PL177809B1 - Enzym unieruchomiony na nośniku, sposób prowadzenia enzymatycznej syntezy w obecności enzymu unieruchomionego na nośniku i sposób poprawienia aktywności objętościowej enzymu unieruchomionego na nośniku - Google Patents

Abstract

1. Enzym unieruchomiony na nosniku, wybrany z grupy skladajacej sie z amidazy penicylinowej G (E.C. 3.5.1.11), acylazy glutarylo-7-ACA i oksydazy D-aminokwasowej (E.C. 1.4.3.3), który jest unieruchomiony przez kowalencyjne wiazanie na aminofunkcyjnym organosiloksanopolimerze jako nosniku. PL PL PL

Description

Prredmiatnm wuealarDu -ą eerymy ukieruchamiaen ea kaśeiDu, wyZraen r grupy -Dładającej -ię r amidary peeicylieowej G, azylaru glutarylo-7-ACA i oD-ydaru D-amieaDwa-owej, -po-ób prnwadrneia ekromatycreej -yeenry w aZeckaści tego eerymu orar -po-ób poprawiema aDtywknści objętościowej i -eaZilknśzi nnrumów ueienuchamiakyzh ea kaśeiDu.

Biala8icrkin aDtywke -ub-takcje, ep. ^^όο, można ukienuchnmić ea -tałych nośniDach ra pomocą -reregu metod, Dtóre opi-ano w wielu maka8rafiach i puZliDazjach, patrr ea prryDład „Charazteriratiae of Ιοου^Ε^ Biacaealy-t-” Buchholr, K., (wydawca), DECHEMA Moeograph- er 1724-1731, tom 84 (1979), ”Prnteik ImmaZiliratiak - Fukdamektal- aed Applizatiae-” Taylor R.F. (wydawca), Marcel DeDDer, Iec. (1991). OboD nieDnnweDzjakaleyzh tnzhkiD unieruchamiania, jaD ea prraDład aZ-arpcji, włącreeia, miDnaDap-ułDawania, zhnlatyracji orar agregacji, dla ra-ta-awakia prremy-ławnga rZaZyła uweakin, rwła-rcra Daewalnezyjee metody ueinruchamiakia.

JaDo kaśkiDi do ukienuchnmiekia Zinlagicrkie aDtywkych -uZ-eakzji ream -ą ranówea argaeicrke jaD też kieargakizree materiały ea barie -yktetycrkej i katuraleej. Knwaleezojen ukinnuchamineie białeD ea eośniDach ea-tępuje ea ogół prrer prryłącrekin białeD do eaśeiDa popreer rnaDtywee łańzuzhy bazrke ich amikoDwa-ów. Z reguły wymagaża je-t do tego chemizrea aDtowacja kośk/Da albo/i białDa. Chemia prrołązreeia je-t prry tym u-talaża DażZnrarnwa prrer raZwaj białDa orar ra-to-owaeą matrycę oośkiDa. Na pod-tawie całDiem rkacroych różkic w drugarrędawyzh, trreciarrędnwych i crwartorrędowych -truDtur białeD ra-adkizra kie daje -ię prrepowiedrieć -Dłaekaśzi -pecyficrkych kośk/Dów dla -pncyfizreych eerymów.

Dla więD-mści Dnmercyjnych rabtn-nwań do unieruchomieeia biologicrnie aDeyweyzh -uZ-eaezji rZaZyły -obie ureaein argaeicren nośeiDi, do Dtórych można wproWadrić całO -rereg reaDtywnych grup. PrryDłady -tanowią tu naturalne polimeru, jaD ea prraDład pazhadnn poli-azharydów i -eruDeuralke białDa orar -yntetycrne wielDnzrą-encrDawn -ub-tancje na barie

177 809 polistyrenu albo poliakrylanu. Te organiczne nośniki dają się aktywować powszechnie stosowanymi chemicznymi sposobami albo już dysponują reaktywnymi grupami, które pozwalają na przyłączenie z przeznaczonym do unieruchomienia białkiem. Te organiczne nośniki wykazują jednakże jeszcze pewne niedokładności, które ograniczają ich przydatność. I tak, naturalne pochodne polisacharydów często są wrażliwe wobec mikrobiologicznego rozkładu (celuloza), posiadają niekorzystne właściwości cząstek (celuloza, włókna o różnej długości) oraz złe właściwości mechaniczne albo pęcznienia.

Syntetyczne materiały z reguły są niewrażliwe wobec ataku mikrobiologicznego, wykazująjednak inne niedogodności.

Nośniki na bazie poliakryloamidu, które najczęściej stosuje się we współunieruchomieniu białko-monomer, zbudowane są z potencjalnie rakotwórczych monomerów (akryloamid) i wykazują silne pęcznienie wodnych układów. Poliakrylany, polimetakrylany, hydroksyalkilometakrylany oraz polimetakryloamidy można wytwarzać w drodze polimeryzacji odpowiednich monomerów z odpowiednimi środkami sieciującymi i są częściowo dostępne w handlu. Zwłaszcza w wyniku zastosowania glicydylopochodnych przy kopolimeryzacji albo dodatkowych modyfikacjach można z tymi materiałami wytwarzać już aktywne nośniki, np. Eupergit, Biosynth. Te nośniki wykazują względnie silne pęcznienie i w przypadku unieruchomienia enzymów osiąga się często tylko małe aktywności objętościowe, przez co stosowanie tych nośników przy enzymatycznych reakcjach syntezy jest mniej przydatne.

