺1和氨甲蝶呤有一样效果和毒性[Wells and Tugwell，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)：51-56(1993)；Forre etal.，Arth.Rheum.，30：88-92(1987)]由于环孢菌素的“潜在不可逆毒性”，这些试验仅报告了治疗“很严重的，难治的活性RA”[Dougados and Torley，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)：57-59(1993)]。认为肾毒性主要是通过肾血管收缩介导的，所述肾血管收缩会加重NSAID肾毒性和类风湿关节炎本身的肾病[Leaker and Cairns，Br.J.Hosp.Med.，52：520-534(1994)；Sturrock et al.，Nephrol.Dial.Transplant，9：1149-1156(1994)；Ludwin and Alexopolulou，Br.J.Rheum.，32(suppl 1)：60-64(1993)]。约10％来自用环孢菌素治疗的RA患者的肾解剖表明了环孢菌素毒性的形态学特征[Intemational Kidney BiopsyRegistry of Cyclosporin in Autoimmune Diseases，Br.J.Rheum.，32(suppl1)：65-71(1993)]。
还有另一实例，已经报告了环孢菌素对于治疗类固醇依赖性气喘是有效的。在一个试验中，给少量的患者随机施用环孢菌素或安慰剂，环孢菌素组的空气流量和FVC增加，泼尼松龙的解毒期减短。
另一实例是表明环孢菌素在治疗类固醇依赖性微小病变肾病综合症中是有效的。在该试验中，环孢菌素剂量低时，患者有较低的类固醇需求，但当停止环孢菌素用药时全部复发。抗类固醇肾病综合症对环孢菌素只有20-30％的反应率[Meyrier，Nephrol.Dial.Transplant，9：596-598(1994)；Hulton et al.，Pediatr.Nephrol.，8：401-403(1994)]。
从系统性红斑狼疮(SLE)的治疗来看，一项研究报告说在前瞻的非随机化，无对照组的研究中，SLE活性指数有显著的降低[Tokuda et al.，Arthr.Theumat.，37：551-558(1994)]。而其他研究未表明在SLE中是有效的。
另一实例是，在开始出现的早期，环孢菌素会介导胰岛素依赖性糖尿病的缓解。平均缓解约一年，尽管有些长达850天[Jenner et al.，Diabetologia，35：884-888(1992)；Bougneres et al.，Diabetes，39：1264-1272(1990)]。在一项研究的扩大的随访中，环孢菌素没有持续的长期效果[Martinetal.，diabetologia，34：429-434(1991)]。但在另一研究中，在治疗的12-18个月中肾功能恶化，并不能恢复到安慰剂水平，这表明可能发生了一些慢性肾损伤[Feldt-Rasmussen et al.，Diabetes Mediacine，7：429-433(1990)]。早期的发明需要提高对胰岛素依赖性糖尿病密期的免疫移植治疗效果。有些研究者正在筛选最相关的物质并成功地预防性地治疗有糖尿病迹象的患者[Elliottand Chase Diabetologia，34：362-365(1991)]。
还有另一实例，用环孢菌素可以治疗某些牛皮癣[Cuellar et al.，Balliere’sClin.Rheum.，8：483-498(1994)；Ellis et al.，JAMA 256：3110-3116(1986)]。高剂量治疗对于牛皮癣关节炎，特别是破坏性关节炎的严重情况是有效的，治疗中止后，通常会加重皮肤和关节病。从潜在的副作用和需要连续的长期治疗来看，环孢菌素只对用其他方法不能治疗的难以医治的牛皮癣关节炎有效。
另外，在安慰剂控制的双盲研究中，环孢菌素对于治疗严重的特应性皮炎是有效的[Van Joost et al.，Br.J.Derm.，130：634-640(1994)；Cooper，J.Invest.Derm.，102：128-137(1994)]。比起未治疗的疾病，患者宁愿接受因药物而产生的恶心、腹部不适、感觉异常、胆汁郁积和肾功能不全的副作用。另一随机化的双盲安慰剂控制研究发现环孢菌素治疗显著的提高患严重特应性皮炎的患者的生活质量[Saleketal.，Br.J.Derm.，129：422-430(1993)]。在停止环孢菌素用药后，皮肤损伤迅速复发，但生活质量仍得到保持。
作为另一实例，已经用环孢菌素来治疗手的慢性皮炎(其报告的发生率为4-22％，通常用局部类固醇来治疗，但该药对许多患者无效。在一项开放研究中，低剂量的环孢菌素能有效地治疗6/7的患者[Reitamo andGranlund，Br.J.Derm.，130：75-78(1994)]。在停用环孢菌素后，约一半的患者复发。
作为另一实例，已经用环孢菌素来治疗荨麻疹和血管性水肿，表现为荨麻疹和皮下肿胀的特发性皮肤病。病理与肥大细胞有关，治疗常常无效。在一项试验中，用环孢菌素治疗患难治的荨麻疹和血管性水肿的三名患者，所有症状均在一星期内消除[Fradin et al.，J.Am.Acad.Derm.，25：1065-1067(1991)]。由于副作用，所有患者不得不停止治疗，而且在治疗停止后，症状复发。
关于其他风湿病，研究报告说环孢菌素在治疗其他不太常见的自身免疫性疾病，包括白塞病[Pacoretal.，Clin.Rheum.，13：224-227(1994)]，Wegner’s肉芽肿病[Allen et al.，Cyclosporin A Therapy for Wegner’s Granulomatosis inANCA-Associated  Vasculitides：Immunological and Clinical Aspects，Grossed.Plenum Press(1993)]和免疫介导的血小板减少症[Schultz et al.，Blood85：1406-1408(1995)]方面是有效的。
