CZ288269B6 - Immobilization of penicillin G amidase, glutaryl-7-ACA acylase or D-amino acid oxidase on an aminofunctional organosiloxane polymer carrier, use of the enzymes and process of their preparation - Google Patents
Immobilization of penicillin G amidase, glutaryl-7-ACA acylase or D-amino acid oxidase on an aminofunctional organosiloxane polymer carrier, use of the enzymes and process of their preparation Download PDFInfo
- Publication number
- CZ288269B6 CZ288269B6 CZ19961694A CZ169496A CZ288269B6 CZ 288269 B6 CZ288269 B6 CZ 288269B6 CZ 19961694 A CZ19961694 A CZ 19961694A CZ 169496 A CZ169496 A CZ 169496A CZ 288269 B6 CZ288269 B6 CZ 288269B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- carrier
- fixed
- enzyme
- wet
- amino acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/18—Multi-enzyme systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Enzym fixovaný na nosiči, penicilin-G-amidáza nebo glutaryI-7-ACA-acyláza nebo oxidáza-D-aminokyseliny fixované na nosiči, použití enzymů a způsob jejich výroby
Oblast techniky
Předložený vynález se týká enzymů fixovaných na nosiči, vybraných ze skupiny sestávající z penicilin-G-amidázy, glutaryl-7-ACA-acylázy a oxidázy D-aminokyseliny, použití těchto enzymů při enzymatické syntézní reakci jakož i způsobu jejich výroby a zlepšení objemové aktivity a stálosti těchto enzymů fixovaných na nosiči.
Dosavadní stav techniky
Fixace biologicky aktivních látek, například enzymů, na pevné materiály nosičů je možná mnoha způsoby a je popsána v řadě monografií a zveřejnění /viz například „Charakterization of Immobilized Biocatalysts“, Buchholz, J. /vydavatel/, DECHEMA Monographa č. 1724-1731, sv. 84 /1979/, „Protein Immobilization-Fundamentals and Application“ Taylor R.F. /vydavatel/, Marcel Dekker, lne. /1991/. Vedle nekovalentních technik imobilizace, jako například adsorpce, uzavření, mikropouzdření, chelatace a agregace prosadily se pro průmyslové použití, zejména kovalentní fixační metody.
Jako materiály nosičů pro fixaci biologicky aktivních látek jsou známy i organické, tak i anorganické materiály na syntetické nebo přírodní bázi. Kovalentní fixace proteinů na materiálech nosiče se obecně provádí kopulace proteinů přes reaktivní postranní řetězce jejich aminokyselin na nosič. Zpravidla je k tomu zapotřebí nosič a/nebo protein chemicky aktivovat. Způsob provádění chemické kopulace se při tom určuje podle druhu proteinu, jakož i podle použité matrice nosiče. Na základě toho, že se sekundární, terciární a kvartémí struktury proteinů značně od sebe liší, není možné předpovědět, které specifické materiály nosiče se hodí pro specifické enzymy.
Pro většinu komerčních použití fixace biologických látek se prosadily organické materiály nosičů, do nichž se může zavést velká řada reaktivních skupin. Jejich příklady jsou přírodní polymery, jako například deriváty polysacharidů a strukturní proteiny, stejně tak jako syntetické makromolekulámí látky na bázi polystyrenu nebo polyakrylátu. Tyto organické materiály nosičů se dají aktivovat běžnými chemickými způsoby nebo mají samy již reaktivní skupiny, které připustí spojení s proteinem, který se má imobilizovat. Tyto organické materiály nosičů mají ale ještě některé nedostatky, které omezují jejich použitelnost. Tak například přírodní deriváty polysacharidů jsou často citlivé vůči mikrobiologickému odbourání /celulóza/, mají nepříznivé vlastnosti týkající se částic /celulóza, vlákna různých délek/, jakož i nepříznivé mechanické vlastnosti a/nebo botnací vlastnosti.
Syntetické materiály jsou zpravidla necitlivé vůči mikrobiálnímu napadení, ale mají jiné nedostatky. Materiály nosičů na bázi polyakrylamidu, které se nejčastěji používají pro koimobilizaci proteinu a monomeru, jsou vybudovány z potenciálně kancerogenních monomerů /akrylamidu/ a jejich vodné systémy značně botnají. Polyakryláty, polymethakrylamidy se mohou vyrobit polymeraci odpovídajících monomerů s vhodnými síťovadly a dají se zčásti získat komerčně. Zejména za použití derivátů glycidu při kopolymeraci a následující modifikací se z těchto materiálů dají vyrobit již aktivované nosiče /například eupergit, biosynth/. Tyto materiály nosičů relativně značně botnají a při imobilizaci enzymů se často dosáhne jen malých objemových aktivit, čímž je použití těchto materiálů nosičů při enzymatických syntézních reakcích méně vhodné.