Nieorganiczne nośniki wykazują niejednokrotnie korzystniejsze właściwości mechaniczne, termiczną stabilność, odporność wobec organicznych rozpuszczalników i mikrobiologicznego ataku niż organiczne nośniki. Przykłady nieorganicznych nośników stanowią materiały mineralne, jak na przykład bentonit atapulgit, ziemia okrzemkowa. Często wykazują one szeroki rozdział wielkości porów. Nieporowate materiały, jak metale albo tlenki metali mają z reguły tylko małe powierzchnie wiązania i z tego względu na ogół są nieodpowiednie do unieruchamiania biologicznych substancji. Można wprawdzie wytwarzać szkło o kontrolowanych porach (Controlled Pore Glass /CPG/) z określonymi wielkościami porów i powierzchniami wiązania, jednak już w umiarkowanych alkalicznych warunkach (pH > 8) jest ono niestabilne. Wszystkie wymienione dotychczas nieorganiczne materiały przed właściwą reakcją łączenia muszą być nadto w odpowiedni sposób wstępnie obrabiane i przeprowadzone w aktywną pochodną. To przeprowadzanie w pochodne jest często względnie trudne z powodu obojętnego charakteru nośników. Najczęściej następuje tu powlekanie nośnika przez silanowanie. Wówczas przeznaczone do unieruchomienia białko po zfunkcjonalizowaniu nośnika zostaje na ogół kowalencyjnie połączone z 3-aminopropyloetoksysilanem, jednak w ten sposób otrzymuje się na ogół tylko nieduże wydajności łączenia.

Znane jest użycie organofunkcjonalizowanych polisiloksanów jako nośników enzymów, patrz np. Poster nr 518 i 519, DECHEMA-Tagung der Biotechnologen 1992; Poster 5.218 DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen 1993. Opisano tam, że organofunkcyjne polisiloksany, zwłaszcza aminofunkcyjne polisiloksany, można stosować jako nośniki do unieruchomienia enzymów inwertazy, laktazy i oksydazy glukozowej. Dla tych enzymów opisano dużą pojemność i efektywność wiązania oraz zwiększoną stabilność. Nie ujawniono zwiększenia aktywności objętościowej unieruchomionych enzymów na innych nośnikach.

Enzymy amidazę penicylinową G, acylazę glutarylo-7-ACA i oksydazę D-aminokwasową stosuje się do przemysłowego wytwarzania modyfikowanych antybiotyków penicylinowych i cefalosporynowych. Oksydaza D-aminokwasowa i acylaza glutarylo-7-ACA katalizują dwuetapową enzymatyczną reakcję cefalosporyny-C albo jej pochodnych i soli do kwasu

7-amino-cefalosporanowego (7-ACA) albo jego pochodnych, patrz opisy patentowe EP-B-O 211 033, EP-A-O 409 521. Amidaza penicylinowa G katalizuje syntezę cefalotyny z 7-ACA i kwasu tienylooctowego.

Przy przeprowadzaniu tych powyższych reakcji w skali przemysłowej stosuje się wymienione enzymy najczęściej w unieruchomionej postaci. Opis patentowy EP-B-O 211 033 podaje na przykład wzbogacenie oksydazy D-aminokwasowej z mikroorganizmu Trigonopsis

177 809 variabilis i unieruchomienie tego enzymu na CNBr-aktywowanej Sepharos’ie, przy czym otrzymuje się aktywność objętościową wynoszącą 7 U/ml nośnika.

Opis patentowy EP-A-O 492 495 ujawnia unieruchamianie oksydazy D-aminokwasowej na kopolimerze składającym się głównie z jednostek octanu winylu i/lub alkoholu winylowego i jednostek środka sieciującego. Otrzymuje się aktywność objętościową wynoszącą 32 U/g wilgotnego nośnika. Unieruchomiony enzym jest stabilny w temperaturze 30°C przez 6 miesięcy. W przypadku zastosowania innych stałych nośników (CNBr-aktywowanej Sepharos’y^(R\ Vinylosepharos’y i Eupergit’u R) ) ofrzymuj e się mniejsze aktywności bbjętościowe i stabilności.

Opis patentowy EP-A-O 496 993 podaje unieruchamianie oksydazy D-aminokwasowej z Rhodotorula gracilis oraz acylazy glutarylo-7-ACA z Acinetobacter species, którą wytworzono w przekształconych komórkach E.coli, na szeregu stałych nośników, np. silnie zasadowych żywicach polistyrenowych o czwartorzędowej aminofuncyjności, jak na przykład Amberlite^R IFA900, słabo zasadowych żywicach polistyrenowych o pierwszorzędnwjj aminofunaczjności, jak na przykład Duolite⁽R) A365, średniozasadowych poliaondeniacyjnych żywicach fenolowoformaldjhydowych z drugorzędowymi i trzeciorzędowymi aminofunaczjnościami, jak na przykład Duolite^ A568 albo Duolite^ A7. Dla oksydazy D-aminnawasowej opisano aktywność objętościową wynoszącą do najwyżej 75 U/g wilgotnego nośnika (epoksydo-funkcyjny Eupergit^R C). Dla acylazy glutarylo-7-ACA opisano najwyższą aktywność objętościową wynoszącą 41 U/g wilgotnego nośnika (epoksydo-funkcyjny Eupergit⁽R) C).

