CZ286752B6

CZ286752B6 - Peptide and pharmaceutical preparation containing thereof

Info

Publication number: CZ286752B6
Application number: CZ19951575A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Haupt; Bernd Janssen; Kurt Ritter; Dagmar Klinge; Gerhard Keilhauer; Cynthia Romerdahl; Teresa Barlozzari; Xiao-Dong Qian
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 1992-12-16
Filing date: 1993-12-04
Publication date: 2000-06-14
Also published as: EP0674652A1; HUT72067A; HRP931504B1; DE69329425T2; ATE196296T1; AU5695994A; FI952961A0; JPH08504415A; DE69329425D1; WO1994013695A1; FI952961A; PL309353A1; BR1100019A; SG67935A1; IL107987A0; RU2132334C1; RU95115135A; EP0674652B1; IL107987A; HU9501754D0

Description

Peptid a farmaceutický prostředek s jeho obsahem

Oblast techniky

Zde popsaný vynález se týká nových peptidů a farmaceutických prostředků s jejich obsahem, které jsou vhodné k ošetřování neoplastických onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Z odborné a patentové literatury jsou známy sloučeniny, které nacházejí uplatnění při potlačování neoplastických onemocnění. V této souvislosti se poukazuje na článek, který zveřejnil R. Bai a kol., Biochem. Pharmakol. 40(8), 1859-1864 /1990/, E. Giralt a kol., „Peptides 1990“, Escom, Leiden, 1991, str. 104 až 106, R. Bai a kol., Biochem. Pharmakol. 45(7), 1503-1515 /1993/, stejně jako na WO 93/03054-A, EP 0 222 283-A a EP 0 357 332-A.

V citované literatuře jsou popsány účinné látky známé pod označením dolastatin-10, bleomycin, doxorubicin nebo taxol, které byly zavedeny v klinické terapii nádorů.

Vhodnou substancí zjmenovaných látek je dolastatin-10, jehož výraznou nevýhodou je mimořádně vysoká toxicita. Dolastatinu-10 se získává poměrně komplikovaným a náročným postupem (Biochem. Pharmacol. 40, 1859-1864 (1990), obzvláště str. 1860, vpravo nahoře).

V důsledku dolafeninového zbytku se nedaří tuto látku vyrábět s technicky použitelným výtěžkem. Kromě toho dolastatin-10 musí být laboratorně čištěn ze zřídka se vyskytujících přírodních zdrojů. Jeho další nevýhodou je, že je nestabilní vůči kyselinám. Bylo totiž popsáno, že i jen malá změna ve struktuře může být příčinou úplné ztráty aktivity (Biochemical Pharmacology, 40 (8), 1859-1864 /1990/).

Trvá proto poptávka po méně toxických peptidech podobných známých substancím, zejména dolastinu-10, které by byly ve srovnání s ním výhodněji použitelné a daly se vyrobit v technicky použitelném výtěžku.

Cílem tohoto vynálezu je prostřednictvím nových sloučenin rozšířit spektrum možných prostředků.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je peptid obecného vzorce I

R¹ \

N-CHX-CO-A-NR³-CHB-CHD-CHE-CO-(R⁷)_b-M-Q /

R² (I), ve kterém

R¹ znamená alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku nebo fluorethyl,

R² znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo

R'-N-R² dohromady mohou znamenat pyrrolidinový kruh,

- 1 CZ 286752 B6

X představuje alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, cykloalkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, -CH₂-cyklohexyl nebo benzyl,

A je vybrán ze souboru zahrnujícího valylový, isoleucylový, leucylový, allo-isoleucylový, 3terc.-butylalanylový, 2-terc.-butylglycylový, 2-ethylglycylový nebo 2-cyklohexylglycylový zbytek,

R³ znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl,

B představuje alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, cykloalkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, -CH2-cyklohexyl nebo benzyl,

D znamená atom vodíku, hydroxyskupinu, acetoxyskupinu nebo alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku,

E znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku,

R⁷ znamená skupinu vzorce -NR⁴-CHG-CHK-CHL-CO~, kde R⁴ znamená atom vodíku nebo methyl,

G znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, cyklohexyl, -CH₂cyklohexyl nebo benzyl,

K znamená atom vodíku, hydroxyskupinu, acetoxyskupinu nebo alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku,

L znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, nebo

R⁴ a G znamenají dohromady skupinu vzorce -(^2)4-, -(CH2)3- nebo -CH₂CH(OH)CH₂-,

M je zvolen ze souboru zahrnujícího 1-aminopentyl-l-karbonylový, valylový, 2-tercbutylglycylový, prolylový, hydroxypropylový, isoleucylový, leucylový, 3-cyklohexylalanylový, fenylalanylový, tetrahydroisochinolyl-2-karbonylový, 3-thiazolylalanylový, 3thienylalanyl, histidylový, 2-aminoindyl-2-karbonylový, tyrosylový, 3-pyridylalanylový, 3-terc.-butylalanylový, 2-cyklohexylglycylový nebo 3-naftylalanylový zbytek, b představuje nulu nebo číslo 1,

Q představuje hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, fenoxyskupinu, benzyloxyskupinu nebo aminoskupinu vzorce NR⁵R⁶, kde R⁵ znamená atom vodíku, hydroxyskupinu, benzyloxyskupinu, alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku, fluorethyl, difluorethyl nebo trifluorethyl,

R⁶ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku, fenyl, kteiý je popřípadě substituován jedním substituentem zvoleným ze souboru zahrnujícího trifluormethyl, nitroskupinu, atom halogenu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jež může tvořit cyklický systém, nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená benzyl, který je popřípadě substituován jedním substituentem zvoleným ze souboru zahrnujícího trifluormethyl, nitroskupinu, atom halogenu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jež může tvořit cyklický systém, nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená pyridyl,

-2CZ 286752 B6 pikolyl, benzisothiazolyl, benzopyrazolyl, benzoxazolyl, pyrimidyl nebo 5-člennou heteroarylovou skupinu zvolenou ze souboru zahrnujícího skupiny vzorce

nebo

R⁵ a R⁶ dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří arylovou skupinu zvolenou ze souboru zahrnujícího

a jeho soli s fyziologicky přijatelnými kyselinami.

Výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém R‘-N-R²znamená pyrrolidinovou skupinu.

Jinou výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém Q znamená aminoskupinu vzorce R⁵-N-R⁶, kde

R⁵ znamená atom vodíku, hydroxyskupinu, benzyloxyskupinu, alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku, fluorethyl, difluorethyl nebo trifluorethyl,

R⁶ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku, fenyl, který může být substituován jedním substituentem, jímž může být CF₃, nitroskupina, atom halogenu, alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, která může mít formu cyklického systému, alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená benzyl, který může být substituován jedním substituentem, jímž může být CF₃, nitroskupina, atom halogenu, alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, která může mít formu cyklického systému nebo alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená pyridyl, pikolyl, benzisothiazolyl, benzopyrazolyl, benzoxazolyl, pyrimidyl nebo pětičlennou heteroarylovou skupinu definovanou v nároku 1.

