PL175220B1

PL175220B1 - Sposób wytwarzania estrów fosforowych modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów

Info

Publication number: PL175220B1
Application number: PL93298111A
Authority: PL
Inventors: Lucyna Woźniak; Wojciech J. Stec
Original assignee: Pan
Priority date: 1993-03-17
Filing date: 1993-03-17
Publication date: 1998-11-30

Abstract

1 1. Sposób wytwarzania estrów fosforowych modyfiko- wanych P-chiralnych analogów nukleotydów o wzorze ogólnym 2, w którym A i R ’ oznaczaja grupy 3’- i 5’-nukleozydylowe z odpowiednio zablokowanymi grupami funkcyjnymi zasad pury- nowych lub pirymidynowych, C’ oznacza grupe alkilowa, alkoksylowa, S-alkilowa i N-dialkiloamidowa, a X jest tlenem, siarka lub selenem, znamienny tym, ze poddaje sie reakcji dia- stereomerycznie czysty kwas metanofosfonowy o wzorze ogól- nym 3, w którym A, C' i X maja wyzej podane znaczenie, a B oznacza tnetyloamine lub przeciwjon, korzystnie Na, z chlor- kiem benzoilowym o ogólnym wzorze 4, w którym R oznacza grupe fenylowa, podstawiona w pierscieniu aromatycznym, ko- rzystnie chlorek 2,4,6-trimetylobenzoilowy, a otrzymany miesza- ny bezwodnik o ogólnym wzorze 1, w którym A, C’, R i X maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie nastepnie reakcji z alko- holem pierwszorzedowym o wzorze R ’OH, gdzie R’ oznacza grupe 5’-nukleozydylowa, po czym stosujac odczynnik aktywu- jacy, otrzymuje sie produkt o wzorze 2, który wyodrebnia sie w znany sposób. 4. Sposób wytwarzania estrów fosforowych, modyfiko- wanych P-chiralnych analogów nukleotydów o wzorze ogólnym 2, w którym A i R ’ oznaczaja grupy 3’- i 5’-nukleozydylowe z odpowiednio zablokowanymi grupami funkcyjnymi zasad pury- nowych lub pirymidynowych, C’ oznacza grupe alkilowa, alkoksylowa, S-alkilowa i N-dialkiloamidowa, a X jest tlenem, siarka lub selenem, znamienny tym, ze poddaje sie reakcji P -chiralny kwas metanofosfonowy 3, w którym A, B, C’ i X maja wyzej podane znaczenie, w postaci mieszaniny diastereoizome- rów, z chlorkiem benzoilowym 4, w którym R ma wyzej podane znaczenie, korzystnie podstawionym w pierscieniu aromatycz- nym chlorkiem 2,4,6-tri-metylobenzoilowym a otrzymany pro- dukt o wzorze ogólnym 1, w którym A, C', R i X maja wyzej podane znaczenie, rozdziela sie metodami chromatografii. . . W ZÓR i WZÓR 4 WZÓR 2 WZÓR 3 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania estrów fosforowych modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów o ogólnym wzorze 2, poprzez wykorzystanie mieszanych bezwodników karboksylowo-fosforowych o ogólnym wzorze 1 do wytworzenia wiązania internukleotydowego w modyfikowanych nukleotydach o wzorze ogólnym 2.

Modyfikowane oligonukleotydy, w tym szczególnie niejonowe metanofosfoniany nukleozydów, syntetyzowane do tej pory w sposób niestereokontrolowany, wykazują własności przeciwwirusowe i przeciwnowotworowe in vitro i in vivo i mają potencjalne znaczenie w chemoterapii jako leki antisense.

Modyfikowane oligonukleotydy (tiofosforany, metanofosfoniany) różniące się jedynie konfiguracją na atomie fosforu wykazują szereg różnic własności fizycznych, chemicznych i biologicznych, m.in. zróżnicowaną reaktywność w stosunku do nukleaz (B.V.L. Polter, B.A. Connolly, F. Eckstein, Biochemistry, 22 (1983) 1369; F.R. Bryant,

S.J. Benkovic, Biochemistry, 18 (1979) 2825), a także duże różnice wartości temperatur mięknięcia (Tm), świadczące o różnej zdolności do tworzenia dupleksów z nicią komplementarną (Z.J. Leśnikowski, M. Jaworska, WJ. Stec, Nucl. Acids Res., 18 (1990) 2109).