在上述的许多试验中，环孢菌素或FK506的使用会带来许多不必要的副作用。通常，感染和恶性肿瘤危险的增加与一般的免疫抑制相关，锚定蛋白相关的免疫抑制不会没有相似的危险。但通过锚定蛋白组织特异性可以避免或降低其他副作用。环孢菌素和FK506最常见的严重副作用是肾毒性，至少在某些程度上是与剂量相关的，而且在大多数患者中均可能发生，主要是在治疗期间降低肾小球的滤过率。但当中止药物时，至少部分副作用是可逆的[Leaker and Cairns.同上文]。通常进行性肾功能不全不会发展，尽管需要更多的随访来进行确定的评价。在接受低剂量(3-4mg/kg/d)环孢菌素的患者中也会观察到慢性损伤，这些患者活检的40％都有间质纤维化，血管萎缩和动脉并发症(arteriolopathy)的变化[Svarstad et al.，Nephrol.Dial.Transplant，9：1462-1467(1994)；Young et al.，Kidney International，46：1216-1222(1994)]。在组织切片中，内皮细胞的变化也很明显[Kahan，N.Engl.J.Med.，321：1725-1748(1989)]。尽管表明药物也对血管细胞和血管间质细胞有直接毒性[Platz et al.，transplantation，58：170-178(1994)]，但认为肾毒性主要是由于小动脉血管收缩和慢性低级局部缺血而造成的[Leaker andCarins.同上文]。有些报告表明使用FK506，肾毒性的发生率和严重程度可能稍微高一点[Platz et al.，同上文]。
环孢菌素和FK506的另一显著毒性是神经毒性，临床表现包括癫痫发作，精神错乱，失明，昏迷，头痛，共济失调，帕金森综合症，感觉异常，精神病，聚焦缺乏(focal deficits)，运动不能性缄默症，震颤，神经病和睡眠障碍[Shimizu et al.，Pediatr.Nephrol.，8：483-385(1994)；Wilsonetal.，Muscle andNerve，17：528-532(1994)；Reece et al.，Bone Marrow Transpl.，8：393-401(1991)；Eidelman et al.，Transpl.Proc.，23：3175-3178(1991)；de Groen et al.，N.Engl.J.Med.，317：861-566(1987)]。在肝移植后，在用FK506治疗的10-20％的患者和用环孢菌素治疗的3-12％的患者中发生了中等程度到严重的神经中毒。神经中毒还与血清脂异常和肝功能障碍有关。
环孢菌素和/或FK506的其他副作用包括肝毒害性，葡萄糖不耐受症，高血压，多毛症，胃肠综合症，静脉血栓形成，胰腺炎和龈增生[Morris J.HeartLung Transplant，12：s275-s286(1993)；Fung et al.，Transpl.Proc.，23：3105-3108(1991)；Mason，Pharmacol，Rev.，42：423-434(1989)；Kahan，N.Engl.J.Med.，321：1725-1738(1989)；Thomason et al.，Renal Failure 16：731-745(1994)]。因此，从广泛利用环孢菌素和FK506及其利用所带来的固有副作用来看，开发另一种免疫抑制剂可能是极其有益的。
例如，从推测的T细胞锚定蛋白使神经钙蛋白去定位可以抑制在T活动抑制中的神经钙蛋白活性，由此提供有环孢菌素或FK506利用性的T细胞特异性免疫抑制，但副作用较低。前面观察到PKA从T细胞锚定蛋白的去定位，可以提高IL-2在受刺激的细胞中的表达，这表明锚定蛋白定位的PKA在T细胞激活过程中以一定的方式在IL-2表达中起调节作用。因此，PKA的T细胞特异性去定位可以提供一种提高IL-2体内分泌的方法，由此模拟重组IL-2的施用并可能降低以前报道的如下文描述的IL-2毒性。
IL-2已被允许治疗转移性肾癌，而且15-20％患转移性肾细胞癌或恶性黑瘤的患者对IL-2治疗有反应。这些反应中的一部分是可持续的，持续达66个月以上[Dillman，Cancer Biotherapy，9：183-209(1994)；whittington andFaulds，Drugs 46：446-514(1993)]。高剂量的单次快速注射治疗与几种严重的副作用(如下所述)相关，低剂量皮下或连续输注治疗会产生中度的反应率(12％)，但毒性降低[Vogelzang et al.，J.Clin.Oncol.，11；1809-1816(1993)]。
已经在其他恶性肿瘤的治疗中研究了IL-2治疗(带和不带α干扰素和其他试剂)。例如，在神经胶质瘤切除后，发现将IL-2直接用于瘤床就会有持续的临床反应，但不能治愈[Merchangt et al.，J.Neuro.，8：173-188(1990)]。在其他试验中，在淋巴瘤[Dillman，同上文]，结肠癌[Whittington and Faulds，同上文]，有限的AML[Bruton and Koeller，Pharmacotherapy 14：635-656(1994)]，卵巢癌和早期膀胱癌[Whittington and faulds，同上文]中报告有有限的疗效。但各试验的参与者太少而不能得出有关有效性的显著结论。
还将IL-2与继承性免疫治疗相结合，而且表明对于治疗转移性肾癌是有效的[Pierce et al.，Sem.Oncol.，22：74-80(1995)；Belldegrun et al.，J.Urol.，150：1384-1390(1993)]。另外，通过降低皮肤细菌负载和通过皮下注射降低麻风病患者的抗原水平，IL-2对于治疗特定的感染性疾病也是有效的[Kaplan，J.Infect.Dis.，167(suppl 1)：s18-22(1993)]。还观察到，与PPD阳性健康对照相比，结核病患者的淋巴细胞产生较低水平的IL-2[Sanchez etal.，Inf.Immun.，62：5673-5678(1994)]，这表明IL-2在治疗分支杆菌的感染中是有价值的。