Ještě jinou výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém Q znamená aminoskupinu vzorce R⁵-N-R⁶, která tvoří struktury zvolené ze souboru sestávajícího z

-/Ί \__/ \^N

Další výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém b představuje nulu.

Ještě další výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém b představuje nulu, R⁷ znamená skupinu vzorce -NR⁴-CHG-CHK-CHL-CO- a Q představuje fenoxyskupinu, benzyl- oxyskupinu nebo aminoskupinu vzorce NR⁵R⁶.

Ještě jinou výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém b znamená nulu a Q představuje fenoxyskupinu, benzyloxyskupinu nebo aminoskupinu vzorce NR⁵R⁶.

Konečně ještě jinou výhodnou sloučeninou obecného vzorce I je svrchu uvedený peptid, ve kterém b znamená 1 a Q představuje hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku nebo benzyloxyskupinu.

Předmětem tohoto vynálezu je také farmaceutický prostředek k ošetřování neoplastických onemocnění, který obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosnou látku a terapeuticky účinné množství sloučeniny popsané svrchu.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou výhodně odvozeny od L-aminokyselin nebo jejich derivátů, ale mohou být odvozeny od jedné nebo většího počtu D-aminokyselin nebo jejich derivátů.

Zvláště výhodné fyziologicky přijatelné kyseliny jsou kyselina chlorovodíková, kyselina citrónová, kyselina vinná, kyselina mléčná, kyselina fosforečná, kyselina methansulfonová, kyselina octová, kyselina mravenčí, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina jablečná, kyselina jantarová, kyselina malonová, kyselina sírová, kyselina L-glutamová, kyselina Laspartová, kyselina pyrohroznová, kyselina muková, kyselina benzoová, kyselina glukuronová, kyselina oxalová, kyselina askorbová a acetylglycin.

Nové sloučeniny se mohou vyrábět známými způsoby. Tak sloučeniny mohou být sestaveny sekvenčně nebo vázáním vhodných malých fragmentů. Při sekvenčním sestavování, které vychází od uhlíkatého konce peptidového řetězce, se provádí prodloužení po stupních, vždy o jednu aminokyselinu, nebo o stavební blok v každém čase. Při kondenzaci fragmentu je možné vázat dohromady fragmenty o rozdílných délkách a fragmenty naopak se mohou získávat sekvenčním sestavením z aminokyselin nebo stavebních bloků.

Jak při sekvenčním sestavení, tak při fragmentové kopulaci je nezbytné vázat jednotky vytvářející amidovou vazbu. K tomu jsou vhodné enzymatické a chemické způsoby.

Chemické způsoby vytváření amidové vazby podrobně popsal Můller, Methoden der organischen Chemie, sv. XV/2, str. 1 až 364, Thieme Verlag, Stuttgart /1974/, Stewart a Young, Solid Phase Peptide Synthesis, str. 31 až 34 a 71 až 82, Pierce Chemical Company, Rockford /1984/, Bodanszky, Klausner a Ondetti, Peptide Synthesis, str. 85 až 128, John Wiley & Sons, New York /1976/, ajsou také uvedeny v jiných základních pracech týkajících se chemie peptidů. Zvláštní přednost se dává azidové metodě, metodě na bázi symetrického a smíšeného anhydridu, in šitu

-4CZ 286752 B6 generovaným nebo předem připraveným aktivním esterům, použití urethanem chráněných Nkarboxyanhydridů aminokyselin a tvorbě amidové vazby za použití kopulačních činidel, zvláště dicyklohexylcarbodiimidu (DCC), diisopropylkarbodiimidu (DIC), l-ethoxykarbonyl-2ethoxy-l,2-dihydrochinolinu (EEDQ), hydrochloridu l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDCI), anhydridu kyseliny n-propanfosfonové (PPA), N,N-bis(2-oxo-3oxazolidinyl)amidofosfoiylchloridu (BOP-C1), brom-tris-pyrrolidinofosfoniumhexafluorfosfátu (PyBrop), difenylfosforylazidu (DPPA), Castrova reakčního činidla (BOP, PyBop), O-benzotriazolyl-N,N,N',N'-tetramethyluroniových solí (HBTU), diethylfosforylkyanidu (DEPCN), 2,5difenyl-2,3-dihydro-3-oxo—4-hydroxythiofendioxidu (Steglichova reakčního činidla, HOTDO) a l,l'-karbonyldiimidazolu (CDI). Kopulační činidlo se může použít samotné nebo v kombinaci s přísadami, jako je Ν,Ν-dimethyl—4-aminopyridin (DMAP), N-hydroxybenzotriazol (HOBt), N-hydroxybenzotriazin (HOOBt), N-hydroxysukcinimid (HOSu) nebo 2-hydroxypyridin.

I když je obvykle možné netrvat na ochranných skupinách při enzymatické syntéze peptidů, reversibilní ochrana reaktivních skupin nepostihující tvorbu amidové vazby je nezbytná u obou reakčních činidel, použitých pro chemickou syntézu. K chemické syntéze peptidů jsou vhodné tři běžné technické postupy s ochrannou skupinou a to technický způsob využívající benzyloxykarbonylovou (Z) skupinu, terc.-butoxykarbonylovou (Boc) skupinu a 9-fluorenylmethoxykarbonylovou (Fmoc) skupinu. Identifikována v každém případě je chránící skupina na aaminoskupině jednotky s prodlužovaným řetězcem. Podrobný přehled skupinu chránících aminokyseliny udává Miiller, Methoden der organischen Chemie, sv. XV/1, str. 20 až 906, Thieme Verlag, Stuttgart /1974/. Jednotky použité pro vytvoření peptidového řetězce se mohou nechat reagovat v roztoku, suspenzi nebo způsobem podobným způsobu, který popsal Merrifield v J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 /1963/. Zvláště výhodné jsou takové způsoby, při kterých dochází k sestavení peptidů postupně nebo fragmentovou kopulací za využití technického postupu používajícího chránící skupinu benzyloxykarbonylovou (Z), terc.-butoxykarbonylovou (Boc) nebo 9-fluorenylmethoxykarbonylovou (Fmoc), s jedním z reakčních činidel vhodných za použití Merrifieldova technického postupu, při kterém se vázání provádí na nerozpustný polymemí základ (který se zde dále také označuje jako pryskyřice). To obvykle má za následek peptid, který je sestaven sekvenčně na polymemím základu za využití technického postupu používajícího chránící skupinu terc.-butoxykarbonylovou (Boc) nebo 9-fluorenylmethoxykarbonylovou (Fmoc), přičemž rostoucí peptidový řetězec je kovalentně vázán na uhlíkatém konci k částicím nerozpustné pryskyřice (srov. obr. 1 a 2). Tento postup umožňuje odstranit reakční činidla a vedlejší produkty filtrací a tak rekiystalizace meziproduktů je nadbytečná.