Istnieje szereg sposobów zawiązywania wiązania internukleotydowego, prowadzących do modyfikowanych P-chiralnych nukleotydów, w tym szczególnie metanofosfonianów nukleozydów, ale tylko następujące przebiegają stereoselektywnie:

1. Metoda polegająca na reakcji grupy 5’-hydroksylowej nukleozydu, aktywowanej za pomocą odczynnika Grignarda, chlorku t-butylomagnezowego, z rozdzielonymi na diastereoizomery estrami p-nitrofenylowymi metanofosfonianów nukleozydów (Z.J. Leśnikowski, M. Jaworska, WJ Stec, Nucl. Acids Res., 16 (1988) 11675).

2. Synteza dinukleozydo metanofosfonianów z wykorzystaniem metylodichlorofosfiny jako odczynnika fosfitylującego w niskich temperaturach, w reakcji z grupą 3’-hydroksylową nukleozydu w pierwszym etapie reakcji i grupą 5’-hydroksylową w drugim etapie reakcji. Metoda ta prowadzi do preferencyjnego (w zależności od użytych nukleozydów i warunków) powstania izomeru Rp (T. Loschner, J. Engels, Tetrahedron Lett., 30 (1989) 5587; J.W. Engels, T. Loschner, A. Frauendorf, Nucleosides & Nucleotides 10 (1991) 347).

3. Synteza 5’-tiono(5’-seleno)5’-deoksy pochodnych, metano-tio(seleno)fosfonianów i tio(seleno)fosforanów nukleozydów, z wykorzystaniem rozdzielonych na diastereoizomery odpowiednio tio- i selenokwasów, alkilowanych przy użyciu 5’-chlorowco-5’-deoksynukleozydów (A.V. Lebedev, J.P. Rife, H.W. Seligsohn, G.R. Wenzinger, E. Wickstrom, Tetrahedron Lett, 31 (1990) 855; L. Woźniak, WJ. Stec, International Conference NAMA, Can-cun, 1993).

4. Metoda syntezy stereoregularnych tiofosforanów ·nukleozydów polegająca na wykorzystaniu jako substratu 5’-O-DMT-nukleozydo-3’-O-[2-tiono-1,3,2-oksatiafosfolanów], które w obecności DBU reagują w sposób stereoselektywny z grupami 5’-hydroksylowymi nukleozydów prowadząc do oligomerów o określonej konfiguracji na centrach fosforowych (WJ. Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznański, Nucl. Acids Res., 19 (1991) 5883).

Sposób wytwarzania estrów o wzorze ogólnym 2, w którym A i R’ oznaczają grupy 3’i 5’-nukleozydylowe z odpowiednio zablokowanymi grupami funkcyjnymi zasad purynowych lub pirymidynowych, C’ oznacza grupę alkilową, alkoksylową, S-alkilową i N-dialkiloaminową, a X jest tlenem, siarką lub selenem, z mieszanych bezwodników karboksylowo-fosforowych o wzorze ogólnym 1, w którym A, C’ i X mają wyżej podane znaczenie, a R oznacza grupę fenylową, podstawioną w pierścieniu aromatycznym, polega według wynalazku na tym, że poddaje się reakcji diastereomerycznie czysty kwas metanofosfonowy o wzorze ogólnym 3, w którym A, Ci X mają wyżej podane znaczenie a B oznacza trietyloaminę lub przeciwjon, korzystnie Na, z chlorkiem benzolowym o ogólnym wzorze 4, w którym R ma wyżej podane znaczenie, korzystnie podstawionym w pierścieniu aromatycznym, np. chlorkiem 2,4,6-trimetylobenzoilowym, a otrzymany mieszany bezwodnik o ogólnym wzorze 1, w którym A, C’, R i X mają wyżej podane znaczenie, poddaje

175 220 się następnie reakcji z alkoholem pierwszorzędowym o wzorze R’OH, gdzie R’ oznacza grupę 5’-nukleozydylową, po czym stosując odczynnik aktywujący, otrzymuje się produkt o wzorze 2, który wyodrębnia się w znany sposób.