Opis patentowy WO90/12110 ujawnia unieruchomienie oksydazy D-aminokwasowej i acylazy glutarylo-7-ACA na tworzywie kompleksowym tlenek arzjmu-pnchlichlorea winylu w postaci płyty, które, można przeprowadzić w pochodne polietylenoiminą i aldehydem glutarowym. Nie opisano zwiększenia aktywności objętościowej w porównaniu z innymi nośnikami.

W literaturze Wood i współpracownicy (J. Biotech. 13 (1990), 305-314) oraz Cobbs i współpracownicy (Bintechnologz Techniques, tom 4, nr 1 (1990), 5-10) opisano unieruchamianie oksydazy D-aminokwasowej na stałym nośniku za pomocą tritunkcyjnej azyrydyny. Nie opisano zwiększenia aktywności objętościowej przez ten sposób unieruchomienia w porównaniu z innymi nośnikami.

Literatura Szwajcer-Dey i współpracownicy (Appl. Biochem. Biotech. 27 (1991), 239-250) podaje unieruchomienie oksydazy D-aminokwasowej z Trigonopsis variabilis na cząstkach tlenków metali oraz na CNB^aktywowanej Sepharos’ie. Opisano unieruchomienie 23 mg oksydazy D-aminokwasowej na gram wilgotnej Sepharos’y. Nie ujawniono zwiększenia aktywności objętościowej przez zastosowanie jako nośnika cząstek tlenku metalu.

Zadaniem omawianego wynalazku było zatem opracowanie nowych enzymów unieruchomionych na nośniku, wybranych z grupy obejmującej amidazę penicylinową G, acylazę glutarylo-7-ACA i oksydazę D-aminokwasową, które wobec znanych enzymów unieruchomionych na nośniku wykazują zwiększoną aktywność objętościową albo/i stabilność. Dalsze zadanie wynalazku polega na opracowaniu jednorodnego układu nośników dla trzech wymienionych enzymów, w wyniku czego upraszcza się znaczenie jednoczesne użycie tych enzymów w reaktorach syntez enzymatycznych.

Zadanie to rozwiązano według wynalazku przez opracowanie enzymu unieruchomionego na nośniku, wybranego z grupy obejmującej amidazę penicylinową G (E.C. 3.5.1.11), acylazę glutarylo-7-ACA i oksydazę D-aminokwasową (E.C. 1.4.3.3), który zostaje unieruchomiony przez kowalencyjne wiązanie na aminofunkcyjnym nośniku organosiloksanopnlimjrycznzm.

Pojęcie „aminofunkcyjny organosiloasanopolimer” według omawianego wynalazku obejmuje pnlimjrzczne związku, w których atomy krzemu i ewentualnie atomy tytanu, cyrkonu albo/i glinu połączone są przez atomy tlenku, a wolne wartościowości tych atomów metali są wysy^ne organicznymi rodnikami, które zawierają zdolne do aktywowania grupy aminowe.

177 809

Grupy aminowe są korzystnie pierwszorzędowymi grupami aminowymi. Tego rodzaju aminofunkcyjne organosiloksany są dostępne w handlu, np. firmy DEGUSSA AG, Frankfurt, Republika Federalna Niemiec, pod nazwą DELOXAN^(R). Skład i wytwarzanie korzystnych aminofunkcyjnych organosiloksanów podano na przykład w opisach patentowych DE-OS 31 20 214, DE-OS 38 37 418, DE-OS 39 25 359 i DE-OS 39 25 360, powołując się przy tym na ich ujawnienie.

Przykłady odpowiednich funkcyjnych grup aminowych na organosiloksanopolimerach stanowią na przykład -NH₂, -RNH₂, -NH-R-NH₂ albo -R-(NH-R)^_n-NH₂, przy czy, R i R' oznaczają ewentualnie niezależnie od siebie liniowa albo rozgałęziona grupę alkilenowąo 1-10 atomach węgla, grupę cykloalkilenową o 5-8 atomach węgla albo liniową lub rozgałęzioną grupę alkilenową, która zawiera jednostkę cykloheksylenową albo fenylenową. Szczególnie korzystnymi przykładami funkcyjnych grup aminowych są -NH2. -NH(CH2)2-NH2, -(CH2)₃-NH2 albo -(CH2)2-NH-(CH2)2-NH-(CH2)2-NH2.