Chráněné aminokyseliny nebo stavební bloky se mohou vázat na libovolné vhodné polymery, které toliko mají být nerozpustné v použitých rozpouštědlech a mají mít vhodnou fyzikální formu, která usnadňuje filtraci. Polymer musí obsahovat funkční skupinu, ke které se nejprve chráněná aminokyselina může pevně připojit kovalentní vazbou. K tomuto účelu jsou vhodné široce různorodé polymery, například celulóza, polyvinylalkohol, polymethakrylát, sulfonovaný polystyren, kopolymer chlormethylovaného styrenu a divinylbenzenu (Merrifieldova pryskyřice), 4-methylbenzhydrylaminová pryskyřice (MBHA-pryskyřice), fenylacetamidomethylová pryskyřice (Pam-pryskyřice), p-benzyloxybenzylalkoholová pryskyřice, benzhydrylaminová pryskyřice (BHA-pryskyřice), 4-(hydroxymethyl)benzoyloxymethylová pryskyřice, pryskyřice, kterou popsal Breipohl a kol. (Tetrahedron Letters 28, 565 /1987/, dodává BACHEM), 4-(2,4dimethoxyfenylaminomethyl)fenoxylová pryskyřice (dodává Novabiochem) nebo ochlortritylová pryskyřice (dodává Biohellas).

Pro vytvoření amidové vazby v roztoku jsou vhodná všechna rozpouštědla, která jsou inertní za reakčních podmínek, zvláště voda, Ν,Ν-dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), acetonitril, dichlormethan (DCM), 1,4-dioxan, tetrahydrofuran (THF), N-methyl-2-pyrrolidon (NMP) a směsi těchto rozpouštědel. Syntéza na polymemím nosiči se může provádět ve všech inertních organických rozpouštědlech, ve kterých použité deriváty aminokyselin jsou rozpustné,

-5CZ 286752 B6 avšak výhodná rozpouštědla mají kromě toho vlastnosti způsobující nabotnání pryskyřice. Vhodným rozpouštědlem je například Ν,Ν-dimethylformamid, dichlormethan, N-methyl-2pyrrolidon, acetonitril nebo dimethylsulfoxid a směsi těchto rozpouštědel. Poté co je syntéza ukončena, peptid se odštěpí od polymemího základu. Podmínky, za kterých je možné dosáhnout odštěpení od různých typů pryskyřice, jsou uvedeny v literatuře. Ke štěpícím reakcím se nejběžněji používá štěpení katalyzované kyselinou a palladiem, zvláště štěpení v kapalném bezvodném fluorovodíku, v bezvodé kyselině trifluormethansulfonové, ve zředěné nebo koncentrované kyselině trifluoroctové, štěpení katalyzované palladiem v tetrahydrofuranu nebo směsi tetrahydrofuranu a dichlormethanu v přítomnosti slabé báze, jako je morfolin nebo štěpení ve směsi kyseliny octové, dichlormethanu a trifluorethanolu. V závislosti na zvolených chránících skupinách, se tyto skupiny mohou zachovat nebo podobně odštěpit za štěpících podmínek. Parciální odstranění chránících skupin může být také užitečné, pokud se mají také provést určité derivatizační reakce. Sloučeniny dialkylované na dusíkatém konci se mohou vyrobit buď kopulací vhodných N,N—dialkylaminokyselin v roztoku nebo na polymemím základu nebo reduktivní alkylací v roztoku (například natriumkyanborhydridem v methanolu) nebo reduktivní alkylací sloučeniny vázané na pryskyřici v 1% kyselině octové v dimethylformamidu s natriumkyanborhydridem a příslušnými aldehydy. Sloučeniny s τ- nebo δlaktamovými můstky se mohou vyrobit zavedením vhodných laktamových můstkových dipeptidových jednotek (R. Freidinger, J. Org. Chem., 104-109 /1982/) do peptidového řetězce. Sloučeniny s bloky tvořícími dipeptid, které obsahují zbytek thiazolidu, oxazolu, thiazolinu nebo oxazolinu, se mohou vyrobit zavedením příslušných dipeptidových jednotek (U. Schmidt a kol., Synthesis, 233-236 /1978/, P. Jouin a kol., Tetrahedron Letters, 2807-2810 /1992/, P. Wipf a kol., Tetrahedron Letters, 907-910 /1992/, W. R. Tully, J. Med. Chem. 2065 /1991/, Synthesis 235 /1987/, T. Shioiri a kol., J. Org. Chem., 1252-1255 /1987/, R. Pettit a kol., J. Am. Chem. Soc., 5463-5465 /1989/) do peptidového řetězce. Stavební bloky obsahující strukturu -NR³CHB-CHD-CHE-CO a -NR⁴-CHG-CHK-CHL-CO- se mohou vyrobit podle literatury reakcí například odpovídajících chráněných aldehydů aminokyselin s vhodnými alkylačními látkami jako fosfonáty, ylidy obsahujícími fosfor, Evansovým reakčním činidlem a podobně (S. Shibuya a kol., Heterocycles, 1597-1600 /1990/, M. Braun a kol., Angew. Chem., 24-37 /1987/, Angew. Chem., 10.104 /1992/, T. Shioiri a kol., Peptide Chemistry /1989/. N. Yanaihara (vyd.) 291-296, Pettit a kol., J. Am. Chem. Soc., 111, 5463 /1989/, T. Shioiri a kol., J. Org. Chem., 931-934 /1987/ a K. Koga, Tetrahedron Letters 2395-2397 /1991/).

Využitelnost

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou používat k inhibici nebo jinému ošetření tuhých nádorů (například tumorů plic, prsu, tračníku, prostaty, močového měchýře, konečníku nebo děložních nádorů) nebo hematologického zhoubného bujení (například leukémie, lymfomasy) podáváním sloučeniny savci. Podávání se může provádět libovolným způsobem, který je obvyklý pro farmaceutické prostředky, výhodně prostředky používané v onkologii, včetně orálních a parenterálních prostředků, jako subkutánně, intravenózně, intramuskulámě a intraperitoneálně. Sloučeniny se mohou podávat samotné nebo ve formě farmaceutických prostředků, které obsahují sloučeninu obecného vzorce I dohromady s farmaceuticky přijatelnou nosnou látkou vhodnou pro požadovanou cestu podání. Takové farmaceutické prostředky mohou být kombinovanými produkty, to znamená, že mohou také obsahovat jiné terapeuticky účinné složky.

Dávka určená k podání savci bude obsahovat účinné množství aktivní látky inhibující nádor, které bude záviset na obvyklých okolnostech, včetně biologické aktivity jednotlivé použité sloučeniny, způsobu podání, věku, zdravotnímu stavu a tělesné hmotnosti pacienta, povaze a rozsahu příznaků, četnosti ošetřování, podávání jiných terapeuticky účinných látek a požadovaném účinku. Obvyklá denní dávka bude přibližně od 5 až do 250 mg na kilogram tělesné

-6CZ 286752 B6 hmotnosti při orálním podání a přibližně od 1 do 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti při parenterálním podání.

Vhodné dávkové formy obsahují přibližně od 10 až do 500 mg účinné látky na jednotku. Účinná látka tak bude tvořit přibližně od 1 do 90 % hmotnosti, vztaženo na celkovou hmotnost prostředku.

