PL178766B1

PL178766B1 - Nowe peptydy

Info

Publication number: PL178766B1
Application number: PL93309353A
Authority: PL
Inventors: Andreas Haupt; Bernd Janssen; Kurt Ritter; Dagmar Klinge; Gerhard Keilhauer; Cynthia Romerdahl; Teresa Barlozzari; Xiao-Dong Qian
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-12-04
Publication date: 2000-06-30
Also published as: SI9300661A; HRP931504B1; ATE196296T1; RU95115135A; DE69329425T2; CZ157595A3; NO952366D0; SG67935A1; AU5695994A; CA2151953A1; ZA939389B; US5502032A; PL309353A1; AU679479B2; WO1994013695A1; FI952961A; NZ258882A; BR1100019A; ES2151921T3; HUT72067A

Abstract

Nowe peptydy o wzorze I w którym R1 oznacza grupe C 1 -7-alkilowa, R2 oznacza grupe C 1 -4-alkilowa, X oznacza grupe C 1 -5-alkilowa, R3 oznacza nizsza grupe alkilowa, B oznacza grupe C 1 -5-alkilowa. D oznacza grupe C 1 -5-alkoksylowa, R4 oznacza wodór, grupe hydroksylowa, benzyloksylowa, C 1 -7-alkilowa, fluoroetylowa, difluoroetylowa, trifluoroetylowa, R5 oznacza wodór, C 1-7-alkil, fenyl, benzyl, pirydyl, pikolil, benzotiazolil, benzoizotiazolil, benzopirazolil, benzoksazoil albo pirymi- dyl M jest wybrane z grupy obejmujacej grupe 1-aminopentylo-1-karbonylowa, walilowa, 2-III-rz -butyloglicylowa, prolilowa, hydroksypro- lilowa, izoleucylowa, leucylowa, 3-cykloheksyloalanylowa, fenyloalanylowa, tetrahydroizochinolilo-2-karbonylowa, 3-tiazoliloalanylowa 3-tienyloalanylowa, histydylowa, 2-aimnoindylo-2-karbonylowa, tyrozylowa, 3-pirydyloalanylowa, 3-III-rz.butyloalanylowa, 2-cyklohe- ksyloglicylowa albo 3-naftyloalanylowa, d oznacza liczbe 0 lub 1, oraz ich sole z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami PL PL PL PL PL PL

Description

Związki według wynalazku obejmują nowe peptydy o wzorze I

N-CHX-CO-Val-NR³-CHB-CHD-CH₂-CO- (M) _d~N

R· w którym

R1 oznacza grupę C ^-alkilową R2 oznacza grupę C^-alkilową

178 766

X oznacza grupę C^-alkilową,

R³ oznacza niższą grupę alkilową,

B oznacza grupę Cj.₅-alkilową,

D oznacza grupę Cpj-alkoksylową,

R⁴ oznacza wodór, grupę hydroksylową, benzyloksylową, C_b7-alkilową, fluoroetylową, difluoroetylową, trifluoroetylową,

R⁵ oznacza wodór, Cj^-alkil, fenyl, benzyl, pirydyl, pikolil, benzotiazolil, benzoizotiazolil, benzopirazolil, benzoksazoil albo pirymidyl.

M jest wybrane z grupy obejmującej grupę 1 -aminopentylo-1-karbonylową, walilową,

2- III-rz.-butyloglicylową prolilową, hydroksyprolilową, izoleucylową, leucylową, 3-cykloheksyloalanylową, fenyloalanylową, tetrahydroizochinolilo-2-karbonylową, 3-tiazoliloalanylową,

3- tienyloalanylową, histydylową,2-ąmnKaindylo-d-kar2onykiwą,tyrozylową,3-pir3-dyloalanylową, 3-III-rz.butyloalanylową, 2-cykloheksyloglieylową. albo 3-naftyloalanylową;

d oznacza liczbę 0 lub 1, oraz ich sole z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami.

Jedna podklasa związków według wynalazku obejmuje związki o wzorze I, w którym ugrupowanie Rj-N-R² oznacza pierścień pirolidynylowy.

Inna podklasa związków według wynalazku obejmuje związki o wzorze I z grupąaminową o wzorze R4-N-R5, w którym ,

R4 oznacza H albo hydroksy, albo benzyloksy albo C₁_7-alkil albo fluoretyl albo difluoroetyl albo trifluoroetyl,

R5 oznacza H albo Cj.7-alkil albo fenyl, benzyl, pirydyl, pikolil, benzotiazolil, kenzoizotiazolil, benzopirazolil, benzoksazoil albo pirymidynyl.

W innej podklasie związków według wynalazku R4-N-R5 razem może tworzyć struktury wybrane z grupy obejmującej

Jeszcze inna podklasa związków według wynalazku obejmuje związki o wzorze I, w którym d oznacza zero lub 1.