尽管IL-2有潜在的治疗价值，但这种细胞因子仍有显著的毒性[除特别说明，来源是Whittington and faulds，Dillman and Bruton and Koeller，同上文]。治疗上主要的副作用是毛细管渗漏综合症。IL-2治疗增加了血管的通透性引起间质和肺水肿，相当多患者发展成需增压药的低血压。强烈的液体回生导致威胁生命的肺水肿。高达20％的患者需要插管和机械通气。高剂量的单次快速注射会引起比低剂量或慢输注更严重的渗漏，在有些方案中，在IL-2治疗期间100％的患者需要ICU支持。还观察到心肌炎，心肌病和心率失常。由毛细管渗漏综合症诱导的sypotension还可能发生急性肾衰竭。
IL-2还会引起腹泻，同时伴有电解质失衡，胆固醇沉着病，甲状腺异常和急性胰腺炎。15-20％治疗过的患者发生需要输注的贫血[MacFarlane etal.，Cancer 75：1030-1037(1995)]。可能会发生伴有出血的血小板减少症，凝血途径缺陷是常见的。70％以上的患者经历了精神状态的变化，包括偏执狂样妄想，幻想，兴趣丧失，睡眠障碍和倦睡。还报告了昏迷，视觉缺陷，暂时性脑缺血发作和感觉异常。与外源IL-2有关的这些缺陷表明，应开发其它的潜在疗法例如可以调节内源IL-2的产生，从而减少对外源IL-2治疗的需求。
除提供可能的方法以鉴定免疫抑制药物和IL-2生产调节剂外，锚定蛋白的鉴定使得通过已表明锚定蛋白参与其中的不同代谢途径调节其他细胞活性成为可能。例如，在神经元突触后密质中，推测AKAP79可能经结合PKA，PKC和神经钙蛋白在调节谷氨酸受体调节的离子通道方面起重要作用。PKA调节AMPA受体调节通道的活性，PKA的去定位或抑制减弱了AMPA离子通道活性。PKC调节NMDA受体调节通道的活性，已经表明神经钙蛋白减弱NMDA受体对刺激的敏感度。这些观察结果表明定位的激酶(PKA和PKC)可以调节神经元中谷氨酸受体的活性。由神经钙蛋白去磷酸化是NMDA受体的计数调节机制。该模型在生理上与由环孢菌素或FK506诱导的癫痫发作是一致的。
另外，谷氨酸受体与许多神经性疾病有关。谷氨酸和其他兴奋性氨基酸可以在神经元中产生兴奋毒性(excitotoxicity)，而且已经表明突触后谷氨酸受体的过度刺激对神经元有毒，会导致急性神经元变性。已经表明氧不足(如中风或心搏骤停后)和CNS损伤会使谷氨酸明显地泻流到细胞外空间，然后与谷氨酸受体相互作用，从而引发兴奋毒性级联反应。已经在动物模型中表明抗兴奋剂可以抵御脑损伤[Olney，Neurobiology of Aging，15：259-260(1994)]。令人感兴趣的是，NMDA拮抗剂对有些类型的神经元是有毒的，这表明谷氨酸可能在那些细胞中抑制其他兴奋途径。大环内酯抗体，如FK506也抗NMDA(但不抗kainate)在培养的神经元中的兴奋毒性[Manevetal.，Brain Res.，624：331-335(1993)]。
谷氨酸也与帕金森综合症有关。在暴露于MPTP的猴黑质中NMDA拮抗剂保护多巴胺能神经元，MPTP是一种在人和其他灵长类中诱发帕金森综合症的化学物质。金刚胺和二甲金刚胺是NMDA拮抗剂并已在欧洲用于治疗帕金森综合症，但是两种药物在某些患者中均会引起精神病。还有些迹象表明谷氨酸能神经元在帕金森病中活动过强，其抑制可以降低该病的运动症状[Lange and Riederer，Life Sciences，55：2067-2075(1994)]。
谷氨酸还在癫痫发作中起作用，参与发作的开始，扩散和保持。NMDA和非NMDA拮抗剂是潜在的抗惊厥药[Meldrum，Neurology，44(suppl 8)：S14-S23(1994)]。AMPA受体还与ALS有关，目前正在进行一系列的受体拮抗剂试验。49
从总的这些结果看，大量其他免疫抑制剂正在临床试验中并不使人感到惊奇。有关这些试验的信息来自Haydon and Haynes，Balliere’s ClinGastroentero.，8：455-45(1994)；Thomason and Starzi，Immunol.Rev.1993，71-98(1993)；和Morris J.Heart Lung Transplant.，12：S275-S286(1993)。例如，azaspirane是一种SKB化合物，抑制移植细胞渗入物和IL-2R诱导，并破坏IL-2和IFN-γ生产。显然，azaspirane诱导某些类型的抑制细胞，而且有些与环孢菌素有协同效果。
作为另一实例，麦考酚酸mofetial是一种Syntex产化合物，抑制嘌呤合成，并有T和B细胞选择性抗生殖作用。它减少抗体。麦考酚酸mofetial还减少来自细胞表面的粘附分子。 而所述药物的毒性明显很低，它可能会引起白细胞减少，并已经用其治疗牛皮癣达20年。
作为另一实例，咪唑立宾是一种抑制DNA合成的Sumitomo产化合物。其作用机制与麦考酚酸的相同。
作为另一实例，brequinar是通过阻断二氢乳清酸脱氢酶而抑制嘧啶合成的DuPont-Merck产化合物。正在等待临床试验的全部结果。已经报告该药物可与环孢菌素协调作用，但可能会引起血小板减少症，皮炎和粘膜炎。
作为另一实例，15-脱氧精胍菌素是一种Nippon-Kayaku产化合物，主要影响单核细胞/巨噬细胞的功能，包括抑制氧化代谢，溶酶体酶合成，IL-1生产和MHC II型抗原的细胞表面表达。在难治的肾排斥中有70-90％的效力，但在高剂量时可能会发生骨髓毒性。
作为另一实例，来福米物(leflunomide)是抑制细胞因子作用，阻断T细胞激活以及抗体合成的Hoechst化合物。它对肾和骨髓没有毒性。
作为另一实例，雷怕霉素(rapamycin)是与FK506有关的Wyeth-Ayerst化合物。它是必须与一种免疫亲和蛋白结合才有活性并不抑制神经钙蛋白或阻断T细胞细胞因子生产的前药物。借助未知的机制，雷怕霉素阻断G1到S转运。
在上述举证性实施例中所列的大量修饰和变化对于本领域专业人员来说是可预期的。结果只应将权利要求中的限制放在本发明上。
序列表
(1)一般资料
   (i)申请人：Lockerbie，Robert Owen，et al.