Anorganické nosiče mají mnohem příznivější mechanické vlastnosti, tepelnou stálost, odolnost vůči organickým rozpouštědlům a jsou odolnější proti mikrobiálnímu napadení než organické nosiče. Příklady anorganických nosičů, tj. jejich materiálů, jsou například bentonit, attapulgit,
-1 CZ 288269 B6 rozsivková hlinka /křemelina/. Tyto mají často široké spektrum velikosti pórů. Neporézní materiály, jako kovy nebo oxidy kovů, mají zpravidla jen malou povrchovou vaznost a obecně se tedy nehodí pro imobilizaci biologických látek. Controle Póre Glass /CPG/ se dá sice vyrobit s definovanými velikostmi pórů a vaznými povrchy, ale je již při moderovaných alkalických podmínkách /pH větší než 8/ nestálé. Všechny dosud uvedené anorganické materiály se musí kromě toho před vlastní kopulační reakcí vhodným způsobem přeupravit a převést na aktivovaný derivát. Tato derivatizace je na základě inertní povahy nosiče často relativně obtížná. Nejčastěji se proto provádí povlékání nosiče silanizací. Potom se protein, který se má imobilizovat po funkcionalizaci nosiče obecně 3-aminopropylethoxysilanem kovalentně váže. Tímto způsobem se získá ale obecně jen malý výtěžek kopulovaného proteinu.
Použití organofunkčních polysiloxanů jako nosičů enzymů je známé /viz například Poster č. 518 a 519, DECHEMA-Tagung der Biotechnologen 1992; Poster 5.218 DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen 1993/. Tam je napsáno, že se jako materiály nosičů pro imobilizaci enzymů invertázy, laktázy a glukozooxidázy, mohou používat organofunkční polysiloxany, zejména aminofunkční polysiloxany. U těchto enzymů je popsána vysoká vazebná kapacita a vazebný účinek, stejně tak jako zvýšená stálost. Zvýšení objemové aktivity imobilizovaných enzymů oproti jiným materiálům nosičů ale není zveřejněno.
Enzymy penicilin-G-amidáza, glutaryl-7-ACA-acyláza a oxidáza D-aminokyseliny se používají pro průmyslovou výrobu modifikovaných antibiotik penicilinu a cephalosporinu. Oxidáza D-aminokyseliny a glutaryl-7-ACA-acyláza katalyzují dvoustupňovou enzymatickou konverzi cephalosporinu C nebo jeho derivátů na solí na 7-aminocephalosoranovou kyselinu /7-ACA/ nebo její deriváty /viz například EP-B-0 211 033/, EP-A-0 409 521/. Penicilin-G-amidáza katalyzuje syntézu cephalothinu z 7-ACA a thienylové kyseliny.
Při provádění těchto výše uvedených reakcí v průmyslovém měřítku se uvedené enzymy používají nejčastěji v imobilizované formě. EP-B-0 211 033 popisuje například obohacení oxidázy D-amino kyseliny z mikroorganismu Trigonopsis variabilis a imobilizaci tohoto enzymu na sypharóze aktivované kyanbromidem, přičemž se získají objemové aktivita 7 U/ml materiálu nosiče.
EP-A-492 495 zveřejňuje imobilizaci oxidázy D-aminokyseliny na kopolymerů, který sestává v podstatě z jednotek vinylacetátu a/nebo vinylalkoholu a jednotek síťovadla. Získá se objemová aktivita 32 U/g vlhkého nosiče. Imobilizovaný enzym je při 30 °C stálý 6 měsíců. Při použití jiných pevných nosičů /sepharóza* aktivovaná kyanidem bromu, vinylsepharoza* a eupergit*/ se získají jen menší objemové aktivity a stálosti.
EP-A-0 496 993 popisuje imobilizaci oxidázy D-aminokyseliny zRhodetorula gracilis a glutaryl-7-ACA-acylázy z Acinetobacter species, která byla vyrobena v transformovaných buňkách E. coli, na řadě pevných nosičů, například silně zásadité polystyrénové pryskyřici s kvartémí aminofunkčností, jako například amberlitu* IFA900, mírně zásadité polystyrénové pryskyřici s primární aminofunkčností, jako například duolitu* A365, středně zásadité polykondenzované fenolformaldehydové pryskyřici se sekundárními a terciárními aminofimkčnostmi, jako například duolitu* A568 nebo duolitu* A7. Pro oxidázu Daminokyseliny se popisuje objemová aktivita až maximálně 75 U/g vlhkého nosičce /eupergit* C fluniconalizovaný epoxidem/. Pro glutaryl-7-ACA-acylázu se popisuje maximální objemová aktivita 41 U/g vlhkého nosiče /eupergiťC funkcionalizovaný epoxidem.
WO 90/12110 zveřejňuje imobilizaci oxidázy D-aminokyseliny a glutaryl-7-ACA-acylázy na sendviči oxidu křemičitého a polyvinylchloridu ve formě lístků, který může být derivatizován polyethyleniminem a glutaraldehydem. Zvýšení objemové aktivity tímto druhem imobilizace oproti jiným materiálům nosičů není popsáno.
-2CZ 288269 B6
Místa literatury Wood et al. /J. Biotechn. 13, /1990/ 305-314/ a Cobbs et al. /Biotechnology Techniques, Vol. 4., č. 1 /1990/, 5-10/ popisují imobilizaci oxidázy D-aminokyseliny na pevném nosiči pomocí trifunkčního aziridinu. Zvýšené objemové aktivity tímto druhem imobilizace oproti jiným materiálům nosiče není popsáno.
Místo literatury Szwajcer-Dey et al. /Appl. Biochem. Biotechn. 27 /1991/, 239-250/ popisuje imobilizaci oxidázy D-aminokyseliny zTrigonopsis variabilis na částicích oxidu kovu a na sepharóze aktivované CNBr. Popisuje se imobilizace 23 mg oxidázy D-aminokyseliny pro g vlhké sepharózy. Zvýšení objemové aktivity pomocí použití částic nosiče z oxidu kovu není zveřejněna.