Korzystne są związki, w których podstawniki mają następujące znaczenia:

R¹ oznacza etyl, metyl, trifluoroetyl, fluoroetyl, difluoroetyl, izopropyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl,

R2 oznacza H, metyl, etyl, izopropyl, n-propyl, n-butyl,

X oznacza metyl, etyl, izopropyl, -CH₃Ch(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, III-rz.butyl,

R3 oznacza metyl lub etyl,

B oznacza metyl, etyl, izopropyl, -CH2CH(CH3)2, -CH(CH3)CH2CH3, III-rz.butyl,

D oznacza metoksy, etoksy, izopropyloksy lub III-rz.butyloksy,

M jest wybrane z grupy obejmującej grupę 1-aminopentylo-1-karbonylową, walilową,

2- III-rz.butyloglicylową, prolilową, hydroksyprolilową, izoleucylową, leucylową, 3-cykloheksyloalanylową, fenyloalanylową, tetrahydroizochinolilo-2-karbonylową, 3-tiazoliloalanylową,

3- tienyloalanylową, histydylową. 2-aminomd\io-2-ka2donklową. tyrozylową, 3rpirypyloalanylową 3-III-rz.butyloalanylową, 2-cykloheksyloglieylowąalbo 3-naftyloalanylową

R4 oznacza wodór, metyl, etyl, trifluoroetyl, fluoroetyl, difluoroetyl, propyl, izopropyl, R5 oznacza wodór, metyl, etyl, trifluoroetyl, propyl, izopropyl, III-rz.butyl, albo

17:8766

178 766

cf₃

QCH₃)₃

178 766

Bardziej korzystne są związki, w których podstawniki mają następujące znaczenia:

R¹ oznacza etyl, metyl, fluoroetyl, izopropyl, propyl, cyklopropyl,

R² oznacza wodór, metyl, etyl, izopropyl, propyl, butyl,

X oznacza metyl, izopropyl, -CH₂CH(CH3)2, -CH(CH3)CH₂CH3, III-rz.butyl albo benzyl, R³ oznacza metyl albo etyl,

B oznacza metyl, izopropyl, -CH₂CH(CH3)₂, -CH(CH3)CH2CH3, III-rz.butyl albo benzyl, D oznacza metoksy albo III-rz.butyloksy,

M jest wybrane z grupy obejmującej prolil, hydroksyprolil, walil, izoleucyl, fenyloalanyl, tetrahydroizochinolilo-2-karbonyl, 2-aminoindylo-2-karbonyl, tyrozyl, 3-naftyloalanyl, d oznacza 0 albo 1,

Grupa aminowa oznacza -NR⁴R⁵, gdzie

R⁴ oznacza wodór, metyl, etyl, trifluoroetyl, fluoroetyl, difluoroetyl, propyl, izopropyl,

C(CH₃)₃

178 766

R⁵ oznacza wodór, metyl, etyl, propyl, izopropyl, Ill-rz.bu tyl,

albo R⁴-N-r5 razem oznaczają

178 766

Przykłady te ilustrują, lecz nie ograniczają zakresu niniejszego wynalazku.

Związki o wzorze I składają się korzystnie z L-aminokwasów albo składników pochodzących od L-aminokwasów, lecz mogąone zawierać jeden lub więcej D-aminokwasów albo składników pochodzących od D-aminokwasów.

Szczególnie odpowiednimi fizjologicznie tolerowanymi kwasami są: kwas solny, kwas cytrynowy, kwas winowy, kwas mlekowy, kwas fosforowy, kwas metanosulfonowy, kwas octowy, kwas mrówkowy, kwas maleinowy, kwas fumarowy, kwas jabłkowy, kwas bursztynowy, kwas malonowy, kwas siarkowy, kwas L-glutaminowy, kwas L-asparaginowy, kwas pirogronowy, kwas śluzowy, kwas benzoesowy, kwas glukuronowy, kwas szczawiowy, kwas askorbinowy i acetyloglicyna.

Nowe związki można wytwarzać znanymi metodami. Tak więc związki te można zestawiać kolejno lub przez wiązanie odpowiednich małych fragmentów. W zestawianiu kolejnym wchodząc z C-końca łańcuch peptydowy rozwija się etapami za pomocąjednego aminokwasu albo każdorazowo budując blok. W przypadku sprzęgania fragmentów można wiązać wzajemnie fragmenty o różnych długościach, a fragmenty z kolei można otrzymywać drogąkolejnego zestawiania z aminokwasów albo budując bloki.

Zarówno w zestawianiu kolejnym jak i w sprzęganiu fragmentów konieczne jest wiązanie jednostek przez tworzenie wiązania amidowego. Odpowiednie do tego sąmetody enzymatyczne i chemiczne.

Metody chemiczne do tworzenia wiązania amidowego są opisane szczegółowo w następujących pozycjach Muller, Methoden der organischen Chemie, tom XV/2, str. 1 - 364, wydawnictwo Thieme, Stuttgart, 1974; Stewart, Young, Solid Phase Peptide Synthesis, str. 31 - 34,71 82, Pierce Chemical Company, Rockford, 1984; Bodanszky, Klausner, Ondetti, Peptide Synthesis, str. 85 128, John Wiley and Sons, Nowy Jork, 1976 i inne standardowe opracowania dotyczące chemii peptydów. Szczególnie korzystna jest metoda azydowa, metoda symetrycznych i mieszanych bezwodników, wytwarzanych in situ lub wstępnie otrzymywanych aktywnych estrów, stosowanie uretanem chronionych N-karboksy-bezwodników aminokwasów i tworzenie wiązania amidowego z zastosowaniem reagentów sprzęgania, zwłaszcza dicykloheksylokarbodiimidu (DCC), diizopropylokarbodiimidu (DIC), 1-etoksy-karbony 10-2-0^^57-1,2-0^0^)chinoliny (EEDQ), chlorowodorku ]-etylo-3-(3-dimetyioaminopropylo)-karbodii.midu (EDCl), bezwodnika kwasu n-propanofosfonowego (PPA), chlorku N,N-bis-(2-okso-3-oksazolidynylo)-amidofosforylu (BOP-Cl), heksafluorofosforanu bromo-tris-pirolidynofosfoniowego (PyBrop), azydku difenylofosforylowego (DPPA), reagentu Castro (BOP, PyBop), soli O-benzotriazolilo-N^NN-tetrametylouroniowych (HBTU), cyjanku dietylofosforylu (DEPCN), dwutlenku 2,5-difenylo-2,3-dihydro-3-okso-4-hydroksytiofenu (reagent Steglicha; HOTDO) i 1,1'-karbonylodiimidazolu (CDI). Reagenty sprzęgania można stosować same albo w kombinacji z dodatkami, takimi jak N,N-dimetylo-4-aminopirydyna (DMAP), N-hydroksy-benzotriazol (HOBt), N-hydroksybenzotriazyna (HOOBt), N-hydroksysukcynimid (HOSu) albo 2-hydroksypirydyna.