Nové sloučeniny se mohou podávat v obvyklých pevných nebo kapalných formách pro farmaceutické podávání, například nepovlečených nebo (filmem) povlečených tabletách, kapslích, prášcích, granulích, čípcích nebo roztocích. Tyto prostředky se vyrábějí obvyklým způsobem. Účinná látka se může k tomuto účelu zpracovat s obvyklými farmaceutickými pomocnými látkami, jako jsou pojivá pro tablety, plniva, konzervační látky, látky způsobující rozpad tablet, regulátory tekutosti, plastifíkátory, smáčedla, dispergační činidla, emulgátory, rozpouštědla, složky způsobující uvolňování, antioxidační prostředky a/nebo vynášecí plyny (srov. H. Sucker a kol., Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart /1978/). Formy pro podání, získané tímto způsobem, obvykle obsahují od 1 do 90 % hmotnostních účinné látky.

Příklady provedení vynálezu

Dále uvedené příklady jsou zamýšleny k ilustraci vynálezu. Proteinogenní aminokyseliny se v některých případech v příkladech zkracují za použití známých třípísmenových kódů. V některých případech se také používá zkratek, které mají tyto významy:

TFA = kyselina trifluoroctová, Ac = kyselina octová, Bu = butyl, Et = ethyl, Me = methyl a Bzl = benzyl.

A. Obecné postupy

I.

Peptidy nárokované v patentovém nároku 1 jsou buď vyrobeny synteticky klasickou syntézou v roztoku za použití standardní Z- a Boc-metodologie jak je popsáno výše nebo standardními způsoby syntézy v tuhé fázi na zcela automatickém syntetizéru, model 431 A, který dodává firma Applied Biosystems. Aparát používá rozdílných syntetických cyklů pro technický postup využívající Boc a Fmoc chránící skupinu.

a) Syntetický cyklus pro techniku s Boc chránící skupinou

1. 2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

30% kyselina trifluoroctová v DCM 50% kyselina trifluoroctová v DCM promývání DCM

5% diisopropylethylamin v DCM 5% diisopropylethylamin v NMP promývání NMP adice předaktivované chráněné aminokyseliny (aktivace 1 ekvivalentem

DCC a 1 ekvivalentem HOBt v NMP/DCM), peptidová kopulace (první část) adice DMSO na reakční směs až obsahuje 20 % objemových DMSO peptidová kopulace (druhá část) adice 3,8 ekvivalentů diisopropylethylaminu na reakční směs x 3 minuty x 1 minuta 5x1 minuta x 1 minuta lxl minuta 5 x 1 minuta

1x30 minut

1x16 minut

11. peptidová kopulace (třetí část)

12. promývání DCM

13. pokud je konverze neúplná, opakuje se kopulace (zpět na 5)

14. 10% anhydrid kyseliny octové,

5% diisopropylethylamin v DCM

15. 10% anhydrid kyseliny octové v DCM

16. promývání DCM

17. zpět na 1.

x 7 minut x 2 minuty

1x4 minuty

4x1 minuta

BOP-C1 a PyBrop se používají jako reakční činidla pro kopulaci aminokyseliny a poté Nmethylaminokyseliny. Reakční doby se odpovídajícím způsobem zvyšují. V roztoku pro syntézu je nejvýhodnější pro tento typ kopulace použití buď Boc-chráněné NCAs aminokyseliny (anhydridu kyseliny N-terc.-butyloxykarbonylamino-N-karboxylové) nebo Z-chráněné NCAs aminokyseliny (anhydridu kyseliny N-benzyloxykarbonylamino-N-karboxylové).

b) Syntetický cyklus pro techniku s Fmoc chránící skupinou

1.	DMF promývání	1 x 1 minuta
2.	20% piperidin v DMF	1 x 4 minuty
3.	20% piperidin v DMF	1x16 minut
4.	DMF promývání	5 x 1 minuta
5.	adice předaktivované chráněné aminokyseliny (aktivace 1 ekvivalentem TBTU a 1,5 ekvivalentu DIPEA v DMF), peptidová kopulace	1x61 minuta
6.	promývání DCM	3 x 1 minuta
7.	pokud je konverze neúplná, opakuje se kopulace (zpět na 5)
8.	10% anhydrid kyseliny octové v DMF	1 x 8 minut
9.	promývání DCM	3 x 1 minuta
10.	zpět na 2.

BOP-C1 a PyBrop se používají jako reakční činidla pro kopulaci aminokyseliny a potom Nmethylaminokyseliny nebo stavebních bloků obsahujících N-methylovou skupinu. Reakční doby se odpovídajícím způsobem zvyšují.

Π. Reduktivní alkylace dusíkaté koncové skupiny

Peptid vázaný na pryskyřici, vyrobený jako v příkladu Ala nebo Alb, se zbaví chránící skupiny na dusíkaté koncové skupině (stupně 2 až 4 v případě Alb nebo stupně 1 až 6 v případě Ala) a poté se nechá reagovat s trojnásobným molámím přebytkem aldehydu nebo ketonu v Ν,Νdimethylformamidu, který obsahuje 1 % kyseliny octové, s přídavkem 3 ekvivalentů natriumkyanborhydridu. Poté co je reakce úplná (podle negativního Kaiserova testu), pryskyřice se několikrát promyje vodou, isopropanolem, Ν,Ν-dimethylformamidem a dichlormethanem.

III. Zpracování peptidu vázaného na pryskyřici, získaného jako v příkladu Ia a II

Peptid vázaný na pryskyřici se vysuší za sníženého tlaku a přenese do reakční nádoby zařízení TEFLON HF (dodává firma Peninsula). Poté se přidá zachycovací činidlo, výhodně anisol (1 ml/g pryskyřice), a v případě thiolových peptidů obsahujících tryptofan, k odstranění indolformylové skupiny se výhodně přidá ethandiol (v množství 0,5 ml/g pryskyřice), potom se provede kondenzace ve fluorovodíku (v množství 10 mg/g pryskyřice), za chlazení kapalným dusíkem. Směs se nechá ohřát na teplotu 0 °C a míchá se při této teplotě po dobu 45 minut.

-8CZ 286752 B6

Stripováním za sníženého tlaku se potom odstraní fluorovodík a odparek se promyje ethylacetátem, k odstranění zbývajícího zachycovacího činidla. Sloučenina se extrahuje 30% kyselinou octovou a filtruje a filtrát se potom lyofilizuje.

IV. Zpracování peptidu vázaného na pryskyřice, získaného jako v příkladu lb a II

Peptid vázaný na pryskyřici se vysuší za sníženého tlaku a potom se podrobí jednomu z dále uvedených způsobů štěpení, v závislosti na složení aminokyseliny (Wade, Tregear a Howard Florey, Fmoc Workshop Manual, Melboume /1985/).

Podmínky štěpení

	kyselina trifluoroctová	zachycovací činidlo	reakční doba
1	95%	5% H₂O	1,5 h
2	95%	5% ethandithiol/	1,5 h
		anisol (1:3)

Suspenze peptidu vázaného na pryskyřici v příslušné směsi kyseliny trifluoroctové se míchá za teploty místnosti po uvedenou dobu a poté se pryskyřice odfiltruje a promyje kyselinou trifluoroctovou a dichlormethanem. Filtrát a promývací kapalina se odpaří a peptid se vysráží přídavkem diethyletheru. Po ochlazení na ledové lázni se sraženina odfiltruje, vyjme 30% kyselinou octovou a lyofilizuje.