Podstata vynálezu
Úloha, která je základem předloženého vynálezu sočívala tedy v přípravě nových enzymů, fixovaných na nosiči, vybraných ze skupiny, sestávající z penicilin-G-amidázy, glutaryl-7ACA-acylázy a oxidázy D-aminokyseliny, které mají oproti známým enzymům, fixovaným na nosiči vyšší objemovou aktivitu a/nebo jsou stálejší. Úlohou předloženého vynálezu bylo dát k dispozici jednotný systém nosičů pro tyto tři výše uvedené enzymy, čímž se zjednoduší podstatně současné použití těchto enzymů v enzymatických syntézních reaktorech.
Úloha podle vynálezu je vyřešena enzymem fixovaným na nosiči, vybraným ze skupiny sestávající z penicilin-G-amidázy /E.E.3.5.1.11/, glutaryl-7-ACA-acylázy a oxidázy D-aminokyseliny /E.C.1.4.3.3/, který je fixován kovalentní vazbou na materiál nosiče, kterým je aminofimkční polymer organosiloxanu.
Pojem „aminofunkční polymer organosiloxanu“ podle předloženého vynálezu zahrnuje polymerní sloučeniny, ve kterých jsou atomy křemíku a popřípadě atomy titanu, zirkonia a/nebo hliníku, vázány přes atomy kyslíku a volné valence těchto atomů kovů jsou vysyceny organickými zbytky, které obsahují aktivovatelné aminokyseliny. Aminoskupiny jsou například s výhodou primární aminoskupiny. Takovéto aminofunkční organosiloxany jsou komerčně dostupné, například od firmy DEGUSSA AG, Frankfurt, BRD, pod označením DELOXANx. Složení a výroba výhodných aminofunkčních organopolysiloxanů je popsána například v DE-OS 31 20 214, DE-OS-38 37 418, DE-OS 39 25 339 a DE-OS 39 25 360, na jejichž zveřejnění je možné se tímto odvolat.
Příklady vhodných funkčních aminoskupin na organosiloxanových polymerech jsou například -NH2, -RNH2, -NH-R-NH2 nebo -R-/NH-R'/n-NH2, přičemž R a R' mohou být nezávisle na sobě lineární nebo rozvětvená alkylenová skupina s 1 až 10 atomy C, cykloalkylenová skupina s 5 až 8 atomy C nebo lineární nebo rozvětvená alkylenová skupina, která obsahuje cyklohexylenovou jednotku nebo fenylovou jednotku. Zejména výhodné příklady funkčních aminoskupin jsou -NH2, -NH/CH2/2-NH2, -/CH2/3-NH2 nebo -/CH2/2-NH-/CH2/2-NH-/CH2/2-NH2.
Ve výhodném provedení vynálezu je enzym fixován na materiál nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu, přes dialdehyd.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je hmotnostní poměr materiálu nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu, v rozmezí 1 až 300 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je materiál nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu, ve tvaru částic, jejich střední průměr je 0,01 až 3 mm.
S výhodou je velikost částic materiálu nosiče 0,1 až 0,4 mm.
Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je materiál nosiče kulovitý.
-3CZ 288269 B6
Tvar aminofunkčních materiálů nosiče může být sám o sobě libovolný. Výhodné jsou ale tvarové částice materiálů nosiče, které mají vhodnou velikost a kromě toho jednak velký specifický povrch a jednak umožňují dobrou vaznost. Jak je již výše uvedeno výhodný tvar nosiče je v podstatě kulovitý. Výroba kulovitých aminofunkčních polymerů organosiloxanu je popsána ve výše uvedených DE-OS 39 25 359 a DE-OS 39 25 360, na jejichž zveřejnění se tímto poukazuje. Střední velikost částic je s výhodou 0,05 až 1 mm a nejvýhodnější střední velikost je, jak je již rovněž výše uvedeno, 0,1 až 0,4 mm. Pro penicilin-G-amidázu je nejvýhodnější střední velikost částic 0,1 až 0,3 mm a pro glutaryl-7-ACA-acylázu a oxidázu D-aminokyselin 0,2 až 0,4 mm.
Kapacita, to znamená počet aminoskupin, aminofunkčního nosiče, použitého pro fixaci enzymů, je s výhodou 0,5 až 5 mval/g nosiče, nejvýhodněji pak 1 až 4 mval/g nosiče.
Pro fixaci enzymů na aminofunkční nosič se mohou používat různé metody známé ze stavu techniky. Tyto metody zahrnují obecně aktivaci aminoskupin nacházející se na nosiči aktivačním činidlem. Aktivované skupiny na nosiči mohou potom reagovat s reaktivními skupinami enzymu, zejména s aminoskupinami v bočním řetězci. Tímto způsobem se získají enzymy fixované na nosič, které mají oproti jiným materiálům nosiče překvapivě zvýšenou objemovou aktivitu.
Reakcí s thiofosgenem popřípadě s 1,4-fenylendiisothiokyanátem se může aminoskupina nosiče převést v reaktivní isothiokyanátovou skupinu. Reakcí nosiče s dianhydridy (například anhydridem kyseliny jantarové) se mohou zavést karboxylové funkce, které se dají převést v reaktivní chloridy kyseliny a estery /například N-hydroxysukcinimidester/. Dále se aktivace aminoskupiny na nosiči může provést reakcí s chlortriaziny /například kyanurchloridem/. Dalším příkladem aktivace je reakce primárních aminoskupin na nosiči se 4-nitrobenzoylchloridem a diazotace aromatické skupiny a/nebo převedení v odpovídající hydrazin. Také reakcí sbis-epoxidy /například 1,4-butandioldiglycidyletherem/ nebo epichlorhydrinem se mohou aminoskupiny aktivovat zavedením reaktivních epoxidových skupin. Podrobnosti takovýchto a jiných metod jsou popsány například v „Covalent and Coordination Immobilization of Proteins, Cabral J.M.S., Kennedy, J. F., in Protein Immobilization, Fundamentals and Application /Taylor R.F., Hrsg/ Marcel Dekker lne., 1991.