Postać względnie kształt aminofunkcyjnego nośnika mogą być w zasadzie dowolne. Jednak korzystne są nośniki w postaci cząstek o odpowiedniej wielkości, które z jednej strony wykazują dużą powierzchnię właściwą i z drugiej strony stwarzają dobrą możliwość manipulowania nimi. Korzystny przeciętny zakres średnicy cząstek wynosi 0,01-3 mm. Zasadniczo korzystny jest nośnik w postaci kulek. Wytwarzanie kulistych aminofunkcyjnych organosiloksanopolimerów podano w wyżej wymienionych opisach patentowych DE-OS 39 25 359 i DE-OS 39 25 360, powołując się przy tym na ich ujawnienie. Korzystna jest średnia wielkość cząstek nośnika wynosząca 0,05-1 mm, a szczególnie korzystna 0,1-0,4 mm. Najczęściej korzystna jest dla amidazy penicylinowej G średnia wielkość cząstek wynosząca 0,1-0,3 mm, a dla acylazy glutarylo-7-ACA i oksydazy D-aminokwasowej 0,2-0,4 mm.

Pojemność, to znaczy liczba grup aminowych aminofunkcyjnego nośnika zastosowanego do unieruchomienia enzymów, wynosi korzystnie 0,5-5 mmol/g nośnika, szczególnie korzystnie 1-4 mmol/g nośnika.

Do unieruchomienia enzymów na aminofunkcyjnych nośnikach można stosować różne metody znane ze stanu techniki. Metody te obejmują ogólnie biorąc aktywowanie grup aminowych znajdujących się na nośniku za pomocą odczynnika aktywującego. Aktywowane grupy na nośniku mogą następnie reagować z reaktywnymi grupami enzymu, zwłaszcza z grupami aminowymi w bocznym łańcuchu. W ten sposób otrzymuje się enzymy unieruchomione na nośniku, które nieoczekiwanie wykazują zwiększoną aktywność objętościową wobec innych nośników.

Przez reakcję z tiofosgenem względnie diizotiocyjanianem, 1,4-fenylenu można grupę aminową nośnika przeprowadzić w reaktywną grupę izotiocyjanianową. W wyniku reakcji nośnika z dibezwodnikami, na przykład bezwodnikiem kwasu bursztynowego, można wprowadzić funkcje karboksylowe, które można przeprowadzić w reaktywne chlorki kwasowe i estry, na przykład N-hydroksysukcynoimidoestry. Ponadto aktywowanie grupy aminowej na nośniku można przeprowadzać na drodze reakcji z chlorotriazynami, np. z chlorkiem cyjanurowym. Dalszym przykładem aktywowania jest reakcja pierwszorzędowych grup aminowych na nośniku z chlorkiem 4-nitrobenzoilu i diazowanie aromatycznej grupy aminowej i/albo przeprowadzenie w odpowiednią hydrazynę. Grupy aminowe można również aktywować przez wprowadzenie reaktywnych grup epoksydowych w wyniku reakcji z bis-epoksydami, na przykład 1,4-butanodiolodiglicydyloeterem, albo epichlorohydryną. Szczegóły tych i innych metod opisano np. w „Covalent and Coordination Immobilization of Proteins, Cabral J.M.S., Kennedy, J.F., in Protein Immobilization, Fundamentals and Application (Taylor R.F. wydawca) Marcel Dekker Inc., 1991.

Aktywowanie grup aminowych na nośniku przeprowadza się jednak korzystnie przez reakcję z dialdehydami, np. z dialdehydem glutarowym. Ta metoda jest szczególnie łatwa do przeprowadzenia również w wodnym środowisku. Dzięki temu można uniknąć stosowania toksycznych związków i rozpuszczalników organicznych.

177 809

Po aktywowaniu grup aminowych na nośniku następuje unieruchomienie enzymu przez kontaktowanie aktywnego nośnika z enzymem w odpowiednich warunkach. Następnie można wysycić reaktywne grupy nośnika, które nie uległy reakcji. W przypadku nośnika aktywowanego aldehydem wysycenie można prowadzić np. etanoloaminą.

W jednej z postaci wykonania omawiany wynalazek dotyczy unieruchomionej na nośniku amidazy penicylinowej G. Amidaza penicylinowa G jest enzymem, który można otrzymać z całego szeregu różnych gatunków bakterii oraz niektórych grzybów i drożdży, korzystnie z E.coli. Stosunek wagowy amidazy penicylinowej G do nośnika wynosi korzystnie w zakresie 2-200 mg białka na gram wilgotnego nośnika, szczególnie korzystnie 40-80 mg białka na gram wilgotnego nośnika. W przypadku zgodnego z wynalazkiem unieruchomienia amidazy penicylinowej G na aminofunkcyjnych organosiloksanopolimerach można osiągnąć na przykład właściwe aktywności objętościowe wynoszące więcej niż 100 U/g wilgotnego nośnika, a zwłaszcza więcej niż 125 U/g wilgotnego nośnika. Właściwa aktywność objętościowa wynosi korzystnie 100-300 U/g wilgotnego nośnika, a szczególnie korzystnie 125-275 U/g wilgotnego nośnika. Jednostka ”U” dla amidazy penicylinowej G określana jest jako ilość enzymu, która hydrolizuje 1 (imol penicyliny G na minutę w warunkach standardowych (5% penicyliny G, 0,6 mmola/l fosforanu potasu jako buforu pH 8,0; 28°C).