V.

Pokud se použije o-chlortritylované pryskyřice (dodává forma Biohellas), suspenze peptidu vázaného na pryskyřici se míchá ve směsi kyseliny octové, trifluorethanolu a dichlormethanu v poměru 1:1:3 za teploty místnosti po dobu 1 hodiny. Pryskyřice se potom odfiltruje za odsávání a důkladně promyje roztokem použitým ke štěpení. Spojené filtráty se odpaří za sníženého tlaku a uvedou do styku s vodou. Vysrážená tuhá látka se odfiltruje nebo odstředí, promyje diethyletherem a vysuší za sníženého tlaku.

VI. Čištění a charakterizace sloučenin

Čištění se provádí gelovou chromatografíi (Sephadex G-10, G-15 s 10% kyselinou octovou, Sephadex LH20 s methanolem) s nebo bez následující středotlaké chromatografie (stacionární fáze: HD-SIL C-18, 0,341 až 0,833 mm, 1000 nm, mobilní fáze: gradient s A = 0,1% kyselinou trifluoroctovou v methanolu, s B = 0,1% kyselinou trifluoroctovou ve vodě). Čistota výsledných produktů se stanovuje analyticky vysokotlakou kapalinovou chromatografíi (stacionární fáze: 100 2,1 mm Vydac C-18, 5 litrů, 3000 nm, mobilní fáze: gradient acetonitrilu a vody, pufrováno 0,1% kyselinou trifluoroctovou, teplota 40 °C). Charakterizace se provádí hmotnostní spektroskopií využívající techniky rychlého bombardování atomů a *H nebo ¹³C spektroskopií.

-9CZ 286752 B6

B. Jednotlivé postupy

Příklad 1

0,4 g (2 mmol) hydrochloridu fenylalaninamidu a 0,55 (2 mmol) Boc-N(CH₃)-CH[CH(CH₃)₂]CH(OCH₃)-CH2-COOH (syntetizován podle literatuiy, viz S. Shibuya a kol., Heterocycles 31(9), 1597-1600 /1990/) se rozpustí v dimethylformamidu. Po přidání 0,4 g (2,2 mmol) DEPCN a 1,4 ml diisopropylaminu (DIPEA) se reakční směs míchá za teploty místnosti přes noc, rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku, odparek se vyjme ethylacetátem a důkladně promyje 5% vodnou kyselinou citrónovou, vodou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří dosucha. Odparek o hmotnosti 0,66 g se vysuší za sníženého tlaku, zbaví chránící skupiny pomocí 5 ml kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu v poměru 1:1 během 2 hodin a odpaří za sníženého tlaku. Takto získaný fragment zbavený chránící skupiny se rozpustí v dimethylformamidu a nechá reagovat s 0,44 g (1,8 mmol) N-terc.-butoxykarbonyl-valin-N-karboxyanhydridu za teploty 45 °C. Vše se míchá po dobu 5 hodin a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku, k odparku se přidá ethylacetát a organická vrstva se důkladně promyje 5% vodnou kyselinou citrónovou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a vodným roztokem chloridu sodného a organická vrstva se vysuší síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a odparek o hmotnosti 0,7 g (1,3 mmol) se zpracuje s 5 ml kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu v poměru 1:1 během 2 hodin. Po odpaření směsi rozpouštědel se odparek vysuší hydroxidem draselným. Získaný odparek se rozpustí v dimethylformamidu a 0,19 g (1,3 mmol) Ν,Ν-dimethylvalinu (syntetizován podle literatury, viz například R. E. Bowman, J. Chem. Soc. 1342, /1959/ a přidá 0,25 (1,5 mmol) DEPCN a 0,7 ml DIPEA. Reakční směs se míchá přes noc za teploty místnosti, odpaří dosucha a chromatografuje na koloně naplněné Sephadexem LH-20. Frakce vyprodukované látky se zachytí a rozpouštědlo odpaří. Tak se dostane 0,46 g sloučeniny 1.

Příklad 2

N,N-Dimethyl-Val- VaP-N

CH(CH₃)2

0,29 g (2 mmol) benzylaminu a 0,55 g Boc-N(CH₃)-CH[CH(CH₃)₂]-CH(OCH₃)-CH₂-COOH (syntetizován podle literatury, viz S. Shibuya a kol., Heterocycles 31(9), 1597-1600 /1990/) se rozpustí v dimethylformamidu. Po přidání 0,4 g (2,2 mmol) DEPCN a 1,4 ml DIPEA se reakční směs míchá za teploty místnosti přes noc, rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku, odparek se

-10CZ 286752 B6 vyjme ethylacetátem a důkladně promyje 5% vodnou kyselinou citrónovou, vodou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší síranem sodným, filtruje a odpaří dosucha. Odparek o hmotnosti 0,51 g se vysuší za sníženého tlaku, zbaví chránící skupiny působením 5 ml kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu v poměru 1:1 během 2 hodin a odpaří za sníženého tlaku. Takto získaný fragment zbavený chránící skupiny se rozpustí v dimethylformamidu a nechá reagovat s 0,4 g (1,6 mmol) N-terc.-butyloxykarbonylvalin-N-karboxyanhydridu za teploty 45 °C. Vše se míchá po dobu 5 hodin, rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku, k odparku se přidá ethylacetát a organická vrstva se důkladně promyje 5% vodnou kyselinou citrónovou, 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a vodným roztokem chloridu sodného a potom vysuší síranem sodným. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a odparek o hmotnosti 0,51 g (1,1 mmol) se zpracuje s 5 ml kyseliny trifluoroctové a dichlormethanu v poměru 1:1 během 2 hodin. Po odpaření směsi rozpouštědel a vysušení odparku hydroxidem draselným se odparek rozpustí v dimethylformamidu a ke vzniklému roztoku se přidá 0,16 g (1,1 mmol) N,N-dimethylvalinu, 0,23 g (1,4 mmol) DEPCN a 0,7 ml DIPEA. Reakční směs se míchá přes noc za teploty místnosti, odpaří dosucha a chromatografuje na koloně Sephadexu LH-20. Frakce vyprodukované látky se zachytí a rozpouštědlo odpaří. Dostane se 0,36 g sloučeniny 1.

Dále uvedené sloučeniny se mohou vyrobit podle příkladů 1 a 2.