   (ii)发明题目：神经钙蛋白抑制化合物和固定蛋白
   (iii)序列数：42
   (iv)相关地址：
      (A)收件人：Marshall，O’Toole，Gerstein，Murray & Borun
      (B)街道：233 South Wacker Drive，6300 Sears Tower
      (C)城市：Chicago
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      (F)邮编：60606
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   (viii)代理人/代理资料
      (A)姓名：Williams Jr.，Joseph A.
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      (C)文献/档案号：27866/32861
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144Val Phe Asp Met Asp Gly Ile Pro Arg Val Asp Val Leu Lys Asn His
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192Leu Val Lys Glu Gly Arg Val Asp Glu Glu Ile Ala Leu Arg Ile Ile
 50                  55                  60AAT GAG GGT GCT GCC ATA CTT CGG CGG GAG AAA ACC ATG ATA GAA GTA
240Asn Glu Gly Ala Ala Ile Leu Arg Arg Glu Lys Thr Met Ile Glu Val65                  70                  75                  80GAA GCT CCA ATT ACA GTG TGT GGT GAC ATC CAT GGC CAA TTT TTT GAT
288Glu Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp
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336Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr
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384Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys
    115                 120                 125GTC TTA TAT TTA TGG GTC TTG AAG ATT CTA TAC CCA AGC ACA TTA TTC
432Val Leu Tyr Leu Trp Val Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Phe
130                 135                 140CTT CTG AGA GGC AAC CAT GAA TGC AGA CAC CTT ACT GAA TAT TTT ACC
480Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr145                 150                 155                 160TTT AAG CAG GAA TGT AAA ATT AAA TAT TCA GAA AGA GTC TAT GAA GCT
528Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Glu Ala
            165                 170                 175TGT ATG GAG GCT TTT GAC AGC TTG CCC CTT GCT GCA CTT CTA AAC CAA
576Cys Met Glu Ala Phe Asp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Leu Asn Gln
        180                 185                 190CAA TTT CTT TGT GTT CAT GGT GGA CTT TCA CCA GAA ATA CAC ACA CTG
624Gln Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile His Thr Leu
    195                 200                 205GAT GAT ATT AGG AGA TTA GAT AGA TTT AAA GAG CCA CCT GCA TTT GGA
    672Asp Asp Ile Arg Arg Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Phe Gly
210                 215                 220CCA ATG TGT GAC TTG CTA TGG TCT GAT CCT TCT GAA GAC TTT GGA AAT
720Pro Met Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro er Glu Asp Phe Gly Asn225                 230                 235                240GAA AAA TCA CAA GAA CAT TTT AGT CAT AAT ACA GTT CGA GGA TGT TCT
768Glu Lys Ser Gln Glu His Phe Ser His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser
            245                 250                 255TAT TTT TAT AAC TAT CCA GCA GTG TGT GAA TTT TTG CAA AAC AAT AAT
816Tyr Phe Tyr Asn Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln Asn Asn Asn
        260                 265                 270TTG TTA TCG ATT ATT AGA GCT CAT GAA GCT CAA GAT GCA GGC TAT AGA
864Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg
    275                 280                 285ATG TAC AGA AAA AGT CAA ACT ACA GGG TTT CCT TCA TTA ATA ACA ATT
912Met Tyr Arg Lys Ser Gln Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile
290                 295                 300TTT TCG GCA CCT AAT TAC TTA GAT GTC TAC AAT AAT AAA GCT GCT GTA
960Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val305                 310                 315                 320CTA AAG TAT GAA AAT AAT GTG ATG AAC ATT CGA CAG TTT AAT TGC TCT1008Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser
            325                 330                 335CCA CAT CCT TAT TGG TTG CCC AAT TTT ATG GAT GTC TTT ACA TGG TCC1056Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser
        340                 345                  350TTA CCA TTT GTT GGA GAA AAA GTG ACA GAA ATG TTG GTA AAT GTT CTG1104Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val Leu
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370                 375                  380GAT GTA GGT TCA GCT GCA GCC CGG AAA GAA ATC ATA AGA AAC AAG ATC1200Asp Val Gly Ser Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ile Ile Arg Asn Lys Ile385                 390                 395                 400CGA GCA ATT GGC AAG ATG GCA AGA GTC TTC TCT GTT CTC AGG GAG GAG1248Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu
            405                 410                 415AGT GAA AGC GTG CTG ACA CTC AAG GGC CTG ACT CCC ACA GGG ATG TTG1296Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu
        420                 425                  430CCT AGT GGA GTG TTG GCT GGA GGA CGG CAG ACC TTG CAA AGT GGT AAT1344Pro Ser Gly Val Leu Ala Gly Gly Arg Gln Thr Leu Gln Ser Gly Asn
    435                 440                  445GAT GTT ATG CAA CTT GCT GTG CCT CAG ATG GAC TGG GGC ACA ACT CAC1392Asp Val Met Gln Leu Ala Val Pro Gln Met Asp Trp Gly Thr Thr His
450                 455                  460TCT TTT GCT AAC AAT ACA CAT AAT GCA TGC AGG GAA CTC CTT CTG CTT1440Ser Phe Ala Asn Asn Thr His Asn Ala Cys Arg Glu Leu Leu Leu Leu465                 470                 475                 480TTT AGT TCC TGT CTT AGC AGC TGACATATGC AGGGTATTAT GTGATAGGCA
1491Phe Ser Ser Cys Leu Ser Ser
            485TCTGATTAGT ACCTGGCCAG GGCATAATAT TGATAGAACA AGTTGTCTTT TAACTGAAAA1551TAACAATCAG TTTCCCAGAT TTTCATAAGG TGATATGGGG AGCAGCTCAT GTCATAATTC1611CGAAATATTT ATTCATTTGT TTAATGCACC CCTTTCTTTC AAAAGCCTCA GTCAAGAATG1671TGAATCAGGG ATATATCTAT ATATCTATTT ACACACATAC ATAAATATAT ATAACTAAAA1731TGGAAATGTA ATTCCGAGTT TCTTACTTTT AAAATTTACG TAATTGTATT AGATTTTGCT1791TATGTTTTCA AGTATTTATT TTTTGAGTTA AAATTCTGCT TAGGCCCCAA AACTTCCTTT1851ATGCACTCAT TTGCCAAAAG ATTTATGCTA AATTTTGTAC CCTGGTAAAT GATTAGAGTT1911TGTTTTCTGT GGTGTTTGTC AAACGTTCTA TGTATAATTG ACTGTCTGTA ACATGCTGTT1971TCCTTCCTCT GCAGATATAG CTGCTTTCCT AAATCTGTCT GTCTTTCTTT AGGATAGCTG2031TATGTCTGTA AATATATGTT CAATTAAATT ACTCTATCAG ACGCTTGTCT GTCTTTTGAT2091GTAGAAGCAA CTTTGTAGCA CCTTGATTTT AGGTTTGCTG CATTTGTTGC TGCACTTGGT2151TCAGTCTGAA TATGAATGTA ACATTAGATA TTGAGCTATT GTTATAAAGG GTTGAATTTA2211AATCATGTAA GTCAAAATTG AAAGGGTGTT ATAAAGTGTG CCTTTA
2257
(2)SEQ ID NO：7的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：487个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：蛋白质
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Asp Arg Val1               5                   10                  15Val Lys Ala Val Pro Phe Pro Pro Thr His Arg Leu Thr Ser Glu Glu
         20                   25                   30Val Phe Asp Met Asp Gly Ile Pro Arg Val Asp Val Leu Lys Asn His
     35                   40                  45Leu Val Lys Glu Gly Arg Val Asp Glu Glu Ile Ala Leu Arg Ile Ile
 50                   55                  60Asn Glu Gly Ala Ala Ile Leu Arg Arg Glu Lys Thr Met Ile Glu Val65                  70                  75                  80Glu Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Phe Asp
             85                   90                   95Leu Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Ser Pro Ala Asn Thr Arg Tyr
        100                  105                  110Leu Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys
    115                 120                   125Val Leu Tyr Leu Trp Val Leu Lys Ile Leu Tyr Pro Ser Thr Leu Phe
130                 135                   140Leu Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Glu Tyr Phe Thr145                 150                 155                 160Phe Lys Gln Glu Cys Lys Ile Lys Tyr Ser Glu Arg Val Tyr Glu Ala
            165                  170                  175Cys Met Glu Ala Phe Asp Ser Leu Pro Leu Ala Ala Leu Leu Asn Gln
        180                  185                  190Gln Phe Leu Cys Val His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Ile His Thr Leu
    195                  200                 205Asp Asp Ile Arg Arg Leu Asp Arg Phe Lys Glu Pro Pro Ala Phe Gly
210                 215                  220Pro Met Cys Asp Leu Leu Trp Ser Asp Pro Ser Glu Asp Phe Gly Asn225                 230                 235                 240Glu Lys Ser Gln Glu His Phe Ser His Asn Thr Val Arg Gly Cys Ser
            245                  250                 255Tyr Phe Tyr Asn Tyr Pro Ala Val Cys Glu Phe Leu Gln Asn Asn Asn
        260                  265                  270Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg
    275                  280                  285Met Tyr Arg Lys Ser Gln Thr Thr Gly Phe Pro Ser Leu Ile Thr Ile
290                  295                 300Phe Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val305                 310                 315                 320Leu Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Ser