Jak již rovněž bylo výše uvedeno, provádí se aktivace aminoskupin na nosiči s výhodou reakcí s dialdehydy /například s glutaraldehydem/. Tato metoda se dá zejména snadno provést i ve vodném médiu. Tím se může zabránit použití toxických sloučenin a organických rozpouštědel.
Po aktivaci aminoskupin na nosiči se provádí fixace enzymu kontaktováním aktivovaného nosiče s enzymem za vhodných podmínek. Potom se mohou nezreagované reaktivní skupiny nosiče vysytit. U nosiče aktivovaného aldehydem se může vysycení provádět například ethanolaminem.
V jedné formě provedení se předložený vynález týká penicilin-G-amidázy fixované na nosiči. Penicilin-G-amidázy je enzym, který se dá získat z velké řady různých druhů bakterií a z něktelých hub a kvasinek, s výhodou z E. coli. Podle vynálezu je hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče v rozmezí 2 až 200 mg proteinu na 1 mg vlhkého nosiče. Ve výhodném provedení vynálezu pak v rozmezí 40 až 80 mg na 1 g vlhkého nosiče.
Při imobilizaci penicilin-G-amidázy podle vynálezu se dá dosáhnout specifická objemová aktivita v rozmezí 100 až 300 U na 1 g vlhkého nosiče. Výhodná je specifická objemová hustota v rozmezí 125 až 275 U/g vlhkého nosiče. Jednotka „U“ pro penicilin-G-amidázu je definována jako množství enzymu, které hydrolyzuje za standardních podmínek /5 % penicilinu G, 0,6 mmolů/1 pufřu fosforečnanu draselného pH 8,0; 28 °C/ za minutu 1 pmol penicilinu G.
Další forma provedení předloženého vynálezu se týká glutaryl-7-ACA-acylázy fixované na nosiči. Glutaryl-7-ACA-acyláza se dá získat například z Acinetobacter app. nebo z buněk E. coli transformovaných genem glutaryl-7-ACA-acylázy /srov. EP-A-0 496 993/. U glutaiy-7-ACA
-4CZ 288269 B6 acylázy fixované na nosiči je hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče v rozmezí 10 až 110 mg na 1 g vlhkého nosiče a ve výhodném provedení vynálezu je tento poměr v rozmezí 20 až 70 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
Specifická objemová aktivita glutaryl-7-ACA-acylázy fixované na nosiči je v rozmezí 100 až 250 U na 1 g vlhkého nosiče- nejvýhodněji pak v rozmezí 125 až 200 U/g vlhkého nosiče. Jednotka „U“ pro glutaryl-7-ACA-acylázu je definovaná jako množství enzymu, které hydrolyzuje za standardních podmínek /2 % G1-7-ACA, 5 mmolů/1 pufru fosforečnanu draselného pH 8,0; 37 °C/ 1 pmol 7(3-/4-karboxybutanamido/-cefalosporanové kyseliny/glutaryl-7-ACA/ za minutu.
Další forma provedení vynálezu se týká oxidázy D-aminokyseliny fixované na nosiči, přičemž hmotnostní poměr enzymu k nosiči je v rozmezí 5 až 25 mg na 1 g vlhkého nosiče. Ve výhodném provedení vynálezu pak v rozmezí 8 až 15 mg na 1 g vlhkého nosiče.
Jednotka „U“ pro oxidázu D-aminokyseliny je v této souvislosti definována jako jednotka cephalosporinu C-/Ceph-C/. Aktivita Ceph-C je určuje v přítomnosti katalázy/O2/H2O2. Vzniklá množství produktů /a-ketoadipinyl-7-aminocephalosporanové kyseliny a glutaryl-7-aminocephalosporanové kyseliny/ se kvantifikují po oddělení reakčního roztoku pomocí HPLC. Aktivita 1 U odpovídá tvorba 1 pmolu produktů/min při 25 °C za standardních podmínek/1,3 kU katalázy, roztok nasycený O2, 0,007 % H2O2/.
Popřípadě se může oxidáza D-aminokyseliny předložit také koimobilizovaná katalázou /E.C. 1.11.1.6/. V tomto případě se obecně používá 50 U až 100 U katalázy pro U/Ceph-C-U/ oxidázy aminokyseliny. Imobilizace katalázy se provádí v souladu s výše popsanými technikami. Aktivita 1 U katalázy odpovídá množství enzymu, které hydrolyzuje za standardních podmínek /25 mmolů/1 pufru fosforečnanu draselného pH 7,0; 0,018 % H2O2/1 pmol H2O2 za minutu.
Oxidáza D-aminokyseliny podle vynálezu se dá získat z velkého počtu organismů, například E. coli, Pseudomonas Species, Aerobacter species, Aspergillus flavus a Aspergillus niger, Neurosphora crassa, Nocardia, Citrobacter, rhodotorula a Trigonopsis variabilia. Oxidáza Daminokyseliny s Trigonopsis variabilis je zejména vhodná. Izolace a čištění tohoto enzymu je popsáno například v EP-A-0 211 033.