Podczas gdy zazwyczaj możliwe jest pomijanie grup ochronnych w enzymatycznych syntezach peptydowych, odwracalna ochrona grup reaktywnych nie biorących udziału w tworzeniu wiązania amidowego jest niezbędna dla obydwu reagentów w syntezie chemicznej. Korzystnie stosuje się trzy konwencjonalne techniki grup ochronnych w chemicznych syntezach peptydowych: technika benzyloksykarbonylowa (Z), ΙΙΙ-rz.butoksykarbonylowa (Boc) i 9-fluorenylometoksykarbonylowa (Fmoc). Identyfikowana jest w każdym przypadku grupa ochronna przy grupie α-aminowej w jednostce przedłużającej łańcuch. Szczegółowe zestawienie grup ochronnych dla aminokwasów podane jest w pozycji Muller, Methoden der organischen Chemie, tom XV/1, str. 20 - 906, wydawnictwo Thieme, Stuttgart, 1974. Jednostki stosowane do zestawiania łańcucha peptydowego można poddawać reakcj i w roztworze, w zawiesinie albo metodą analogiczną do opisanej przez Merrifeilda w J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149. Szczególnie korzystne są sposoby, w których peptydy zestawia się kolejno albo przez sprzęganie fragmentów; stosując techniki grup ochronnych Z, Boc lub Fmoc, przy czymjeden z reagentów w wyżej opisanej technice Merrifieldajest związany z nierozpuszczalnym polimerycznym podłożem (zwanym

178 766 też niżej żywicą). To zazwyczaj sprawia, że peptyd jest zestawiany kolejno z polimerycznym podłożem z zastosowaniem technik grup ochronnych Boc lub Fmoc, przy czym rosnący łańcuch peptydowy wiąże się kowalencyjnie C-końcem z cząsteczkami nierozpuszczalnej żywicy (patrz Fig. 1 i2). Sposób ten umożliwia usuwanie reagentów i produktów ubocznych drogą sączenia i w ten sposób przekrystalizowanie związków pośrednich jest niepotrzebne.

Chronione aminokwasy lub bloki budujące można wiązać z odpowiednimi polimerami, które jedynie muszą być nierozpuszczalne w stosowanych rozpuszczalnikach i muszą mieć trwałą postać fizyczną, która ułatwia sączenie. Polimer musi zawierać grupę funkcyjną, z którą pierwszy chroniony aminokwas może się trwale połączyć wiązaniem kowalencyjnym. Odpowiedni do tego celujest szeroki wachlarz polimerów, takich jak celuloza, alkohol poliwinylowy, polimetakrylan, sulfonowany polistyren, kopolimer chlorometylowanego styrenużdiwinylobenzenu (żywica Memfielda), żywica 4-metylobenzhydryloaminowa (żywica MBHA), żywica fenyloacetamidometylowa (żywica Pam), żywica alkoholu p-benzyloksy-benzylowego, żywica benzhydryloaminowa (żywica BHA), żywica 4-(hydroksymetylo)-benzoiloksymetylowa, żywica Breipohla i innych (Tetrahedron Letters 28(1987) 565; dostarczana przez BACHEM), żywica

4-(2,4-dimetoksyfenyloaminometylo)-fenoksylowa (dostarczana przez Novabiochem) albo żywica o-chlorotrytylowa (dostarczana przez Biohellas).