Dalsza postać wykonania omawianego wynalazku dotyczy unieruchomionej na nośniku acylazy glutarylo-7-ACA. Acylazę glutarylo-7-ACA można otrzymać np. z Acinetobacter spp. albo z komórek E.coli przekształconych genem acylazy glutarylo-7-ACA, porównaj opis patentowy EP-A-O 496 993. W przypadku unieruchomionej na nośniku acylazy glutarylo-7-ACA stosunek wagowy enzymu do nośnika wynosi korzystnie 10-110 mg białka na gram wilgotnego nośnika, a szczególnie korzystnie 20-70 mg białka na gram wilgotnego nośnika. Właściwa aktywność objętościowa unieruchomionej według wynalazku acylazy glutarylo-7-ACA może wynosić więcej niż 100 U/g wilgotnego nośnika, a zwłaszcza więcej niż 125 U/g wilgotnego nośnika. Właściwa aktywność objętościowa unieruchomionej na nośniku acylazy glutarylo-7-ACA wynosi korzystnie 100-250 U/g wilgotnego nośnika, a szczególnie korzystnie 125-200 U/g wilgotnego nośnika. Jednostka ”U” dla acylazy glutarylo-7-ACA określona jest jako ilość enzymu, która hydrolizuje 1 pmol kwasu 7P-(4-karboksybutanoamido)-cefalosporanowego (glutarylo-7-ACA) na minutę w warunkach standardowych (2% G1-7-ACA., 5 mmoli/l fosforanu potasu jako buforu pH 8,0; 37°C).

Jeszcze dalszą postać wykonania omawianego wynalazku dotyczy unieruchomionej na nośniku oksydazy D-aminokwasowej. Stosunek wagowy unieruchomionej na nośniku oksydazy D-aminokwasowej do nośnika wynosi korzystnie 5-25 mg białka na gram wilgotnego nośnika, a szczególnie korzystnie 8-15 mg białka na gram wilgotnego nośnika. Właściwa aktywność objętościowa oksydazy D-aminokwasowej w przypadku unieruchomienia według wynalazku może wynosić 100 U/g wilgotnego nośnika albo więcej, a szczególnie 125 U/g wilgotnego nośnika albo więcej. Korzystnie właściwa aktywność objętościowa wynosi 100-200 U/g, a szczególnie korzystnie 125-175 U/g wilgotnego nośnika. Jednostka ”U” dla oksydazy D-aminokwasowej określana jest w związku z tym jako jednostka cefalosporynowa C (CephC-). Aktywność Ceph-C oznaczana jest w obecności katalazy/O2/H2O2. Utworzone ilości produktów (kwasu a-ketoadypinylo-7-aminocefalosporanowego i kwasu glutarylo-7-aminocefalosporanowego) po rozdzieleniu roztworu reakcyjnego oznacza się ilościowo za pomocą HPLC. Aktywność 1 U odpowiada utworzeniu 1 pmola produktu/minutę w temperaturze 25°C w standardowych warunkach (1,3 kU katalazy, roztwór nasycony O2, 0,007% H2O2).

Oksydaza D-aminokwasowa może ewentualnie występować także wspólnie unieruchomiona z katalazą (E.C. 1.11.1.6). W tym przypadku stosuje się na ogół 50-100 U katalazy na U (Ceph-C-U) oksydazy D-aminokwasowej. Unieruchomienie katalazy następuje odpowiednio do opisanych wyżej technik. Aktywność 1 U katalazy odpowiada ilości enzymu, która hydrolizuje 1 pmol H2O2 na minutę w warunkach standardowych (25 mmoli/1 fosforanu potasu jako buforu pH 7,0; 0,018% H2O2).

177 809

Zgodną z wynalazkiem oksydazę D-aminokwasową można otrzymać z dużej liczby organizmów, np. E.coli, Pseudomonas spezies, Aerobacter spezies, Candida tropicalis, Penicillinium roqueforti, Aspergillus flavus i Aspergillus niger, Neurospora crassa, Nocardia, Citrobacter, Rhodotorula i Trigonopsis variabilis. Szczególnie korzystna jest oksydaza D-aminokwasowa z Trigonopsis variabilis. Wyodrębnienie i oczyszczanie tego enzymu opisano na przykład w opisie patentowym EP-A-O 211 033.

Dalszym przedmiotem omawianego wynalazku jest zastosowanie zgodnych z wynalazkiem unieruchomionych na nośniku enzymów pojedynczo albo w kompozycji co najmniej dwu z wymienionych enzymów w reakcji enzymatycznej syntezy. Amidazę penicylinową G można stosować na przykład przy syntezie cefalotyny z 7-ACA i kwasu tienylooctowego. Oksydazę D-aminokwasową i acylazę glutarylo-7-ACA można stosować w przypadku dwuetapowej enzymatycznej syntezy 7-ACA z cefalosporyny C.