3.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xab
4.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xac
5.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xat
6.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xbp
7.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xbt
8.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xbu
9.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xbv
10.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xbw
11.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xby
12.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xca
13.	Xaa	Val	Xdh	Xcx	Xbq
14.	Xaa	Val	Xdh	Xcx	Xbs
15.	Xaa	Val	Xdm	Xat
16.	Xaa	Val	Xdm	Xbp
17.	Xav	Val	Xdm	Xbq
18.	Xav	Val	Xdm	Xbs
19.	Xbo	Val	Xdm	Xbt
20.	Xbo	Val	Xdm	Xbu
21.	Xaa	Xaf	Xdm	Xbv
22.	Xaa	Xaf	Xdm	Xbw
23.	Xav	Leu	Xdm	Xby
24.	Xaa	Leu	Xdm	Xca
25.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xcf
26.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xao
27.	Xax	Val	Xdm	nh₂
28.	Xax	Val	Xdm	Xcf
29.	Xax	Val	Xdm	Xao
30.	Xaa	Xdm	nh₂
31.	Xax	Xdm	nh₂
32.	Xaa	Xdm	Xcf
33.	Xax	Xdm	Xcf
34.	Xaa	Xdm	Phe	Xcf
35.	Xax	Xdm	Phe	Xcf

-11CZ 286752 B6

36.	Xaa	Val	Xda	Xda	nh₂
37.	Xaa	Val	Xda	Xda	Phe	nh₂
38.	Xaa	Val	Xdh	Xdh	nh₂
39.	Xaa	Val	Xdh	Xdh	Phe	nh₂
40.	Xaa	Val	Xda	nh₂
41.	Xaa	Val	Xdb	nh₂
42.	Xaa	Val	Xdc	nh₂
43.	Xaa	Val	Xdd	nh₂
44.	Xaa	Val	Xde	nh₂
45.	Xaa	Val	Xdf	nh₂
46.	Xaa	Val	Xdg	nh₂
47.	Xaa	Val	Xdh	nh₂
48.	Xaa	Val	Xdi	nh₂
49.	Xaa	Val	Xdk	nh₂
50.	Xaa	Val	Xdl	nh₂
51.	Xaa	Val	Xdn	nh₂
52.	Xaa	Val	Xdo	nh₂
53.	Xaa	Val	Xdp	nh₂
54.	Xaa	Val	Xdq	nh₂
55.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	nh₂
56.	Xaa	Val	Xdm	Xcy	nh₂
57.	Xaa	Val	Xdm	Xcz	nh₂
58.	Xaa	Val	Xdm	Xds	nh₂
59.	Xaa	Val	Xdm	Xcw	nh₂
60.	Xaa	Val	Xdm	Xda	nh₂
61.	Xaa	Val	Xar	nh₂
62.	Xaa	Val	Xdm	Xdc	nh₂
63.	Xaa	Val	Xdm	Xbf	nh₂
64.	Xaa	Val	Xdm	Xbg	nh₂
65.	Xaa	Val	Xdm	Xck
66.	Xaa	Val	Xdm	Xcl
67.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Phe	nh₂
68.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Phe	Xcf
69.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Phe	Xao
70.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xad	nh₂
71.	Xaa	Val	Xdm	Pro	nh₂
72.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xdr	nh₂
73.	Xaa	Val	Xdm	Xcx	Xcu	nh₂
74.	Xav	Val	Xdm	Xcx	Phe	nh₂
75.	Xax	Val	Xdm	Xcx	Phe	nh₂
76.	Xaa	Val	Xdm	Phe	nh₂
77.	Xav	Val	Xdm	Phe	nh₂
78.	Xax	Val	Xdm	Phe	nh₂
79.	Xas	Val	Xdm	Phe	nh₂
80.	Xaa	Val	Xdm	Xab
81.	Xaa	Val	Xdm	Xac
82.	Xbh	Xdm	nh₂
83.	Xbi	Xdm	Xcx	nh₂
84.	Xbk	Xdm	Xcx	Phe	nh₂
85.	Xbh	Xdh	nh₂
86.	Xbm	Xdh	Xcx	nh₂
87.	Xbn	Xdh	Xcx	Phe	nh₂

-12CZ 286752 B6

88.	Xaa	Xdm	Phe	nh₂
89.	Xas	Xdm	Phe	Xao
90.	Xav	Xdm	Phe	Xcf
91.	Xax	Xdm	Phe	nh₂
92.	Xaa	Val	Xdm	OH
93.	Xaa	Val	Xdm	OBzl
94.	Xaa	Val	Xdm	nh₂
95.	Xaa	Val	Xdm	Xan
96.	Xaa	Val	Xdm	Xao
97.	Xaa	Val	Xdm	Xap
98.	Xaa	Val	Xdm	Xau
99.	Xaa	Val	Xdm	Xaq
100.	Xaa	Val	Xar	Pro
101.	Xaa	Val	Xdm	Xbz
102.	Xaa	Val	Xdm	Xcb
103.	Xaa	Val	Xdm	Xcc
104.	Xaa	Val	Xdm	Xcd
105.	Xaa	Val	Xdm	Xce
106.	Xaa	Val	Xdm	Xcf
107.	Xaa	Val	Xdm	Xcg
108.	Xaa	Val	Xdm	Xch
109.	Xaa	Val	Xdm	Xci
110.	Xaa	Val	Xdm	Xcm
111.	Xaa	Val	Xdm	Xcn
112.	Xaa	Val	Xdm	Xco
113.	Xaa	Val	Xdm	Xcp
114.	Xaa	Val	Xdm	Xcq
115.	Xaa	Val	Xdm	Xcr
116.	Xaa	Val	Xdm	Xao
117.	Xag	Val	Xdm	nh₂
118.	Xah	Val	Xdm	nh₂
119.	Xag	Val	Xdm	nh₂
120.	Xai	Val	Xdm	nh₂
121.	Xak	Xaf	Xdm	nh₂
122.	Xal	Xaf	Xdm	nh₂
123.	Xam	Xaf	Xdm	nh₂
124.	Xas	Xaf	Xdm	nh₂
125.	Xav	Xaf	Xdm	nh₂
126.	Xaw	Val	Xdm	nh₂
127.	Xax	Val	Xdm	nh₂
128.	Xay	Val	Xdm	nh₂
129.	Xaz	Val	Xdm	nh₂
130.	Xba	Xaf	Xdm	Xcf
131.	Xbb	Xaf	Xdm	Xcf
132.	Xbc	Val	Xdm	nh₂
133.	Xbd	Val	Xdm	nh₂
134.	Xbe	Val	Xdm	nh₂
135.	Xbo	Xaf	Xdm	nh₂
136.	Xcs	Xaf	Xdm	nh₂
137.	Xct	Val	Xdm	nh₂
138.	Xcv	Val	Xdm	nh₂
139.	Xaa	Val	Xdt	Xcx

NH₂

-13CZ 286752 B6

140.	Xaa	Val	Xdt	Xcx
141.	Xaa	Val	Xdt	nh₂
142.	Xaa	Val	Xdu	Xcx
143.	Xaa	Val	Xdu	nh₂
144.	Xdv	Val	Xdm	Xcf
145.	Xdw	Val	Xdm	Xcf
146.	Xdx	Val	Xdm	Xcf
147.	Xaa	Val	Xar	Xae
148.	Xaa	Val	Xar	Xdy

Tabulka I

Identifikace sekvencí sloučenin vyrobených podle příkladů 1 a 2

Sloučenina číslo	Identifikační číslo sekvence
3-14, 25-26, 70, 72, 73	1
15-20, 28-29,36,38, 55-60, 62-66, 80-81, 95-99, 101-116, 140, 142, 144-148	2
21-22, 131	3
23-24	4
37, 39, 67-69, 74-75, 139	5
34-35, 89-90	6
76-79	7
84, 87	8
71,100	9