Odpowiednie do tworzenia wiązania amidowego w roztworze są wszystkie rozpuszczalniki, które są obojętne w warunkach reakcji, zwłaszcza woda, N,N-dimetyloformamid (DMF), sulfotlenek dimetylowy (DMSO), acetonitryl, dichlorometan (DCM), 1,4-dioksan, tetrahydrofuran (THF), N-metylo-2-pirolidon (NMP) i mieszaniny tych rozpuszczalników. Syntezę z podłożem polimerycznym można prowadzić we wszystkich obojętnych rozpuszczalnikach organicznych, w których rozpuszczalne są stosowane pochodne aminokwasów; jednakże korzystne rozpuszczalniki dodatkowo mają właściwości spęczniające żywicę, takie jak DMF, NMP, acetonitryl i DMSO, oraz mieszaniny tych rozpuszczalników. Po zakończeniu syntezy związek oddziela się od polimerycznego podłoża. Warunki, w których możliwe jest oddzielanie różnych typów żywic, opisane sąw literaturze. Najczęściej stosowanymi reakcjami rozszczepiania sąprocesy katalizowane przez kwas i pallad, zwłaszcza rozszczepianie w ciekłym bezwodnym fluorowodorze, w bezwodnym kwasie trifluorometanosulfonowym, w rozcieńczonym lub stężonym kwasie trifluorooctowym, katalizowane palladem rozszczepianie w THF albo w mieszaninach THF-DCM w obecności słabej zasady, takiej jak morfolina, albo rozszczepianie w mieszaninie kwas octowy/dichlorometan/trifluoroetanol. W zależności od wybranych grup ochronnych, pozostają one albo też ulegają odszczepieniu w warunkach rozszczepiania. Częściowe usuwanie grup ochronnych z peptydu może być również opłacalne, gdy mająbyć przeprowadzane pewne reakcje derywatyzacji. Związki dialkilowane przy N-końcu można wytwarzać albo drogą sprzęgania odpowiednich N,N-dialkiloaminokwasów w roztworze albo na podłożu polimerycznym, drogą redukującego alkilowania w roztworze (np. za pomocą NaCNBH₃ w MeOH) albo drogą redukującego alkilowania związanego z żywicą związku w DMF/1% kwasie octowym za pomocą NaCNBH₃ i odpowiednich aldehydów. Związkami z mostkami γ - lub δ-laktamowymi można wytwarzać przez wbudowywanie odpowiednich dipeptydowych jednostek z mostkami laktamowymi (R. Freidinger, J. Org. Chem. (1982) 104 -109) do łańcucha peptydowego. Związki z dipeptydowymi blokami budującymi zawierającymi tiazol, oksazol, tiazolinę lub oksazolinę można wytwarzać przez wbudowywanie odpowiednich jednostek dipeptydowych (U. Schmidt i inni, Synthesis (1987), 233 - 236; P. Jouin i inni, Tetrahedron Letters (1992), 2807 - 2810; P Wipf i inni, Tetrahedron Letters (1992), 907 - 910; W. R. Tully. J. Med. Chem. (1991), 2065; Synthesis (1987), 235; T. Shioiri i inni, J. Org. Chem. (1987), 1252 - 1255; R. Pettit i inni, J. Am. Chem. . Soc. (1989), 5463 65) do łańcucha peptydowego. Budujące bloki o strukturze -NR3-CHB-CHD-CHE-CO- i -NR4-CHG-CHK-CHL-CO- można wytwarzać zgodnie z literaturądrogąreakcji na przykład odpowiednich chronionych aminokwasów aldehydów z odpowiednim środkiem alkilującym, takim jak fosfoniany, ylidy fosforawe, reagent Evansa itp. (S. Shibuya i inni, Heterocycles (1990), 1597 - 1600; M. Braun i inni, Angew. Chemie (1987), 24- 37, Angew. Chem. 1992,104, nr 10; T. Shioiri i inni, Peptide Chemistry 1989, N. Yanaihara (Ed.), 291 - 296; Pettit i inni, J. Am. Chem.

178 766

Soc. 1989,111, 5463; T. Shioiri, Tetrahedron Letters 1991,931 - 934; K. Koga, Tetrahedron Letters 1991,2395 -2398.

Związki według wynalazku można stosować do hamowania lub innego traktowania guzów litych (np. nowotworów płuc, sutka, okrężnicy, gruczołu krokowego, pęcherza, odbytnicy albo nowotworów śluzówki macicy) albo hematologicznych nowotworów złośliwych (np. białaczek, chłoniaków) drogąpodawania związku ssakom. Podawanie można prowadzić dowolnym sposobem, który jest konwencjonalny dla środków farmaceutycznych, zwłaszcza onkologicznych, włączając środki doustne i pozajelitowe, takie jak podskórne, dożylne, domięśniowe i śródotrzewnowe. Związki można podawać same albo w postaci kompozycji farmaceutycznych zawierających związek o wzorze I wraz z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem odpowiednim do żądanej drogi podawania. Takie kompozycje farmaceutyczne mogą być produktami kombinowanymi, to jest mogą również zawierać inne terapeutycznie czynne składniki.

Dawka podawana ssakom powinna zawierać skutecznąhamującąnowotwór ilość substancj i czynnej, która zależy od czynników konwencjonalnych, takichjak biologiczna aktywność danego stosowanego związku; sposób podawania; wiek, stan zdrowia i waga ciała przyjmującego; charakter i rozmiar objawów; częstotliwość traktowania; stosowanie innych terapii, i pożądany skutek. Typowa dawka dzienna wynosi około 5 - 250 miligramów na kilogram wagi ciała przy podawaniu doustnym i około 1 -100 miligramów na kilogram wagi ciała przy podawaniu pozajelitowym.

Odpowiednie postacie do dawkowania zawierają około 10 - 500 miligramów substancji czynnej najednostkę. Tak więc zawartość substancji czynnej wynosi około 1 - 90% wagowych w stosunku do całkowitej wagi kompozycji.

Nowe związki można podawać w postaci konwencjonalnych stałych lub ciekłych form do farmaceutycznego podawania, np. niepowlekane lub powlekane (błoną) tabletki, kapsułki, proszki, granulaty, czopki lub roztwory. Wytwarza się je w sposób konwencjonalny. Substancje czynne przerabia się do tych celów z konwencjonalnymi farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi, takimi jak tabletkowe środki wiążące, wypełniacze, środki konserwujące, środki rozkruszające tabletkę, regulatory przepływu, plastyfikatory, środki zwilżające, dyspergatory, emulgatory, rozpuszczalniki, kompozycje o przedłużonym działaniu, przeciwutleniacze i/lub gazy propelentowe (patrz H.Sucker i inni: Pharmazeutische Technologie, wydawnictwo Thieme, Stuttgart, 1978). Postacie użytkowe otrzymane w ten sposób zawierają zazwyczaj 1 - 90% wagowych substancji czynnej.