Enzymy unieruchomione na nośniku zgodnie z wynalazkiem różnią się od znanych unieruchomionych na nośniku enzymów zwiększoną aktywnością objętościową, zwiększoną stabilnością albo/i polepszonymi właściwościami mechanicznymi produktu unieruchomienia. Dalszym przedmiotem omawianego wynalazku jest zatem sposób polepszania aktywności objętościowej unieruchomionych na nośnikach enzymów, wybranych z grupy składającej się z amidazy penicylinowej G (E.C. 3.5.1.11), acylazy glutamylo-7-ACA i oksydazy D-aminokwasowej (E.C. 1.4.3.3), który charakteryzuje się tym, że przez kowalencyjne wiązanie unieruchamia się enzym na aminofunkcyjnym organosiloksanopolimerze jako nośniku.

Jak już wyżej przedstawiono, unieruchomienie enzymów na nośniku następuje korzystnie przez dialdehyd, np. dialdehyd glutarowy, ale do unieruchomienia białek na aminofunkcyjnych nośnikach można stosować również inne odpowiednie sposoby.

Enzymy unieruchomione na nośniku według wynalazku wykazują nieoczekiwanie duże aktywności objętościowe, dzięki czemu osiąga się duże wydajności produktu w przemysłowych reakcjach syntezy. Zgodnie z wynalazkiem unieruchomione enzymy nadają się zwłaszcza w reakcjach, w przypadku których panują niskie temperatury, np. 4-30°C albo/i obecne są organiczne rozpuszczalniki, np. dimetyloformamid, dimetylosulfotlenek itd. Poza tym zgodnie z wynalazkiem unieruchomione enzymy wykazują poprawione właściwości mechaniczne w porównaniu z innymi nośnikami, jak np. przepływ przez kolumnę i ściśliwość.

Omawiany wynalazek przedstawiono poza tym za pomocą poniższych przykładów w połączeniu z fig. 1-5, które pokazują:

fig. 1 porównanie właściwych aktywności objętościowych amidazy penicylinowej G, którą unieruchomiono na aminofunkcyjnym organopolisuloksanie albo na polimetakrylanie, fig. 2 porównanie wydajności produktu w przypadku syntezy cefalotyny z amidazą penicylinową G unieruchomioną na aminofunkcyjnym organopolisiloksanie albo na polimetakrylanie, fig. 3 porównanie aktywności objętościowych unieruchomionej acylazy glutarylo-7-ACA w przypadku różnych nośników, fig. 4 porównanie właściwości przepływu przez różne materiały kolumny i fig. 5 porównanie ściśliwości różnych materiałów kolumny.

Przykład I. Wytwarzanie unieruchomionej amidazy penicylinowej G Aminofunkcyjne organopolisiloksany zostały odniesione do różnych specyfikacji firmy

DEGUSSA AG. Funkcyjne grupy poszczególnych substancji przedstawiono w tabeli 1, Tabela 1

Materiał	Pojemność	Wielkość cząstek mm	Grupa funkcyjna
mwali/g	mwali/ml
ΡΑΡΠΙ	3,14	0,66	0,1-0,3	-nh2
DAP III	2,77	0,49	0,1-0,3	-NH-(CH2)2-NH2
DAP IV	1,7	0,34	0,2-0,4	-NH-(CH2)2-NH2

177 809

Do 1 g nośnika PAP III zawierającego grupy aminowe dodaje się 1 ml 25% roztworu dialdehydu glutarowego w roztworze 0,1 mola/l fosforanu potasu jako buforu pH 7,0 i miesza mieszadłem śmigłowym przez godzinę w temperaturze pokojowej. Potraktowany żel przemywa się 20 ml roztworu 0,1 mola/l fosforanu potasu jako buforu pH 7,0. Do aktywowanego nośnika dodaje się 500-5000 U roztworu amidazy penicylinowej G w 10 ml roztworu 0,01 mola/l fosforanu potasu pH 7,0 i zawiesinę miesza się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Nadmiar reaktywnych grup wysyca się za pomocą 1 ml roztworu 0,1 mola/l etanoloaminy pH 9,0 przez jednogodzinne mieszanie w temperaturze pokojowej.

Następnie w temperaturze 4°C płucze się najpierw przy użyciu 50 ml roztworu 0,02 mola/l fosforanu potasu jako buforu pH 7,0/1 mola/l NaCl, a potem 50 ml roztworu 0,02 mola/l fosforanu potasu jako buforu. Oznaczenia aktywności roztworów połączenia i płuczącego oraz unieruchomionego enzymu przeprowadza się w warunkach stałego pH przez automiareczkowanie (5% PenG, 28°C, pH 8,0, 0,6 mola/l fosforanu potasu jako buforu). Aktywność właściwą podaje się na podstawie ciężaru wilgotnego katalizatora.

Na figurze 1 podane jest porównanie właściwych aktywności objętościowych PAP III i pochodnych polimetakrylanu.

Dające się uzyskać w przypadku nośników według wynalazku duże aktywności objętościowe umożliwiają użycie unieruchomionej amidazy penicylinowej G (PGA) w reakcjach syntezy, w których dla dużych wydajności produktu wymagane są niskie temperatury i wartości pH oraz organiczne rozpuszczalniki. Na fig. 2 przedstawione jest porównanie równowagowych syntez cefalotyny z 7-ACA i kwasu tienylooctowego przy użyciu jednakowych objętości enzymu PGA unieruchomionego przy zastosowaniu PAP III i enzymu PGA unieruchomionego na polimetakrylanie.