            325                  330                  335Pro His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser
        340                  345                  350Leu Pro Phe Val Gly Glu Lys Val Thr Glu Met Leu Val Asn Val Leu
    355                  360                  365Ser Ile Cys Ser Asp Asp Glu Leu Met Thr Glu Gly Glu Asp Gln Phe
370                  375                 380Asp Val Gly Ser Ala Ala Ala Arg Lys Glu Ile Ile Arg Asn Lys Ile385                 390                 395                 400Arg Ala Ile Gly Lys Met Ala Arg Val Phe Ser Val Leu Arg Glu Glu
            405                  410                  415Ser Glu Ser Val Leu Thr Leu Lys Gly Leu Thr Pro Thr Gly Met Leu
        420                  425                  430Pro Ser Gly Val Leu Ala Gly Gly Arg Gln Thr Leu Gln Ser Gly Asn
    435                  440                  445Asp Val Met Gln Leu Ala Val Pro Gln Met Asp Trp Gly Thr Thr His
450                  455                 460Ser Phe Ala Asn Asn Thr His Asn Ala Cys Arg Glu Leu Leu Leu Leu465                 470            475              480Phe Ser Ser Cys Leu Ser Ser
            485
(2)SEQ ID NO：8的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：28个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQID NO：8：Ser Ile Lys Arg Leu Val Thr Arg Arg Lys Arg Ser Glu Ser Ser Lys1               5                  10                  15Gln Gln Lys Pro Phe Lys Ala Lys Leu Gln Ser Glu
         20                  25
(2)SEQ ID NO：9的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：24个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：  线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Asp Leu Ile Glu Glu Ala Ala Ser Arg Ile Val Asp Ala Val Ile Glu1                   5               10                   15Gln Val Lys Ala Ala Gly Ala Tyr
         20
(2)SEQ ID NO：10的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：26个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：GTATTAGCAG GAGATCTTCC TACTTC
  26
(2)SEQ ID NO：11的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GTGTGTGTAG ATCTGGTGAA AGTCC
  25
(2)SEQ ID NO：12的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：29个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：ATTGTAGAGA TCTAAGTAAT TAGGTGCCG
  29
(2)SEQ ID NO：13的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：28个碱基对
        (B)关型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GCCAATTGCT CAGATCTTGT TTCTTATG
  28
(2)SEQ ID NO：14的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：29个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GGAATTCGGA TCCTCGAGAG ATCTCGCCG
    29
(2)SEQ ID NO：15的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：30个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CCACTTTGAG ATCTCTACCG TCCTCCAGCC
  30
(2)SEQ ID NO：16的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：25个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQID NO：16：CCCTGAGATC TTCAGCTGCTAAGAC
  25
(2)SEQ ID NO：17的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：30个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：GGCTGAGATC TGGCAGACCT TGCAAAGTGG
  30
(2)SEQ ID NO：18的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：GTGATGAAGA TCTTACAGTT TAATTGCTCT CC
  32
(2)SEQ ID NO：19的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：26个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：TTCTCCAGAT CTTGGTAAGG ACCATG
  26
(2)SEQ ID NO：20的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：30个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
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    (xi)序列描述：SEQ ID NO：20：CACCTTCTGT AGATCTTTCA TCATCAGAAC
  30
(2)SEQ ID NO：21的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：24个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：CATCGGCAGA TCTCTGAAGA AGTG
  24
(2)SEQ ID NO：22的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：29个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：CCATGGCCAA TTTTAGATCT CGATGAAAC
  29
(2)SEQ ID NO：23的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：30个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：23：GGACCATGAG ATCTAATCCA TAAAATTGGG
  30
(2)SEQ ID NO：24的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：31个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：AAATGGGAGA TCTAATAAGG ATGTGGAGAG C
  3l
(2)SEQ ID NO：25的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：25：GGAGAGCAAT TAAAGATCTA AATGTTCATC AC
  32
(2)SEQ ID NO：26的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：27个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：TTTTCATAGA TCTATACAAG CAGCTTT