Odmiana sposobu wytwarzania estrów o wzorze ogólnym 2, w którym A, C’, R’ i X mają wyżej podane znaczenie, polega na tym, że poddaje się reakcji P-chiralny kwas metano-fosfonowy 3, w którym A, B, C’ i X mają wyżej podane znaczenie, w postaci mieszaniny diastereoizomerów z chlorkiem benzoilowym 4, w którym R ma wyżej podane znaczenie, korzystnie podstawionym w pierścieniu aromatycznym chlorkiem 2,4,6-trimetylobenzoilowym a otrzymany produkt o wzorze ogólnym 1, w którym A, C’, R i X mają wyżej podane znaczenie, rozdziela się metodami chromatografii kolumnowej, po czym diastereoizomerycznie czysty bezwodnik o wzorze ogólnym 1 poddaje się reakcji z alkoholem o wzorze ogólnym ROH, gdzie R’ oznacza grupę 5’-nukleozydylową, i w obecności aktywatora otrzymuje się produkt o wzorze 2, który wyodrębnia się w znany sposób.

Sposób według wynalazku prowadzi się, korzystnie w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w pirydynie lub acetonitrylu.

Pierwszy wariant sposobu, będący przedmiotem wynalazku polega na wytworzeniu diastereoizomerycznie czystego mieszanego bezwodnika fosforowo-karboksylowego o wzorze ogólnym 1, gdzie A, R’, X i C’ mają podane wyżej znaczenie, ulegającego solwolizie w wyniku reakcji z alkoholami pierwszorzędowymi w obecności aktywatora. Produktami reakcji alkoholizy są estry kwasów fosforu o wzorze ogólnym 2, gdzie R’ oznacza grupę 5’-nukleozydylową.

Wariant drugi sposobu, będący przedmiotem wynalazku polega na wytworzeniu mieszanin diastereoizomerów mieszanego bezwodnika o wzorze ogólnym 1, gdzie A, R', X i C’ mają podane wyżej znaczenia a R oznacza grupę fenylową, odpowiednio podstawioną w pierścieniu np. grupę 2,4,6-trimetylofenylową i rozdzielenie produktu na diastereoizomery znanymi metodami.

Proponowana metoda według wynalazku charakteryzuje się:

1. wysoką wydajnością w procesie syntezy monomerów o wzorze 1,

2. możliwością otrzymania substratów o wzorze 1 w sposób stereoselektywny z czystych optycznie tiokwasów fosforu o wzorze 3,

3. alternatywną możliwością rozdzielenia mieszaniny diastereomerycznej substratów o wzorze 1 metodami chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym,

4. wysoką trwałością substratów 1, również w obecności I rzędowych alkoholi,

5. możliwością katalizy procesu zawiązywania wiązania estrowego w celu uzyskania produktu o wzorze 2.

Sposób według wynalazku jest procesem uniwersalnym i pozwala na otrzymanie szeregu estrów kwasów fosforu o ogólnym wzorze 2.

Występujący w opisanej metodzie produkt pośredni - mieszany bezwodnik fosforowo-karboksylowy 1 może być otrzymany w sposób stereokontrolowany i wyizolowany znanymi metodami.

Wykorzystanie rozdzielonych na diastereoizomery substratów o wzorze 3 umożliwia otrzymanie optycznie czynnych produktów o wzorze 1 i 2.

Sposób według wynalazku polega na reakcji podstawienia nukleofilowego przy atomie fosforu w metylotiofosfonianach nukleozydów o wzorze ogólnym 3, za pomocą grupy benzoilowej. Reagentami są tiokwasy lub kwasy metanofosfonowe nukleozydów o wzorze ogólnym 3, w którym A, Β, X i C’ mają podane wyżej znaczenie oraz chlorek benzoilowy 4, podstawiony w pierścieniu aromatycznym. Otrzymany bezwodnik o wzorze 1 ulega następnie reakcji z odpowiednim alkoholem R’OH, w obecności aktywatora, którym może być korzystnie t-butanolan potasu, wodorek sodowy lub aminy takie jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undek-7-en (DBU), 4-dimetyloamino-pirydyna (DMAP), diizopropyloetyloamina lub l,4-diazabicyklo[2.2.2]-oktan (DABCO).

Produkty reakcji wydziela się stosownymi metodami chromatograficznymi.

175 220

W odmianie sposobu według wynalazku przeprowadza się opisaną powyżej reakcję i rozdziela się na diastereoizomery, metodami chromatografii kolumnowej na żelu, mieszany bezwodnik fosforowo-karboksylowy o wzorze ogólnym 1 i każdy z diastereoizomerów poddaje się reakcji z alkoholem R’OH w obecności aktywatora, a powstający produkt 2 izoluje się podanymi powyżej metodami.