Następujące przykłady mają ilustrować wynalazek. Białkotwórcze aminokwasy są skracane w przykładach, stosując znany kod trzyliterowy. Inne oznaczenia: TFA = kwas trifluorooctowy, Ac = kwas octowy, Bu = butyl, Et = etyl, Me = metyl, Bzl = benzyl.

A. Ogólne sposoby postępowania

I. Związki zastrzeżonewoastrz. a syntetyzuje się ajboęapomocąklasycznej syntezy wroztworze z zastosowaniem standardowej metodologii Z i Boc, jak wyżej opisano, albo za pomocą standardowych metod syntezy w fazie stałej albo ręcznie albo za pomocą całkowicie automatycznego syntezatora model 431A firmy APPLIED BIOSYSTEMS. Różne cykle syntezy dla technik grup ochronnych Boc i Fmoc są następujące:

a) Cykl syntezy dla techniki grupy ochronnej Boc

1. 30% kwaa ZrifluoroocCo\zi ^w DCM 1 x 3 min

2. 50% kwaa ZtiiluoroocCoλZi zw DCM 1x1 nim

3. przemywanie DCM 5x1 min

4. 55% diizoproppioeSyioamina w DCM 1x1 mm

5. 550 diieopropyioeSyio^anina w NIM 1 x 1 min

6. ρ^πι^^ε NMP 5x1 mm

7. Dodawane wstę-piue alrtywowiaiego ccron/mego aminokwasu (aktywowanie za pomocą 1 równoważnika DCC i 1 równoważnika HOBt w NMP/DCM); sprzęganie peptydów (część I) 1x30 ϋώ

178 766

8.	Dodawanńe DMSO do 11110^-^07 aż do zawartości
	20% objętościowych DMSO
9.	Sprzęganie peptydu (część II)	1x16 min
10.	Dodawanie 3.8 równośvażnik.ów- diizopropyloe-tylotumny
	do mieszaniny reakcyjnej
11.	peptydów (część III)	1x7 mim
12.	Przemywame DCM	3x1 mni
13.	koow-Oi-ssa nie _jest całkowita, powtórzenńe sprzęgama
	(powrót do 5.)
14.	10% bezwodnika kwasu octowego, 5% diizopropyloetyloaminy
	w DCM	1x2 mm
15.	10% bezwodnik kwasu octowego w DCM	1x4 mm
16.	Przemywanie DCM	4x1 mn
17.	PoowZó dd o i
	BOP-C1 i PyBrop stosuje się jako reagenty do sprzęgania aminokwasów i następnie N-me-

χ 1 min 1x4 min 1x16 min 5x1 min

1.

2.

3.

4.

5.

1x61 mm 3x1 min

6.

7.

8. 9.

10.

1x8 min 3x1 min tyloaminokwasów albo bloków budujących zawierających grupę N-metylową. Czas trwania reakcji wzrasta odpowiednio. W syntezach w roztworze stosowanie odpowiednio albo Boc-aminokwas-NCas (N-karboksy-bezwodniki , N-III-rz.butyloksykarbonylo-aminokwasów) albo Z-aminokwas-NCAs (N-karboksy-bezwodniki N-benzyloksykarbonylo-aminokwasów) jest najbardziej korzystne dla tego typu sprzęgania.

b) Cę^d^l syntezy dla dechniki grupy ochronnej I^;moc

Przemywrune DMF

20% piperydyna w DMF

20°/o ρϊρ^^ιζ^w DMF

Przemjwwune DMF

Dodawanie ws^tt^f^niii aktywoowanego chromonego aminokwasu (aktywowanie za pomocą 1 równoważnika TBTU i 1,5 równoważnika DIPEA w DMF); Sprzęganie peptydu Przemywanie DMF

Jezell konwersja me Iest caakowiia, powtórzeń ńe st^l^r^^<^f^aIma (powrót do 5.)

10% kwas octowy w DMF

Przemywanie DMF

Powót do 2

BOP-Cl i PyBrop stosuje się jako reagenty do sprzęgania aminokwasów i następnie N-metyloaminokwasów albo bloków budujących zawierających grupę N-metylową. Czas trwania reakcji odpowiednio wzrasta.

II. Redukujące alkilowanie N-końca

Od żywicy peptydowej otrzymanej jak w AIa lub AIb usuwa się grupy ochronne przy N-końcu (etapy 2 - 4 w AIb albo 1 - 6 w AIa) i następnie poddaje reakcji z 3-krotnym molowym nadmiarem aldehydu lub ketonem w DMF/1 %o kwasie octowym z dodatkiem 3 równoważników NaCNBH3. Po zakończeniu reakcji (negatywny test Kaisera) żywicę przemywa się kilkakrotnie wodą, izopropanolem, DMF i dichlorometanem.

III. Obróbka żywicy peptydowej otrzymanej jak w Ia i II

Żywicę peptydowąsuszy się pod obniżonym ciśnieniem i przenosi do naczynia reakcyjnego urządzenia TEFLON HF (dostarczonego przez PENINSULA). Dodaje się zmiatacz, korzystnie anizol (1 ml/g żywicy), a w przypadku peptydów zawierających tryptofan - tiol, w celu usunięcia grup indolo-formylowych, korzystnie etanoditiol (0,5 ml/g żywicy), po czym prowadzi się kondensację w fluorowodorze (10 ml/g żywicy), chłodząc za pomocą ciekłego N2. Mieszaninę pozostawia się do ogrzania do temperatury 0°C i miesza w tej temperaturze w ciągu 45 minut. Fluorowodór usuwa się następnie pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałość przemywa

178 766 octanem etylu w celu usunięcia pozostałości zmiatacza. Związek ekstrahuje się za pomocą 30% stężonego kwasu octowego i sacza. a przesącz liofilizuje.