-14CZ 286752 B6

Symboly Xaa ... v souhrnu mají tyto významy:

Xaa: N/N-dimethylvalin

Xad: kyselina tetrahydroisochinolinkarboxylová

Xaf: terc.-leucin nebo 2-terc.-butylglycin

Xag: N,N-dimethylisoleucin

Xah: N,N-dimethylleucin

Xai: Ν,Ν-dimethyl-terc.-leucin

Xak: N-amidinovalin

Xal: N-acetyl-N-methylvalin

Xam: N-methyl-N-benzylvalin

Xan:

-15CZ 286752 B6

Xas; N-methyl-N-isopropylvalin

O

NH s ^F

N-n f

Xav: N_fN-diethylvalin

Xaw: N-fluorethylvalin

Xax: N,N-dipropylvalin

Xay: N-cyklopropylvalin

-16CZ 286752 B6

Xba:

Xbe:

Xaz:

CH(CH₃)₂

Xbbí

CH(CH₃)₂

Xbc:

Xbd:

CH(CH₃)₂

-17CZ 286752 B6

Xbk:

Xbl:

Xbf:

Xbg:

Xbh:

Xbi:

r )

ch₃

CH

•V coXbm:

CHj ch₃ ch₃ \/^N r¹CH,

ch₃

-18CZ 286752 B6

Xbo:

Xbp:

Xbq:

Xbs;

COOEt

Xbní

Xbr:

-19CZ 286752 B6

Xbt:

Xbu:

Xbv:

Xbw:

Xbx:

CH(CH₃)₂

-20CZ 286752 B6

Xcb:

Xby:

Xbz:

Xca:

Xcc:

Xcd:

Xce:

Xcf:

n-n — NH ^S

-21CZ 286752 B6

Xcg:

Xch;

Xci:

Xck:

Xcl:

Xcm:

Xcn:

Xco:

-22CZ 286752 B6

Xcp:

Xcq:

Xcr:

Xcs: N-ureylvalin

Xct: N,N-diinethylfenylalanin

Xcu: 3-thíenylalanin

Xcv: N-uiethyl-N-isopropyl-terc. -leucin

-23CZ 286752 B6

Xcw:

Xcx:

Xcz:

Xda:

Xdb:

Xdc:

CH₃ 'CO-

Xdd:

( OH ch₃

-24CZ 286752 B6

Xde:

— N čh₃ (CH₃)₂CH _CIÍ3

OH coXdf:

(CH₃)₃C

Xdg:

CH(CH₃)₂

Xdh:

CH(CH₃)₂ —- CO— čh₃

Xdi:

(ch₃)₃c

Xdk:

CHÍCHah

coch₃

-25CZ 286752 B6

Xdm:

Xdn:

Xdo:

Xdp:

Xdl:

CH(CH₃)₂

CH₃ OH

COcích₃)₃

CH₃ OH

COCH(CH₃)₂

—- N CO—

CH₃ OH

COXdq:

CH(CH₃)₂ —jy^Y^coČH₃ OC(CH₃)₃

-26CZ 286752 B6

Xdr: 3-naftylalanin

Xds:

Xdt:

ČH₃

Xdu:

—N

CH₅

Xdv: N-methylaminosulfonylvalin

Xdw: N-me thy 1 -N-ine thy 1 sul f ony lva 1 in

Xdx: N-laktyl-N-methylvalin

Xdy:

Koncová aminoskupina (-NH₂) znamená, že uhlíkaté zakončení aminokyseliny nebo stavebního blokuje ve formě amidu.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu se mohou zkoušet na protirakovinovou aktivitu obvyklými způsoby včetně například metod popsaných dále.

A. Metodologie in vitro

Cytotoxicita se může měřit za použití standardní metodologie pro adherentní buněčné linie, jako tetrazoliovým testem mikrokultury (MTT). Detaily této zkoušky publikoval M. C. Alley a kol. v Cancer Research 48, 589-601 /1988/. Exponenciálně rostoucí kultury nádorových buněk, jako tračníkový karcinom HT-29 nebo plicní nádor LX-1, se použijí k přípravě kultivační 15 mikrotitrační plotny. Buňky se vloží v počtu 5000 až 20 000 buněk na jamku do plotny s 96 jamkami (ve 150 μΐ prostředí) a nechají růst za teploty 37 °C přes noc. Poté se přidá testovaná sloučenina při desetinásobném ředění, které se mění od 10^ do 10“¹⁰ mol. Buňky se potom inkubují po dobu 48 hodin. Ke stanovení počtu životaschopných buněk v každé jamce se přidá barvivo MTT (50 μΐ z 3 mg/ml roztoku 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl

-27CZ 286752 B6 tetrazoliumbromidu ve fyziologickém roztoku). Tato směs se inkubuje za teploty 37 °C po dobu 5 hodin a potom se do každé jamky přidá 50 μΐ 25% SDS, při hodnotě pH 2. Vše se inkubuje přes noc a potom se odečte absorbance každé jamky při vlnové délce 550 nm, za použití vyhodnocovacího zařízení ELISA. Spočítají se střední hodnoty a ± směrodatné odchylky z replikovaných jamek, za použití vzorce % T/C (% životaschopných buněk u ošetřeného a kontrolního vzorku):

OD ošetřených buněk

--------------------x 100 = % T/C

OD kontrolních buněk

Koncentrace testovaných sloučenin, které poskytují poměr T/C odpovídající 50 % inhibice růstu se označují jako IC₅₀.

B. Metodologie in vivo

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být dále testovány při libovolném z různých předklinických testů pro stanovení aktivity in vivo, které jsou indikativní pro stanovení klinické použitelnosti. Takové testy se provádějí na holých myších, kterým byla transplantována nádorová tkáň, s výhodou lidského původu (došlo k zavedení xenoimplantátu), jako jsou dobře známy v této oblasti. Testované sloučeniny se hodnotí na svou protinádorovou účinnost po podání myším se zavedením xenoimplantátem.

Uvedeno přesněji, lidské nádory, které rostly myším (athymic nudě mice), se transplantují novým zvířecím příjemcům, za použití nádorových fragmentů o hmotnosti přibližně 50 mg. Den transplantace se označí jako den 0. O 6 až 10 dnů později se myši ošetří testovanými sloučeninami podávanými jako intravenózní nebo intraperitoneální injekce, při skupině 5 až 10 myší pro každou dávku. Sloučeniny se podávají denně po dobu 5 dnů, 10 dnů nebo 15 dnů, v dávce od 10 do 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti. Průměr nádoru a tělesná hmotnost se stanovují dvakrát týdně. Objemy nádorů se vypočítají za použití průměrů změřených Vemierovými kalipery podle vzorce (délka x šířka²)/2 = hmotnost nádoru v mg

Pro každou ošetřenou skupinu se vypočítá střední hmotnost nádoru a pro každou skupinu se také určí hodnoty T/C, vzhledem k neošetřeným kontrolním nádorům.