Mieszane bezwodniki fosforylowo-karboksylowe nukleozydów o wzorze 1 były w literaturze opisane wcześniej (V.V. Shumyantzeva, N.I. Sokolova, Z.A. Shabarova, Nucleic Acids Res, 1976, 3, 903; V.L. Druca, V.F. Zarytova, D.G. Knorre, A.V. Lebedev, N.I. Sokolova, Z.A. Shabarova, DAN SSSR, 1977, 233, 595), jednak nowość opisanej w wynalazku procedury polega na syntezie tych bezwodników w sposób stereokontrolowany, z diastereoizomerycznie czystych substratów tzn. odpowiednich kwasów tiono- lub selenofosforowych (fosfonowyeh) (3), lub na rozdziale mieszanin diasteromeiycznych (1) w wyniku chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym i na wykorzystaniu tych czystych diastereoizomerów jako substratów w stereospecyficznie przebiegającej reakcji zawiązania wiązania intemukleotydowego P-chiralnych analogów kwasów nukleinowych.

Wynalazek ilustrują podane niżej przykłady.

Przykład I. Synteza 5’-O-Dimetoksytrytylo-3’-O[(O-2,4,6-trimetylobenzoilo)metanotiofosfonianu] tymidyny (1).

Do roztworu 5’-O-Dimetoksytrytylo-3’-O-metanotiofosfonianu tymidyny (0,1 g, 0,18 mmol) w 0,5 ml suchej pirydyny dodano jednorazowo roztwór chlorku 2,4,6-trimetylobenzoilowego (0,06 g, 0,33 mmol) w 0,5 ml suchej pirydyny. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1/2 godziny, po czym rozpuszczono w 5 ml chloroformu i ekstrahowano dwa razy za pomocą buforu węglanowego (pH = 8,5). Warstwę organiczną suszono za pomocą MgSO4, zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, stosując chloroform jako eluent. Otrzymano trzy frakcje zawierające izomery FAST, SLOW i mieszany w proporcjach odpowiednio 1:0,5:0,5. Łączna wydajność procesu po wytrąceniu produktów rozpuszczonych w chloroformie do pentanu schłodzonego do temp. ok. 0°C wynosi 70% (0,075 g).

Przykład II. Solwoliza 5’-O-Dimetoksytrytylo-3’-O[(O-2,4,6-trimetylobenzoilo)metanotiofosfonianu] tymidyny (1) za pomocą metanolu.

Substrat (1) (0,02 g, 0,025 mmol) rozpuszczono w mieszaninie równych objętości metanolu (0,25 ml) i pirydyny (0,25 ml) i dodano w postaci stałej t-butanolan potasu (4) (0,007 g). Po 1/2 godz. mieszaninę reakcyjną rozcieńczono octanem etylowym (2 ml) i wyekstrahowano buforem węglanowym (pH = 8,5) (1 ml x 2). Fazę organiczną zatężono po suszeniu siarczanem magnezowym i poddano analizie, otrzymano 5’-O-dimetoksytrytylo-3’-0-[(0-metylo)metanotiofosfonianttymidyny (5) z wydajnością 85% (³¹P NMR: 96,43 ppm, 96,39 ppm); Ms [m/s]+ 652

Przykład III. Reakcja pomiędzy 5’-O-Dimetoksytrytylo-3’-O-[(O-2,4,6tΓimetylobenzoilo)metanotioSosSonianem]tymidyny (1) i 3’-Oacetylotymidyną aktywowana za pomocą (DBU).

Diastereoizomer SLOW (1) (0,020 g, 0,025 mmol, czystość optyczna 90%) rozpuszczono w pirydynie (100^l) i dodano 3’-O-acetylotymidynę (0,030 g, 0,1 mmol) rozpuszczoną w pirydynie (100 ^l). Do mieszaniny reakcyjnej dodano DBU w pirydynie (200 ^l, 30% roztwór DBU (v/v)). Reakcję kontrolowano za pomocą ³¹P NMR. Po 0,5 godz. uzyskano zanik sygnału substratu 1. Produkt 2 SLOW (Sp) otrzymano z wydajnością 40%. Czystość optyczna - 85%. 3¹P NMR: 98,49 ppm, 97,50 ppm).

Produkt poddano deprotekcji:

1° NH3/EtOH (2:1) 4 godz.

2° 80% CH3COOH 1 godz.

175 220 i analizowano metodą HPLC, potwierdzając identyczność z produktem 2, otrzyma nym na drodze niezależnej.