IV. Obróbka żywic peptadowach otrzymanych jak w Ib i II

Żywicę pepto2owa suszy się pod obniżonym ciśnieniem, po czym poddaje jednej z następujących procedur rozszczepiania, w zależności od kompozycji aminokwasowej (Wade, Tregear, Howard Florey Fmoc Workshop Manual, Melbourne 1985).

Warunki rozszczepiania
	TFA	Zmiatacz	Czas trwania reakcji
1	95%	5% H2O	1,5 h
2	95%	5% etanoditiol/anizol (1:3)	1,5 h

Zawiesinę żywicy peptydowej w odpowiedniej mieszaninie TFA miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu ustalonego czasu, po czym żywicę odsącza się i przemywa TFA i DCM. Przesącz i przemywki zatęża się i związek wytrąca się przez dodawanie eteru dietylowego. Po ochłodzeniu w kąpieli lodowej osad odsącza się, roztwarza w 30% kwasie octowym i liofilizuje.

V. Jeżeli stosuje się żywicę o-chlorotIyatylową(dostarczuląprzez Biohellas), zawiesinę żywicy peptydowej w mieszaninie kwas octow-y/triliuoroetanol/dichlorometan/ (1:1:3) miesza się w temperaturze pokojowej w ciągu 1 godziny. Następnie żywicę odsącza się z odsysaniem i dokładnie przemywa roztworem rozszczepiającym. Połączone przesącze zatęża się w próżni i traktuje wodą. Wytrącony osad odsącza się albo odwirowuje, przemywa eterem 2ietylowym i suszy pod obniżonym ciśnieniem.

VI. Oczyszczanie i charakterystyka związków

Oczyszczanie prowadzi się drogą chromatografii żelowej (SEPHADEX G-10, G-15/10% HOAc, SEPHADEX LH20/MeOH) z użyciem lub bez następnie śre2niociśnieniowej chromatografii (faza stacjonarna: HD-SIL C-18, 20 - 45 μ, 100 A; faza ruchoma; gradient z A = 0,1

TEA/MeOH, B = 0,1 % TFA (H2O). Czystość otrzymanego produktu określa się za pomocą analitycznej HPLC (faza stacjonarna: 100 2,1 mm VYDAC C-18, 51, 300 A; faza ruchoma; CH3CN/H2O gradient, buforowany za pomocą 0,1% TFA, 40°C). Charakterystykę prowadzi się za pomo^iąbombardowania szybkimi atomami, spektroskopii masowej i spektroskopii 'H albo ¹³C.

B. Procesy specyficzne

Przykład 1.

N,N-dimetylo-Val-Val-N ch/ch₃/₂

0,4 g chlorowodorku fenyloalaninoamidu (2 mmole) i 0,55 g Boc-N(CH3)-CH[CH(CH3)2]-CH(OCH3)-CH2-COOH (2 mmole), otrzymany zgodnie z literaturą: S. Shibuya i inni, Heterocycles, tom 31/nr 9,1597-1600 (1990) rozpuszcza się w DMF. Po dodaniu 0,4 g DEPCN (2,2 mmoli) i 1,4 ml diizopropyloaminy (DIPEA) mieszaninę reakcyjną miesza się przez noc w temperaturze pokojowej, rozpuszczalnik odparowuje pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałość roztwarza w octanie etylu i dokładnie przemywa 5% wodnym kwasem cytrynowym, wodą, 5%

178 766

NaHCO3 i roztworem NaCl. Warstwę organiczną suszy się nadNa2SO4, sączy i odparowuje do sucha. Pozostałość (0,66 g) suszy się w próżni, usuwa grupy ochronne za pomocą 5 ml TFA/DCM (1:1) w ciągu 2 godzin i odparowuje do sucha. Tak otrzymany fragment bez grup ochronnych rozpuszcza się w DMF i poddaje reakcji z 0,44 g N-kayboksybezwo2nika N-III-rz.butyloksakarbonylo-waliny (1,8 mmoli) w temperaturze 45°C. Miesza się w ciągu 5 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowuje się w próżni, dodaje octan etylu i warstwę organiczną przemywa dokładnie 5% wodnym kwasem cytrynowym, 5%> wodnym NaHCO3, wodą i wodnym NaCl i suszy nad Na2SO4. Rozpuszczalnik odparowuje się pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałość (0,7 g, 1,3 mmoli) traktuje się 5 ml TEA/DCM (1:1) w ciągu 2 godzin. Po odparowaniu mieszaniny rozpuszczalników i wysuszeniu nad KOH pozostałość rozpuszcza się w DMF i 0,19 g N,N-2imetolowalino (1,3 mmoli; otrzymana według literatury: patrz np. R.E. Bowmann, J. Chem. Soc. 1959,1342), dodaje się 0,25 g DEPCN (1,5 mmoli) i 0,7 ml DiPeA. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez noc w temperaturze pokojowej, odparowuje do sucha i chromatografuje na kolumnie SEPHADEX LH-20. Frakcje zawierające produkt gromadzi się i odparowuje rozpuszczalnik, otrzymując 0,46 g związku 1.

Przykład 2.