  27
(2)SEQ ID NO：27的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：36个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：27：CAACCAGAFC TAATGTGGAG AGCAATTAAA CTGTCG
  36
(2)SEQ ID NO：28的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：33个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：28：CCAATAAGAG ATCTAAGAGC AATTAAACTG TCG
  33
(2)SEQ ID NO：29的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：35个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构： 线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：29：FGTGAGATCT AATTAAACTG TCGAATGTTC ATCAC38
(2)SEQ ID NO：30的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：30：GGAGAGCAGA TCTACTGTCG AATGTTCATC AC
  32
(2)SEQ ID NO：31的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：40个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：31：AAGGATAGAT CTAGCAATTA AACTGTCGAA TGTTCATCAC
  40
(2)SEQ ID NO：32的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：54个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：32：TACAACTAGT ACCATGGTCG ATGGTCGACA GATCTCTCGA GAAGCTTAGC TAGC
  54
(2)SEQ ID NO：33的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：981个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：33：CAGAGTATCG ATGAAATCTA CAAATATGAC AAAAAACAAC AACAAGAAAT CCTGGCGGCG60AAACCCTGGA CTAAGGATCA CCACTACTTT AAATACTGCA AAATCTCAGC ATTGGCTCTA120CTGAAAATGG TGATGCATGC CAGGTCAGGA GGCAACTTGG AAGTGATGGG TTTGATGCTC  180GGGAAAGTCG ACGGCGAGAC CATGATCATC ATGGACAGTT TCGCTTTGAC TGTAGAGGGC240ACAGAAACTC GAGTAAATGC TCAAGCTGCT GCGTATGAGT ATATGGCTGC ATACATAGAA300AATGCCAAAC AGGTTGGCCG CCTTGAGAAT GCAATCGGTT GGTATCATAG CCACCCTGGT360TATGGCTGCT GGCTCTCCGG GATTGATGTT AGTACACAGA TGCTGAACCA GCAGTTTCAA420GAACCATTTG TAGCAGTGGT GATTGATCCA ACCAGAACAA TCTCTGCAGG AAAAGTGAAT480CTTGGCGCCT TTAGGACATA TCCAAAGGGC TACAAACCTC CTGATGAAGG ACCTTCTGAG540TACCAGACTA TCCCACCTTA ATAAAATAGA AGATTTGGGC GTGCACTGAA ACAATATTAT600GCCTTAGAAG TCTCATATTT CAAATCATCT TGGATCGTAA ACTACTTGAG CTTTGGTGGA660ATAAATACTG GGTGAATACC CTGAGTCCTC TAGCTTGCTT ACTAATGCAG ACTACACCAC720AGGCCAGGTG TTGATTTGTC TGAGAAGTTA GAGCAGTCGG AAGCCCAACT GGGACGTGGC780AGTTTCATGT TGGGCTTAGA AACACATGAC CGCAAGTCGG AAGACAAACT TGCCAAAGCT840ACTAGAGACA GCTGTAAAAC CACCATAGAA GCCACCATGG ACTGATGTCT CAGGTTATTA900AGGATAAACT GTTTAATCAG ATTAACGTTG TTAGTTACCA CCACGTACTT CTCAAAGTGG960TGTGTGGAAG GAAAAGAGCT C
 981
(2)SEQ ID NO：34的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：919个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：34：AAACCCTGGA CTAAGGATCA CCACTACTTT AAATACTGCA AAATCTCAGC ATTGGCTCTA60CTGAAAATGG TGATGCATGC CAGGTCAGGA GGCAACTTGG AAGTGATGGG TTTGATGCTC120GGGAAAGTCG ACGGGGAGAC CATGATCATC ATGGACAGTT TCGCTTTGCT GTAGAGGGCA180CAGAAACTCG AGTAAATGCT CAAGCTGCTG CGTATGAGTA TATGGCTGCA TACATAGAAA240ATGCCAAACA GGTTGGCCGC CTTGAGAATG CAATCGGTTG GTATCATAGC CACCCTGGTT300ATGGCTGCTG GCTCTCCGGG ATTGATGTTA GTACACAGAT GCTGAACCAG CAGTTTCAAG360AACCATTTGT AGCAGTGGTG ATTGATCCAA CCAGAACAAT CTCTGCAGGA AAAGTGAATC420TTGGCGCCTT TAGGACATAT CCAAAGGGCT ACAAACCTCC GATGAAGGAC CTTCTGAGTA480CCAGACTATC CCACCTTAAT AAAATAGAAG ATTTGGGCGT GCACTGAAAC AATATTATGC540CTTAGAAGTC TCATATTTCA AATCATCTTG GATCGTAAAC TACTTGAGCT TTGGTGGAAT600AAATACTGGG TGAATACCCT GAGTCCTCTA GCTTGCTTAC TAATGCAGAC TACACCACAG660GCCAGGTGTT GATTTGTCTG AGAAGTTAGA GCAGTCGGAA GCCCAACTGG GACGTGGCAG720TTTCATGTTG GGCTTAGAAA CACATGACCG CAAGTCGGAA GACAAACTTG CCAAAGCTAC780TAGAGACAGC TGTAAAACCA CCATAGAAGC CACCATGGAC TGATGTCTCA GGTTATTAAG840GATAAACTGT TTAATCAGAT TAACGTTGTT AGTTACCACC ACGTACTTCT CAAAGTGGTG900TGTGGAAGGA AAAGAGCTC
 919
(2)SEQ ID NO：35的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：541个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：35：GACCACCGAG ATGCCAATTC CAGTGTCATG AGATTTCTGC GAGACCTCAT CCACACAGGA   60GTAGCCAATG ATTTATCTGT TTTCTTACAG CATGAAGAAG ATTTTGTTGC GGAAGGAACT120AATTGGACAG GTGATGAGCC AGCTTGGGCA GCAACTTGTC AGCCAGCTGC TCCACACATG180CTGCTTTTGG TTCCCCCCTA CACCCTACCC GACGTGGTTG AAGTGCTCTG GGAGATCATG240CAGGTTGACA GACCGACTTT CTGTCGGTGG CTAGAGAATT CCTTGAAAGG TTTGCCAAAA300GAGACCACAG TGGGAGCTGT CACAGTGACA CATAAACAAC TTACAGATTT CCACAAGCAA360GTCACTAGTG CCGAGGAATG TAAGCAAGTT TGCTGGGCCT TGAGAGACTT CACCAGGTTG420TTTCGATAGC TCAAGCTCAC ACTCCTGCAC TGTGCCTGTC ATCCAGGAAT GTCTTTTTTT480ATTAGAAGAC AGGAAGAAAA CAACCCAGAC TGTGTCCCAC AATCAGAAAC CTCTGTTGTG540G
 541
(2)SEQ ID NO：36的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：519个碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：cDNA