175 220

X ο

II II

A-P-Q-CS +

WZÓR 4

X

II c·

WZÓR 2

175 220

X Θ

II Η

A -Ρ -Θ·Β + 0-C -GL

WZÓR 3

Κ

II

Α -Ρ~

ZZÓR 4

WZÓR 1

I

C^e

WZÓR 2

175 220

X

II

A - Ρ - 0 · Β I e°

WZÓR 3

X

II

A - P I

C‘ ϋ

II + — c — ct

WZÓR 4

WZÓR 1

175 220

G* 0 I II

A-p-O-G-8 li

X

WZÓR 4

X

A II

WZÓR 2

C'

WZÓR 3

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania estrów fosforowych modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów o wzorze ogólnym 2, w którym A i R’ oznaczają grupy 3’- i 5’-nukleozydylowe z odpowiednio zablokowanymi grupami funkcyjnymi zasad purynowych lub pirymidynowych, C’ oznacza grupę alkilową, alkoksylową, S-alkilową i N-dialkiloamidową, a X jest tlenem, siarką lub selenem, znamienny tym, że poddaje się reakcji diastereomeiycznie czysty kwas metanofosfonowy o wzorze ogólnym 3, w którym A, C’ i X mają wyżej podane znaczenie, a B oznacza trietyloaminę lub przeciwjon, korzystnie Na, z chlorkiem benzoilowym o ogólnym wzorze 4, w którym R oznacza grupę fenylową, podstawioną w pierścieniu aromatycznym, korzystnie chlorek 2,4,6-trimetylobenzoilowy, a otrzymany mieszany bezwodnik o ogólnym wzorze 1, w którym A, C’, R i X mają wyżej podane znaczenie, poddaje się następnie reakcji z alkoholem pierwszorzędowym o wzorze R’OH, gdzie R’ oznacza grupę 5’-nukleozydylową, po czym stosując odczynnik aktywujący, otrzymuje się produkt o wzorze 2, który wyodrębnia się w znany sposób.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że prowadzi się go w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w pirydynie, acetonitrylu lub tetrahydrofuranie.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako aktywatory procesu pomiędzy związkiem o wzorze 1 i alkoholem pierwszorzędowym stosuje się związki metaloorganiczne lub aminy, korzystnie t-butanolan potasu, wodorek sodu lub 'l,8-diazabicyklo[5.4.0]-undek-7-en (DBU), 4-dimetyloaminopirydyna (DMAP), diizopropyloetyloamina lub 1,4-diazabicyklo-[2.2.2j-oktan (DABCO).
4. Sposób wytwarzania estrów fosforowych, modyfikowanych P-chiralnych analogów nukleotydów o wzorze ogólnym 2, w którym A i R’ oznaczają grupy 3’- i 5’-nukleozydylowe z odpowiednio zablokowanymi grupami funkcyjnymi zasad purynowych lub pirymidynowych, C’ oznacza grupę alkilową, alkoksylową, S-alkilową i N-dialkiloamidową, a X jest tlenem, siarką lub selenem, znamienny tym, że poddaje się reakcji P-chiralny kwas metanofosfonowy 3, w którym A, B, C’ i X mają wyżej podane znaczenie, w postaci mieszaniny diastereoizomerów, z chlorkiem benzoilowym 4, w którym R ma wyżej podane znaczenie, korzystnie podstawionym w pierścieniu aromatycznym chlorkiem 2,4,6-trimetylobenzoilowym a otrzymany produkt o wzorze ogólnym 1, w którym A, C’, R i X mają wyżej podane znaczenie, rozdziela się metodami chromatografii kolumnowej, po czym diastereoizomerycznie czysty bezwodnik o wzorze ogólnym 1 poddaje się reakcji z alkoholem o wzorze ogólnym R’OH, gdzie R’ oznacza grupę 5’-nukleozydylową, i w obecności aktywatora otrzymuje się produkt o wzorze 2, który wyodrębnia się w znany sposób.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że prowadzi się go w warunkach bezwodnych, w nieprotonowym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie w pirydynie, acetonitrylu lub tetrahydrofuranie.
6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako aktywatory procesu pomiędzy 1 i alkoholem pierwszorzędowym stosuje się związki metaloorganiczne lub aminy, korzystnie t-butanolan potasu, wodorek sodu lub l,8-diazabicyklo[5.4.0]-undek-7-en (DBU), 4-dimetyloaminopirydyna (DMAP), diizopropyloetyloamina lub 1,4-diazabicyklo[2.2.2]-oktan (DABCO).

175 220