Dalším předmětem vynálezu je použití enzymů fixovaných na nosiči samotných nebo v kombinaci při odpovídající enzymatické syntézní reakci, kde reakční teplota je 4 až 30 °C a reakce se provádí v přítomnosti organického rozpouštědla.
Penicilin-G-amidáza se může používat například při syntéze cephalothinu ze 7-ACA a trienyloctové kyseliny. Oxidáza D-aminokyseliny a glutaryl-7-ACA-acyláze se mohou používat při dvoustupňové syntéze 7-ACA z celphalosporinu C.
Enzymy fixované na nosiči podle vynálezu se liší od známých enzymů fixovaných na nosiči zvýšenou objemovou aktivitou, větší stabilitou a/nebo zlepšenými mechanickými vlastnostmi imobilizátu.
Dalším předmětem vynálezu je způsob výroby enzymů fixovaných na nosiči, vybraných ze skupiny sestávající z penicilin-G-amidázy /E.C.3.5.1.11/, glutaryl-7-ACA-acylázy a oxidázy D-aminokyseliny /E.C. 1.4.3.3/, kteiý spočívá vtom, že se enzym fixuje kovalentní vazbou na materiál nosiče, jímž je aminofunkční polymer organosiloxanu.
Podle výhodného provedení způsobu podle vynálezu se fixace enzymu na materiál provádí přes dialdehyd.
-5CZ 288269 B6
Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se použije hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče v rozmezí 1 až 300 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se použije materiál nosiče ve tvaru se středním průměrem 0,01 až 3 mm.
Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se použije materiál nosiče se střední velikostí částic 0,1 až 0,4 mm.
Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle vynálezu se použije materiál nosiče s kulovitým tvarem.
Jak již bylo uvedeno výše, provádí se fixace na materiál nosiče s výhodou přes dialdehyd. Tímto může být například glutaraldehyd. Mohou se ale použít i všechny ostatní způsoby vhodné pro imobilizaci proteinů na aminofunkčním nosiči.
S překvapením mají enzymy fixované na nosiči podle vynálezu vysoké objemové aktivity, čímž se dosáhnou vysoké výtěžky produktů při průmyslových syntézních reakcích. Enzymy imobilizované podle vynálezu se zejména hodí pro reakce, při kteiých panují nízké teploty, například 4 až 30°C, a/nebo jsou přítomna organická rozpouštědla, například dimethylformamid, dimethylsulfoxid atd. Enzymy imobilizované podle vynálezu mají dále zlepšené mechanické vlastnosti ve srovnání s jinými materiály nosičů, jako například průchodnost sloupcem a stlačitelnost.
Přehled obrázků na výkresech
Předložený vynález je dále znázorněn pomocí následujících příkladů ve spojení s obr. 1 až 5. Obr. ukazují:
obr. 1 srovnání specifických objemových aktivit penicilin-G-amidázy, která byla fixována na aminofunkčním organopolysiloxanu nebo na polymethakrylátu, obr. 2 srovnání výtěžku produktu při syntéze cephalothinu s imobilizovanou penicilin-Gamidázou, která byla fixována na aminofunkční organopolysiloxan nebo na polymethakrylát, obr. 3 srovnání objemových aktivit imobilizované glutaiyl-7-ACA-acylázy při různých materiálech nosičů, obr. 4 srovnání vlastností průtoku různých materiálů sloupců a obr. 5 srovnání stlačitelnosti různých materiálů sloupců.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Výroby imobilizované penicilin-G-amidázy
Byly použity aminofunkční organopolysiloxany v různých specifikacích firmy DEGUSSA AG. Funkční skupiny jednotlivých látek jsou uvedeny v následující tabulce:
-6CZ 288269 B6
Tabulka 1
| materiál | kapacita | velikost částic | funkční skupina | |
| mval/g | m/val ml | |||
| PAP III | 3,14 | 0,66 | 0,1-0,3 | -nh2 |
| DAP III | 2,77 | 0,49 | 0,1-0,3 | -NH-/CH2/r-NH2 |
| DAP IV | 1,7 | 0,34 | 0,2-0,4 | -NH-/CH2/2-NH2 |
K 1 g materiálu nosiče PAP III obsahujícímu aminoskupiny se přidá 1 ml 25% glutardialdehydového roztoku v 0,1 mol/1 pufru fosforečnanu draselného pH 7,0 a míchá se 1 hodinu při teplotě místnosti vrtulovým míchadlem. Zpracovaný gel se promyl 20 ml 0,1 mol/1 roztoku pufru fosforečnanu draselného pH 7,0, k aktivovanému materiálu nosiče se přidá 500 až 5000 U roztoku penicilin-G-amidázy v 10 ml 0,01 molu/1 fosforečnanu draselného pH 7,0 a suspenze se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Přebytečné reaktivní skupiny se vysytí jednohodinovým mícháním s 1 ml mol/1 roztoku ethanolaminu pH 9,0 při teplotě místnosti.
Dále se promývá při 4 °C nejdříve 50 ml 0,02 molu/1 pufru fosforečnanu draselného pH 7,0 mol/1 NaCl, potom 50 ml 0,02 mol/1 pufru fosforečnanu draselného. Stanovení aktivit kopulačních a promývacích roztoků, stejně tak jako imobilizovaného enzymu se provede za podmínek stát pH na autotitrátoru /5 % PenG, 28 °C, pH 8,0, 0,6 mol/1 pufru fosforečnanu draselného/. Údaj o specifické aktivitě je uveden na bázi hmotnosti katalyzátoru ve vlhkém stavu.