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：36CGAGATGCCA ATTCCAGTGT CATGAGATTT CTGCGAGACC TCATCCACAC AGGAGTAGCC60AATGATCATG AAGAAGATTT TGAATTGCGG AAGGAACTAA TTGGACAGGT GATGAGCCAG120CTTGGCCAGC AACTTGTCAG CCAGCTGCTC CACACATGCT GCTTTTGTCT TCCCCCTACA180CCCTACCCGA CGTGGTTGAA GTGCTCTGGG AGATCATGCA GGTTGACAGA CCGACTTTCT240GTCGGTGGCT AGAGAATTCC TTGAAAGGTT TGCCAAAAGA GACCACAGTG GGAGCTGTCA300CAGTGACACA TAAACAACTT ACAGATTTCC ACAAGCAAGT CACTAGTGCC GAGGAATGTA360AGCAAGTTTG CTGGGCCTTG AGAGACTTCA CCAGGTTGTT TCGATAGCTC AAGCTCACAC420TCCTGCACTG TGCCTGTCAT CCAGGAATGT CTTTTTTTAT TAGAAGACAG GAAGAAAACA480ACCCAGACTG TGTCCCACAA TCAGAAACCT CTGTTGTGG
 519
(2)SEQ ID NO：37的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：14个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：37：Phe Xaa Arg Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1               5                   10
(2)SEQ ID NO：38的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：14个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：38：Phe Ala Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1               5                   10
(2)SEQ ID NO：39的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：14个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：39：Phe Lys Arg Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1               5                   10
(2)SEQ ID NO：40的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：14个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：40：Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Leu Ala Pro Lys1               5                   10
(2)SEQ ID NO：41的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：14个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：Phe Lys Arg Arg Lys Lys Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ala1               5                   10
(2)SEQ ID NO：42的资料：
    (i)序列特征：
        (A)长度：14个氨基酸
        (B)类型：氨基酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：肽
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：42：Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ala Pro Ala1               5                   10

Claims (29)

1.纯化并分离的多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO：33所示序列的pACT59多肽。
2.由权利要求1的多核苷酸编码的pACT 59多肽。
3.纯化并分离的多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO：34所示序列的pACT74多肽。
4.由权利要求3的多核苷酸编码的pACT 74多肽。
5.纯化并分离的多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO：35所示序列的pACT36多肽。
6.由权利要求5的多核苷酸编码的pACT 36多肽。
7.纯化并分离的多核苷酸，其编码具有SEQ ID NO：36所示序列的pACT60多肽。
8.由权利要求7的多核苷酸编码的pACT 36多肽。
9.鉴定可能的抑制剂化合物的方法，所述化合物抑制锚定蛋白和结合配对物之间的结合，所述方法包括：
在存在和不存在可能的抑制剂化合物时，在适宜锚定蛋白和所述结合配对物结合的条件下将锚定蛋白和带标记的结合配对物保温，其中所述锚定蛋白被固定在一固体支持物上；
从固体支持物上洗脱未结合的结合配对物；
确定与固定的锚定蛋白结合的结合配对物的量；
比较存在所述化合物时与锚定蛋白结合的结合配对物的量和不存在所述化合物时结合锚定蛋白的结合配对物的量；和
从中确定所述化合物是否抑制锚定蛋白和所述结合配对物间的结合。
10.权利要求9的方法，其中所述结合配对物是带放射性标记的。
11.权利要求9的方法，其中所述结合配对物是用荧光基团标记的。
12.权利要求9的方法，其中所述结合配对物是PKA的I型调节亚单位。
13.权利要求9的方法，其中所述结合配对物是PKA的II型调节亚单位。
14.利要求9的方法，其中所述锚定蛋白是AKAP 79。
15.权利要求9的方法，其中所述结合配对物是神经钙蛋白多肽。
16.权利要求15的方法，其中所述神经钙蛋白多肽是选自由SEQIDNO：7的氨基酸1-487，1-400，1-312，1-204，1-104，332-487，441-487，332-441，1-375，1-354，30-375，98-375，1-347，1-340，1-330，1-320，1-338，1-336，1-334，1-332和1-335组成的一组缺失突变体。
17.选自由SEQ ID NO：7的氨基酸1-487，1-400，1-312，1-204，1-104，332-487，441-487，332-441，1-375，1-354，30-375，98-375，1-347，1-340，1-330，1-320，1-338，1-336，1-334，1-332和1-335组成的一组神经钙蛋白缺失突变体。
18.提高T淋巴细胞表达白细胞介素2的方法，包括将T淋巴细胞与下列氨基酸序列之一接触：
    Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile或Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala。
19.权利要求18的方法，其中所述氨基酸序列是：
       Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp-Ile。
20.权利要求19的方法，其中所述氨基酸序列被肉豆蔻酸化。
21.权利要求18的方法，其中所述氨基酸序列是：Asp-Leu-Ile-Glu-Glu-Ala-Ala-Ser-Arg-Ile-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Glu-Gln-Val-Lys-Ala-Ala-Gly-Ala。
22.权利要求21的方法，其中所述氨基酸序列被肉豆蔻酸化。
23.权利要求18的方法，还包括用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯和伊屋诺霉素激活T细胞。
24.从含有神经钙蛋白的细胞组分中分离神经钙蛋白的方法，包括将所述细胞组分与固定在固体底物上的AKAP 79或其神经钙蛋白结合片段接触，然后从中洗脱神经钙蛋白。
25.在细胞中抑制神经钙蛋白活性的方法，包括将所述细胞与含有下列氨基酸序列的神经钙蛋白结合肽接触：
   Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro。
26.权利要求25的方法，其中所述肽是
   Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Leu-Gln。
27.权利要求25的方法，其中所述肽是：
   Arg-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Ser-Ser-Lys-Glu-Glu-Lys-Pro-Phe-Lys。
28.权利要求25的方法，其中所述肽不结合PKA。
29.确定细胞是否含有结合神经钙蛋白和结合PKA的锚定蛋白的方法，包括：
裂解细胞以形成裂解产物；
将裂解产物与固体支持物一起保温，所述固体支持物上固定有神经钙蛋白分子；
从固体支持物上洗脱裂解产物；
将所述固体支持物与结合在锚定蛋白上的带标记的PKA调节亚单位接触；
从固体支持物上洗脱调节亚单位；
检测保留在固体支持物上的标记；
从中确定在细胞中是否存在结合神经钙蛋白和结合PKA的锚定蛋白。
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