SEKVENČNÍ ZÁZNAM

1) OBECNÉ INFORMACE:

i) PŘIHLAŠOVATEL:

A) BASF Aktiengesellschaft

B) ULICE: Carl-Bosch-Strasse 38

C) MĚSTO: Ludwigshafen

E) ZEMĚ: Spolková republika Německo

F) PSČ: D-67056

G) TELEFON: 0621/6048526

H) TELEFAX: 0621/6043123

I) DÁLNOPIS: 1762175170 ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Nové peptidy, způsob jejich výroby a jejich použití

-28CZ 286752 B6 iii) POČET SEKVENCÍ: 9 iv) FORMA DOSTUPNÉHO POČÍTAČE:

A) TYP MÉDIA: Disketa

B) POČÍTAČ: IBM PC-kompatibilní

C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DPS

D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze # 1.25 (EPO)

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 1 (sekv. ID čís. 1):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 5 aminokyselin

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 1:

Xaa Val Xaa Xaa Xaa

5

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 2 (sekv. ID čís. 2):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 5 aminokyselin

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 2:

Xaa Val Xaa Xaa Xaa

5

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 3 (sekv. ID čís. 3):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 4 aminokyseliny

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 3:

Xaa Xaa Xaa Xaa

-29CZ 286752 B6

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 4 (sekv. ID čís. 4):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 4 aminokyseliny

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 4:

Xaa Leu Xaa Xaa

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 5 (sekv. ID čís. 5):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 5 aminokyselin

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 5:

Xaa Val Xaa XaaPhe

5

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 6 (sekv. ID čís. 6):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 4 aminokyseliny

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 6:

Xaa Xaa Phe Xaa

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 7 (sekv. ID čís. 7):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 4 aminokyseliny

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid

-30CZ 286752 B6 xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 7:

Xaa Val Xaa Phe

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 8 (sekv. ID čís. 8):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 4 aminokyseliny

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 8:

Xaa Xaa Xaa Phe

2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍ ČÍSLO 9 (sekv. ID čís. 9):

i) SEKVENČNÍ CHARAKTERISTIKA:

A) DÉLKA: 4 aminokyseliny

B) TYP: aminokyselina

C) SVINUTELNOST: jednoduchá

D) TOPOLOGIE: lineární ii) TYP MOLEKULY: peptid xi) POPIS SEKVENCE: Sekv. ID čís. 9:

Xaa Val Xaa Pro

Claims

1. Peptid obecného vzorce I

R¹ \

N-CHX-CO-A-NR^HB-CHD-CHE-COARÝ-M-Q / (I),

R² ve kterém

R¹ znamená alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku nebo fluorethyl,

-31CZ 286752 B6

R² znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo

R'-N-R² dohromady mohou znamenat pyrrolidinový kruh,

X představuje alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, cykloalkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, -CHr-cyklohexyl nebo benzyl,

R³ znamená atom vodíku, methyl nebo ethyl,

B představuje alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, cykloalkylovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, -CH₂-cyklohexyl nebo benzyl,

E znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku,

R⁷ znamená skupinu vzorce -NR⁴-CHG-CHK-CHL-CO-, kde R⁴ znamená atom vodíku nebo methyl,

L znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, nebo

R⁴ a G znamenají dohromady skupinu vzorce -(CH₂)₄-, -(CH₂)₃- nebo -CífyCH(OH)CH₂M je zvolen ze souboru zahrnujícího 1-aminopentyl-l-karbonylový, valylový, 2-tercbutylglycylový, propylový, hydroxypropylový, isoleucylový, leucylový, 3-cyklohexyIalanylový, fenylalanylový, tetrahydroisochinolyl-2-karbonylový, 3-thiazolylalanylový, 3thienylalanyl, histidylový, 2-aminoindyl-2-karbonylový, tyrosylový, 3-pyridylalanylový, 3-terc.-butylalanylový, 2-cyklohexylglycylový nebo 3-naftylalanylový zbytek, b představuje nulu nebo číslo 1,

R⁶ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku, fenyl, který je popřípadě substituován jedním substituentem zvoleným ze souboru zahrnujícího trifluormethyl, nitroskupinu, atom halogenu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jež může tvořit cyklický systém, nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená benzyl, který je

-32CZ 286752 B6 popřípadě substituován jedním substituentem zvoleným ze souboru zahrnujícího trifluormethyl, nitroskupinu, atom halogenu, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, jež může tvořit cyklický systém, nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená pyridyl, pikolyl, benzisothiazolyl, benzopyrazolyl, benzoxazolyl, pyrimidyl nebo 5-člennou heteroarylovou skupinu zvolenou ze souboru zahrnujícího skupiny vzorce nebo

R⁵ a R⁶ dohromady s atomem dusíku, ke kterému jsou připojeny, tvoří aiylovou skupinu zvolenou ze souboru zahrnujícího a jeho soli s fyziologicky přijatelnými kyselinami.

2. Sloučenina obecného vzorce I, podle nároku 1, kde R^!-N-R² znamená pyrrolidinovou skupinu.

3. Sloučenina obecného vzorce I, podle nároku 1, kde Q znamená aminoskupinu vzorce R⁵-N-R⁶, kde

R⁶ znamená atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 7 atomy uhlíku, fenyl, který může být substituován jedním substituentem, jímž může být CF₃, nitroskupina, atom halogenu, alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, která může mít formu cyklického systému, alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená benzyl, který může být substituován jedním substituentem, jímž může být CF₃, nitroskupina, atom halogenu, alkylová skupina

-33CZ 286752 B6 s 1 až 4 atomy uhlíku, která může mít formu cyklického systému nebo alkoxyskupina s 1 až 4 atomy uhlíku, dále znamená pyridyl, pikolyl, benzisothiazolyl, benzopyrazolyl, benzoxazolyl, pyrimidyl nebo pětičlennou heteroarylovou skupinu definovanou v nároku 1.

4. Sloučeniny obecného vzorce I, podle nároku 1, kde Q znamená aminoskupinu vzorce R⁵-N-R⁶, která tvoří struktury zvolené ze souboru sestávajícího z

-

5. Sloučenina obecného vzorce I, podle nároku 1, kde b představuje nulu.

6. Sloučenina obecného vzorce I, podle nároku 1, kde b představuje nulu, R⁷ znamená skupinu vzorce -NR⁴-CHG-CHK-CHL-CO- a Q představuje fenoxyskupinu, benzyloxyskupinu nebo aminoskupinu vzorce NR⁵R⁶.

7. Sloučenina obecného vzorce I, podle nároku 1, kde b znamená nulu a Q představuje fenoxyskupinu, benzyloxyskupinu nebo aminoskupinu vzorce NR⁵R⁶.

8. Sloučenina obecného vzorce I, podle nároku 1, kde b znamená 1 a Q představuje hydroxyskupinu, alkoxyskupinu s 1 až 5 atomy uhlíku nebo benzyloxyskupinu.

9. Farmaceutický prostředek k ošetřování neoplastických onemocnění, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelnou nosnou látku a terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 1.