Na obr. 1 jsou proti sobě postaveny specifické aktivity PAP III a derivátů polymethakrylátu.
Vysoké objemové aktivity, které se dají dosáhnout u nosičů podle vynálezu, umožňují použít imobilizovanou penicilin-G-amidázu při syntézních reakcích, při kterých jsou nezbytné nízké teploty a hodnoty pH jakož i organická rozpouštědla. Na obr. 2 jsou proti sobě postaveny rovnovážné syntézy cephalothinu ze 7-ACA a thienyloctové kyseliny při použití stejných objemů imobilizované penicilin-G-amidázy /PGAP za použití PAO III a polymethylakrylátem mobilizované PGA.
Příklad 2
Imobilizace glutaryl-7-ACA-acylázy
Fixace se provádí analogicky jako při imobilizaci PGA. Použije se 180 až 250 U/g vlhkého materiálu nosiče DAP III popřípadě PAP III. Rezultující objemové aktivity jsou znázorněny na obr. 3 ve srovnání s imobilizáty polymethakrylátu a nylonu.
Příklad 3
Imobilizace oxidázy D-aminokyseliny /DAO/
Enzym se před fixací dialyzuje proti 20 mmolům/1 KPO4 pufru pH 7,0/1 mmol/1 dithiothreitolu. 2500 U DAO /D- alaninu jednotek/ se použije na g vlhkého materiálu nosiče DAP III. Blokování přebytečných reaktivních míst se provádí jednohodinovým mícháním s 0,1 molu/1 roztoku ethanolaminu, pH 8,0. Promývá se 0,5 molu/1 NaCl/0,2 mmolu/1 DDT/ 0,5 mmolu/1 EDTA ve 20 mmolech/1 KPO4, pH 7,0. Dosáhnou se aktivity větší než 1000 U/g vlhkého materiálu nosiče.
Tabulka 2 ukazuje objemové aktivity imobilizované DAO s různými materiály nosiče.
Tabulka 2
| materiál nosiče | DAPIII | polymethakrylát/ decylamin | chitosan | wofatit |
| adsorpce /D-Ala U/g/ | 2500 | 1660 | 2500 | 5000 |
| objemová aktivita | ||||
| /Ceph-C U/g/ | 150 | 76 | 44 | 40 |
| materiál nosiče | duolite ES 762 | XAD 2 | XAD 8 | akrylamid |
Aktivita D-Ala: Aktivity oxidázy D-aminokyseliny se určuje proti D-alaninu jako substrát 5 v přítomnosti katalázy/H2O2/laktátdehydrogenázy/NADH při 25 °C podle srov.“ Biochemicals for the diagnostic industry nad clinical chemistry, 1993/94, 5. ed. s. 25, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BRD.
Ceph-C- aktivita: Aktivita proti cephalosporinu C se určuje v přítomnosti katalázy/O2/H2O2. 10 Vzniklá množství produktů /a-ketoadipinyl-7-aminocephalosporanové kyseliny a glutaryl-7aminocephalosporanové kyseliny/ se kvantifikují po oddělení reakčního roztoku pomocí HPLC. Aktivita 1 U odpovídá tvorbě 1 pmol produktů/min při 25 °C.
XAD 2: materiál nosiče na bázi polystyrenu
XAD 8: materiál nosiče na bázi kyseliny akrylové
Příklad 4
Mechanické vlastnosti
1. Průtokové vlastnosti/ průchodnost sloupcem
Vlastnosti filtrace různých katalyzátorů nosiče /Eupergit C, polyakiylamidový gel, PAP ΠΙ/ se zjišťují stanovením objemu průtoku/časovou jednotku za konstantního hydrostatického tlaku a výšce gelového lože. Pokus se dvakrát opakuje bez předchozího zrušení gelu. Výsledek tohoto pokusu je znázorněn na obr. 4. Je zřejmé, že aminofunkční polysiloxan má lepší průtokové vlastnosti než jiné materiály nosičů.
2. Stlačitelnost
Stlačitelnost organopolysiloxanu PAP III stejně tak jako eupergitu a polyakrylamidu byla zjišťována při testu průtoku sloupcem při použití stejného objemu gelového lože a výšce násypu.
Je znázorněna závislost lineárního množství toku na hydrostatickém tlaku. Tato závislost je znázorněna na obr. 5. Je zřejmé, že aminofunkční polysiloxan má lepší vlastnosti stlačitelnost! než jiné materiály nosiče.
Claims (23)
1. Enzym fixovaný na nosiči, vybraný ze skupiny sestávající z penicilin-G-amidázy /E.C.3.5.1.11/, glutaryl-7-ACA-acylázy a oxidázy D-aminokyseliny /E.C.1.4.3.3/, který je fixován kovalentní vazbou na materiál nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu.
2. Enzym fixovaný na nosiči podle nároku 1, vyznačující se tím, že je na materiál nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu, fixovaný přes dialdehyd.
3. Enzym fixovaný na nosiči podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr materiálu nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu, je v rozmezí 1 až 300 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
4. Enzym fixovaný na nosiči podle jednoho z nároků laž3, vyznačující se tím, že materiál nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu, je ve tvaru částic, jejichž střední průměr je 0,01 až 3 mm.