0,29 g benzyloaminy (2 mmole) i 0,55 g Boc-N(CH3)-CH[CH(CH₃)2]-CH(OCH₃)-CH2-COOH (2 mmole; otrzymany według literatury: S. Shibuya i inni, Heterocycles, tom 31, nr 9,1597-1600 (1990)) rozpuszcza się w DMF. Po dodaniu 0,4 g DEPCN (2,2 mmoli) i 1,4 ml DIPEA mieszaninę reakcyjną miesza się przez noc w temperaturze pokojowej, rozpuszczalnik odparowuje pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałość roztwarza w octanie etylu i dokładnie przemywa 5% wodnym kwasem cytrynowym, wodą, 5% NaHCO₃ i roztworem NaCl. Warstwę organiczną suszy się nad Na2SO4, sączy i odparowuje do sucha. Pozostałość (0,51 g) suszy się w próżni, usuwa grupy ochronne zapomocą5 ml TFA/DCM (1:1) w ciągu 2 godzin i odparowuje do sucha. Tak otrzymany fragment bez grup ochronnych rozpuszcza się w DMF i poddaje reakcji z 0,4 g N-karboksybezwocdnkaN-in-rz.butyloksykarbonylo-waliny (1,6 mmoli) w temperaturze 45°C. Miesza się w ciągu 5 godzin, po czym rozpuszczalnik odparowuje się w próżni, dodaje octan etylu i warstwę organiczną przemywa dokładnie 5% wodnym kwasem cytrynowym, 5% wodnym NaHCO3, wodą i wodnym NaCl i suszy nad Na2SO4. Rozpuszczalnik odparowuje się pod obniżonym ciśnieniem, a pozostałość (0,51 g, 1,1 mmoli) traktuje się 5 ml TFA/DCM (1:1) w ciągu 2 godzin. Po odparowaniu mieszaniny rozpuszczalników i wysuszeniu nad KOH pozostałość rozpuszcza się w DMF i dodaje 0,16 g N,N-dimetylo-waliny (1,1 mmoli), 0,23 g DEPCN (1,4 mmoli) i 0,7 ml DlPEA. Mieszaninę reakcyjną miesza się przez noc w temperaturze pokojowej, odparowuje do sucha i chromatografuje na kolumnie SEPHADEX LH-20. Frakcje zawierające produkt gromadzi się i odparowuje rozpuszczalnik, otrzymując 0,36 g związku 1.

Następujące związki wytwarza się i można wytwarzać według przykładów 1 i 2:

3.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xab
5.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xat
11.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xby
12.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xca
15.	Xaa	Val	Xdm	Xat
25.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xcf

178 766

26.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xao
37.	Xaa	Val	Xda	Xda	Phe	NH2
39.	Xaa	Val	Xdh	Xdh	Phe	NH2
67.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Phe	NH2
68.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Phe	Xcf
69.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Phe	Xao
70.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xad	NH2
71.	Xaa	Val	Xdm	Pro	NH2
72.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xdr	NH2
73.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xcu	NH2
74.	Xav	Val	Xdm	Xcx	Phe	NH2
75.	Xax	Val	Xdm	Xcx	Phe	NH2
76.	Xaa	Val	Xdm	Phe	NH2
77.	Xav	Val	Xdm	Phe	NH2
78.	Xax	Val	Xdm	Phe	NH2
79.	Xas	Val	Xdm	Phe	NH2
80.	Xaa	Val	Xdm	Xab
100.	Xaa	Val	Xar	Pro	NH2

Tabela I

Identyfikacja sekwencji wytwarzanych związków według przykładów 1 i 2

Numer związku	Numer sekwencji ID
3-14, 25-26, 70, 72, 73	1
15-20, 28-29, 36, 38, 55-60, 62-66, 80-81, 95-99, 101-116, 140, 142, 144-148	2
21-22, 131	3
23-24	4
37, 39, 67-69, 74-75, 139	5
34-35, 89-90	6
76-79	7
84, 87	8
71, 100	9

Symbole Xaa... we wzorze sumarycznym mają następujące znaczenie: Xaa: N,N-dimetylowalina

Xab:

— HN CONHCYCHab

178 766

Xad: kwas tetrahydroizochinolinokarboksylowy — NH

CH(CH₃)₂

Xar: — _

OCH₃

Xas: N-metylo-N-izopropylowalina

O

Xat:

— NH 11 S ch(ch₃)₂

Xav: N,N-dietylowalina Xax: N,N-dipropylowalina

Xby:

Xca

-~ΝΚμ

178 766

Xcu: 3-tienyloalanina

Xcv: N-metylo-N-izopropylo-III-rz. leucyna

Xda:

COXdh

CH(CH₃)₂

ch₃

CH(CH₃)₂

Xdm:

—

ĆH₃ oh

COXdr: 3-naftyloalanina

Końcowe -NH2 oznacza, że C-końcowy aminokwas albo blok budujący występuje w postaci amidu.

Związki według wynalazku można testować na działanie przeciwrakowe zapomocąmetod konwencjonalnych, włącznie na przykład z metodami opisanymi poniżej.