Przykład II. Unieruchomienie acylazy glutarylo-7-ACA

Unieruchomienie przeprowadza się analogicznie do unieruchomienia PGA. Stosuje się 180-250 U/g wilgotnego nośnika DAP III względnie PAP III. Uzyskane aktywności objętościowe przedstawiono na fig. 3 w porównaniu z produktami unieruchomienia na polimetakrylanie i nylonie.

Przykład III. Unieruchomienie oksydazy D-aminokwasowej (DAO)

Przed unieruchomieniem enzym dializuje się wobec 20 mmoli/l KPO₄ bufor pH 7,0/1 mmol/l ditiotreitolu. 2500 U DAO (jednostki A-alaniny) łączy się na gram wilgotnego nośnika DAP III. Nadmiar reaktywnych grup blokuje się przez jednogodzinne mieszanie z roztworem 0,1 mola/l etanoloaminy pH 8,0. Przemycie następuje za pomocą 0,5 mola/l NaCl/0,2 mmola/l DDT/0,5 mmola/l EDTA w 20 mmolach/l KPO₄, pH 7,0. Uzyskuje się aktywności > 1000 U/g wilgotnego nośnika.

W tabeli 2 przedstawiono aktywności objętościowe unieruchomionego enzymu DAO na różnych nośnikach.

Tabela 2

Nośnik	DAP III	Polimeta- ktylan/decylo- amina	Chitozan	Wofatyt	Duolite ES 762	XAD2	XAD8	Akrylo- amid
Nasycenie [D-Ala U/g]	2500	1660	2500	5000	3000	3000	3000	666
Aktywność objętościowa [Ceph-C U/g]	150	76	44	40	0	0	11	4

Aktywność D-Ala: Aktywność oksydazy D-aminokwasowej oznacza się wobec D-alaninyjako substratu w obecności katalazy /H2O2/dehydrogenazy mleczanowej/NADH w temperaturze 25°C, porównaj „Biochemicals for the diagnostic industry and clinical chemistry, 5. wydanie, strona 25, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BdR)

Aktywność Ceph-C: Aktywność wobec cefalosporyny C w obecności katalazy /02/H2O2. Utworzone ilości produktów (kwasu α -ketoadypinyIo-7-aminocefalosporanowego i kwasu glutarylo-7-aminocefalosporanowego) oznacza się ilościowo po rozdzieleniu roztworu reakcyjnego drogą HPLC. Aktywność 1 U odpowiada utworzeniu 1 pmola produktów/minutę w temperaturze 25°C.

XAD 2: nośnik na bazie polistyrenu

XAD 8: nośnik na bazie kwasu akrylowego

177 809

Przykład IV. Właściwości mechaniczne

1. Właściwości przepływu/przejście przez kolumnę

Właściwości filtracji różnych katalizatorów na nośniku (Eupergit C, żel poliakryloamidowy, PAP III) oznacza się przez ustalenie objętości przepływu/jednostkę czasu przy stałym hydrostatycznym ciśnieniu i identycznej wysokości złoża żelu. Próbę powtarza się dwukrotnie bez uprzedniego odprężenia żelu. Wynik tej próby przedstawiono na fig. 4. Z tego widać, że aminofunkcyjny polisiloksan posiada lepsze właściwości przepływu niż inne nośniki.

2. Ściśliwość

Ściśliwość organopolisiloksanu PAP III oraz Eupergitu i poliakryloamidu oznacza się w teście przepływu przez kolumnę przy użyciu jednakowych objętości złoża żelu i wysokości napełnienia. Na fig. 5 przedstawiono zależność szybkości liniowego przepływu od hydrostatycznego ciśnienia. Z tego widać, że aminofunkcyjny polisiloksan posiada lepsze właściwości ściśliwości niż inne nośniki.

Claims (19)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Enzym uninruchomiony na nośniku, wybrkzy z ygrr^j^^y składającsj się: j am idazz penicylinowej G (E.C. 3.5.1.11), aaylazy alutarylo-7-ACA i oksydazy D-aminokwasowej (E.C. 1.4.3.3), który jest unieruchomiony przez kowalencyjne wiązanie na aminofunkcyjnym oraanosiloksanopolimerze jako nośniku.
2. 2. Enzym ha cośuikn według zaw^d, 1, znamienny bcm, że j est uciec ruchomiony na nośniku przez dialdehyd.

   1. Enzym umenicComiony ho cośuikn według z^0c. 1 afto z, znamóenny bcm, ii, stosunek wagowy enzymu do nośnika wynosi 1-300 mg białka na gram wilgotnego nośnika.
3. 4. Enzym urnurricComionz ho cośuiku według zawez, 1 azbo 2. a1bo 3₅ znamoenny bcm, że nośnik występuje w postaci cząstek o przeciętnej średnicy wynoszącej 0,01-3 mm.

   1. Enzym 5iniurucComiony ho cośuikn według zwrz, 4, znamienny bcm, że przeciętna wielkość cząstek nośnika wynasi 0,1-0,4 mm.
4. 6. Enzym ulnenicComiony ha cośuikn według zwtrz. 4 albo z. 4namienny bcm, że nośnik posiada pastać kulek.
5. 7. Enzym unilrucComiony monośnike, Utóie-im j ekt az^djesi pecicyiislowa G wawłag zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek wagowy enzymu da nośnika wynosi 2-200 mg białka es gram wilgotnego nośnika.