5. Enzym fixovaný na nosiči podle nároku 4, vyznačující se tím, že velikost částic materiálu nosiče je 0,1 až 0,4 mm.
6. Enzym fixovaný na nosiči podle nároku 4, vyznačující se tím, že materiál nosiče je kulovitý.
7. Penicilin-G-amidáza fixovaná na nosiči podle jednoho z nároků laž6, vyznačující se t í m, že hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče je v rozmezí 2 až 200 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
8. Penicilin-G-amidáza fixovaná na nosiči podle nároku 7, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče je v rozmezí 40 až 80 mg na 1 g vlhkého nosiče.
9. Penicilin-G-amidáza fixovaná na nosiči podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že specifická objemová aktivita je v rozmezí 100 až 300 U na 1 g vlhkého nosiče.
10. Glutaryl-7-ACA-acyláza fixovaná na nosiči podle jednoho z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče je v rozmezí 10 až 110 mg na 1 g vlhkého nosiče.
11. Glutaryl-7-ACA-acyláza fixovaná na nosiči podle nároku 10, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče je v rozmezí 20 až 70 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
12. Glutaryl-7-ACA-acyláza fixovaná na nosiči podle nároku 10 nebo 11, vyznačující se t í m, že specifická objemová aktivita je v rozmezí 100 až 250 U na 1 g vlhkého nosiče.
13. Oxidáza-D-aminokyseliny fixovaná na nosiči podle jednoho z nároků 1 až 6, vyznačují c í se t í m, že hmotnostní poměr enzymu k nosiči je v rozmezí 5 až 25 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
14. Oxidáza-D-aminokyseliny fixovaná na nosiči podle nároku 13, vyznačující se tím, že hmotnostní poměr enzymu k materiálu nosiče je v rozmezí 8 až 15 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
-9CZ 288269 B6
15. Oxidáza-D-aminokyseliny fixovaná na nosiči podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se t i m, že specifická objemová aktivita je v rozmezí 100 až 200 U na 1 g vlhkého nosiče.
16. Oxidáza-D-aminokyseliny fixovaná na nosiči podle jednoho z nároků 13 až 15, která je 5 koimobilizovaná katalázou ZE.C. 1.11.1.6/.
17. Použití enzymů fixovaných na nosiči samotných nebo v kombinaci, podle jednoho z nároků 1 až 16, při odpovídající enzymatické syntézní reakci, kde reakční teplota je 4 až 30 °C a reakce se provádí v přítomnosti organického rozpouštědla.
18. Způsob výroby enzymů fixovaných na nosiči, vybraných ze skupiny sestávající z penicilinG-amidázy /E.C.3.5.1.11/, glutaryl-7-ACA-acylázy a oxidázy D-aminokyseliny /E.C.1.4.3.3/, podle nároku 1, vyznačující se tím, že se enzym fixuje kovalentní vazbou na materiál nosiče, kterým je aminofunkční polymer organosiloxanu.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že se fixace enzymu na materiál provádí přes dialdehyd.
20. Způsob podle nároku 18 nebo 19, vyznačující se tím, že se použije hmotnostní 20 poměr enzymu k materiálu nosiče v rozmezí 1 až 300 mg proteinu na 1 g vlhkého nosiče.
21. Způsob podle jednoho z nároků 18 až 20, vyznačující se tím, že se použije materiál nosiče ve tvaru se středním průměrem 0,01 až 3 mm.
25
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije materiál nosiče se střední velikostí částic 0,1 až 0,4 mm.
23. Způsob podle nároku 21 nebo 22, vyznačující se tím, že se použije materiál nosiče s kulovitým tvarem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4342770A DE4342770A1 (de) | 1993-12-15 | 1993-12-15 | Trägerfixierte Enzyme |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ169496A3 CZ169496A3 (en) | 1996-09-11 |
| CZ288269B6 true CZ288269B6 (en) | 2001-05-16 |
Family
ID=6505080
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19961694A CZ288269B6 (en) | 1993-12-15 | 1994-12-13 | Immobilization of penicillin G amidase, glutaryl-7-ACA acylase or D-amino acid oxidase on an aminofunctional organosiloxane polymer carrier, use of the enzymes and process of their preparation |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5780260A (cs) |
| EP (1) | EP0734437B1 (cs) |
| JP (1) | JP2719047B2 (cs) |
| KR (1) | KR100338566B1 (cs) |
| AT (1) | ATE186743T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ288269B6 (cs) |
| DE (2) | DE4342770A1 (cs) |
| ES (1) | ES2139178T3 (cs) |
| PL (1) | PL177809B1 (cs) |
| RU (1) | RU2135582C1 (cs) |
| SK (1) | SK281379B6 (cs) |
| TW (1) | TW341600B (cs) |
| WO (1) | WO1995016773A1 (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5842804A (en) * | 1996-03-28 | 1998-12-01 | Rexam Cosmetic Packaging, Inc. | Lipstick case with means for push-back prevention |
| JP4812167B2 (ja) * | 1999-02-12 | 2011-11-09 | モレキュラー インサイト ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド | 薬物輸送用マトリックス、ならびにその作成方法および使用方法 |
| JP2004538265A (ja) | 2001-04-19 | 2004-12-24 | ビオフェルマ ムルシア，エス．アー． | α−ケト酸誘導体を使用して３−セファロスポラン酸誘導体を製造する方法 |
| KR100509738B1 (ko) * | 2001-10-06 | 2005-08-23 | 종근당바이오 주식회사 | 실리카겔 또는 복합실리카겔 담체를 이용한 효소의 고정화방법 |
| US9540631B1 (en) | 2004-09-14 | 2017-01-10 | Peter T. Pugliese | Immobilized glucose oxidase for use in oral hygiene |