A. Metodologia in vitro

Cytotoksyczność można mierzyć, stosując standardową metodologię dla odpowiednich linii komórkowych, taką jak mikrokulturowy test tetrazoliowy (MIT). Szczegóły tego testu są opublikowane (Alley, MC i inni, Cancer Research 48: 589-601, 1988). Wykładnikowo wzrastające kultury komórek nowotworowych, takich jak HT-29 raka okrężnicy albo LX-1 nowotworu płuc stosuje się do sporządzenia hodowli na płytkach do mikromiareczkowania. Komórki posiewa się, stosując 5000 - 20000 komórek na zagłębienie w płytkach o 96 zagłębieniach (w 150 μl pożywki), i pozostawia do wzrastania przez noc w temperaturze 37°C. Dodaje się testowane związki w 10-krotnych rozcieńczeniach zmieniających się od 10'⁴M do 10'^WM. Następnie komórki poddaje się inkubacji w ciągu 48 godzin. W celu określenia liczby zdolnych do życia komórek w każdym zagłębieniu, dodaje się barwnik MTT (50 μl 3 mg/ml roztworu bromku 3-(4.5-dimetylotiazol-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego w solance). Mieszaninę tę poddaje się inkubacji w temperaturze 37°C w ciągu 5 godzin i następnie do każdego zagłębienia dodaje 50 μl 25% SDS, pH 2. Prowadzi się inkubację przez noc, po czym odczytuje absorbancję w każdym zagłębieniu przy 550 nm, stosując czytnik ELISA. Oblicza się średnią^/- SD z danych z repliko178 766 wanych zagłębień, stosując wzór % T/C (% zdolnych do życia traktowanych komórek/próba kontrolna).

OD traktowanie komórek x 100=%T/C

OD komórek kontrolnych Stężenie testowanego związku, który daje T/C wynoszące 50% hamowania wzrostu oznacza się jako IC₅₀.

Związek	IC₅₀
Przykład 1	1 x 10’⁷
Przykład 2	2 x 106

B. Metodologia in vivo

Związki według wynalazku testuje się ponadto za pomocą różnych testów pre-klinicznych na działanie in vivo, które to testy wskazująna użyteczność kliniczną. Testy takie prowadzi się na gołych myszach, którym transplantowano („Ksenografowano”) tkankę nowotworową, korzystnie pochodzenia ludzkiego, w sposób znany w tej dziedzinie. Testowane związki ocenia się na ich skuteczność przeciwnowotworowąpo podaniu myszom poddanym przeszczepieniu.

Bardziej specyficznie, nowotwory ludzkie, które wzrastały w pozbawionych grasicy gołych myszach, przeszczepia się nowym zwierzęcym biorcom, stosując fragmenty nowotworu o wymiarara około o/ mg. Dziei tralrsplantaoji ji/nacaasięjako ozięb 0. W sześe dodzieatęaiu dni później myszy traktuje się testowanym związkiem podawanym jako iniekcja dożylna lub śróddOraewndwa, w grupach 5-10 myszy dla każdej dawki. Związki podaje się w ciągu 5 .dni, 10 dni lub 15 dni, w dawkach 10 -100 mg/kg wagi ciała. Średnicę nowotworu i wagę ciała mierzy się dwa razy w tygodniu. Objętość nowotworu oblicza się, stosuj ąc średnicę mierzoną cyklem Verniera oraz wzór:

(długość x szerokość²) /2 = mg wagi nowotworu)

ŚreOniąwagę nowotworu oblicza się dla każdej traktowanej grup i określa wartości T/C dla każdej grupy w stosunku do nietraktowanych nowotworów kontrolnych.

Claims

Zastrzeżenie patentowe

Nowe peptydy o wzorze I

N-CHX-CO-Val-NR³-CHB-CHD-CH₂-CO- (M) _d-N w którym

R¹ oznacza grupę C^-alkilową R² oznacza grupę C^-alkilową X oznacza grupę Cj ^-alkilową.

R³ oznacza niższą grupę alkilową,

B oznacza grupę Ci.₅-alkilową D oznacza grupę Ci_₅-alkoksylową,

R⁴ oznacza wodór. grupę hydroksylową, benzyloksylową, Ci_₇-alkilową fluoroetylową, difluoroetylową, trifluoroetylową,

R⁵ oznacza wodór, C^-alkil, fenyl, benzyl, pirydyl, pikolil, benzotiazolil, benzoizotiazolil, benzopirazolil, benzoksazoil albo pirymidyl.

M jest wybrane z grupy obejmującej grupę ^^^i^:^i^^^i^^^lo-1-karbonylową, walilową,
2- III-rz.-butyloglicylową, prolilową, hydroksyprolilową, izoleucylową, leucylową, 3-cykloheksyloalanylową fenyloalanylową, tetrahydroizochinolilo-2-karbonylową, 3-tiazoliloalanylową,
3- tienyloalanylową histyhylową 2-an2ioindylo-2Varbonylo\vąl tyrożyłową 3-pir3dyloalanylową, 3-III-yz.butyloalanylową, 2-cykloheksyloghcylowp albo 3-naftyloalanolową;

d oznacza liczbę 0 lub 1, oraz ich sole z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami.

Opisany tu wynalazek dotyczy nowych peptydów i ich pochodnych, które oferują potencjalnie polepszone właściwości terapeutyczne do leczenia chorób nowotworowych w porównaniu z Dolastatin-10. W przeciwieństwie do do^taty^-lO, która musi być mozolnie oczyszczona z rzadkich źródeł naturalnych, związki według wynalazku można dogodnie syntetyzować w sposób opisany szczegółowo poniżej. Ponadto dolastatyna-10 jest nietrwała wobec kwasów. Opisano, że nawet najmniejsze zmiany w strukturze mogąpowodować całkowitą utratę aktywności (Biochemical Pharmacology, tom 40, nr 8, 1859-64, 1990).