   I. Enzym umerzcComiony ho nośniku, nońuiki, ekt amidjna pccicbHnpwe G wawEig zasta. 7, znamienny tym, że stosunek wagowy οις-^ da nośnika wynosi 40-80 mg białka es gram wilgotnego nośnika.
6. 9. Enzym umerzcComiony iianośniku, Utś^śniki, ekt amidana pemcyiinowa G wowbig zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że właściwa aktywność objętościowa wynosi 100-300 U es gram wilgotnego nośnika.
7. 10. Enzym 11x101^^011100^ ha cośniku, którymj ckt azytajm gSutzrsza-g-ACA wedCg zastrz. 1, znaminnuy tym, że stosunek wagowy enzymu do nośnika wynosi 10-110 mg białka ua gram wilgotnego nośnika.

   II. Enzym ηηϊιηκΛοιη^ζ ha cośeżCe, którem j ckt azylcjnι gbu-ada-g-ACA wzdCig zastrz. 10, znamienny tym, że stosunek wagowy euzzmu da nośnika wyuosi 20-70 mg białka ua gram wilgotnego nośnika.
8. 12. Enzym 0^10-0^11^7 ha cośeiku, któśum jekt azylem gRc-ryto-g-ACA w-dług zastrz. 10 albo 11, znamienny tym, że właściwa aktywność objętościowa wynosi 100-250 U na grsm wilgotnego nośnika.
9. 13. Enzym ιmieIZchomiony na nośnik, kśóiym jktt zCsydaza D-ammokwsscoiś. według zastrz. 1, znamienny tym, że stosunek wagowy enzymu da nośnika wynosi 5-25 mg białka ua gram wilgotnego nośnika.
10. 14. Enzym umerzchomiony na ^<^i^niku, kośnym jktt zCsydaza D-aminokwasooiś według zastrz. 13, znamienny tym, że stosunek wagowy euz-mu do nośnika wynosi 8-15 mg białka ua gram wilgotnego nośnika.
11. 15. nuz-m uuieruchamiouz us uośuikuj którym jest oksydaza D-sminakwssaws według zastar. 13 albo 14, znamienny tym, że właściwa aktywność objętościowa wynosi 100-200 U us grsm wilgotnego nośnika.

    177 809
12. 16. Enzym unieruchomiony r^a nośniku, któr/m jest oksydaza D-ominokwasowa według jedeego r ra-trr. 13 albo 14, rnamiennu tym, że je-t w-półyeierychomioea r DatalaząE.C. 1.11.1.6.
13. 17. Sposób prowadzepia enzymetycaroa cyntcre w okecnośc 1 enzymu unieruchomionugo ea eośeiDu, wybranego -pośród amidary peeiculikowej G (E.C. 3.5.1.11), acylaru glutarylo-7-ACA i oD-ydaru D-amieoDwa-owej (E.C. 1.4.3.3), rnamienno tym, że reakcję prowadri -ię w obeceości eerymu ukienuchomiokego prrer Dowaleecyjee wiąranie ea amieofunDcyjeym orgako-iloD-aeopolimerrn jako eośżiDu, w temperaturre reakcji od 4 do 30°C i eweetualeie dodaje -ię orgakicrky rorpu-rcraleik.
14. 18. Sposób i? oora-óbrna praWwnoś ci objwtościowej enzymów uniaruóeomionu’ch om neó eiku, wybrakyzh r grupy -Dładającej -ię r amidary pnkicylieawnj G (E.C. 3.5.1.11), acylaru glutarylo-7-ACA i nD-ydaru D-amienDwa-nwej E.C. 1.4.3.3, rnam/enku tym, że eerym unieruchamia -ię prrer Dawalnezyjen wiąranie ea amiknfUkDcajeym argaka-ilaD-ażnpalimnrre jaDo kaśeiDu.
15. 19. Sposó1 wodhig zaste/. 18 , ι-ι^πιϊ1Β,ιβ>ο aym, żż enu^m urneruokamia suc na na śniku poprrer dialdehyd.
16. 20. Opo-ób według ra-trr. 19, rnamienno tym, że -to-uje -ię -ta-ukeD wagowy nkrymu do eaśeiDa w raDre-ie 1-300 mg białDa ea gram wilgatenga eośniDa.
17. 21. Sposó2 wodhig zaWnd. u9 afto 2 0, zaamienny Ho®, że stosm⁶ się nośnik w eośtaDi crą-teD o prrnciętkej śrndkizo wukn-rącej 0,01-3 mm.
18. 22. Sposó2 wodług basta. ui , znam Senny Ιοο®, żż otosoke sńę rn-umk o praeciDtnej wńciDości crą-teD wyea-rązej 0,1-0,4 mm.
19. 23. Sposó2 3.10(^1^-0 ba^tez. ϋ ra-o 1 9, aUto 21, zaam iemny Ιό®, żż otosoje sńę nounek w pa-eazi DuleD.