| CN100465271C (zh) * | 2006-12-28 | 2009-03-04 | 浙江大学 | 一种在聚电解质离子的协同作用下对青霉素酰化酶的固定方法 |
| CN102776599B (zh) * | 2012-07-10 | 2014-02-26 | 东华大学 | 一种静电纺多壁碳纳米管含糖纳米纤维膜的制备 |
| CN112679701B (zh) * | 2020-12-28 | 2022-02-25 | 重庆宸安生物制药有限公司 | 一种固定化赖氨酸内肽酶及其制备方法与用途 |
| CN114369583B (zh) * | 2022-01-12 | 2023-07-11 | 凯莱英生命科学技术(天津)有限公司 | 固定化酶及其在连续化生产中的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62166887A (ja) * | 1986-01-20 | 1987-07-23 | Shin Etsu Chem Co Ltd | 酵素固定化用担体 |
| IT1252308B (it) * | 1990-12-21 | 1995-06-08 | Antibioticos Spa | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati |
| TW198064B (cs) * | 1990-12-24 | 1993-01-11 | Hoechst Ag |
-
1993
- 1993-12-15 DE DE4342770A patent/DE4342770A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-10-24 TW TW083109839A patent/TW341600B/zh active
- 1994-12-13 EP EP95904461A patent/EP0734437B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-13 DE DE59408940T patent/DE59408940D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-13 KR KR1019960703112A patent/KR100338566B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1994-12-13 JP JP7516520A patent/JP2719047B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-12-13 RU RU96115306A patent/RU2135582C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1994-12-13 ES ES95904461T patent/ES2139178T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-13 SK SK784-96A patent/SK281379B6/sk unknown
- 1994-12-13 PL PL94314963A patent/PL177809B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-12-13 AT AT95904461T patent/ATE186743T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-12-13 WO PCT/EP1994/004132 patent/WO1995016773A1/de active IP Right Grant
- 1994-12-13 CZ CZ19961694A patent/CZ288269B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-12-13 US US08/648,015 patent/US5780260A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4342770A1 (de) | 1995-07-06 |
| TW341600B (en) | 1998-10-01 |
| CZ169496A3 (en) | 1996-09-11 |
| KR960706554A (ko) | 1996-12-09 |
| WO1995016773A1 (de) | 1995-06-22 |
| EP0734437A1 (de) | 1996-10-02 |
| ES2139178T3 (es) | 2000-02-01 |
| US5780260A (en) | 1998-07-14 |
| PL177809B1 (pl) | 2000-01-31 |
| KR100338566B1 (ko) | 2002-10-31 |
| SK281379B6 (sk) | 2001-03-12 |
| ATE186743T1 (de) | 1999-12-15 |
| RU2135582C1 (ru) | 1999-08-27 |
| PL314963A1 (en) | 1996-09-30 |
| EP0734437B1 (de) | 1999-11-17 |
| JPH09500282A (ja) | 1997-01-14 |
| JP2719047B2 (ja) | 1998-02-25 |
| DE59408940D1 (de) | 1999-12-23 |
| SK78496A3 (en) | 1997-01-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Tischer et al. | Immobilized enzymes: methods and applications | |
| WO1989000195A1 (en) | Process for immobilization of biological material by cross-linking with polyazetidine | |
| US4438196A (en) | Immobilization of biocatalysts on granular carbon | |
| US5472861A (en) | Method for preparing immobilized enzyme conjugates and immobilized enzyme conjugates prepared thereby | |
| US4229536A (en) | Process for preparing immobilized enzymes | |
| US4288552A (en) | Immobilized intracellular enzymes | |
| GB1568328A (en) | Immobilized enzymes on pullulan carriers and preparation thereof | |
| EP0216272B1 (en) | Immobilization of biocatalysts on granular diatomaceous earth | |
| Itoyama et al. | Lipoprotein lipase immobilization onto porous chitosan beads | |
| Dwevedi et al. | Stabilization of β-galactosidase (from peas) by immobilization onto Amberlite MB-150 beads and its application in lactose hydrolysis | |
| Fernández-Lorente et al. | Immobilization of proteins on glyoxyl activated supports: dramatic stabilization of enzymes by multipoint covalent attachment on pre-existing supports | |
| CZ288269B6 (en) | Immobilization of penicillin G amidase, glutaryl-7-ACA acylase or D-amino acid oxidase on an aminofunctional organosiloxane polymer carrier, use of the enzymes and process of their preparation | |
| Smiley et al. | Immobilized enzymes | |
| Powell | Developments in immobilized-enzyme technology | |
| US5599702A (en) | D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis immobilized on porous copolymer beads | |
| Wasserman et al. | Immobilization of glucoamylase from Aspergillus niger on poly (ethylenimine)-coated non-porous glass beads | |
| Pitcher | Introduction to immobilized enzymes | |
| CA1203187A (en) | Immobilization of invertase on polyethylenimine- coated cotton cloth | |
| Hayashi | Polymer microspheres as carriers of the immobilized enzymes | |
| Kumar et al. | Immobilization of enzymes and biotechnological perspective | |
| Keyes et al. | Immobilized enzymes | |
| Smiley | Immobilized Enzymes KL Smiley And GW Strandberg Northern Regional Research Laboratory, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Peoria, Illinois I. Introduction | |
| Ismaill et al. | Properties and Gamma Radiation Stability of Immobilized Alpha Amylase on Synthetic and Natural Polymer Blends |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20031213 |